Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock. Bericht

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock Bericht Klinische Studie nach 23b MPG: Reduktion von Heparin und inflammatorischem Potential durch Citrasate bei der High-Flux- Hämodialyse Oktober 2011

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 2 Inhaltsverzeichnis 1. ZIELE DER STUDIE 3 2. STUDIENDESIGN 4 2.1 Zeitlicher Ablauf 4 2.2 Materialien und Behandlungsparameter 4 2.3 Patienten 5 2.4 Messparameter 6 2.5 Labormethoden 7 2.6 Ort und Zeit der Studiendurchführung 7 2.7 Datenanalyse und statistische Methoden 8 3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 9 3.1 Dialyse-Effektivität in Abhängigkeit von der Heparindosis 9 3.2 Einfluss von Citrasate auf das inflammatorische und oxidative Potential 12 3.3 Einfluss von Citrasate auf Calcium- und Phosphat-Plasmaspiegel 16 4. ZUSAMMENFASSUNG 18 5. LITERATURVERZEICHNIS 19

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 3 1. ZIELE DER STUDIE In der Literatur wurden Reduktionen der Heparindosis von bis zu 55 % bei gleichzeitiger Erhöhung der Dialysedosis durch den Einsatz von citrathaltigem Dialysat beschrieben (1,2). Als Ursache wird die lokale Antikoagulation im Dialysator durch starke Herabsetzung des freien Calciums angenommen, wodurch eine.geringere Thrombusbildung im Dialysator erfolgt und damit höherer Massetransport durch die Membran möglich wird. Die Acetat-Reduktion soll die hämodynamische Stabilität der Patienten erhöhen (3). Bislang wurde nicht untersucht, ob durch die Acetat-Reduktion auch das inflammatorische Potential des Acetats so verringert wird, dass die Zytokinfreisetzung und Leukozyten- u. Thrombozytenaktivierung reduziert werden. Bisher wurde zwar eine Reduktion des Beta-2-Mikroglogulins (ß2M) beobachtet, die aber auch auf die verbesserte Membranpermeabilität zurückgeführt werden könnte (2). Die mögliche Heparinreduktion durch Citrasate kann bei der chronischen Dialyse zu ökonomischen Vorteilen führen. Der klinische Nutzen für die Patienten bestünde in der Reduktion der oben beschriebenen möglichen acetatbedingten Nebenwirkungen und der bekannten Nebenwirkungen des Heparins. Wegen der bislang nur wenigen vorliegenden Publikationen und Berichte ist es sinnvoll, die bisherigen Ergebnisse zu verifizieren und zu prüfen, inwieweit die beobachtete ß2M-Reduktion auch durch eine Absenkung des inflammatorischen Potentials (4) durch Citrasate verursacht sein könnte. Die Studie sollte deshalb folgende Fragen beantworten: 1. Kann durch den Einsatz von Citrasate die Heparindosis bei der chronischen Dialyse Behandlung bei Erhalt der Dialyseeffektivität (Kt/V) gesenkt werden ohne Erhöhung von Clottingereignissen im Dialysator oder extrakorporalen Kreislauf? 2. Welche Auswirkungen hat der Einsatz von Citrasate auf die Senkung des inflammatorischen und oxidativen Potentials durch Messung des ß2M-Spiegels und der Werte von hscrp, Präalbumin und Marker für den oxidativen Stress wie MPO? 3. Welchen Einfluß hat die Verwendung von Citrasate auf den Plasmaspiegel von freiem Calcium und Phosphat?

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 4 2. STUDIENDESIGN 2.1 Zeitlicher Ablauf Woche 1 + 2: Woche 3 6: Woche 7-10: Erhebung der unten genannten Messparameter mit dem jetzt verwendeten Dialysat und der bislang verwendeten Heparin menge (Bolus+ kontinuierlich) Umstellung auf Citrasat unter sonst unveränderten Bedingungen. Dialyse mit Citrasate und Reduktion der Heparinmenge im Bolus um 50 % von der urspünglichen Menge. Woche 11-14: Dialyse mit Citrasate und Reduktion der Heparinmenge im Bolus um 50% und in der kontinuierlichen Menge um den Betrag 50%, so dass die Gesamt- Heparin- Reduktion 50% beträgt. 2.2 Materialien und Behandlungsparameter Als Aceatat-Konzentrat wurden folgende Typen eingesetzt, die sich lediglich durch ihre K + -Konzentration (3,0 bzw. 4,0 mmol/l) unterscheiden: Typ INTERMEDT DSK-3653-GW-2-750-35 (hergestellt mittels INTERMEDT- Mischanlage) Konzentrationen im fertig gemischten Dialysat: Na + K + Ca 2+ Mg 2+ Cl - Acetat HCO3 - Glucose mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l g/l 138 3,0/4,0 1,25 0,75 110,0 2,00 33 1,0 Für die Citrasate-Dialysen wurden folgende Typen eingesetzt: Typ Na + K + Ca 2+ Mg 2+ Cl - Acetat Citrat HCO3 - Glucose MTN mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l g/l 412 135,3 3,0 1,25 0,50 106,5 0,30 0,80 32,60 1,0 414 135,3 4,0 1,25 0,50 107,5 0,30 0,80 32,60 1,0 Die Hämodialyse-Behandlungen wurden mit Geräten FMC 5008 durchgeführt. Als Dialysatoren kamen die FMC-High-Flux-Typen FX60, FX80 und FX100 zu Einsatz (siehe Tabelle Patienten im Anhang). Der Blutfluss lag generell bei 300 ml/min. Für die Antikoagulation wurde unfraktioniertes Heparin Typ Heparin Natrium 5000 ratiopharm verwendet.

