EliA MPO S and EliA PR3 S

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1 AUSG ABE n Review ANCA und assoziierte Erkrankungen n Die Assays EliA MPO S and EliA PR3 S n Erfahrung ANCA-Bestimmung durch hoch-sensitive Methoden

2 INHALT Editorial Vor einigen Monaten schickte mir ein Schweizer Kollege eine Publikation zum Thema ANCA und ANCA-assoziierte Erkrankungen, die im Swiss Medical Forum erschienen ist. Verfasser der Publikation sind bekannte Schweizer Rheumatologen wie Thomas Vogt und Alan Tyndall. Ich war sehr erfreut, dass die Publikation sich in sehr klarer und verständlicher Form mit der Thematik ANCA und ANCA-assoziierte Vaskulitis auseinandersetzt. Es ist mir ein Vergnügen, Ihnen diese Abhandlung in der aktuellen Ausgabe des EliA Journals (Seite 3) zugänglich zu machen. Experten in aller Welt empfehlen die Ausarbeitung aktualisierter Kriterien und eine Neubewertung der derzeitigen Krankheitsdefinitionen für ANCA-assoziierte Vaskulitiden, da die Kriterien von 1990 unvollständig und irreführend sind. Ein wichtiger Punkt, der geändert werden muss, ist die Aufnahme von ANCA in die Kriterien aber welche Methode oder welcher Algorithmus soll empfohlen werden? In einer internationalen Konsenserklärung von 1999 wurde vereinbart, dass das Screening für ANCA mittels indirekter Immunfluoreszenz (IIF) auf Ethanol-fixierten Granulozyten die Basis für die Diagnostizierung von ANCA bilden soll. Folglich führen viele klinische Labore bei Patienten mit Verdacht auf Vaskulitis ein Screening mit Hilfe von IIF durch und bestätigen positive Ergebnisse mittels ELISA. Allerdings kann ELISA problemlos automatisiert werden und ist somit eine attraktive Alternative zur IIF als Screening-Methode. Vermeersch et al. (Clin Chim Acta 2008; 397:77-81) haben in ihrer Vergleichsstudie dargelegt, dass ein Screening mit Hilfe von EliA und die Bestätigung mittels IIF einen zu erwartenden klinischen Nutzen haben, der mit dem klinischen Nutzen beim Screening mit Hilfe von IIF und Bestätigung mittels EliA vergleichbar ist. Darüber hinaus ist bei der Anwendung von EliA alleine von einem klinischen Nutzen auszugehen, der mit dem klinischen Nutzen eines Screenings mit IIF und Bestätigung mittels ELISA nahezu gleichzusetzen ist. Der höchste zu erwartende klinische Nutzen wurde bei der Durchführung von IIF und ELISA an allen Proben festgestellt, womit frühere Studien bestätigt wurden. Der geringste klinische Nutzen wurde bei der alleinigen Durchführung von IIF beobachtet. Mit der Entwicklung hochempfindlicher Tests wie dem neuen EliA PR3 S oder EliA MPO S wird der klinische Nutzen sogar noch weiter verbessert und tatsächlich stellen immer mehr Studien die derzeitige Rolle von IIF als Goldstandard in Frage. Auf Seite 6 dieser Ausgabe des EliA Journals finden Sie Informationen über die hochempfindlichen Tests EliA PR3 S und EliA MPO S. Auf Seite 7 stellen wir Ihnen eine Studie zum Vergleich dieser Tests mit IIF bei Patienten mit ANCA-assoziierten Erkrankungen vor. Viel Spaß beim Lesen! 3 Review ANCA und assoziierte Erkrankungen 6 Die Assays EliA MPO S and EliA PR3 S Vorreiter automatisierter ANCA-Bestimmung 7 Erfahrung ANCA testing by high sensitive methods in ANCA-Associated Systemic Vasculitis (AASV) diagnosis EliA Journal ist ein Journal von Phadia GmbH Munzinger Straße 7, D Freiburg Editor: Nina Olschowka Autoren: Thomas Daikeler, Stephan Regenass, Ingmar Heijnen, Alan Tyndall, Thomas Vogt Nina Olschowka Antonella Radice, Laura Bianchi, C. Farina, C. Zehnder, Renato Alberto Sinico Layout: Melanie Tritschler, Tom Bernhard Auflage:

