1 Zuwendungsempfänger: Georg-August-Universität Göttingen Department für Nutzpflanzenwissenschaften Abt. für Pflanzenpathologie und Pflanzenschutz Grisebachstraße 6 37077 Göttingen Forschungsauftrag: 02 HS 023 Entwicklung einer Computer gestützten Entscheidungshilfe zur Minimierung des Befallsrisikos durch Ährenfusariosen und der Toxinbelastung sowie zur Optimierung der Bekämpfung Abschlußbericht Projektlaufzeit 15.05.2003 14.05.2006 Bearbeitung: Projektleitung: C. Braun (ZEPP) Dr. C. Brandfaß (AG Prof. Karlovsky) Dr. J. Weinert Prof. Dr. A. von Tiedemann Kooperationspartner: Zentralstelle der Pflanzenschutzdienste für Entscheidungshilfen und Programme (ZEPP), Bad Kreuznach Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL), Braunschweig DLZ Main-Nahe Hunsrück, Rheinland-Pfalz
2 Inhaltsverzeichnis 1 ZIELE UND AUFGABENSTELLUNG DES PROJEKTES... 3 1.1 PLANUNG UND ABLAUF DES PROJEKTES... 3 1.2 WISSENSCHAFTLICHE UND TECHNISCHE AUSGANGSSITUATION... 4 2 MATERIAL UND METHODEN... 7 2.1 VERSUCHSANLAGEN... 7 2.2 PROBENAHME UND PROBENAUFBEREITUNG... 7 2.3 INOKULATIONEN... 8 2.4 BESTIMMUNG DER FUSARIUMMENGE... 8 2.5 QUANTIFIZIERUNG VON DEOXYNIVALENOL (DON)... 8 2.6 DNA-EXTRAKTION... 8 2.7 REAL-TIME PCR FÜR DIE DIAGNOSE UND QUANTIFIZIERUNG DER FUSARIUMARTEN... 10 2.7.1 Qualitative Duplex-PCR... 11 2.7.2 Quantitative PCR... 12 2.8 DATENVERARBEITUNG... 12 3 ERGEBNISSE... 13 3.1 AUSFÜHRLICHE DARSTELLUNG DER WICHTIGSTEN ERGEBNISSE... 13 3.1.1 Optimierung der PCR Nachweismethoden für F. graminearum und F. culmorum... 13 3.1.1.1 Optimierung der DNA-Extraktion... 13 3.1.1.2 Optimierung der Real-time PCR für die Diagnose und Quantifizierung... 13 3.1.2 Untersuchungen zu epidemiologischen Grundlagen... 14 3.1.2.1 Identifizierung der Fusarium-Arten in FHB-Ähren... 14 3.1.2.2 Nord-Süd-Verteilung von Fusarium graminearum und Fusarium culmorum... 16 3.1.2.3 PCR-Analyse von Kornproben der Weizenernten... 16 3.1.2.4 Homogenität und Schlagspezifität von FHB-Infektionen... 19 3.1.2.5 Feldversuche mit spezifischem Boden-Inokulum... 20 3.1.3 Felderhebungen und Feldversuche zur Bedeutung acker- und pflanzenbaulicher Faktoren... 22 3.1.3.1 Einfluss von Vorfrucht und Bodenbearbeitung auf den DON-Gehalt im Korn... 22 3.1.3.2 PCR-Analysen zum Einfluss von Vorfrucht und Bodenbearbeitung... 27 3.1.3.3 Analyse von Maisstoppeln und anderen Vorfruchtrückständen... 28 3.1.3.4 Inokulationen mit Maisstoppeln unterschiedlicher Sorten und Herkünfte... 32 3.1.3.5 Untersuchungen zum Einfluss von Bodenkontakt und Dichte von Maisstoppeln... 36 3.1.3.6 Systemversuche zum Einfluss der Sortenresistenz und der Bodenbearbeitung... 38 3.1.3.7 Untersuchungen zum Einfluss der Sortenresistenz des Winterweizens... 42 3.1.4 Labor- und Feldversuche zum Einfluss biologischer und klimatischer Faktoren... 44 3.1.4.1 Auswirkungen von Ernteverzögerungen...44 3.1.4.2 Feldversuche mit zusätzlicher Beregnung... 45 3.1.4.3 Analyse des Sporenfluges mit Hilfe von Sporenfallen... 46 3.1.4.4 Einfluss von Witterungsbedingungen auf die Perithezienbildung... 48 3.1.4.5 Untersuchungen zur Freisetzung und Keimung von Ascosporen... 51 3.1.4.6 Einfluss von Temperatur und Feuchte auf die Infektion... 51 3.1.4.7 Untersuchungen zur stadienabhängigen Anfälligkeit... 53 3.1.5 Entwicklung des Computer basierten Prognose-Modells FUS-OPT... 54 3.1.5.1 Aufbau und Struktur des Modells... 55 3.1.5.2 Funktionsweise des Modells... 57 3.1.5.3 Validierung... 62 3.2 VORAUSSICHTLICHER NUTZEN UND VERWERTBARKEIT DER ERGEBNISSE... 63 4 ZUSAMMENFASSUNG... 63 5 GEGENÜBERSTELLUNG DER URSPRÜNGLICH GEPLANTEN ZU DEN TATSÄCHLICH ERREICHTEN ZIELEN... 66 EINFLUSS ACKERBAULICHER FAKTOREN UND NATÜRLICHER UMWELTBEDINGUNGEN.. 67 6 LITERATUR... 68 6.1 PROJEKTBEZOGENE PUBLIKATIONEN... 68 6.2 ALLGEMEINES LITERATURVERZEICHNIS... 70
3 1 Ziele und Aufgabenstellung des Projektes 1.1 Planung und Ablauf des Projektes Das übergeordnete Ziel des Projektes war die Entwicklung von computergestützten Entscheidungshilfen zur Minimierung des Toxinrisikos im Getreideanbau, speziell im Weizen. Über das zu entwickelnde Modell sollten Fungizidanwendungen gesteuert und Risikoregionen bzw. flächen ausgewiesen werden können. In einem über kombinierte Module aufgebauten System sollten dazu pflanzenbauliche Risikofaktoren bewertet und verknüpft werden sowie biologische Prozesse zur Sporulation und Infektion in Abhängigkeit von der Witterung simuliert werden. Durch die Projektergebnisse sollten darüber hinaus im Sinn der Prävention nutzbare Risikofaktoren und Anbaualternativen zur Absenkung des Toxinrisikos deutlich werden. Als Datengrundlage zur Ausgestaltung der Module wurden Labor- und Feldversuche zum Einfluss der Temperatur sowie der Befeuchtung, des Bodenkontaktes, der Menge und Art des Inokulums auf die Sporenbildung sowie die Ähren- und Korninfektionen durchgeführt. Hierbei wurde insbesondere auch die Wirkung von unterschiedlichem Vorbefall von Maisstoppeln durch Sorten und Standortunterschiede als potentielle, zusätzliche Möglichkeit von Präventionsmaßnahmen berücksichtigt. Dazu wurden Maisstoppeln aus Sortenversuchen untersucht und in Inokulationsversuchen an mehreren Standorten in Weizenflächen eingesetzt. Die Auswirkungen von Sortenresistenzen bei Mais und Weizen gegenüber Fusarium sowie mehrjährige pflanzenbauliche Effekte wurden in Kooperation mit der FAL Braunschweig in einem kombinierten Sorten-Fruchtfolge-Bodenbearbeitungsversuch beobachtet und ausgewertet. In gezielten, bundesweiten Erhebungen zum Auftreten von Ährenfusariosen bzw. den damit verbundenen Kornbelastungen zur Ernte unter unterschiedlichen pflanzenbaulichen Faktoren und Witterungsbedingungen wurden in Kooperation mit den amtlichen Pflanzenschutzdiensten der Länder durchgeführt. Dazu werden regional verteilte Feldproben, die aus unterschiedlichen Anbausystemen stammen, auf ihren Fusarium- und Toxingehalt untersucht und zu den aufgenommenen Felddaten in Beziehung gesetzt. Für den Weizen wurden quantitative Zusammenhänge zwischen der Resistenzeinstufung durch das Bundessortenamt und Befallsunterschieden im Erntegut ermittelt. Hierbei wurde eine direkte Zusammenarbeit mit der Biologischen Bundesanstalt in Braunschweig als amtlicher Institution für die Resistenzprüfungen angestrebt. Für Analysen zur ursächlichen Beteiligung verschiedener Fusarium-Arten am Infektionsgeschehen sollten qualitative und quantitative PCR-Methoden zum speziellen Nachweis der DON bildenden Fusarium-Arten F. graminearum und F. culmorum entwickelt werden. Über diese Untersuchungen sollten epidemiologische Grundlagen zur Modellierung erstellt und gesichert werden. Ein Basismodell zur Prognose der zu erwartenden Toxinbelastung sollte anhand von Literatur- und Basisdaten sowie Versuchsergebnissen aufgebaut und nachfolgend erweitert und angepasst werden.
