Nachweis der Effekte von Endokrinwirksamen Stoffen Leane Lehmann Lehrstuhl für Lebensmittelchemie Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie Universität Würzburg Berlin 19.10.2012
Endokrine Effekte 2003 2004 2005 2006 2009 2010 2012 Klassisches endokrines System (systemisch) Zelle A ormon Blut ormon Zelle B Parakrine Zelle A ormon Zelle B Autokrine Zelle A ormon Zelle A Neurotransmitter Zelle A AP Zelle A ormon Zelle B
ormone des klassischen endokrinen Systems 2003 2004 2005 2006 2009 2010 2012 ypothalamus-regulierende ormone ypophysenhormone Pankreashormone Gastrointestinale ormone Peptidhormone Calciumregulierende ormone Nebennierencorticoide Schildrüsenhormone Andogene Steroidhormone Estogene Progestine
Nachweis der Wechselwirkung 5 Proliferation/ Differenzierung 3 Co-Aktivator-/Repressorbindung Phänotyp 1 Rezeptorbindung Co-A CBP/p300 P Proteine R2 R1 mrna 2 DNA-Bindung RE TATA 4 Zielgen Reportergenexpression
Rezeptorbindungstests Prinzip/Varianten Radioaktiv markierter Ligand Fluoreszenzmarkierter Ligand Unmarkierter Ligand R R Einflussfaktoren Temperatur Zeit E2, 25, 0 C E1, 0 C E1, 25 C Rezeptor EPA-Guidelines für ER und AR The Journal of Biological Chemistry 258, 8118-8122, 1983
Rezeptorbindungstests Prinzip/Varianten Radioaktiv markierter Ligand Fluoreszenzmarkierter Ligand Unmarkierter Ligand R R Einflussfaktoren Temperatur Zeit E2, 25, 0 C E1, 0 C E1, 25 C Rezeptor Toxicology Letters, 158, 72-86, 2005
Bindung Rezeptor-Ligand DNA Prinzip/Varianten Plasmonresonanz R1 R2 R1 R2 ELISA o.ä. Electromobility shift RE RE Biochemistry 43, 2569-2577, 2004
Bindung Co-Aktivator/-repressor Prinzip/Varianten Co-A FRET Markierter Rezeptor +Markiertes Peptid R Co-A R Molecular Endocrinology,17, 346-355, 2003
Reportergenassays: Testsysteme Transgen Natürlich Einzeller Säuger, transient Säuger, stabil Säuger efe h,r,merα und h,r,merβ Ishikawa herα und herβ ela9903 (herα), MDA-kb2 (AR, GR) Ishikawa ER+ MCF-7 EPA-/OECD- Guidelines Einflussfaktoren Transgen Sub-Zelllinie Kulturbedingungen Art des Konstrukts Effizienz Stabilität Rezeptoren Co-Aktivatoren FKS,... Mycoplasmen Environmental ealth Perspectives 103, 844-850, 1995
Reportergenassays: Endpunkt mrna Prinzip/Varianten qrt-pcr Zieltranskript/PRT in MCF-7 BUS Zellen K (0,1% DMSO) 0,1 µm GEN 1 µm GEN Einflussfaktoren RNA-Qualität Quantifizierung ousekeeping-gen qpcr-methode Katja Schmalbach, unpublizierte Daten Methode: TaqMan TDLA 48 ausgewählte Transkripte Auswertung: Berechnung N0 ausgehend von NCT Darstellung: 3 unabhängige Zellkulturexperimente
Reportergenassays: Endpunkt Protein Prinzip/Varianten Proteinaktivität Proteinmenge E2 Plateau 1-10 nm E2 DAI Einflussfaktoren siehe Testsysteme Variabilität durch Sublinien methodisch ähnlich mrna EC50 Benchmark 4-O-E2 EQU Toxicology Letters, 158, 72-86, 2005
Veränderter Phänotyp Prinzip/Varianten Zellzahl elektronisch durchflusszytometrisch photometrisch Zellzyklusverteilung Kontaktinhibition Plateau 100 pm E2 Einflussfaktoren Zellpopulation Kulturbedingungen 1 nm E2 Carcinogenesis, 29, 363-370, 2008
Veränderter Phänotyp Prinzip/Varianten Zellzahl elektronisch durchflusszytometrisch photometrisch Zellzyklusverteilung Kontaktinhibition DMSO Einflussfaktoren Zellpopulation Kulturbedingungen 1 nm E2 Methods in Molecular Biololgy, 176, 341-351, 2001
Veränderter Phänotyp Prinzip/Varianten Zellzahl elektronisch durchflusszytometrisch photometrisch Zellzyklusverteilung Kontaktinhibition DMSO Plateau 100 pm E2 Einflussfaktoren Zellpopulation Kulturbedingungen 1 nm E2 Methods in Molecular Biololgy, 176, 341-351, 2001
Achtung Kinetik! andere Zelle p Bindeprotein Blut K Zielzelle K K Phänotyp R2 Co-A CBP/p300 P R1 Proteine mrna Blut RE TATA Zielgen
Achtung Kinetik! Beispiel Estrogene Blut Nebennieren EPA-Guidelines für Test Steroidogenese DEA SULT 3β-SD SBG DEA E2 S E2 Sulfatase DEA 3β-SD Ovarien ANDR 17β-SD E2 E1 SULT Brustdrüsenepithel Sulfatase E2 diverse 17β-SD E2-M EPA-Guidelines für Test Aromataseaktivität E1 E1 S ANDR ANDR CYP19A1 Brustdrüsenstroma E1
JSBMB 69, 343-357, 1999 Katja Schmalbach unveröffentlichte Ergebnisse UNI Achtung Kinetik! Beispiel Estrogene Proteinbindung Rezeptorbindungsassay E2-Kinetik in MCF-7 Zellen Steroidsulfatase-Transkript/PRT in MCF-7 BUS Zellen K (0,1% DMSO) E2 GEN GEN 0,1 µm GEN 1 µm E2 GEN Details Folie 10
Beispiel E2-Kinetik in MCF-7 Zellen K GEN 0,1 µm GEN 1 µm z.t. ohne Beteiligung des ER unveröffentlichte Ergebnisse Details Folie 10
Achtung Crosstalk! Aktivierung anderer Signalwege beeinflusst... Genexpression/Stabilität von R, CoA/R... Phosphorylierung Partner Co-A CBP/p300 P P R2 R1 Phänotyp Proteine mrna RE TATA Zielgen
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