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 5 2.3 Patienten 10 Patienten aus dem chronischen Dialyseprogramm wurden ausgewählt, die folgende Kriterien erfüllten: - Einschlusskriterien - Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz, die mit einer Doppel- Nadel-Standard Hämodialyse 3x wöchentlich behandelt werden - Patienten mit einem 2-lumigen Dialysedauerkatheter, der einen Mindestblutfluss von 250 ml/min ermöglicht - Antikoagulation bei der High Flux Dialyse (HFD) mit einem unfraktionierten Heparin mit einem Bolus >/= 2000 Einheiten Heparin seit mindestens 4 Wochen. - Verabreichte Dialysedosis ekt/v>/= 1.0 oder spkt/v>/=1.2 in den letzten 4 Wochen - Ausschlusskriterien - Patienten mit Erkrankungen, die die Ergebnisse beeinflussen könnten Tumorerkrankungen Hämatologische Erkrankungen Koagulopathien, Thrombopathien Akute oder chronische Lebererkrankungen - Patienten, die Vitamin-K-Antagonisten erhalten - Patienten, die außerhalb der Dialyse mit Heparinen antikoaguliert werden - Patienten, die mit HDF behandelt werden - Antikoagulation an der HD mit einem fraktionierten Heparin oder anderen Antikoagulantien - Patienten, bisher ohne Heparin behandelt - Patienten, bei denen in den letzten 4 Wochen der Dialysator gewechselt wurde oder Clotting des Dialysators oder der Blutschläuche vorgekommen ist. - Patienten, die mit HDF behandelt werden - Patienten mit einer Heparindosis < 2000 Einheiten pro Behandlung Die Tabelle Patientendaten (siehe Anhang) enthält die spezifischen Patientendaten einschließlich der Heparindosis (tatsächlich und berechnet nach der Formel von Ouseph/Ward (4). Bei 2 Patienten musste die Studie ab Woche 8 abgebrochen werden: Pat. PI wegen Hospitalisierung (Thrombose), Pat. NG wegen Ca-Mangels und Verschlechterung des Allgemeinzustandes.

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 6 2.4 Messparameter Tabelle 1: Zu messende Parameter Meßwert Freies Calcium Gesamt-Calcium Bicarbonat ph Na + K + Hb/HK Thrombozytenzahl Leukozytenzahl Erfassungzeitraum Vor und nach jeder Behandlung Vor und nach einer Behandlung 1xpro Woche Vor und nach jeder Behandlung Vor und nach jeder Behandlung Vor und nach jeder Behandlung Vor und nach jeder Behandlung Vor, nach 15 min und nach einer Behandlung 1xpro Woche Vor, nach 15 min und nach einer Behandlung 1xpro Woche Vor, nach 15 min und nach einer Behandlung 1xpro Woche Phosphat Vor und nach einer Behandlung - 1x pro Woche Vor, nach 15 min und nach einer Behandlung - 1x ACT pro Woche spkt/v nach einem langen Intervall Nach Woche 2,6,10,14 ß2-Mikroglobulin prädialytisch nach Woche 2, 6, 10,14 Albumin prädialytisch nach Woche 2, 6, 10,14 hscrp, prädialytisch nach Woche 2, 6, 10,14 Wöchentliche Epo-Dosis Wöchentliche Eisen-Dosis MPO Jede Woche Jede Woche 2x während jeder Phase, jeweils vor, nach 15 min und nach einer Behandlung Die Messparameter wurden nach Studienbeginn z.t. den Bedingungen angepasst, z.b. wurden die Elektrolyte Na + und K + zusätzlich mit erfasst, da sie ohnehin bei der Ionometermessung mit anfallen. Auch das prädialytische Albumin wurde zusätzlich mit aufgenommen. Die MPO-Messungen wurden dagegen weniger häufig vorgenommen, als im Protokollentwurf vorgesehen (siehe Anhang), da die Zahl der gewonnenen Messpunkte bereits aussagekräftig war.