4 1.2 Wissenschaftliche und technische Ausgangssituation Die Infektion der Getreideähren durch Fusarium-Arten kann neben Ertragsausfällen zu einer erheblichen Verminderung der Erntegutqualität führen; der Produktion und Anreicherung von Mykotoxinen im Korn kommt hier aufgrund der damit einhergehenden gesundheitlichen Gefährdung die größte Bedeutung zu. Am häufigsten und in den mit Abstand höchsten Konzentrationen wird das Mykotoxin Deoxynivalenol bei den Untersuchungen von Kornproben aller Regionen festgestellt (2, 26). Dieses Toxin wird nur von den beiden aggressivsten Fusarium-Arten Fusarium culmorum und Fusarium graminearum produziert (29). Allein diese Arten sind nach eigenen Untersuchungen dazu fähig, sich nach einer Blüteninfektion sekundär in der Ähre auszubreiten und in viele Körner unter der kontinuierlichen Produktion des Toxins einzuwachsen (23). Das sekundäre Wachstum in der Ähre ist unter den Getreidearten bei Gerste am geringsten und bei Weizen am stärksten ausgeprägt. Dieser Rangfolge entsprechen auch die deutlichen Unterschiede im mittleren Fusarium- und Toxingehalt in den Kornproben dieser Getreidearten (7). Stark kontaminierte Weizenproben lassen sich immer wieder allein auf eine starke Infektion der Ähren und ein damit verbundenes, massives Durchwachsen der Körner durch Fusarium graminearum zurückführen (3, 21, 22). Die Ursache dafür liegt in dem epidemiologischen Unterschied, dass diese Fusariumart im Gegensatz zu F. culmorum in ihrer Hauptfruchtform Gibberella zeae luftverbreitete Ascosporen in speziellen Fruchtkörpern (Perithezien) ausbildet. Dadurch wird eine direkte Infektion der Getreideähren durch Pilzsporen ermöglicht, die auf befallenen, organischen Vorfruchtresten gebildet werden (12, 21). Dies ist von Bedeutung, da die Blätter adulter Weizenpflanzen nicht vor der Abreife durch Fusarium- Arten infiziert werden können. Versuche mit zusätzlich ausgestreutem Bodeninokulum in Weizenflächen haben gezeigt, dass die Verbreitung der Ascosporen jedoch begrenzt ist, so dass die Fusariumproblematik stets schlagbezogen bleibt. Die Ausbildung und Reifung der Perithezien als Grundlage einer Infektion zur Getreideblüte ist an hohe Temperaturen vor der Getreideblüte gebunden. In Vorversuchen wurden bei 16 C auch nach 8 Wochen keine Perithezien gebildet, während bei Temperaturen über 20 C mit höherer Temperatur schneller und mehr Fruchtkörper mit Ascosporen entstanden. Wenig ist in diesem Zusammenhang darüber bekannt, in welcher Weise sich im Tag-Nacht-Rhythmus wechselnde Temperaturen sowie kurzzeitig hohe Temperaturen auswirken. Ein starker Ährenbefall durch Fusarium ist häufig mit dem Auftreten von Gewitterlagen in der Vorblütezeit verbunden. Solche Wetterlagen verbinden die notwendig hohen Temperaturen mit gleichzeitigen Niederschlägen (4), die für eine längerfristige Durchfeuchtung des organischen Inokulums an der Bodenoberfläche sorgen. Dies ist eine grundsätzliche Voraussetzung für das Pilzwachstum und die damit verbundene Fruchtkörperbildung (23). Trockenperioden in der Vorblütezeit senken dagegen die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Ährenfusariosen mit zunehmender Dauer deutlich. Unklar bleibt bisher, welche Bedingungen für die Ausschüttung der Ascosporen und den Infektionsvorgang darüber hinaus nötig sind (6). Der Einfluss der Witterung in der Vorblütezeit des Getreides auf das Ausmaß der Ährenfusariosen ist insgesamt bedeutend (4). In regional gestreuten Verbundversuchen mit einheitlichem Bodeninokulum variierte der Kornbefall um einen Faktor größer 100, wobei im Extrem überhaupt keine Infektionen trotz massiven Bodeninokulums vorkamen (11).
5 Wesentliche Einflussfaktoren auf den Ährenbefall durch F. graminearum Witterung Vorfrucht -Art -Vorbefall -Temperatur -Niederschlag Infektionsdruck Bodenbearbeitung Inokulum -Menge Ährenbefall Kornbefall -wendend -nicht-wendend -ohne Getreide-Art Sortenresistenz Anfälligkeit der Pflanze Entwicklungsstadium Fungizidwirkung -Wirkstoff -Menge -Termin Vor Aussaat Aussaat Blüte Ernte Die Vorfrucht bestimmt in Kombination mit der Form der Bodenbearbeitung die Art und Menge der organischen Vorfruchtreste auf der Bodenoberfläche, die die Quelle einer möglichen Sporenbildung darstellen (1). Die wichtigste Rolle spielt hier der Mais als Vorfrucht. Durch den intensiven Vorbefall durch Fusarien im Stängelbereich treten Ährenfusariosen nach Mais ohne wendende Bodenbearbeitung besonders häufig und intensiv auf (1). Nach anderen Vorfrüchten kommen Befallsereignisse deutlich seltener und auf einem niedrigeren maximalen Befallsniveau vor. In Inokulum-Steigerungsversuchen mit dem Zentrum für Landwirtschaft und Umwelt der Univ. Göttingen stieg der Anteil infizierter Ähren wie auch die Fusarium-Menge im Weizenkorn mit der Anzahl der auf der Oberfläche verbliebenen Maisstoppeln deutlich an (19). Jedoch sind Weizenfelder nach Maisvorfrucht nicht zwangsläufig stark oder gleich stark befallen. Neben dem zentralen Faktor Witterung in der Vorblütezeit könnte dies zusätzlich auch auf einen unterschiedlichen Befall der Maisstoppeln durch Fusarium-Arten zurückzuführen sein. Bei gemeinsamen Untersuchungen von Silomais und Maisstoppeln zwischen Ernte und Frühjahr von Feldern im Amtsbereich der LWK Weser-Ems und der Sächsischen Landesanstalt für Landwirtschaft wurden über ELISA sehr unterschiedliche Fusarium-Mengen quantifiziert. Der Anteil von F. graminearum konnte mit dieser Methode jedoch nicht getrennt bestimmt werden. In einer mehrjährigen Kooperation mit der FH Soest und der KWS Saat AG wurden über ELISA bei Mais deutliche Sortenunterschiede hinsichtlich des Fusarium-Gehaltes im unteren Stängelbereich festgestellt. Deutliche Sortenunterschiede traten auch bei Toxinanalysen von Silomaissorten bei Untersuchungen der FAL-Braunschweig auf (20); die unterschiedlichen DON- und Zearalenon-Gehalte weisen hier auf einen unterschiedlich starken Befall durch die Pathogene F. graminearum und F. culmorum hin. Der Anbau von im Stängelbereich gering anfälligen Maissorten könnte ein neuer Ansatz und wichtiger Beitrag dazu sein, das Inokulum-Potenzial für die Nachfrucht Weizen unabhängig von anderen Maßnahmen gering zu halten und über diesen Weg das Toxinrisiko deutlich zu vermindern. Hierdurch könnte auch der Widerspruch zwischen der