3 Review ANCA und assoziierte Erkrankungen Thomas Daikeler a, Stephan Regenass b, Ingmar Heijnen c, Alan Tyndall a, Thomas Vogt a a Rheumatologische Universitätsklinik, Universitätsspital und Felix Platter-Spital, Basel b Diagnostik AKI, Klinik für Immunologie, UniversitätsSpital Zürich c Medizinische Immunologie, Labormedizin, Universitätsspital Basel Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt in Verbindung mit diesem Artikel vorliege. Dieser Artikel wurde publiziert in: Schweiz Med Forum 2010;10(50): Quintessenz l Beim Nachweis von ANCA mittels Immunfluoreszenzmikroskopie können charakteristische Muster (C-ANCA, P-ANCA, ANCA mit atypischer Färbung) beobachtet werden. l Die am besten dokumentierten Zielantigene der ANCA sind die Myeloperoxidase (MPO, Zielantigen von MPO-ANCA) und die Serin-Proteinase 3 (PR3, Zielantigen von PR3-ANCA). Sie können spezifisch mittels Enzymimmunoassays (EIA) gemessen werden. l Unter dem Begriff «ANCA-assoziierte Vaskulitiden» (AAV) werden die Wegener sche Granulomatose (WG), die mikroskopische Polyangiitis (MPA) und das Churg-Strauss-Syndrom (CSS) zusammengefasst. Bei den ANCA in dieser Assoziation handelt es sich um PR3- und MPO-ANCA. Bei einer Reihe nicht vaskulitischer Krankheitsbilder wurde der Nachweis von ANCA mittels Immunfluoreszenz auch beschrieben. Bei diesen ANCA handelt es sich in der Regel um andere Antikörper als PR3- oder MPO-ANCA. l Eine Untersuchung auf ANCA soll mittels Immunfluoreszenz und EIA (Bestimmung der MPO- und PR3-Spezifität) durchgeführt werden. Die primär spezifische Bestimmung von PR3- und MPO-ANCA mittels ELISA kann eine alternative Strategie sein. Eine negative ANCA-Bestimmung schliesst eine Vaskulitis nicht aus. Zur exakten Diagnostik gehört immer auch eine histologische Untersuchung von geeignetem Gewebe. Einführung Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) umfassen eine heterogene Gruppe von Antikörpern. Sie wurden erstmals 1982 beschrieben. In der Folge wurde eine Verbindung der ANCA mit einer Gruppe von Vaskulitiden deutlich, die kleinere arterielle Gefässe befällt. Zu Beginn erfolgte der Nachweis von ANCA mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Da die Zielantigene vorwiegend in den Granula, z.t. auch im Zytosol von Äthanol-fixierten neutrophilen Granulozyten lokalisiert sind, kann beim Markieren von Antikörpern ein charakteristisches Muster im Zytoplasma dieser Zellen festgestellt werden. Die Methode ergibt als Resultat eine rein visuelle Beschreibung des beobachteten Musters. Es werden hauptsächlich drei verschiedene Muster unterschieden: ANCA mit klassischem zytoplasmatischem granulärem Fluoreszenzmuster (C-ANCA), ANCA mit einer perinukleären Fluoreszenz (P-ANCA) und ANCA mit atypischer Färbung. Später wurden Zielantigene der ANCA charakterisiert. ANCA gegen diese Zielantigene können nun spezifisch mittels Enzymimmunoassays (z.b. ELISA oder Immunoblot) gemessen werden. Die am besten dokumentierten Zielantigene sind die Myeloperoxidase (MPO, Zielantigen von MPO- ANCA) und die Serin-Proteinase 3 (PR3, Zielantigen von PR3-ANCA). Die mittels ELISA nachgewiesenen ANCA lassen sich oft mit einem bestimmten Muster in der Immunfluoreszenz verbinden. PR3-ANCA ergeben in der Regel ein C-ANCA-Muster, MPO-ANCA ergeben meistens ein P-ANCA-Muster. Neben MPO- und PR3- ANCA gibt es weitere Auto-Antikörper, die zu einem ANCA-, vor allem P-ANCA- Muster führen können. Der Nachweis von ANCA lässt zusammen mit Symptomen und weiteren Laborbefunden Rückschlüsse auf das Vorliegen von Krankheiten zu (Abb. 1). Bedeutung von ANCA Gemäss ANCA-Zytokinsequenztheorie können sich ANCA (PR3- oder MPO- ANCA) an