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 7 2.5 Labormethoden Laboruntersuchungen wurden in einem nach DIN IES 17025 zertifizierten Laboratorium durchgeführt: Labormedicus GmbH,Südring 81, 18059 Rostock. Elektrolyte, ph und HCO3 - wurden mit dem ionenselektiven Messgerät der Dialysepraxis des Praxisverbundes Dialyse und Apherese Rostock bestimmt. Das Gerät unterliegt Qualitätskontrollen entsprechend dem QM-System des Praxisverbundes. Die Messungen der Myeloperoxidase (MPO) wurden in Kooperation mit dem Gastroenterologischen Forschungslabor der Universität Rostock von Frau Dr. Waitz (BioArtProducts GmbH) durchgeführt. Die verwendeten Labormethoden können der folgenden Tabelle entnommen werden: Tabelle 2: Labormethoden Parameter Methode Hersteller Elektrolyte, ph, HCO3 - Ionometer ABL 800 Basic Radiometer Kopenhagen Blutbild Harnstoff Phosphat Gesamt-Ca Hämatologischer Automat Standard Methode Sysmex, SE-9000 Diasys, Automat Hitachi 717 ß2-Mikroglobulin ELISA (MEIA) Abbott, Axsym Albumin hscrp Photometrie, Bromcresolgrün Beckman-Coulter AU2770 Immunturbodimetrischer Test Beckman-Coulter AU2770 ACT Activated Clotting Time Test QUEST Medical, Inc., U.S.A. MPO Human MPO Immunoassay Quantikine R&D Systems, Inc. U.S.A. 2.6 Ort und Zeit der Studiendurchführung Die Studie wurde in der Dialysepraxis des Praxisverbundes für Dialyse und Apherese Rostock, St. Petersburger Str. 18c, durchgeführt. Die Praxis ist entsprechend ISO 9001:2000 zertifiziert. Die Studie erfolgte im Zeitraum von 14 Wochen zwischen dem 27.06. und 30.09.2011.

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 8 2.7 Datenanalyse und statistische Methoden Die Datenanalyse wurde mit Hilfe der MicrosoftExcel-Software durchgeführt. Die deskriptive Statistik erfolgte mittels WinStat für Excel und SigmaStat. Alle Parameter wurden als Mittelwerte und Standardmessfehler (SEM) dargestellt. Unterschiede zwischen den Messwerten der unterschiedlichen Behandlungsbedingungen wurden mit dem t-test für gepaarte Messwerte bzw., bei fehlender Normalverteilung, mit dem Mann-Whitney-Test (U-Test), auf Signifikanz geprüft. Ein p- Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Da die Studie bei 2 Patienten nach der 7. Woche abgebrochen werden musste, wurden deren Messwerte im Sinne der Messwertpaarung für alle Behandlungsarten nicht in die Analyse einbezogen. Da sich die Hämatokrit-Werte während der Dialysebehandlung ändern, wurden die Messwerte für Substanzen, die im Blutplasma gemessen werden (Ca, Phosphat, MPO), mit folgender Formel korrigiert (5): c corr = c* (HK 0 /HK n )*(1-HK n )/(1-HK 0 ) HK 0 = Hämatokrit vor Behandlung; HK n = Hämatokrit zur Probennahmezeit n Messwerte, die sich auf das Vollblutvolumen beziehen, wie Leukozyten- und Thrombozytenzahlen, wurden entsprechend der HK-Änderung korrigiert: C corr = C*HK 0 /HK n Die Ionometermesswerte (ph, Ca 2+, Na + und K + ) müssen nach Auskunft des Herstellers (Radiometer) nicht HK-korrigiert werden, da es sich um Aktivitätsmessungen handelt (6).