6 Anwendung boden- und umweltschonender, reduzierter Bodenbearbeitungsverfahren und einem dadurch erhöhten Fusarium- und Toxinrisiko aufgehoben werden. Bei vergleichbarem Infektionsdruck bestimmt die Anfälligkeit der Pflanze und damit das Resistenzniveau der angebauten Getreidesorte das Ausmaß des Ähren- und Kornbefalls (9, 10, 25). Neue Sorten werden regelmäßig hinsichtlich ihrer Anfälligkeit gegen Ährenfusariosen durch das Bundessortenamt in Zusammenarbeit mit der Biologischen Bundesanstalt geprüft und bewertet (9, 24). Nach eigenen Untersuchungen anhand von zeitlich gestaffelten Ährenproben ändert sich der mittlere Kornbefall in der letzten Phase vor der Druschreife besonders stark. Bedingungen die zu einer späten Kornreife mit einer entsprechenden Absenkung des Wassergehaltes führen, erhöhen damit den Fusarium- und Toxingehalt im Erntegut. Lager verstärkt diese Tendenz und verursacht darüber hinaus sekundäre Abreifeinfektionen. Weitere, den Fusarium Befall beeinflussende Faktoren, deren Bedeutung allerdings deutlich geringer eingeschätzt wird, sind die Bestandesdichte, die Stickstoffdüngung und der Einsatz von Wachstumsregulatoren und Fungiziden zur Bekämpfung von Blattkrankheiten. Zur Bekämpfung von Ährenfusariosen zugelassene Azol-Fungizide können den Ährenbefall um ca. 75% und den Kornbefall um 50-60% vermindern, sofern sie zeitlich infektionsnah während der Weizenblüte eingesetzt werden (5, 8). Da sowohl eine protektive als auch kurative Wirkung nur über wenige Tage vorliegt, ist der exakte Einsatztermin nur im Zeitfenster Getreideblüte variabel (11). Schwieriger ist die Entscheidung zu fällen, wo überhaupt bekämpfungswürdiger Befall vorliegt, da die Ähreninfektionen durch F. graminearum lange latent bleiben. Zur Aufklärung des Einflusses pflanzenbaulicher Faktoren und der Witterung auf das Auftreten von Getreidefusariosen ist es notwendig, den vollständigen Lebenszyklus der relevanten Fusarium-Arten im Feld zu verfolgen. Dazu zählt insbesondere die Erfassung der Pilzbiomasse in Pflanzenrückständen. Die dafür benötigten diagnostischen Methoden müssen die pilzliche Biomasse artspezifisch quantifizieren. Das Auslegen von oberflächlich sterilisierten Körnern auf semiselektive Medien, das bisher für die Bestimmung von Fusarien im Pflanzenmaterial am häufigsten angewendet wurde, liefert keine quantitativen Daten. Mit Hilfe von ELISA lässt sich nur die gattungsspezifische Pilzbiomasse quantifizieren, da verschiedene Fusarium-Arten nicht voneinander differenziert werden können. Die Ergebnisse der Untersuchung von Feldproben mit ELISA lassen keine artspezifischen Interpretationen zu, die verschiedenen Fusarium-Arten besitzen jedoch eine sehr unterschiedliche epidemiologische und toxikologische Bedeutung. Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ermöglicht demgegenüber einen artspezifischen Nachweis von Fusarium-Arten in komplexer Matrix. Aufgrund des exponentiellen Charakters der PCR ist die klassische PCR mit Endpunktbestimmung für Quantifizierungen prinzipiell ungeeignet. Deshalb brachten alle Bemühungen, die Endpunktbestimmung für die Quantifizierung von Fusarium-Arten zu adaptieren, keinen ausreichenden Erfolg. (14, 15) Die Nachteile der klassischen PCR wurden durch die Einführung der Real-time PCR beseitigt. Diese PCR-Variante bietet exzellente Quantifizierungen über mehrere Größenordnungen und eröffnet darüber hinaus einen im Vergleich mit der klassischen PCR hohen Probendurchsatz, weil die Aufarbeitung der Proben nach der PCR (in der Regel eine Agarose-Elektrophorese) entfällt. Die Real-time PCR besitzt die gleiche Spezifität und Empfindlichkeit wie die klassische PCR und ist somit für die Bestimmung der Pilzbiomasse in komplexer Pflanzenmatrix und in Gegenwart verwandter Pilzarten optimal geeignet. In den letzten zehn Jahren wurden in mehreren Arbeitsgruppen PCR-Primer für artspezifische Nachweismethoden für Fusarium-Arten entwickelt. Diese Primer werden als Ausgangspunkt für die Entwicklung einer Real-time PCR Methode dienen. Über den ersten Einsatz der Realtime PCR für Fusarium wurde aus der Arbeitsgruppe von L. Niessen, TU München, berichtet (13). Die in dieser Gruppe entwickelte Methode ist für epidemiologische Zwecke jedoch
7 ungeeignet, weil es sich um einen sog. "Gruppen-Assay" handelt, mit dem alle Fusarium- Arten erfasst werden, die ein bestimmtes Gen der Trichothecen-Synthese besitzen (neben F. graminearum auch F. culmorum, F. poae, F. avenaceum und andere). Die Entwicklung eines Real-time PCR-Test für F. graminearum wird gegenwärtig im Rahmen eines DOE-Projektes in Pacific Northwest National Laboratory (Richland, USA) angestrebt. In ersten Untersuchungen wurden Amplifikate von Primern verwendet, die in der Gruppe von L. Niessen entwickelten wurden (27). Diese erwiesen sich jedoch nicht als spezifisch für F. graminearum (28). Für den Ährenbefall und die DON-Kontamination von Weizen ist insbesondere die Art F. graminearum wichtig. Artspezifische Primer für F. graminearum wurden in unserem Institut (16) und in zwei weiteren Arbeitsgruppen (17, 18, 27) entwickelt. Diese Vorarbeiten werden in die Etablierung eines Real-time PCR Tests für F. graminearum einfließen. Über die Abteilung Molekulare Pflanzenpathologie unseres Institutes wird eine Real-time PCR-Anlage, icycler (BioRad), für das geplante Projekt zur Verfügung gestellt. Diese Anlage ermöglicht erstmals eine schnelle Optimierung der PCR-Bedingungen durch die Durchführung der Real-time PCR im Gradienten-Block. Darüber hinaus hat der hier verwendete icycler im Vergleich mit dem in anderen Arbeitsgruppen verwendeten LightCycler weitere Vorteile. Insbesondere ermöglicht er die Verwendung marktüblicher 96- Well-Mikrotiterplatten statt Glaskapillaren, wodurch Betriebskosten reduziert und die Pipettierung und Beladung des Gerätes erleichtert wird. Arbeiten an der Real-time PCR- Anlage in diesem Projekt wurden durch den Leiter der Abteilung Molekulare Phytopathologie und Mykotoxinforschung, Prof. P. Karlovsky, direkt betreut. 2 Material und Methoden 2.1 Versuchsanlagen Die Feldversuche mit unterschiedlichem Bodeninokulum und zusätzlicher Beregnung wurden in Blockanlagen mit gestreuten Kleinstparzellen (5 9 m²) mit einem Zwischenabstand von 15m durchgeführt, um Nachbarschaftseffekte durch Sporendrift zu vermeiden. Die Versuche mit unterschiedlichen Bodenbearbeitungsformen in wurden in Großparzellen von 15 x 30m (standort Torland) bzw. 30 x 30m (Standort Holtensen) in Göttingen oder 15 x 50m mit zusätzlichem Trennstreifen in Braunschweig (FAL) ohne Wiederholung durchgeführt. Die Beerntungen wurden hier nur in der Parzellenmitte durchgeführt. Die Weizenbestände wurden betriebsüblich geführt, eine späte Ährenbehandlung mit Fungiziden wurde hierbei nicht durchgeführt. 2.2 Probenahme und Probenaufbereitung Die Mähdruschproben (500-700g Korn) wurden in der Wind- und Siebreinigung einer Standdreschanlage nachgereinigt und dabei von Spelzen und Spindelteilen vollständig befreit und gegebenenfalls nachgetrocknet. Anschließend wurden die Körner bei einer Restfeuchte von 8-12% H 2 O in einer Rotormühle gemahlen (Schlagkreuzmühle SK 1, Bodensieb 2 mm, Retsch, Haan. Das Mahlgut wurde gemischt und ein Aliquot tiefgefroren bis zur Analyse zwischengelagert. Zur Analyse von Maisstoppeln wurden je Sorte an 4 Stellen einer Parzelle 5 aufeinander folgende Stoppeln entnommen. Dazu wurden die Stängelrestedirekt über dem Boden abgeschnitten. In gleicher Weise wurden Stoppeln für Inokulationsversuche gewonnen. Für die Analyse wurden die Blätter entfernt und die Stängel aus 4 Widerholungsparzellen gemeinsam gehäckselt, gemischt und ein Anteil nach Trocknung gemahlen und ein Anteil zur Analyse tiefgefroren zwischengelagert.