Granulozyten binden, die z.b. durch eine Infektion aktiviert wurden. Dadurch wird in kleinen Gefässen die Freisetzung lysosomaler Enzyme ausgelöst, und diese führen so zu nekrotisierenden Veränderungen der kleinen Gefässe (Abb. 2). Diese Theorie wird durch klinische und experimentelle Beobachtungen gestützt. Für ANCA mit anderen Zielantigenen ist das Vorkommen bei verschiedenen Krankheiten beschrieben, die ursächliche Verbindung mit der jeweiligen Erkrankung ist jedoch weniger gut geklärt. ANCA-assoziierte Vaskulitiden Die ANCA haben in der Differenzialdiagnostik der Vaskulitiden eine grosse Bedeutung. Wegen ihrer Verbindung mit den ANCA (speziell PR3- und MPO-ANCA) werden unter dem Begriff «ANCAassoziierte Vaskulitiden» (AAV) die Wegener sche Granulomatose (WG), die mikroskopische Polyangiitis (MPA) und das Churg-Strauss-Syndrom (CSS) zusammengefasst. Entsprechend der Grösse der befallenen Gefässe zählen die AAV zu den Kleingefässvaskulitiden. Charakteristisch für die AAV ist, dass in den entzündlichen Gefässläsionen in der Regel keine Immunkomplexe nachgewiesen werden können. Daher kommt auch die Bezeichnung «pauciimmune» Vaskulitis. Die zurzeit noch verwendeten Klassifikationskriterien (American College of Rheumatology 1990, Chapel Hill 1994) berücksichtigen die ANCA nicht, obwohl diese in der Klinik etabliert sind. Neue Klassifikationsund Diagnosekriterien sind in Entwicklung, es ist zu erwarten, dass die ANCA in diese Eingang finden. Klinik der ANCA-assoziierten Vaskulitiden Den AAV liegt eine Entzündung vorwiegend der kleinen arteriellen Gefässe zugrunde. So ist es möglich, dass je nach Ausdehnung des Gefässbefalls mehrere oder auch nur einzelne Organe von der Erkrankung betroffen sind. Die Symptome dieser Vaskulitiden sind von den betroffenen Organsystemen abhängig und können somit sehr uncharakteristisch sein. Beschwerden wie Abgeschlagenheit, Fieber oder Gewichtsverlust können im Vordergrund stehen. Vaskulitische Veränderungen der Haut, wie palpable Purpura, Ulzerationen oder auch eine leukozytoklastische Vaskulitis sind häufig. Alle AAV können Ursache eines pulmorenalen Syndroms sein. Bei allen Patienten mit systemisch entzündlichen Erkrankungen ohne eindeu- 3

4 Review tigen Fokus ist immer auch an eine AAV zu denken. ANCA können hier differentialdiagnostisch hilfreich sein. Laborchemisch sind die Entzündungsparameter (z.b. BSG und CRP) meist deutlich erhöht. Im Blutbild können sich sowohl eine Anämie als auch eine reaktive Thrombozytose zeigen. Im Folgenden soll kurz auf die einzelnen Entitäten und ihre Assoziation mit spezifischen ANCA eingegangen werden. Morbus Wegener Beim Morbus Wegener handelt es sich um eine granulomatöse Entzündung der kleineren und z.t. auch mittleren Gefässe. Meistens tritt die Krankheit mit Sym- Vorkommen AAV (ANCA-assoziierte Vaskulitiden) Andere Erkrankungen Immunfluoreszenz- Muster (äthanolfixierte Granulozyten) C-ANCA P-ANCA P-ANCA oder atypisch Häufigstes Antigen (ELISA) Beschrieben bei 4 VI) Nekrotisierende Vaskulitis V) Endothelschäden durch Sauerstoffradikale und PR3, deren Inaktivierung durch ANCA gehemmt wird PR3 MPO Diverse, viele unbekannt M. Wegener (meist PR3-ANCA) Mikroskopische Polyangiitis (meist MPO-ANCA) Churg-Strauss-Syndrom (meist MPO-ANCA) I) Inaktiver Granulozyt IV) Adhäsion und Degranulation ptomen im Bereich der oberen Atemwege, der Lunge und der Nieren auf, aber auch andere Organe können betroffen sein. Die Jahresinzidenz liegt bei ca. zehn Neuerkrankungen pro Million Einwohner, die Prävalenz bei ca. hundert Fällen pro Million Einwohner, wobei jeweils deutliche regionale Unterschiede