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 9 3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die Messergebnisse für die einzelnen Patienten sowie ihre Auswertungen können den Excel-Tabellen und Diagrammen im Anhang entnommen werden. 3.1 Dialyse-Effektivität in Abhängigkeit von der Heparindosis Bei der Hämodialyse mit Citrasate wird davon ausgegangen, dass Citrat im extrakorporalen Blutkreislauf eine Antikoagulation über eine Chelatierung des ionisierten Calciums bewirkt. Dies sollte sich bei Parametern zur Messung der Gerinnungszeit wie die Activated Clotting Time (ACT) widerspiegeln. Abb. 1 zeigt die Mittelwerte der ACT-Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten (vor Dialyse, aber nach Heparinbolus; nach 15 min und am Behandlungsende) und während der einzelnen Studienphasen (Baseline: HD mit Standardkonzentrat; Reduzierung des Heparinblus um 50 %; Reduktion der gesamten Heparindosis um 50 %). Offensichtlich ist der Einfluss des citrathaltigen Konzentrates nicht groß genug, um sich bei der ACT auszuwirken (7). Möglicherweise verhindert die relative große Messwertstreuung einen statistisch signifikanten Unterschied. ACT reagiert jedoch signifikant auf die Reduzierung des Heparin-Bolus und der Gesamt-Heparindosis. 250 ACT während HD; n=8 200 p=0,05 p=0,02 sec 150 100 p=0,01 p=0,02 p=0,03 p=0,008 50 ACTprä(nach Bolus) ACT15min ACT post 0 baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 1: Aktivierte Clotting-Zeit (ACT) in den einzelnen Studienphasen Die Tabelle Patientendaten (s. Anhang) zeigt einen Vergleich der einzelnen Heparindosen mit den theoretisch von Ouseph/Ward empfohlenen Dosen (4). Hiernach wird der Heparinbolus je nach Körpermasse, Diabetes j/n, Raucher j/n, individualisiert, während die kontinuierliche Erhaltungsdosis für jeden Patienten dieselbe ist:

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 10 Heparin-Bolus (IU) = 1600 + 10 * (BW - 76) 300 * Fd 100 * Fs Infusions-Rate (IU/h) = 1750 BW: Körpermasse (kg), Fd =1 für Diabetiker, Fd = 0 für Nicht-Diabetiker, Fs = 1 für Raucher, Fs = 0 für Nichtraucher Der Vergleich zeigt, dass die tatsächlich gegebenen Heparindosen hinsichtlich des Bolus größer sind als nach Ouseph/Ward berechnet, die kontinuierlichen Dosen sind jedoch kleiner, so dass die Gesamt-Heparindosen z.t. wesentlich geringer waren als theoretisch möglich. Da es keinerlei Hinweise auf Clotting-Ereignisse trotz stark reduzierter Heparindosen gegeben hat, kann davon ausgegangen werden, dass ein Einfluss des Citrasate- Dialysates auf das Gerinnungsverhalten während der Dialyse-Behandlungen vorhanden war, auch wenn sich dies nicht empfindlich in der ACT-Messung niedergeschlagen hat. Allerdings fehlt die Gegenprobe mit herkömmlichen Dialysat und reduzierter Heparin-Gabe. Die Möglichkeit, unter der Citrasate-Dialyse die Heparin-Dosis zu reduzieren, ohne dass sich dies auf das Clotting-Verhalten auswirkt, entspricht auch den Ergebnissen anderer Autoren (8: -30 %, 1: -55 %; 9: -33 %). Dabei wird auch eine Verbesserung der Effektivität, insbesondere hinsichtlich des Kt/V-Wertes und der Beta-2-MG- Elimination, konstatiert (2, 9). Dies konnte bei den eigenen Untersuchungen nicht bestätigt werden. Abb. 2 zeigt die spkt/v und eqkt/v (berechnet nach Daugirdas) für die einzelnen Studienphasen: spkt/v und eqkt/v; n=8 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 n.s. spkt/v eqkt/v baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 2: Kt/V-Werte in den einzelnen Studienphasen Der Umstieg von Standard-Konzentrat auf Citrasate ergab eine gleichbleibende Dialyse-Effektivität, während tendenziell bei Verringerung der Heparindosis ein geringer, aber nicht signifikanter Kt/V-Abfall zu beobachten ist. Diese Beobachtung entspricht auch den Ergebnissen von Ahmad et al. (8), während die Untersuchungen von Kossmann et al. (2) signifikante Kt/V-Verbesserungen unter Citrasate selbst bei Heparin-Reduktion ergeben haben. Allerdings sind diese Untersuchungen offensichtlich mit wiederverwendeten Dialysatoren durchgeführt worden, wobei die

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 11 Kt/V-Verbesserung umso kleiner war, je geringer die Wiederverwendungszahl war. Genauere Angaben hierzu fehlen jedoch. Beta-2-Mikroglobulin vor HD; n=8 30,00 25,00 n.s. 20,00 mg/l 15,00 10,00 5,00 0,00 baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb.3: Prädialytische Beta-2-Mikroglobulin-Konzentration in den einzelnen Studienphasen Auch die Beta-2-M-Werte deuten nicht auf eine Verbesserung der Behandlungseffektivität bei der Citrasate-Dialyse hin (s. Abb. 3). Dies steht ebenfalls im Gegensatz zu den Ergebnissen von Kossmann (2). Hinsichtlich der HCO 3 - -Konzentrationen vor und nach Dialyse ist festzustellen, dass beide Werte bei den Citrasate-Dialysen um 4 5 % kleiner waren (s. Abb. 4). Dies ist unkritisch und auf die geringfügig kleinere HCO 3 Konzentration bei Verwendung von Citrasate-Konzentrat zurückzuführen (32,6 gegenüber 33,0 mmol/l). 35,00 30,00 HCO 3 - vor und nach HD; n=8 25,00 mmol/l 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Bica prä Bica post baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 4: HCO 3 Konzentrationen vor und nach Dialyse Bezüglich der Elektrolyte Na + und K + vor und nach Dialyse waren keine auffälligen Unterschiede in den einzelnen Studienphasen zu beobachten (siehe Anhang Excel- Tabellen und Diagramme ).