8 2.3 Inokulationen Bodeninokulationen: Neben den natürlich auf den Versuchsflächen vorkommenden Pflanzenrückständen wurden zur Erhöhung des Infektionsdruckes Maisstoppeln zwischen die Weizenreihen ausgelegt. Dazu wurden nach der Maisernte Reststängel mit einer Motorsense über der Bodenoberfläche abgeschnitten. Für epidemiologische Untersuchungen wurden Haferkörner, die zuvor im Labor mit Fusarium culmorum oder Fusarium graminearum infiziert wurden, in einer Dichte von 100 ml/m² ausgestreut. Die Haferkörner wurden dazu zweifach autoklaviert, mit einer Sporensuspension inokuliert und unter semisterilen Bedingungen in Kunststoffboxen bei Raumtemperatur bebrütet. Für jede Fusariumart wurden stets Mischungen aus 3 Pilzstämmen verwendet: Fg142, Fg143, Fg144 Fc43, Fc44, Fc45 aus der institutseigenen Sammlung. Sprühinokulationen: Zur direkten Inokulation der Weizenähren wurde Sporensuspension (100 ml/m²) mit einer Rückenspritze oder bei Topfversuchen im Gewächshaus mit einem Handsprühgerät (Fa. Gloria) unter Zusatz von 0,05% Tween 20 ausgebracht. Die Konidiosporen wurden auf infizierten Haferkörnern (s.o.) erzeugt, die getrocknet im Kühlraum zwischengelagert wurden. Zur Gewinnung der Sporensuspension wurden die Haferkörner über Nacht gewässert und anschließend abgesiebt. 2.4 Bestimmung der Fusariummenge Die Gesamtmenge an Fusarium in verschiedenen Pflanzenmaterialien wurde in einigen Versuchen mit einem gattungsspezifischen Fusarium-ELISA über ein am Institut erprobtes Serum ermittelt. Im Testverfahren, dessen Durchführung bei Tian et al. (2005) beschrieben ist, wurden Extrakte aus 1,5 g Pflanzenmehl / 30 ml Puffer eingesetzt. Die ermittelten Proteinäquivalente (µg FPE / kg Mehl) sind ein Maß für die relative Pilzmenge im Ausgangsmaterial. 2.5 Quantifizierung von Deoxynivalenol (DON) Die in Getreide- oder sonstigen Pflanzenmehlen enthaltenen Mengen des Mykotoxins Deoxynivalenol wurden auf Grund der hohen Probenzahl über den Enzymimmunoassay Ridascreen DON (r-biopharm, Darmstadt) quantifiziert. 5 g Mehl wurden mit 25 ml destilliertem Wasser versetzt und für 60 Minuten auf einem Horizontalschüttler bei 100 rpm gemischt. Ein Aliquot von 1 ml wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und für 10 Minuten bei 15.000 g zentrifugiert. 50 µl des resultierenden Überstandes wurden in die Kavitäten der ELISA Platte eingesetzt. Der Test wurde dann gemäß Herstellerangeben durchgeführt. Die Auswertung erfolgte über die Messung der Absorption bei 405 nm (Referenzwellenlänge 595 nm) in einem ELISA-Photometer (SLT Spectra). Die vorgesehene Standardkurve wurde durch einen zusätzlichen Eichpunkt bei 66,0 µg kg -1 ergänzt. In vergleichenden Untersuchungen fielen die DON Ananlysen dieser Methode ca. 20% höher aus als bei HPLC Methoden. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, dass der ELISA die ebenfalls toxische Vorstufe (3-Acetyl-Deoxynivalenol) mit erfasst. Aus diesem Grund wird der Gehalt des Toxins in den Ergebnissen als µg DON*/ kg Korn angegeben. 2.6 DNA-Extraktion Eine im Institut etablierte DNA-Extraktionsmethode für Pflanzenmaterial (Getreidehalme) wurde jeweils so modifiziert, dass sie für die anfallenden Spindelproben, für die in 15 % Glycerin konservierten Agarplaques mit den aus den Spindeln ausgewachsenen Myzelen und auch für Mehlproben anwendbar ist. DNA-Extraktion aus Spindelproben Spindelproben ÜN in 60 C Trockenschrank (1 Spindel pro Eppi)
9 30 sek. in großen Stahlbechern mit je einer Stahlkugel (Durchmesser 20 mm) einer Kugelmühle (Retsch) bei maximaler Umdrehungszahl trocken mahlen lassen 1,4 ml Puffer (CTAB-Puffer mit 2µl Mercaptoethanol und 1 µl Proteinase K pro ml) dazugeben und mit der Hand schütteln Kugel herausnehmen und Puffer-Mehlgemisch in 2 ml Eppi überführen 10 min bei 42 C und anschließend 10 min bei 65 C inkubieren (zwischendurch schütteln) + 0,8 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1), kräftig schütteln 10 min auf Eis 10 min bei 8000 RPM zentrifugieren 750 µl der wässrigen Phase in neues 1,5ml Eppi mit 500µl Isopropanol überführen und kräftig schütteln 20 min bei RT inkubieren 15 min bei RT und max RPM zentrifugieren Überstand abgießen, auf Kleenex abtupfen Pellet mit 800 µl von 70% EtOH waschen Pellet trocknen (speedvac 5 min oder 30 min auf dem Tisch) In 200 µl TE aufnehmen, das Pellet resuspendieren und mindestens über Nacht im Kühlschrank stehen lassen 2 h / 40ºC inkubieren 4 µl + 1µl BJ auf 0,8 %iges Gel auftragen DNA-Extraktion für Mycel-Plaques Proben in 2 ml Eppi mit 9 WC-Kugeln und CTAB-Puffer (1 ml CTAB-Puffer + 2µl EtSH (Mercaptoethanol) + 1µl Proteinase K) 6 min in Kugelmühle schütteln (nach 3 min Einsätze drehen) 10 min bei 42 C und anschließend 10 min bei 65 C inkubieren (zwischendurch schütteln) Proben kurz anzentrifugieren 0,8 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) (roter Deckel) hinzugeben und kräftig schütteln 10 min auf Eis 10 min bei 8000 RPM zentrifugieren, falls noch viel Zellmaterial in der oberen wässrigen Phase zu beobachten ist, noch mal 10 min zentrifugieren 750 µl der oberen, wässrigen Phase in neues 1,5ml Eppi mit 500µl Isopropanol überführen und kräftig schütteln 20 min bei RT inkubieren 15 min bei RT und max. RPM zentrifugieren Überstand abgiessen 500µl 70% EtOH am Rand des Röhrchens pipettieren, 5 min bei max rpm zentrifugieren Überstand vorsichtig abgießen trocknen in speedvac in 100µl 1xTE aufnehmen Bei RT das Pellet durch mehrmaliges leichtes aufschütteln resuspendieren und mindestens einen Tag im Kühlschrank stehen lassen, ev. noch 2 h / 40ºC, damit sich DNA vollständig löst. 4 µl auf 0,8 %iges Gel auftragen