beschrieben sind. Bei lokalisierter Erkrankung kann sich ein Morbus Wegener zunächst als chronische Sinusitis zeigen. Ein blutiges Sekret aus der Nase, vermischt mit Borken, sollte auch an einen Morbus Wegener denken lassen. Bei einem ausgedehnteren Befall können unterschiedlichste pulmonale Befunde auftreten, unter anderem kann sich Rheumatoide Arthritis, chronisch entzündliche Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa > M. Crohn), Autoimmunhepatitis, Zystische Fibrose und weitere Abb. 1: ANCA-Muster in der Immunfluoreszenzmikroskopie: ANCA mit klassischem zytoplasmatischem granulärem Fluoreszenzmuster (C-ANCA), ANCA mit einer perinukleären Fluoreszenz (P-ANCA) und ANCA mit atypischer Färbung. II) Zytokininduzierte Expression von PR3 und Adhäsionsmolekülen an Oberfläche III) Aktivierung durch ANCA-Bindung an PR3 Legende Postulierter bakterieller Infect Proteinase 3 (PR3) PR3-ANCA LFA-1 (Adhäsionsmolekül) ICAM-1 (Adhäsionsmolekül) Abb. 2: ANCA (hier PR3-ANCA) binden sich an Granulozyten, die z.b. durch eine Infektion aktiviert wurden, und lösen in kleinen Gefässen die Freisetzung lysosomaler Enzyme aus. Diese führen dann zu den nekrotisierenden Veränderungen der kleinen Gefässe. der Morbus Wegener in der Bildgebung wie eine Tuberkulose darstellen und umgekehrt. Bei unklaren Lungenbefunden gehört diese Erkrankung somit immer in die differentialdiagnostischen Überlegungen. Eine Nierenbeteiligung tritt beim Morbus Wegener bei über 70% der Patienten in Form einer rasch progredienten Glomerulonephritis auf. Diese kann zu einem irreversiblen Verlust der Nierenfunktion führen. Neu auftretende Lähmungserscheinungen oder Gefühlsstörungen im Sinne einer Mononeuritis sind bei Befall der Gefässe peripherer Nerven möglich. Entzündungen der Augen, meist in Form einer Episkleritis, sind ebenfalls nicht ungewöhnlich und z.t. visusbedrohend. Histologisch typisch für den M. Wegener sind eine granulomatöse Entzündung mit Nachweis von Riesenzellen sowie eine nekrotisierende Vaskulitis der kleinen arteriellen Gefässe. In der Untersuchung mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sind bei 90% der Patienten mit aktivem M. Wegener C-ANCA nachweisbar, gelegentlich P-ANCA. Das Zielantigen ist bei 80 95% der Fälle PR3, seltener MPO. Bei limitierter Ausbreitung (z.b. nur Beteiligung der oberen Atemwege oder isolierter Nierenbefall) können die ANCA negativ sein. Bei Bestimmung von ANCA mittels ELISA können Veränderungen der Konzentration von PR3- oder MPO-ANCA gemessen werden. Diese Resultate lassen bei Morbus Wegener z.t. Rückschlüsse auf die Krankheitsaktivität oder das Rezidiv risiko zu. Die ANCA tragen jedoch nicht als alleiniger Faktor zur Krankheitsentstehung bei. So kann beim individuellen Patienten der Anstieg eines ANCA-Wertes auf ein Rezidiv der Vaskulitis hinweisen, diese Beobachtung lässt sich jedoch nicht verallgemeinern. Die Behandlungsindikation wird deshalb weiterhin durch das klinische Bild bestimmt. Mikroskopische Polyangiitis Die mikroskopische Polyangiitis (MPA) wurde früher als besondere Verlaufsform der Polyarteriitis nodosa betrachtet. Charakteristisch sind die Entwicklung einer rasch progredienten Glomerulonephritis und pulmonale Blutungen. Den AAV liegt eine Entzündung der kleinen arteriellen Gefässe zugrunde Allgemeinsymptome und eine Hautbeteiligung in Form der palpablen Purpura sind klinisch zusätzlich erfassbar. Bei 70% der Patienten sind in der Immunfluoreszenz ANCA (meist P-ANCA) nachweisbar. Im ELISA entspricht dies fast ausschliesslich MPO- ANCA. Bei Nachweis von PR3-ANCA ist die Abgrenzung zum M. Wegener schwierig.