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 12 3.2 Einfluss von Citrasate auf das inflammatorische und oxidative Potential Der für Dialysebehandlungen typische vorübergehende Abfall der Leukozytenzahlen nach Dialysebeginn ist mit einer Aktivierung von Complement-Faktoren wie C3a und C5a verbunden (z.b. 10). Wegen der Bedeutung des ica in der Kaskade der Complement-Aktivierung sollte eine Verringerung der ica-konzentration im Dialysator auch eine kleinere Complement-Aktivierung und damit auch einen geringeren Leukozytenabfall bewirken. Dies ist jedoch selbst unter den Bedingungen der Citrat- Antikoagulation nicht der Fall (11). Erst bei ica-konzentrationen < 0,2 mmol/l ist eine signifikant kleinere Complement-Aktivierung zu erwarten (12). Nach Opatrny (11) garantiert die bei Citrat-Antikoagulation übliche ica-konzentration um 0,4 mmol/l nicht eine Verringerung der Thrombogenität, der Komplement-Aktivierung und eine Verhinderung der Hämostase. Demzufolge ist bei der Citrasate-Dialyse noch kein merklicher Einfluss auf den Leukozyten-Abfall zu erwarten. Allerdings beobachtete Polakovic eine signifikante Verringerung des Leukozyten-Abfalls bei Verwendung von Citrasate (13). Bei den eigenen Beobachtungen deutet sich ein entsprechender Trend an, die Verminderung des Leukozyten-Abfalls ist jedoch nicht signifikant und nach Verkleinerung der Heparin-Dosis nicht mehr erkennbar (Abb. 5): 110,0 Leukozytenzahl prozentual versus Dialysezeit 100,0 90,0 n.s. % 80,0 70,0 60,0 baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin 50,0 0 50 100 150 200 250 min Abb. 5: Leukozytenabfall während der Dialyse-Behandlung Hinsichtlich Thrombozyten-Zahlen deutet sich ein Trend zu einer geringfügigen Erhöhung der Vordialyse-Zahlen im Verlaufe der Studiendauer an, für den es bisher keine plausible Erklärung gibt (s. Abb. 6):

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 13 Gpt/L 180,00 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Thrombozytenzahl während HD; n=8 baseline Citrasate p=0,04 50%Bolus 50%Heparin Thrombprä Thromb15min Thrombpost Abb. 6: Verlauf der Thrombozyten-Zahlen während der Dialyse und in den einzelnen Studien-Phasen Die Vordialyse-Werte der Hämoglobin-Konzentration fallen im Verlaufe der Studiendauer kontinuierlich und signifikant ab, obwohl die Wochendosen für das verwendete EPO-Präparat Aranesp (Amgen) und die Eisendosis Ferrlecit nahezu konstant blieben (Abb. 7). Als Ursache kommt in Betracht, dass alle 8 Patienten vor Beginn der Studie mit Hämodiafiltration (HDF) behandelt worden sind. HDF kann Toxine, welche die Erythropoiese hemmen, effektiver entfernen als die Hämodialyse. Ein deutlicher Zusammenhang zwischen Hämoglobin, Erythropoiese-stimulierenden Arzneimitteldosis (ESA), Dialysedosis und inflammatorischen Parametern wurde in zahlreichen Studien nachgewiesen (z.b. 14, 15). Es kann aber auch nicht ausgeschlossen werden, dass die Änderungen in der Hämoglobin-Konzentration in der Patienten-Gruppe auf die normale Fluktuation bei Patienten unter ESA-Therapie zurückzuführen ist. mmol/l 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 baseline Hämoglobin vor HD; n=8 Citrasate p=0,0008 50%Bolus p=0,007 50%Heparin 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 baseline Aranesp und Ferrlecit mittlere Wochendosis; n=8 Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Aranesp µg/woche Ferrlecit mg/woche Abb. 7: Hb-Konzentration sowie mittlere Erythropoeitin- und Eisen-Dosierung im Studienverlauf