10 DNA-Extraktion aus Weizen- und Maisstängelmehlen 1 g Weizenmehl bzw. 500 mg Maisstängelmehl in 50 ml Falcons einwiegen + 10 ml CTAB-Puffer (10 mm Tris, 20 mm EDTA, 0.02 M CTAB, 0.8 M NaCl, 0.03 M N-Laurylsarcosine, 0.13 M Sorbitol, 1% (w/v) Polyvinylpolypyrolidone, ph 8.0) mit 20µl Mercaptoethanol und 10 µl Proteinase K Lösung (20 mg ml-1)), gründlich und zügig vermischen 5 sek Ultraschallbad 10 min bei 42 C und anschließend 10 min bei 65 C inkubieren (zwischendurch schütteln) + 8 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1), kräftig schütteln 10 min auf Eis 10 min bei 4500 RPM zentrifugieren Eppis mit 193,6 µl 30 % PEG (in Wasser) und 100 µl 5 M NaCl vorbereiten 600 µl der oberen, wässrigen Phase in 1,5ml-Eppi mit PEG überführen, kräftig schütteln 15 min bei RT und max. RPM zentrifugieren Überstand vorsichtig abgießen, auf Kleenex abtupfen Pellet mit 800 µl 70% EtOH waschen Pellet trocknen In 200 µl TE aufnehmen und mindestens einen Tag im Kühlschrank stehen lassen am nächsten Tag 2 h / 40ºC inkubieren Elektrophorese der DNA zu Qualitätskontrolle: 4 µl + 1µl BJ auf 0,8 %iges Gel auftragen (60 V, 60 min) zusammen mit 25 ng λ-dna als Standard 2.7 Real-time PCR für die Diagnose und Quantifizierung der Fusariumarten Für die artspezifischen PCR Reaktionen wurden die in der Literatur beschriebenen Primerpaare Fg16N F/R für den Nachweis von F. graminearum (Nicholson et al. 1998 ) und OPT18 F/R für den Nachweis von F. culmorum (Schilling et al. 1996) verwendet (Tab.2.7-1). Tab.2.7-1: Für Fusarium graminearum und F. culmorum spezifische Primerpaare Artspezifität F. graminearum F. culmorum Quellen: Primer- Bezeichnung Länge theoretische Schmelztemperatur [ C] Fg16NF 23mer 61,0 Fg16NR 20mer 59,2 OPT18 F 20mer 60,4 OPT18 R 20mer 60,4 Amplifizierte Fragment- Anzahl getesteter Isolate größe: Quelle F. gram. F. culm. 280 bp 472 bp Nicholson et al. 1998 Schilling et al. 1996 24 21 34 69 Nicholson P, Simpson DR, Weston G, Rezanoor HN, Lees AK, Parry DW, Joyce D (1998): Detection and quantification of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assays. Physiological and Molecular Plant Pathology 53, 17-37. Schilling AG, Moeller EM, Geiger HH (1996): Polymerase chain reaction-based assays for species-specific detection of Fusarium culmorum, F-graminearum, and F-avenaceum. Phytopathology 86, 515-522.
11 2.7.1 Qualitative Duplex-PCR Ein qualitativer Nachweis von F. graminearum und F. culmorum in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Sybr-Green ohne die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese wurde entwickelt. Eine Unterscheidung der Produkte mit unterschiedlicher Größe erfolgt über eine Auswertung der nach der eigentlichen PCR-Reaktion im i-cycler aufgezeichneten Schmelzkurve der amplifizierten Produkte. Die optimierten Reaktions- und Amplifikationsbedingungen sind in den Tab.2.7.1-1 und 2 dargestellt. Tab. 2.7.1-1: Real-time PCR Bedingungen für eine qualitative Duplex-PCR mit den Primern Fg16N F/R und FcOpt F/R unter Verwendung von Sybr-Green Gesamtvolumen PCR-Ansatz 25 µl 10x Puffer Bioline 1 x MgCl2 Bioline 5 mm dntp Genecraft 200 µm Fg16N F 0,3 µm Fg16N R 0,3 µm FcOpt F 0,3 µm FcOpt R 0,3 µm BIOTaq DNA Polymerase 0,7 U SybrGreen Mol. Probes 0,4 x Reference Dye 1µM 10 nm Probe 10 pg - 10 ng Tab. 2.7.1-2: Real-time PCR Programm für eine qualitative Duplex-PCR unter Verwendung von Sybr-Green Zyklen Schritt Beschreibung Reaktionstemperatur Dauer [min:sek] Bemerkung 1 - Anfängliche Denaturierung 95 C 01:35 35 1 Denaturierung 94 C 00:30 2 Annealing 64 C 00:45 Fluoreszenzmessung 3 Elongation 72 C 00:45 1 - Finale Elongation 72 C 05:00 1 - Denaturierung 95 C 01:00 1 - Renatrurierung 55 C 01:00 60 - Schmelzkurvenanalyse mit Fluoreszenzmessung 65 C 00:30 Reaktionstemp. wird nach jedem Zyklus um 0,5 C erhöht 1 - Abkühlung 15 C wird gehalten Diese Methode wurde dazu eingesetzt, die infizierende Fusarien-Art in isolierten Weizenspindeln zu identifizieren.
12 2.7.2 Quantitative PCR Das verwendeten Reaktionsbedingungen und das PCR-Programm sind in den Tabellen 2.7.2-1 3 dargestellt. Tab. 2.7.2-1: Reaktionsbedingungen für den Primer Fg16N Gesamtvolumen 25 µl SYBR Premix Ex Taq Takara 1 x Fg16N F 0,3 µm Fg16N R 0,3 µm Fluorescein 10 nm Probe 0,5 pg 10 ng Tab. 2.7.2-2: Reaktionsbedingungen für den Primer Opt 18F Gesamtvolumen 25 µl 10x Puffer Bioline 1 x MgCl2 Bioline 4 mm dntp Bioline 200 µm Opt18 F 0,3 µm Opt18 R 0,3 µm BIOTaq DNA Polymerase 0,25 U SybrGreen Mol. Probes 0,1 x Reference Dye 1µM 10 nm Probe 0,5 pg 10 ng Tab. 2.7.2-3: Real-time PCR Programm für den für den quantitativen Nachweis von F. graminearum und F. culmorum Zyklen Schritt Beschreibung Reaktionstemperatur 1 - Angfängliche Denaturierung Dauer [min:sek] 95 C 01:35 35 1 Denaturierung 94 C 00:30 Bemerkung 2 Annealing 64,5 C 00:45 Fluoreszenzmessung 3 Elongation 72 C 00:45 1 - Finale Elongation 72 C 05:00 1 - Denaturierung 95 C 01:00 1 - Renatrurierung 55 C 01:00 45 - Schmelzkurvenanalyse mit Fluoreszenzmessung 65 C 00:10 Reaktionstemp. wird nach jedem Zyklus um 1 C erhöht 1 - Abkühlung 15 C wird gehalten 2.8 Datenverarbeitung Die Versuchs- und Analysedaten wurden mit den Programmen Excel, XL-STAT und SPSS ausgewertet und verrechnet.