5 Review Churg-Strauss-Syndrom Beim Churg-Strauss-Syndrom bestehen neben allgemeinen Krankheitssymptomen typischerweise eine Eosinophilie im Blut, und aus der Vorgeschichte ist fast immer ein allergisches Asthma bekannt. Eine schon früh im Krankheitsverlauf im Vordergrund stehende Rhinitis, mit zum Teil ausgeprägter Polypenbildung, kann auf die Diagnose hinweisen. Zusätzlich treten systemische Manifestationen auf, z.b. eine Sinusitis oder eine Mononeuritis multiplex. Im Blutbild ist eine Eosinophilie zwar typisch, jedoch nicht immer vorhanden. Radiologisch werden flüchtige, migratorische pulmonale Infiltrate beschrieben. Histologisch werden eosinophilenreiche, granulomatöse, nekrotisierende vaskulitische Läsionen beschrieben. Die Erkrankung ist insgesamt selten mit einer Inzidenz von etwa drei Erkrankten auf 1 Million Einwohner, wobei regionale Unterschiede bestehen. Bei etwa 50% der Patienten sind mittels Immunfluoreszenz ANCA nachweisbar, häufig handelt es sich dabei um Antikörper, welche gegen MPO gerichtet sind, seltener sind PR3-ANCA. Renal limitierte Vaskulitis Bei der renal limitierten Vaskulitis handelt es sich um eine pauci-immune Vaskulitis der Niere mit fehlender Systembeteiligung. Der ANCA-Nachweis, überwiegend MPO-ANCA, gelingt fast immer. Im Verlauf können zusätzliche systemische Manifestationen auftreten, so dass dann eine Klassifizierung als Morbus Wegener oder MPA möglich wird. Medikamenteninduzierte ANCAassoziierte Vaskulitis Vor allem Propylthiouracil, Hydralazin, Minocyclin, aber auch Kokain können eine oft lokal begrenzte Vaskulitis verursachen. Seltener sind schwere Verläufe, die eine intensive Immunsuppression benötigen. Häufig werden P-ANCA nachgewiesen, welche gelegentlich im ELISA MPO- ANCA entsprechen, daneben können aber vor allem auch atypische ANCA mit anderen Zielantigenen (z.b. Lactoferrin oder Elastase) gefunden werden. Nichtvaskulitische Krankheitsbilder mit ANCA-Nachweis Neben den AAV wurde bei einer Reihe nichtvaskulitischer Krankheitsbilder der Nachweis von ANCA mittels Immunfluoreszenz beschrieben. Beispiele sind aus dem rheumatischen Formenkreis die rheumatoide Arthritis, der systemische Lupus erythematodes oder Myositiden. Auch bei chronischentzündlichen Darmerkrankungen, bei der primär sklerosierenden Cholangitis und der Autoimmunhepatitis, bei granulomatösen Entzündungen wie der Tuberkulose und Sarkoidose, bei zystischer Fibrose und bei der subakuten Endokarditis können ANCA gefunden werden. Diese Erkrankungen sind deshalb bei der Interpretation einer positiven Immunfluoreszenz für ANCA in der Differentialdiagnose zu berücksichtigen. Meistens entspricht die Beschreibung einem atypischen ANCA-Muster, welches im Direktnachweis mittels ELISA nur selten durch Antikörper gegen MPO oder PR3 bedingt ist. Die Zielantigene können Lactoferrin, Cathepsin G, Elastase, Lysozym, bactericidal/ permeability-increasing Protein und andere sein, sie werden mangels Aussagekraft normalerweise nicht bestimmt. Bei der Colitis ulcerosa können P-ANCA deutlich häufiger (50 70%) nachgewiesen werden als beim Morbus Crohn (10 30%). In der Abgrenzung dieser beiden Krankheiten voneinander können deshalb solche P-ANCA-Muster ohne deutlich positiven Nachweis von PR3- bzw. MPO-ANCA hilfreich sein. ANCA-Bestimmung: Indikation und Interpretation der Resultate Grundsätzlich hängt die diagnostische Bedeutung eines Testresultats von der Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen der Verdacht auf systemische Vaskulitis z.b. bei: unspezifischen Allgemeinsymptomen (z.b. Fieber, Gewichtsverlust, Myalgien, Arthralgien) Arthritis systemischer Entzündung Glomerulonephritis, Lungenblutung oder beides (pulmorenales Syndrom) Vaskulitische Hautveränderungen/Livedo reticularis Rundherd(e)/Infiltrate im Thorax-Röntgenbild Antibiotikaresistente Pneumonie Vorgeschichte von allergischem Asthma Nasenschleimhauterosionen, Epistaxis Langdauernde Sinusitis/Otitis, chronische Rhinitis mit Polypenbildung Stenose tracheal/subglottisch Retroorbitaler Tumor Mononeuritis Tab. 1: Hinweise auf ANCA-assoziierte Vaskulitiden, welche für eine ANCA-Bestimmung sprechen. Erkrankung ab. Die AAV sind sehr seltene Erkrankungen. Bei einem Einsatz der