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 14 Die Hämodiafiltration hat ebenso wie auf die Hb-Konzentration einen positiven Einfluss auf das Serum-Albumin (15). Insofern könnte nach der Studien-Vorphase mit HDF bei dem Übergang auf HD ein Absinken des Albumin-Spiegels ebenso wie beim Hämoglobin erwartet werden. Wie die Abb. 8 zeigt, ist dies nicht der Fall. Nach dem Übergang auf Citrasate-Behandlungen ist ein geringer, allerdings nicht signifkanter Anstieg des prädialytischen Serum-Albumins zu beobachten, gefolgt von etwas kleineren Werten bei Reduktion der Heparin-Dosen. g/l 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 baseline Albumin vor HD; n=8 n.s. Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 8: Serum-Albumin-Konzentrationen in den einzelnen Studienphasen Während der Hb-Level positiv mit dem Serum-Albumin korreliert, ist das C-reaktive Protein als empfindlicher Entzündungsparameter negativ mit Hb und Albumin verbunden (15). Die gemessenen hscrp-werte bleiben jedoch ebenso wie das Albumin über alle Studienphasen im Wesentlichen konstant. Zwar hat es eine vorübergehende starke Erhöhung in der Phase 3 (Heparin-Bolus -50%) gegeben, diese wurde aber durch einen entzündlichen Prozess bei einem Patienten (WH, siehe Excel-Tabellen) verursacht. Nach Herausnahme dieses Patienten aus der Auswertung konnte keine statistisch signifikante hscrp-änderung festgestellt werden (s. Abb. 9): mg/l hscrp vor HD; n=7 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 9: Verlauf des hochsensitiven C-reaktiven Proteins (hscrp)

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 15 Zu den wichtigsten Parametern der Kompatibilität und Mortalität von Dialysebehandlungen gehört die Myeloperoxidase (MPO) (16, 17, 18). MPO gehört zur Familie Heparin-bindender Proteine, ist Bestandteil von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen und auch entlang der Gefäßwände lokalisiert (z.b. 17). MPO wird als Marker für die Degranulation von neutrophilen Granulozyten und daher auch als Parameter für die Biokompatibilität der Dialyse und des oxidativen Stress betrachtet (16). Während der Hämodialyse steigt MPO um mehr als das Doppelte an (18). Durch regionale Citrat-Antikoagulation kann die MPO-Freisetzung jedoch weitgehend verhindert werden (18), was auf einen starken Einfluss des Heparins auf die Degranulation neutrophiler Granulozyten hindeutet. Nach der Übersicht von Hörl (17) induziert MPO vaskuläre Komplikationen über verschiedene Mechanismen: Hemmung der NO-abhängigen Vasorelaxation Produktion endogener NO-Inhibitoren Oxidation von LDL mit konsekutiver vermehrter Aufnahme in lokale Makrophagen Produktion reaktiver Species. Die Plasma-MPO-Spiegel sind sowohl in der Allgemeinbevölkerung als auch bei Hämodialysepatienten mit atherosklerotischen Gefäßkomplikationen und der Mortalität assoziiert (17). 1600 1400 MPO während HD; n=8 MPO prä MPO 15 min MPO post 1200 1000 p=0,010 p=0,015 ng/ml 800 600 400 200 0 baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 10: Myeloperoxidase (MPO) im Dialyseverlauf und in den einzelnen Studienphasen Die während der Citrasate-Studie durchgeführten MPO-Bestimmungen zeigen einen starken Anstieg des MPO zu Dialysebeginn (Abb. 10). Nach dem Übergang auf das Citrasate-Konzentrat zeigen sich keine signifikanten Änderungen, obwohl eine Tendenz zu einem etwas kleineren MPO-Anstieg nach 15 min besteht. Die Reduktion der Heparin-Dosen bewirkt dagegen einen signifikant geringeren MPO-Anstieg und tendenziell kleinere Vor- und Nachdialyse-Werte.

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 16 3.3 Einfluss von Citrasate auf Calcium- und Phosphat-Plasmaspiegel Die Chelatierung der Ca-Ionen durch das Citrat führt zu einem Abfall des ionisierten Ca (ica) im Plasma. Systemisch steht ica zwar nach Metabolisierung des Citrates wieder zur Verfügung, ein Teil der Citrat-Calcium-Komplexe wird jedoch durch die Dialyse entfernt, so dass sich insgesamt ein ica-abfall während der Dialysezeit ergibt: siehe Abb. 11. 1,20 Citrasate-Behandlung: Ca +2 vs. Zeit n = 8 1,15 1,10 mmol/l 1,05 1,00 0,95 0,90 0 50 100 150 200 250 300 Abb. 11: Zeitlicher Verlauf des ionisierten Caciums während der Dialyse Der Abfall des ica ist während der 1. Behandlungsstunde am stärksten und ändert sich danach nur noch geringfügig. Insgesamt ergibt sich bei Behandlungen mit Citrasate ein Abfall des ica um durchschnittlich 7 %. Dies ergibt sich auch aus der Abb. 12a, während Abb. 12b den Abfall des Gesamt-Ca zeigt. Dieser ist auch bei Behandlungen mit dem Standard-Konzentrat vorhanden, ist jedoch stärker ausgeprägt bei allen Citrasate-Behandlungen (Baseline: - 7%; Citrasate: -(9 11) %). min 1,40 1,20 1,00 Ca 2+ vor und nach HD; n=8 p=0,002 p=0,006 2,50 2,00 Gesamt Ca vor und nach HD; n=8 p=0,002 p=0,005 mmol/l 0,80 0,60 mmol/l 1,50 1,00 0,40 0,20 Ca2+ prä Ca2+post 0,50 gesamt Ca prä gesamt Ca post 0,00 0,00 baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 12 a, b: ica und Gesamt-Ca vor und nach Dialyse während der einzelnen Studien-Phasen