13 3 Ergebnisse 3.1 Ausführliche Darstellung der wichtigsten Ergebnisse 3.1.1 Optimierung der PCR Nachweismethoden für F. graminearum und F. culmorum 3.1.1.1 Optimierung der DNA-Extraktion Eine im Institut etablierte DNA-Extraktionsmethode für Pflanzenmaterial wurde für die zu untersuchenden Ährenspindelstücke angepasst. Die Problematik der Homogenisation durch die geringe Masse in Kombination mit sehr zähen Struktur wurde durch Zuhilfenahme einer großen Stahlkugel in einem Stahlbecher einer Kugelmühle begegnet. DNA-Extraktionsmethoden für Mehle bzw. Ernterückstände wurden jeweils so optimiert, dass eine homogene DNA-Extraktion aus den Mehlen gewährleistet werden kann. Nach der durchgeführten Optimierung kann auch für die schwierig zu handhabende Mehl-Matrix sowohl eine gleichmäßige Extraktion als auch eine ausreichend sensitive artspezifische Quantifizierung gewährleistet werden. Die Protokolle sind in dem Abschnitt Material und Methoden beschrieben. Ein Vergleich der Varianz in der DNA-Extraktionseffizienz ist in Abb. 3.1.1-1 dargestellt. Abb. 3.1.1-1: Vergleich der Varianz der DNA-Ausbeute vor (links) und nach (rechts) der Optimierung der DNA-Extrakion. 3.1.1.2 Optimierung der Real-time PCR für die Diagnose und Quantifizierung Aus der Literatur wurden verschiedene für F. graminearum spezifische Primerpaare ausgewertet. Die Zugabe von Pflanzen-DNA im Überschuss führte weder zu einer Hemmung noch zu einer ungewünschten Amplifikation mit dem Primerpaar Fg16N. Das verwendete PCR-Programm und die Reaktionsbedingungen sind im Abschnitt Material und Methoden dargestellt. Mit diesem Primer ist somit ein quantitativer Nachweis von F. graminearum- DNA in Pflanzenproben möglich. Um auch einen Nachweis für F. culmorum führen zu können, wurde die bereits im Institut etablierte Methode so angepasst, dass sie zusammen mit dem Primer Fg16N verwendet werden kann. Zunächst wurde ein qualitativer Nachweis von F. graminearum und F. culmorum in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Sybr-Green ohne die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese entwickelt. Eine Unterscheidung der Produkte mit unterschiedlicher Größe erfolgt über eine Auswertung der nach der eigentlichen PCR-Reaktion im i-cycler
14 aufgezeichneten Schmelzkurve der amplifizierten Produkte. Als Ausgangspunkte für die Entwicklung der Duplex-PCR dienten die optimierten Bedingungen für den F. graminearumspezifischen Nachweis (Primer Fg16N) und die Bedingungen für den zuvor im Institut entwickelte F. culmorum- spezifischen Nachweis (Primer Opt18). Die optimierten Reaktionsund Amplifikationsbedingungen sind im Abschnitt Material und Methoden dargestellt. Diese Methode wurde dazu eingesetzt, die infizierende Fusarien-Art in isolierten Weizenspindeln zu identifizieren. Der Assay zur Quantifizierung für F. graminearum erwies sich am Anfang der Untersuchungen als nicht ausreichend empfindlich. Nach einer Überarbeitung der DNA- Extraktion wurden die Reaktionsbedingungen für den Primer Fg16N (Nicholson et al., 1998) durch Verwendung eines Premixes mit einer hochwertigeren DNA-Polymerase so optimiert, dass ein Nachweis der F. graminearum DNA bis 0,5 pg in einer PCR-Reaktion ermöglicht wurde. Das Protokoll ist im Abschnitt Material und Methoden beschrieben. Die zur Auswertung herangezogenen Probenzahlen sind in Tab. 3.1.1-2 dargestellt. Abb. 3.1.1-2: Anzahl und Verteilung der Weizenspindeln und kornproben 2003 2005. Anzahl der zur Spindeluntersuchung beprobten Felder (je 10 Spindeln ) Anzahl Weizenproben Bundesland 2003 2003 2004 2005 Bayern 4 4 6 7 Brandenburg 3 4 6 10 Niedersachsen 21 51 90 31 Mecklenburg- Vorpommern 6 6 1 Nordrhein-Westfalen 1 2 Rheinland-Pfalz 13 29 44 11 Saarland 1 Sachsen 6 11 17 Schleswig Holstein 2 1 Thüringen 6 16 14 18 gesamt 54 120 174 94 3.1.2 Untersuchungen zu epidemiologischen Grundlagen 3.1.2.1 Identifizierung der Fusarium-Arten in FHB-Ähren Im ersten Projektjahr wurde eine PCR-Methode entwickelt, die den gleichzeitigen Nachweis der beiden Arten in einer Reaktion unter Verwendung des interkalierenden Farbstoffes SYBR Green ermöglicht. Dabei werden im direkten Anschluss an die eigentliche PCRU die beiden artspezifischen PCR-Produkte mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse differenziert. Die Duplex-PCR wurde zur Untersuchung von Ähren mit typischen Fusarium-Head-Blight Symptomen genutzt, die im Rahmen des Projektes in Zusammenarbeit mit den Pflanzenschutzdiensten der Länder von Praxisschlägen aus dem Bundesgebiet zur Milchreife des Weizens 2003 entnommen wurden. Bei jeweils 10 Ährenspindeln pro Standort wurde das eingewachsene Pathogen bestimmt und der DON-Gehalt in den Ernteproben dieser Schläge
15 festgestellt. Außerdem wurde in den Ernteproben der Gehalt an F. graminearum und F. culmorum DNA mit der quantitativen Real-time PCR gemessen. Die typische Braunfärbung (Nekrotisierung) der infizierten Abschnitte der Ährenspindeln konnte zu 96% (516 von 540 Spindeln) auf die DON bildenden Arten F. graminearum und / oder F. culmorum zurückgeführt werden. Die Daten der 54 Standorte wurden in Abhängigkeit von dem DON-Gehalt der jeweiligen Ernteprobe ausgewertet (Abb. 3.1.2.1-1). Für 23 Standorte, deren Ernteproben mehr als 500 µg/kg DON enthielten, konnte in 91% der Fälle F. graminearum nachgewiesen werden. In 4% der Ährenspindeln wurden beide untersuchten Pathogene nachgewiesen, wogegen nur in 4% der Spindeln F. culmorum allein nachzuweisen war. Bei 31 Standorten mit geringeren DON-Konzentrationen im Erntegut sank der Anteil von F. graminearum auf 74%, während der F. culmorum Anteil auf 24% anstieg. Der Anteil von Mischinfektionen lag bei 2%. Hohe DON-Kontaminationen des Erntegutes wurden also überwiegend durch F. graminearum verursacht. Um zu überprüfen, ob das infizierende Pathogen sich auch im Erntegut der jeweiligen Schläge wiederfindet, wurden die entsprechenden Kornproben auf den Gehalt an F. culmorum und F. graminearum DNA untersucht. Dabei bestätigte sich zum einen der hohe Anteil an F. graminearum in den mit DON hoch belasteten Proben, zum anderen konnte ein wesentlicher Beitrag von F. culmorum zu der DON-Belastung ausgeschlossen werden (Abb. 3.1.2.1-2). Diese Ergebnisse bestätigen die ersten Resultate aus den Untersuchungen der Vorjahre und zeigen somit eine weitgehende Dominanz von F. graminearum bei der Besiedlung der Ähre nach Blüteninfektionen, insbesondere bei Flächen mit hohen DON-Gehalten im Erntegut. Abb. 3.1.2.1-1: Anteil der über PCR in der Ährenspindel nachgewiesenen Fusarium-Art in Abhängigkeit von der DON-Konzentration im Erntegut der entsprechenden Schläge. Basis 54 Schläge, BRD 2003 Abb. 3.1.2.1-2: Fusarium DNA-Gehalte der Weizenproben von den Flächen mit Spindelbeprobung, gruppiert nach dem DON-Gehalt (2003). Mittelwerte und Standardabweichungen. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Diff. (Mann-Test, p < 0.0001).
