MALDI-TOF zur Erregerdifferenzierung MALDI Biotyper

MALDI-TOF zur Erregerdifferenzierung MALDI Biotyper

7870.62 8368.99 6410.90 5096.01 7157.65 7273.87 6315.49 5380.64 6254.64 Intens. [a.u.] 4364.06 Die MALDI TOF Differenzierung ist robust, beruht auf Messung hochprävalenter (ribosomaler) Proteine 5000 4000 3000 ribosomal Protein m/z RL36 4364,33 RS32 5095,82 RL34 5380,39 RL33meth. 6255,39 RL32 6315,19 RL30 6410,60 RL35 7157,74 RL29 7273,45 RL31 7871,06 RS21 8368,76 2000 1000 0 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 m/z E. coli

Identifikation

Konventionelle Testung: Wachstum in Gegenwart von Antibiotika Vorteile: Breites AB Spektrum K Korrelation von in vitro Testung und klinischem Ansprechen z.t. sehr gut automatisiert Nachteil: Zeitverzögerung etwa 1 Arbeitstag

MALDI-TOF MS zum Nachweis von Resistenzen gegen Antiinfektiva: Möglichkeiten und Grenzen Prof. Dr. med. Sören Schubert Max von Pettenkofer-Institut LMU München

MALDI-TOF MS 1. Direktnachweis von Resistenzfaktoren

MALDI-TOF MRSA Nachweis?

MRSA

MALDI TOF Nachweis von MRSA

Wolters et al., 2011

MALDI-TOF Detektion von Antibiotika-Resistenzen b-laktamasen (ESBL) Carbapenemasen (NDM-1, KPC, )

Problem

> 700 b-laktamase - Subtypen SHV-1 SHV-2 SHV-3 SHV-178 OXA-1 OXA-2 OXA-3 OXA-161 TEM-1 TEM-2 TEM-3 TEM-213 CTX-M-1 CTX-M-2 CTX-M-3 CTX-M-75 CMY-1 CMY-2 CMY-3 CMY-23 IMP-1 IMP-2 IMP-3 IMP-23

Fazit: Direktnachweis von Resistenzfaktoren Nachweis klonaler Gruppen! Nachweis MRSA-assoziierter Peptide! Nicht verlässliche Resistenz-Identifikation b-laktamasen, PBP2a, Van A / Van B

MALDI-TOF MS 1. Direktnachweis von Resistenzfaktoren (z.b. PBP2a) 2. b-laktamase Aktivitätstest (MS-BL)

b-laktamase Aktivität +H 2 O + 18 Da - 44 Da A B C

Ampicillin + ESBL-E. coli Ampicillin + b-lact.-neg. E. coli C A B Sparbier et al., 2012

396.1 Intens. [a.u.] 414.1 456.1 460.9 Intens. [a.u.] 369.9 414.0 445.0 396.0 414.1 Intens. [a.u.] 456.1 Cefotaxim (CTX) 4 x10 5 4 3 2 1 A CTX + ESBL- neg. E. coli 0 x10 4 0.8 0.6 0.4 0.2 B CTX + ESBL-pos. E. coli 0.0 x10 4 1.5 1.0 0.5 0.0 360 380 400 420 440 460 480 m/z C CTX / CLAV + ESBL-pos. E. coli Zimmermann et al. J. Clin. Microbiol. 2011, 49(9):3321 Sparbier et al. J Clin Microbiol. 2012 Mar;50(3):927-37

CAZ 0.5 mg/ml CAZ in 10 mm NH 4 -hydrogen carbonate 2 h incubation 15 µl sup plus 5 µl 0.5 ng/µl reserpine 1.5 µl spotted 1.5 1.0 b-laktamase- Aktivität 0.5 0.0-0.5 CAZ_09 2012-04-17 CAZ_16358 2012-04-17 CAZ_20 2012-04-17 CAZ_DH5a 2012-04-17 CAZ_K1 2012-04-17 logrq Keine Spaltung Spontanhydrolyse

Identifikation b-laktamase Aktivität

4 MIC>256 5 MIC 4 9 MIC 8 10 MIC >256 11 MIC >256 16 MIC >256 18 MIC >256 20 MIC 3 21 MIC 4 22 MIC 3 25 MIC 4 30 MIC 6 31 MIC 4 37 MIC 6 39 MIC 2 40 MIC >256 41 MIC 3 42 MIC >256 45 MIC >256 46 MIC 4 47 MIC>256 51 MIC>256 52 MIC 4 54 MIC >256 55 MIC >256 56 MIC >256 57 MIC >256 60 MIC >256 61 MIC >256 62 MIC 4 66 MIC >256 67 MIC >256 69 MIC 4 72 MIC >256 73 MIC >256 74 MIC >256 76 MIC >256 81 MIC >256 82 MIC 6 84 MIC >256 85 MIC 3 86 MIC >256 87 MIC 8 90 MIC 2 91 MIC >256 92 MIC >256/4 93 MIC 1,5 94 MIC >256 E. coli ATCC 25922 logrq E. coli direkt aus positiven Blutkulturen Ampicillin 1 Ampicillin MIC >8 0.5 0 Ampicillin MIC 8-0.5 Jung et al., 2014