ANCA-Immunfluoreszenzdiagnostik als Screeningmethode ergibt sich somit wahrscheinlich eine grosse Zahl von Resultaten, welche bezogen auf die Frage nach AAV falsch positiv sind. Zum Beispiel kann beim Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) gelegentlich ein ANCA- Muster vorgetäuscht werden. Gemäss internationalem Konsensus soll deshalb eine Untersuchung mittels Immunfluoreszenz durchgeführt werden, begleitet von einem ELISA zur Bestimmung der MPO- und PR3-Spezifität. Die primär spezifische Bestimmung von PR3- und MPO-ANCA mittels ELISA kann bei gezielter Fragestellung nach AAV eine alternative Strategie sein. Die Autoimmunserologie ist ein Baustein in der Diagnostik der AAV und muss in Zusammenschau aller Befunde interpretiert werden. Im Hinblick auf eine meist intensive längerfristige Therapie mit potentiell gefährlichen Nebenwirkungen muss unbedingt eine exakte Diagnostik durchgeführt werden. Dazu gehört neben der Klinik und den Laboruntersuchungen immer auch eine histologische Untersuchung von geeignetem Gewebe. Wenn sich bei unerklärten Allgemeinsymptomen der Verdacht auf eine Vaskulitis ergibt, sollte die Bestimmung von ANCA in Betracht gezogen werden. Die Autoimmunserologie ist ein Baustein in der Diagnostik der AAV und muss in Zusammenschau aller Befunde interpretiert werden Nicht alle systemischen Vaskulitiden sind mit dem Vorkommen von ANCA assoziiert, deshalb schliesst eine negative ANCA-Bestimmung eine Vaskulitis nicht aus. Die Indikation zur Bestimmung von ANCA wird erhärtet, wenn zusätzliche Hinweise für eine AAV gefunden werden (Tab. 1). Ergibt die Immunfluoreszenzuntersuchung ein positives Resultat für C- (oder P-) ANCA, und werden im ELISA PR3-ANCA gefunden, so ist bei positiver Klinik ein Morbus Wegener wahrscheinlich. Positive P- (oder C-) ANCA und ein Nachweis von MPO- ANCA im ELISA weisen eher auf das Vorliegen einer MPA oder eines CSS hin (immer vorausgesetzt, dass auch klinisch entsprechende Hinweise vorliegen). In beiden Fällen, aber auch wenn bei negativen Resultaten der Verdacht bestehen bleibt, sollte hier mit einem Spezialisten Kontakt aufgenommen werden. Der nächste Schritt, die histologische Bestätigung und die folgende Behandlung, sollte auf jeden Fall spezialärztlich begleitet werden. 5

6 DIE ASSAYS Zusammenfassung Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) umfassen eine heterogene Gruppe von Antikörpern, die in der Differentialdiagnostik der Vaskulitiden eine grosse Bedeutung haben. In der mikroskopischen Immunfluoreszenzuntersuchung kann für ANCA ein charakteristisches Muster beschrieben werden. Es werden hauptsächlich drei verschiedene Muster unterschieden: ANCA mit klassischem zytoplasmatischem granulärem Fluoreszensmuster (C-ANCA), ANCA mit einer perinukleären Fluoreszenz (P-ANCA) und ANCA mit atypischer Färbung. Zielantigene wurden charakterisiert, ANCA gegen diese Zielantigene können mittels Enzymimmunoassays (EIA) gemessen werden. PR3-ANCA ergeben in der Regel ein C-ANCA-Muster, MPO-ANCA ergeben meistens ein P-ANCA-Muster. Wegen ihrer Verbindung mit den ANCA (speziell PR3 und MPO-ANCA) werden unter dem Begriff «ANCA-assoziierte Vaskulitiden» (AAV) die Wegener sche Granulomatose (WG), die mikroskopische Polyangiitis (MPA) und das Churg- Strauss-Syndrom (CSS) zusammengefasst. Bei allen Patienten mit systemisch-entzündlichen Erkrankungen ohne eindeutigen Fokus ist immer auch an eine AAV zu denken. ANCA können hier differentialdiagnostisch hilfreich sein. Eine ANCA-Untersuchung soll immer mittels Immunfluoreszenz durchgeführt werden, begleitet von einem EIA zur Bestimmung der MPO- und PR3-Spezifität. In jedem Fall muss die Diagnose durch eine histologische Untersuchung gesichert werden. Liegt der Verdacht auf eine nekrotisierende Vaskulitis vor, ist eine Überweisung zum Spezialisten sinnvoll. Empfohlene Literatur Kallenberg CG, Heeringa P, Stegeman CA. Mechanisms of Disease: pathogenesis and treatment of ANCA-associated vasculitides. Nat Clin Pract Rheumatol. 2006;2(12): Little MA, Smyth CL, Yadav R, Ambrose L, Cook HT, Nourshargh S, et al. Antineutrophil cytoplasm antibodies directed against myeloperoxidase augment leukocyte-microvascular interactions in vivo. Blood. 