16 3.1.2.2 Nord-Süd-Verteilung von Fusarium graminearum und Fusarium culmorum In der Literatur wird häufig berichtet, dass F. graminearum die dominierende Art in warmen, kontinentalen Zentraleuropa wäre, wohingegen F. culmorum vorwiegend in den kühleren maritimen Regionen Nordeuropas vorkäme. Aufgrund dieser Aussage wurde überprüft, ob es einen Nord-Süd-Gradient im Anteil der infizierenden Arten innerhalb von Deutschland gibt, der dieses Verhältnis abbildet. Dieses konnte mit unserem Probensatz nicht bestätigt werden, da keine signifikante Korrelation zwischen der geographischen Länge des Schlages, von dem die Probe stammt, und dem Anteil des Auftretens von F. graminearum und F. culmorum in der Spindel nachgewiesen werden konnte (Pearson s Korrelationstest, α= 5%, Abb. 3.1.2.2-1). F. graminearum war unabhängig von der geographischen Länge die dominierende Art. Abb. 3.1.2.2-1 Nord-Süd-Verteilung von Fusarium spp. Der Anteil des Auftretens von F. graminearum und F. culmorum in Weizenspindeln ist gegen die geographische Länge des untersuchten Standortes aufgetragen. (p<0,0001, Pearsons Korrelationstest) 3.1.2.3 PCR-Analyse von Kornproben der Weizenernten Aus den Standorterhebungen 2003 2005 wurden 388 Kornproben, die durch vorangegangene DON-ELISA Untersuchungen als befallen eingestuft worden waren, quantitativ auf F. culmorum und F. graminearum untersucht. Die Ergebnisse (Abb. 3.1.2.3-1) zeigen, dass die F. graminearum DNA Menge im Mehl positiv mit den DON-Belastungen im Erntegut korreliert (R²= 0,74). Dagegen sind die für F. culmorum ermittelten DNA-Mengen für die Mehrzahl der Proben sehr gering und nicht mit den DON-Belastungen im Erntegut korreliert. Ähnlich wie bei den direkten Ähren-Untersuchungen bestätigt dieses Ergebnis F. graminearum als dominierendes Pathogen für massive Ähreninfektionen und DON- Belastungen des Erntegutes im Mittel über alle Jahre.
17 B Abb. 3.1.2.3-1: Korrelation zwischen Fusarium graminearum (A) bzw. F. culmorum (B) DNA- Mengen und dem DON-Gehalt im Weizen 2003-2005. Der DON- Gehalt zeigt einen signifikante Korrelation zu dem F. graminearum DNA Gehalt (p<0,0001), jedoch keine Beziehung zum F. culmorum DNA Gehalt Vergleicht man die Korrelation von F. graminearum DNA und DON der einzelnen Jahre, zeigt sich, dass sich die Steigung der Regressionsgeraden der drei Jahre deutlich unterscheidet. Sie fällt von 24 im Jahr 2003 bis auf den Faktor 5 im Jahr 2005, wobei das Jahr 2004 eine mittlere Position mit dem Faktor 15 einnimmt (Abb. 3.1.2.3-2). Somit hat sich die DON-Bildungsrate pro Einheit F. graminearum DNA in dem Zeitraum 2003 bis 2005 deutlich verringert. Ob es sich dabei möglicherweise um ein Resultat unterschiedlicher Witterungskonstellationen, oder um eine Verschiebung innerhalb der F. graminearum Population hin zu Isolaten mit geringerer DON-Bildung handelt, bleibt offen.
18 DON [µg kg -1 ] 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 DON 2003 DON 2004 DON 2005 y = 24.05x R 2 = 0.75*** y = 14.66x R 2 = 0.90*** y = 5.34x R 2 = 0.91*** 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 F. graminearum DNA [µg kg -1 ] Abb. 3.1.2.3-2: DON-Gehalt im Mehl des Erntegutes in Abhängigkeit von den DNA Mengen von Fusarium graminearum in den Proben von 2003, 2004 und 2005. Hoch signifikante Korrelationen bei unterschiedlichen Steigungen der Regressionsgraden für die verschiedenen Jahre. (p<0,0001, Pearsons Korrelationstest) Die unterschiedliche DON-Bildungsrate wird auch bei dem Vergleich der Mittelwerte der F. graminearum bzw. F. culmorum DNA mit den mittleren DON-Belastungen der Jahre 2003 bis 2005 deutlich (Abb. 3.1.2.3-3). Das Jahr 2005 weist im Mittel die höchsten F. graminearum DNA Gehalte auf, wohingegen die DON-Gehalte des Jahres 2005 die niedrigsten darstellen (es sei darauf hingewiesen, dass in allen drei Jahren nur bei Proben mit mehr als 100 µg kg -1 DON eine Fusarium spp. DNA-Quantifizierung durchgeführt wurde. Nur dieses Probenset ist in beiden Grafiken dargestellt). n: 150 228 94 Abb. 3.1.2.3-3: Fusarium spp.-dna und DON Gehalt in Weizen 2003-2005 Fusarium spp.-dna Quantifizierung wurde nur bei DON-Gehalten > 100 µg kg -1 durchgeführt.
19 3.1.2.4 Homogenität und Schlagspezifität von FHB-Infektionen In Rheinland-Pfalz und Süd-Niedersachsen wurde in der Vegetationsperiode 2004 an 50 Standorten die Homogenität der Infektionshäufigkeit im Bestand geprüft, indem die Anzahl infizierter Ähren über mehrere 15m² große, über den Schlag verteilte Zählstellen erfasst wurde. Hierdurch sollte untersucht werden, ob ein Weizenschlag als ausreichend homogene Einheit in Bezug auf die Infektionswahrscheinlichkeit betrachtete werden kann und während des Mähdrusches einmalig entnommene Kornproben ausreichend repräsentativ für einen ganzen Schlag sein können. Nur auf 2 Flächen von 50 Flächen mit unterschiedlichen Vorfrüchten und Bodenbearbeitungsformen konnten überhaupt keine sichtbaren Ähreninfektionen festgestellt werden. Die ermittelten Infektionshäufigkeiten variierten selbst innerhalb von Schlägen mit geringer Befallshäufigkeit von <0,5% infizierter Ähren nur wenig, während Unterschiede zwischen diesen Feldern deutlich wurden (Abb.3.1.2.4-1). Ausgenommen davon waren nur Feldränder im Windschatten großer Bäume; in diesen Bereichen konnte eine mäßige Erhöhung der Infektionshäufigkeit im Vergleich zur übrigen Ackerfläche auftreten (Felder Nr.26 und 28). Die relativ homogene Verteilung der Infektionen im Bestand lässt auf eine ähnlich gleichmäßige Verteilung belasteter Körner im Erntegut schließen. Die Entnahme einer repräsentativen Probe für einen Schlag dürfte deshalb in der Regel gegeben sein, sofern eine ausreichend große Stichprobe gezogen wird. In Feldern mit höherem Infektionsdruck fällt die Verteilung der Infektionen ohnehin noch deutlich homogener aus (vgl. Abb. 3.1.2.4-2). 50 40 Inf. Ähren / 15m² 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Abb. 3.1.2.4.-1: Häufigkeit und Variabilität von FHB-Infektionen innerhalb von Weizenfeldern in Süd-Niedersachsen, 2004. Mittelwerte und Standardabweichungen aus 10 Zählstellen/Feld. Für die Standorte mit geringen Befallshäufigkeiten zwischen 0-0,5% variierten die im Erntegut ermittelten Toxinwerte in der Vegetationsperiode 2004 jedoch zwischen 0 580µg DON*/kg Korn ohne direkten Bezug zum erkennbaren Ährenbefall im Feld. Diese Grundbelastung war nur in 2004 auf Grund der feuchten Witterung verzögerten Abreife und Ernte so ausgeprägt und blieb insgesamt unterhalb der DON Richtwerte. Bei stärkerem Infektionsdruck und einem Anteil infizierter Ähren von >0,5% war eine direkte Beziehung der Infektionshäufigkeit zur nachfolgenden Belastung des Erntegutes zu erkennen.