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 17 Der ica-abfall wurde in derselben Größenordnung auch bei anderen Citrasate- Anwendern festgestellt (9), zumindest wenn die Ca-Konzentration im Citrasate- Konzentrat bei 1,25 mmol/l lag. Bei Citrasate mit 1,5 mmol/l Ca wurde nur ein geringfügiger ica-abfall beobachtet (z.b. 7, 13). Der statistisch signifikante Abfall des prädialytischen Gesamt-Ca (Abb. 12b) gegenüber der Normaldialyse (baseline) führt zu Werten unterhalb des Normbereiches (2,2 2,65 mmol/l), so dass die Gefahr der Hypocalciämie besteht. Es ist daher zu empfehlen, weitere Citrasate-Behandlungen mit 1,5 mmol/l Dialysat-Ca vorzunehmen (s. auch 13). Die Gefahr einer Citrat-Akkumulation während der Dialysebehandlung besteht unter den gegebenen Bedingungen nicht. Die Citrat-Akkumulation kann durch die Ca-Lücke (Ca-GAP) ausgedrückt werden: Ca-GAP = (gesca post gesca prä) (ica post ica prä) (3) Bei schneller Citrat-Metabolisierung ist Ca-GAP < 0,2 (3). Die Abb. 13 zeigt, dass diese Bedingung bei den Citrasate-Dialysen in jedem Falle eingehalten wurde: Calcium GAP 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2-0,3-0,4-0,5-0,6 Baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 13: Calcium-Lücke in den einzelnen Studien-Phasen

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 18 mmol/l 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Phosphat vor und nach HD; n=8 n.s. Phosphat prä Phosphat post baseline Citrasate 50%Bolus 50%Heparin Abb. 14: Phosphat-Elimination in den einzelnen Studien-Phasen Die Phosphat-Elimination ist effektiv (Reduktion um ca. 70 %) und unterscheidet sich nicht bei den einzelnen Studien-Phasen (siehe Abb. 14). 4. ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassend können die Studien-Hypothesen folgendermaßen beantwortet werden: 1. Die Senkung der Heparin-Dosis sowohl um 50% des Bolus als auch zusätzlich der kontinuierlichen Dosis um 50 % war möglich bei Erhalt der Dialyse- Effektivität (Kt/V) und ohne Erhöhung von Clottingereignissen im extrakorporalen System. 2. Ein Einfluss des Citrasate auf inflammatorisch sensitive Parameter wie Beta-2- Mikroglobulin, hscrp und Serum-Albumin konnte nicht festgestellt werden. Dagegen reagierte MPO als Marker für Granulozyten-Degranulation und oxidativen Stress empfindlich auf die Reuzierung der Heparin-Dosis. 3. Der Phosphat-Plasmaspiegel wurde durch die Verwendung von Citrasate nicht beeinflusst, es fand aber eine Reduzierung des ionisierten Calciums und des Gesamt-Calciums z. T. unterhalb des Normbereiches statt, so dass eine Erhöhung des Dialysat-Calciums auf 1,5 mmol/l statt der verwendeten 1,25 mmol/l zu empfehlen ist. Die Ca-Lücke blieb hinreichend klein, so dass von einer schnellen Citrat-Metabolisierung ausgegangen werden kann.