2005;106(6): Bosch X, Guilabert A, Font J. Antineutrophil cytoplasmic antibodies. Lancet. 2006;368(9533): Aries PM, Hellmich B, Gross WL. Diagnose und Therapie der ANCAassoziierten Vaskulitiden. Dtsch Med Wochenschr. 2006;131(9): Holle JU, Gross WL. ANCA-associated vasculitides: Pathogenetic aspects and current evidence-based therapy. J Autoimmun. 2009;32(3 4): Korrespondenz: Dr. med. Thomas Vogt Rheumatologische Universitätsklinik Felix Platter-Spital Postfach CH-4012 Basel Switzerland Thomas.vogt@fps-basel.ch 6 EliA MPO S und EliA PR3 S Vorreiter automatisierter ANCA-Tests Nina Olschowka Global Marketing, Phadia GmbH, Munzinger Straße 7, D Freiburg Phadia bietet neue, hochempfindliche EliA Tests für den Nachweis von ANCAassoziierter Vaskulitis an: EliA MPO s und EliA PR3 s. Beide Tests arbeiten mit der sogenannten Ankertechnologie (vgl. Abbildung unten). Der Vorteil im Vergleich zu herkömmlichen EliA Tests ist eine erhebliche Steigerung der Empfindlichkeit bei unveränderter Spezifität. Mit anderen Worten: Es werden mehr Patienten mit Wegener scher Granulomatose oder Mikroskopischer Polyangiitis ermittelt, ohne dass ein höheres Risiko für falsch positive Ergebnisse besteht. Aus diesem Grund zählen die neuartigen, vollständig automatisierten EliA ANCA- Tests zu den leistungsstärksten Tests unter den kommerziellen ANCA-ELISA-Kits. In einer internationalen Konsenserklärung von 1999 [1] wurde vereinbart, dass das Screening für ANCA mittels indirekter Immunfluoreszenz (IIF) auf Ethanol-fixierten Granulozyten erfolgen und die Bestätigung positiver Ergebnisse mittels ELISA-Tests durchgeführt werden soll. Doch es wurde auch von einer alternativen Strategie mit hoher diagnostischer Genauigkeit berichtet, bei der im ersten Schritt ein sensitiver ELISA- Test oder EliA Test Anwendung findet und die IIF zur Bestätigung eingesetzt wird [2,3]. Trotz eindeutiger und statistisch bestätigter Nachweise wurde diese Alternative mit Misstrauen betrachtet, da es sich bei der IIF um die klassische Screening-Methode handelt. Mit der neuen Generation hochempfindlicher EliA Tests ist es an der Zeit, alte Traditionen in Frage zu stellen. Das Prinzip dieser neuen Technologie wird in der folgenden Abbildung dargestellt: Die Antigene (Proteinase 3 bzw. Myeloperoxidase) werden mittels sogenannter Fangantikörper (Capture- Technologie) oder Ankermoleküle wie bei den neuen EliA Tests indirekt beschichtet. Dadurch können selbst die patientenspezifischen Proteinase 3 anti-pr3-antikörper (Patient) Epitope klassische Festphase Antikörper ermittelt werden, die an Epitope gebunden sind, die bei direkter Beschichtung der Antigene möglicherweise nicht verfügbar sind (rote Dreiecke). Vorteile von EliA PR3 S und EliA MPO S l Eine neue Dimension der Sensitivität. l Höchste Spezifität, nur in sehr seltenen Fällen positiv bei anderen Autoimmunerkrankungen. l Zuverlässige und einfache Ermittlung von Vaskulitis-assoziierter ANCA mit vollautomatisierter EliA Methode. l Bessere Harmonisierung der Testergebnisse durch Standardisierung gemäß den neuen internationalen CDC-Referenzen für PR3-ANCA und MPO-ANCA. Die Ergebnisse werden in internationalen Einheiten (IU/ml) angegeben. Welche Veränderungen ergeben sich durch die neuen Tests? Wegen der andersartigen Beschichtung und der neuen Standardisierung werden die neuen Testergebnisse sich deutlich von ihren früheren Testergebnissen unterscheiden durch neue Werte, neue Messbereiche und neue Grenzwerte (Cut-off). Dies erschwert eine direkte Vergleichbarkeit der Werte im Rahmen des Monitorings der Krankheitsaktivität. Wir sind uns sicher, dass die gesteigerte klinische Wertigkeit der neuen Tests diesen Nachteil bei weitem ausgleicht. Literatur 1. Savige J et al. Am J Clin Pathol 1999; 111: Vermeersch P et al. Clin Chim Acta 2008; 397: Russel KA et al. Clin Immunol 2002; 103: Capture- Technologie Capture-AK Anker- Technologie