20 Da die luftbürtigen Ascosporen bei der Infektion der Ähren durch Fusarium graminearum nach allen bisherigen Untersuchungsergebnissen die entscheidende Rolle spielen, wurde in 2003 und 2004 in Versuchen und Beobachtungsschlägen durch gestaffelte Ährenbonituren im Feld untersucht, inwieweit sich die Drift dieser Sporen auf benachbarte Ackerflächen in der Praxis bzw. auf Nachbarparzellen in Versuchsanlagen auswirken kann. Dazu wurde die Häufigkeit von Ähreninfektionen auf Parallelen zum Feldrand mit zunehmendem Abstand zwischen stark und nicht belasteten Flächen bestimmt (Abb. 3.1.2.4.-2). 100 80 Inf. Ähren / m² 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Abstand zur Nachbarfläche (m) Abb. 3.1.2.4.-2: Auswirkung von Sporendrift Anzahl von FHB-Ähren im Weizen in Abhängigkeit vom Abstand zur hoch infizierten Nachbarfläche (Maismulch) Mittelwerte und Standardabweichungen aus je 3 Zählstellen auf Parallelen zum Feldrand, Weende 2004 Die Häufigkeit der Ähreninfektionen verminderte sich dabei innerhalb der Nachbarfläche nach jeweils 3 m um ca. 50%. Daraus wird deutlich, dass der Einfluss des Sporenfluges selbst bei hoher Sporenproduktion und damit verbundener Infektionsdichte auf der Donor-Fläche nur einen schmalen Randstreifen von 20-30m der Nachbarfläche bei exponentiell abnehmender Intensität beeinflusst. Der Einflussbereich von Kleinparzellen mit Inokulum in den umgebenden Weizenbestand war deutlich geringer, da die Ausdünnung der Sporendichte hier radial erfolgt. Die Reduktion der Infektionshäufigkeit betrug in dieser Konstellation 50-70% je zusätzlichem Meter Abstand. Die Infektionshäufigkeit der Ähren und auch die Toxinbelastung des Erntegutes im kritischen Bereich wird demnach neben der Witterung durch streng schlagbezogene Faktoren bestimmt, wobei übliche Inhomogenitäten innerhalb eines Feldes zur Beurteilung des Toxinrisikos keine entscheidende Rolle spielen. 3.1.2.5 Feldversuche mit spezifischem Boden-Inokulum In allen 3 Versuchsjahren 2003-2005 wurden Kleinparzellen mit unterschiedlichem Boden- Inokulum in Winterweizenflächen angelegt. Neben Maisstoppeln wurden Haferkörner, die zuvor im Labor mit Fusarium culmorum (reiner Konidiosporen-Bildner) oder Fusarium graminearum (Konidiosporen- und Ascosporen-Bildner) infiziert worden waren, im Frühjahr zwischen den Getreidepflanzen ausgestreut. Pro 1m² wurden 5g nach der Beimpfung
21 rückgetrocknete Haferkörner vor dem Schossen des Weizenbestandes auf dem Boden der Kleinparzellen verteilt. Am Versuchsstandort Göttingen blieb in der Vegetationsperiode 2003 in den Parzellen mit F. culmorum-inokulum sowohl die Infektionsrate der Ähren (0,3%) als auch die Fusarium- Menge im geernteten Korn (350 mg FPE/kg Korn) gegenüber der Kontrolle unverändert. In den Parzellen mit eingestreuten F. graminearum-körnern variierte der Prozentsatz infizierter Ähren dagegen zwischen 65 und 95 % und die Fusarium-Konzentration im Mehl des Erntegutes war mit durchschnittlich 39.000µg FPE/kg Korn um mehr als 100-fach gegenüber der Kontrolle erhöht. Auch die Anzahl der Fusarium-Kolonien in den zur Getreideblüte aufgestellten Agar-Sporenfallen war mehr als 10-fach erhöht (>50 Kolonien/Agarplatte). In der Vegetationsperiode 2004 erhöhte das Ausstreuen von inokulierten Haferkörnern die Infektionsrate der Ähren wie im Vorjahr nur in den Weizenparzellen mit F. graminearum- Inokulum auf 2,4% FHB-Ähren gegenüber dem Grundniveau auf der Versuchsfläche (0,2%) und die Fusarium-Menge im Erntegut von 2,8 mg FPE/ kg Korn auf 12 mg FPE/ kg Korn. In 2005 wurde ein vergleichbares Ergebnis anhand der DON-Konzentrationen im Erntegut ermittelt. Hier waren die Toxingehalte in den Parzellen mit F. graminearum-inokulum um den Faktor 7 gegenüber den übrigen Varianten erhöht. (Abb.3.1.2.5-1) 1000 800 µg DON/kg Korn 600 400 200 a b b b 0 F. graminearum F. culmorum ZR-Reste 20x Kontrolle Abb. 3.1.2.5-1: DON-Gehalte im Korn in Abhängigkeit von unterschiedlichem Inokulum Haferkörner mit F. graminearum bzw. F. culmorum, Zuckerrübenreste 20-fach konzentriert, Kontrolle = Zuckerrübenmulch der Gesamtfläche, Göttingen-Weende 2005 Mittelwerte mit Standardabweichungen, unterschiedliche Buchstaben markieren signifikante Differenzen (Duncan-Test, alpha = 0,05) Da bei den Standorterhebungen die Befalls- und Toxinwerte nach Zuckerrübenmulch gegenüber anderen Vorfrüchten erhöht waren, wurden in den Vegetationsperioden 2004 und 2005 auf einer Rübenmulchfläche jeweils im März die auf der Bodenoberfläche verbliebenen Rübenreste (Wurzelbruchstücke u. Rübenköpfe) gesammelt und in Kleinparzellen 20-fach konzentriert. In diesen Parzellen war jedoch weder der Anteil infizierter Ähren noch die Belastung des Erntegutes im Vergleich zur normalen Feldfläche verändert. Dagegen führten eingestreute Haferkörner mit F. graminearum und Masistoppeln auf diesen Versuchsflächen zu einer signifikanten Steigerung infizierter Ähren bzw. Fusarium- und Toxin-Mengen im Korn (Abb.3.1.2.5-1). Zum gleichen Ergebnis führte das Auslegen von Sonnenblumenstoppeln aus Versuchen der FAL Braunschweig, während Maisstoppeln gleicher Herkunft die Infektionshäufigkeit auf dieser Versuchsfläche von 0,2% auf 4% erhöhten.