Fazit 2: MALDI-TOF b-laktamase Aktivitätstest Schneller Test 1,5 3 h Automatische Analyse Direkt aus positiven Blutkulturen Beschränkt auf bestimmte Antibiotika-Resistenzen b-laktamasen (z.b. ESBL, Carbapenemasen)

MALDI-TOF MS 1. Direktnachweis von Resistenzfaktoren (z.b. PBP2a) 2. MALDI-TOF b-laktamase Aktivitätstest (MS-BL) 3. Antibiotika Resistenzbestimmung - phänotypisch

Phänotypischer Resistenztest (MS-RESIST) 13 C 6 15 N 2 -L-Lysin 8Da 8Da Susceptible: No integration Für alle kultivierbaren Bakterien einsetzbar Resistant: Integration

Antibiotika-Resistenztest mit stabilen Isotopen normal Lys Control 1 heavy Lys + antibiotic Susceptible Resistant heavy Lys Control 2 October 21, 2014 26

S. aureus Massenspektrum Gel-Ansicht MSSA OXA sensibler Stamm MRSA OXA - resistenter Stamm normal normal heavy + Oxa heavy + Oxa heavy heavy October 21, 2014 27

MRSA P. aeruginosa

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MBT MS-RESIST / P. aeruginosa (Tobramycin- susceptible) 6000 5000 5213.353 5739.928 1025_N 0:B8 MS, BaselineSubtracted, Smoothed 4000 3000 2000 5116.874 normal 1000 0 6000 5212.952 1020_H_60 0:A10 MS, BaselineSubtracted, Smoothed 5000 4000 3000 2000 1000 5116.441 5739.242 heavy + TOB 0 1020_H 0:A7 MS, BaselineSubtracted, Smoothed 6000 4000 5021.891 5213.753 5117.392 5244.916 5740.349 5795.447 heavy 2000 0 5000 5100 5200 5300 5400 5500 5600 5700 5800 Jung et al., EJCMID 2013 October 21, 2014 m/z 29

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MS-RESIST/ P. aeruginosa (Tobramycin-resistant) 5000 4000 6050.312 4025_N 0:G10 MS, BaselineSubtracted, Smoothed 6679.371 3000 2000 5740.567 6351.691 normal 1000 0 6000 6113.220 6630.988 4020_H_60 0:G1 MS, BaselineSubtracted, Smoothed 5000 4000 3000 2000 1000 6049.902 5739.994 6113.019 5796.772 6351.301 6390.383 6678.694 6717.281 heavy + TOB 0 x10 4 1.25 6050.252 4020_H 0:F11 MS, BaselineSubtracted, Smoothed 6679.317 1.00 0.75 5740.398 6113.323 6351.650 6718.107 6390.951 heavy 0.50 5796.203 0.25 0.00 5600 5800 6000 6200 6400 6600 m/z Jung et al., EJCMID 2013 October 21, 2014 30

Ciprofloxacin Pseudomonas aeruginosa Meropenem Tobramycin Jung et al., 2014

3. Antibiotika-Resistenbestimmung mit phänotypischen MALDI-TOF-Tests Phenotypischer Test ohne Isotope!

MS ASTRA MALDI-TOF MS zur Wachstumsmessung (quantitativ) BHI McF 0.5 Incubation 37 C Species dependent time Antibiotic Cell lysis Lysis reagent with internal standard Target preparation Acquisition of MS profile spectra

spectra view Klebsiella pneumoniae Standard [M+ H] 2+ Standard [M+ H] 2+ Standard [M+ H] + Standard [M+ H] + BHI + Meropenem 8 µg/ml sensibel Nur BHI resistent Lange et al. J Clin Microbiol. 2014

Zusammenfassung (1) Direktnachweis von Resistenzfaktoren Nachweis klonaler Gruppen Kann den Nachweis klonal verbreiteter Resistenzfaktoren ermöglichen Zweifelhaft! (bisher) kein Direktnachweis von b-laktamasen, PBP2a, Van A/B,

Zusammenfassung (2) b-laktamase Aktivitätstest (MS-BL) Schneller Test 1.5 3 h Automatische Analyse Direkt von positiven Blutkulturen anwendbar Beschränkt auf bestimmte Resistenzen b-laktamasen Alle b-laktamasen nachweisbar? Einsatz?

Zusammenfassung (3) Phänotypischer Resistenztest (MS RESIST / MS ASTRA) Schneller Test 2 3 h Universell Automatische Analyse MS RESIST: Stabile Isotope: Komplexer Workflow Kits und Karten wären notwendig MS ASTRA: Einfache Handhabung Alle bug-drug Kombinationen analysierbar? Einsatz: Wann?

Bruker Daltonik Katrin Sparbier Markus Kostrzewa Christoph Lange Max von Pettenkofer-Institut Jette Jung Theresa Eberl Christina Popp Julia Walker Christina Hamacher Lukas Schmidt ForBIMed FöFoLe