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 19 5. LITERATURVERZEICHNIS 1. R.J. Kossmann, R. Callan, S. Ahmad: Fifty five percent heparin reduction is safe with citrate dialysate in chronic dialysis patients, ASN s 39 th Annual Renal Week meeting November 2006 2. R.J. Kossmann, A. Gonzales, R. Callan, S. Ahmad: Increased Efficiency of hemodialysis with Citrate Dialysate, A prospective Controlled study, JASN, Vol 4, number 9, 2009 3. L. Gabutti, B. Lucchini, C. Marone, L. Alberio, M. Burnier: Citrate vs. Acetate based Dialysate in Bicarbonate Haemodialysis: Consequences on Haemodynamics, Coagulation, Acis-base status and Electrolytes. BMC Nephrology 2009, vol 10,1471-2369 4. R. Ouseph, R.A. Ward: Anticoagulation for Intermittent Hemodialysis. Seminars in Dialysis, Vol. 13, No. 3, 181-187 5. W. van Beaumont: Evaluation of hemoconcentration from hematocrit measurements. Journal of Applied Physiology, Vol. 32, No. 5, May 1972, 712-713 6. T.F. Christiansen: Determination of Sodium and Potassium in Plasma. A Comparison between Direct Potentiometry and Flame Photometry. Radiometer Publication, ISSN 0906.0189, Denmark 1991 7. T. Leimbach, M. Jütterschenke, J. Czerny, S. Aign, J. Kron: Heparin-Einsparung durch Verwendung von citrathaltigem Dialysat? Poster, Kongress für Nephrologie, Berlin 10-13.9.2011 8. S. Ahmad, R. Callan, R.J. Kossmann: Heparin reduction with citrate dialysate. Presented at the European Renal Association European Dialysis and Transplant Association congress, Glasgow, Scotland, July 2006, and published in Nephrology Dialysis Transplantation, Volume 21 Supplement 4 2006 9. J.J. Sands, P. Kotanko, J.H. Segal, C-H. Ho, A. Young, M. Carter, O. Sergeyeva, L. Korth, E. Maunsell, Y. Zhu, M. Krishnan, J.A. Diaz-Buxo: Citrasate: Effects on Hemodialysis Adequacy and Heparin N Requirements. Poster and Abstract 10. P.R. Craddock, J. Fehr, A.P. Dalmasso, K.L. Brighan, H.S. Jacobs: Hemodialysis leukpenia. Pulmonary vascular leukostasis resulting from complement activation by dialyzer cellophane membranes. J. Clin. Invest 1977 May; 59(5): 879-888 11. K. Opatrný Jr, P. Richtrová, K. Polanská, J. Wirth, F. Sefrna, M. Brandl, D. Falkenhagen: Citrate Anticoagulation Control by Ionized Calcium levels Does Not Prevent Hemostasis and Complement Activation During Hemodialysis. Artificial Organs 31(2), 2007: 200-207 12. J. Hartmann, K. Strobl, U. Fichtinger, D. Falkenhagen: Citrate anticoagulation and activation of the complement system. Poster, ESAO 2006, Umea, Sweden 13. V. Polakovic, F. Lopot, F. Svara: Citrasate dialysis concentrate. General University Hospital and 1th Medical Faculty of the Charles University, Dept. of Medicine, Prague, Research Report 14. F. Locatelli, C. Manzoni, L. Del Vecchio, S. Di Filippo, G. Pontoriero, A. Cavalli: Management of Anemia by Convective Treatments. Contributions to Nephrology, Vol. 168, p. 162-172. H. Kawanishi, A.C. Yamashita, Eds. 15. R.E. Winkler, P. Ahrenholz, K. Freivogel: Influence of Online Hemodiafiltration on Hemoglobin Level, ESA-Dosage and Serum Albumin Retrospective, Multicenter Analysis. Progress in Hemodialysis From Emergent Biotechnology to Clinical Practice. A. Carpi, C. Donadio, G. Tramonti, Eds., published by InTech, ISBN 978-953-307-377-4, free online: www.intechopen.com 16. J. Borawski, B. Naumnik, A. Rydzewska-Rosolowska, M. Mysliwiec: Myeloperoxidas up-regulation during haemodialysis: is heparin the missing link? Nephrol. Dial. Transplant (April 2006) 21 (4): 1128-1129

Klinische Studie Citrasate bei HFD Rostock 20 17. W.H. Hörl: Die Antikoagulation mit Zitrat reduziert die Mortalität und verbessert die Erholung der Nierenfunktion bei Patienten mit akutem Nierenversagen. Nephro-News, Ausgabe 5/08 18. M. Gritters, M. P. C. Grooteman, M. Schoorl, M. Schoorl, P. C. M. Bartels, P. G. Scheffer, T. Teerlink, C. G. Schalkwijk, M. Spreeuwenberg M. J. Nubé: Citrate anticoagulation abolishes degranulation of polymorphonuclear cells and platelets and reduces oxidative stress during haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant (2006) 21: 153-159 6. ANHANG 1. Tabelle Patienten-Daten 2. Messdaten für die einzelnen Patienten (Excel-Dateien als beigelegte CD) 3. Auswertung: Excel-Daten und Diagramme 4. Studien-Protokoll Rostock, den 08.11.2011 Dr. Peter Ahrenholz BioArtProducts GmbH Dr. Roland E. Winkler, MBA Praxisverbund Dialyse u. Apherese Dr. Grit Waitz BioArtProducts GmbH