7 ERFAHRUNG ANCA TESTING BY HIGH SENSITIVE METHODS IN ANCA TESTING BY HIGH SENSITIVE METHODS IN ANCA-ASSOCIATED ASSOCIATED SYSTEMIC VASCULITIS (AASV) (AASV) DIAGNOSIS DIAGNOSIS *A. Radice, L.. Bianchi, *C. Farina, ^C. Zehnder, RA Sinico *Microbiology Institute & Nephrology and Clinical Immunology Unit,, Osp S. Carlo Borromeo, Milano, ITALY; ^Future-Lab, Sementina, CH. BACKGROUND PR3 and MPO-ANCA are important serological markers for small vessel vasculitis such as WG, MPA and CSS (AASV). In the clinical suspicion of AASV, ANCA-testing is very useful to confirm or exclude the diagnosis, assuming that the available methods possess high sensitivity, specificity and diagnostic accuracy. Although ANCA-testing is widely used to support diagnosis of AASV, until recently the diagnostic performances of the commercially available direct PR3 and MPO-ANCA assays were extremely variable, often lacking the basic standards. Subsequently, a significant improvement in PR3- ANCA performance was achieved by means of the novel and high performant assays (capture, anchor); unfortunately, the same progress was not achieved in MPO-ANCA assays. In this setting the novel EliA-MPO S could allow to get over the gap. AIM OF THE STUDY To evaluate the diagnostic performance of the novel, high sensitive EliA-MPO S and EliA-PR3 S in AASV patients. RETROSPECTIVE STUDY: PATIENTS Sera from 107 AASV (WG 55, MPA 52), 123 pathological (SLE, CTDs, RA, IBD, Cryoglobulinemia, non-aasv vasculitis, infectious) and 20 healthy controls, were retrospectively tested. AASV were selected on the basis of the clinical diagnosis, according to the available criteria & definitions (ACR, EUVAS, CHCC), irrespective of the disease activity / inactivity / extension, and ANCA status. METHODS EliA-MPO s S (Phadia) Diagn) EliA-PR3 s S (Phadia) Diagn) ANCA-IIF (EUROPLUS Granulocyte Mosaic 2, Euroimmun) All assays were performed following the suppliers instructions, and results calculated using the cut-off values suggested by the manifacturers RESULTS ANY TEST ALONE OR IN COMBINATION EliA MPO s EliA PR3 s EliA MPO s or PR3 s (any positivity) IIF IIF+ (EliA MPO s or PR3 s positivity) LH LH LH+ > 10 = test result very useful LH- < 0.2 = test result very useful 0.2 < LH- < 0.5 = test result of limited impact LH- > 0.5 = test result of poor impact DISCUSSION AND CONCLUSIONS The sensitivity and specificity of both, EliA-MPO S and EliA-PR3 S, in AASV diagnosis, was satisfactory; LH+/LH- and the diagnostic accuracy (data not shown) confirmed their ability in differentiating between patients with AASV and those who do not have the disease; the sensitivity of the combined tests for AASV diagnosis was as good (or something better) as the standard IIF technique. EliA-MPO S & PR3 S are calibrated against the CDC Human Ref. Sera #15 & #16, then the results are given in International Units. Such good performance makes the use of the combined EliA-MPO S & EliA-PR3 S a possible first step in the algorithm of ANCA testing, followed by the confirmation of the positive results with the standard IIF technique. This alternative algorithm shows the same diagnostic sensitivity of the usually used, with the IIF assay as screening test. Indeed, the combination of the two methods (IIF+EliA s ), as stated in the International Consensus, allows the best required specificity. PPV/NPV were not reported because they depend, other than the intrinsic features of the tests, on the prevalence of the target disease in the evaluated population (below). Then the PPV/NPV obtained in our high-prevalence cohort of patients (42.8%) cannot be extrapolated to other clinical settings. PPV Pre-test probability 7

8 Verfügbare Ausgaben AUSGABE AUSGABE AUSGABE AUSGABE Zöliakie Zöliakie EliA Celikey Rheumatoide Arthritis EliA CCP Automatisierung im Autoimmunlabor EliA auf dem ImmunoCAP 250 Serodiagnostik der RA AUSGABE AUSGABE AUSGABE AUSGABE S P E C I A L E D I T I O N 5th International Congress on Autoimmunity 2006, Sorrento, Italien RA Outcome Review CCP-AK Anti-citrull. Proteine/Peptide Antiphospholipid-Syndrom (APS) EliA TM APS Biosensor-Analyse von APS-AK S P E C I A L E D I T I O N 7th International Congress on Autoimmunity 2010, Ljubljana, Slovenia Phadia AG Sennweidstr Steinhausen / Schweiz Tel. +41 (0) 43 / Fax +41 (0) 43 / phadia.ch@phadia.com Phadia Austria GmbH Donau-City-Str Wien / Österreich Tel. +43 (0)1 / Fax +43 (0)1 / info.austria@phadia.com Phadia GmbH Munzinger Str Freiburg / Deutschland Tel. +49 (0)7 61 / Fax +49 (0)7 61 / info@phadia.com /2011