Anleitung zum Praktikum Mikroskopie

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1 Vorbemerkungen Anleitung zum Praktikum Mikroskopie Folgende Kenntnisse werden für das Praktikum vorausgesetzt (siehe Vorlesung Angewandte Optik) - Aufbau des zusammengesetzten Mikroskops - Abhängigkeit von Apertur und Auflösungsvermögen - Prinzip der Köhlerschen Beleuchtung - Strahlengänge des Durchlicht- und des Auflichtmikroskops bei Hellfeld- und Dunkelfeldbeleuchtung - Lernziele - Handhabung verschiedener Lichtmikroskope mit Durchlicht- und Auflichtbeleuchtung für die gängigen Beleuchtungsverfahren - laterale Größenmessung mit dem Lichtmikroskop - Messungen mit dem Zweistrahl-Interferenzmikroskop Die Leistungsklassen der Lichtmikroskope Man unterscheidet die Lichtmikroskope nach ihren Einsatzmöglichkeiten für die verschiedenen mikroskopischen Verfahren und nach ihrer Leistungsklasse. Einfachste Mikroskope, so genannte Schülermikroskope verfügen in der Regel über keine eingebaute Beleuchtung, sondern lenken das Beleuchtungslicht über Spiegel ins Mikroskop. Die Objektive sind nicht korrigiert und mit allen möglichen Bildfehlern behaftet. Es gibt keinen oder nur einen einfachen Kondensor. Dieser Mikroskoptyp wird hier nicht verwendet. Labormikroskope sind normalerweise für bestimmte Aufgaben konzipiert und nicht für alle gängigen Verfahren ausbaubar. Es ist möglich, auch hoch korrigierte Objektive zu verwenden, die zu optimalen Bildergebnissen führen. Der maximale Sehfelddurchmesser liegt bei 16 bis 18 mm. Vertreter dieser Klasse ist bei uns das Mikroskop Zeiss Standard 16. Die höchste Leistungsklasse der Lichtmikroskope bilden die Forschungsmikroskope. Sie sind i. d. R. umrüstbar von Durchlicht auf Auflicht und verfügen über das umfangreichste Zubehör zur Realisierung aller lichtmikroskopischen Verfahren. Sehfelddurchmesser bis 28 mm (Großfeld) sind möglich. Wir verfügen über die Typen Leitz Orthoplan / Metalloplan / Metallux und Leica DMR / DMRM. Bei allen diesen Mikroskopen handelt es sich um aufrechte Mikroskope, das heißt die abbildende Optik befindet sich oberhalb des Objekts. Mikroskope, bei denen sich die abbildende Optik unterhalb des Objekts befindet, heißen umgekehrte, inverse oder gestürzte Mikroskope. 1

2 Abbildungsmaßstab und Vergrößerung sind zwei Begriffe, die auch in der Mikroskopie häufig nicht korrekt verwendet werden. Grundsätzlich gilt: Bei reellen Bildern sprechen wir von einem Abbildungsmaßstab M. Dieser gibt das Verhältnis von Bildgröße zur Objektgröße an. Der Begriff Vergrößerung bezeichnet tatsächlich eine Winkelvergrößerung. Ein Gegenstand, der durch eine Lupe oder ein Fernglas betrachtet wird, erscheint dem Betrachter unter einem größeren Winkel. Es gibt hier kein reelles Bild (also kein Bild, das man auf einem Schirm auffangen könnte) sondern man beobachtet ein virtuelles Bild. Demnach bewirken Objektive, die nach Unendlich abbilden, eine Vergrößerung. Das Objekt steht in der vorderen Brennebene des Objektivs. Die Vergrößerung ist auf dem Objektiv mit einem x graviert (z. B. 10x). Ferner sollte auch noch das Zeichen graviert sein. Dieses besagt, dass das Bild des Objekts im Unendlichen liegt. Man sagt auch, die optische Tubuslänge ist unendlich. Um ein reelles Zwischenbild zu erzeugen, benötigt man bei Unendlichobjektiven eine Tubuslinse, die, je nach Brennweite, eine Erhöhung (z. B. 1,25 x) oder Verringerung (z. B. 0,8 x) des Abbildungsmaßstabs (!) im reellen Zwischenbild bewirkt oder diesen nicht beeinflusst (1 x). Der so genannte Tubusfaktor berechnet sich aus Brennweite der Tubuslinse : 250 mm. Objektive, die ein reelles Zwischenbild erzeugen, haben einen Abbildungsmaßstab. Er müsste eigentlich als Verhältnis angegeben werden (z. B. 10:1). Da aber 10:1 mathematische dasselbe ist wie 10, hat sich seit den1960er Jahren die verkürzte Schreibweise bei Objektivgravuren eingebürgert. Ferner muss auf diesen Objektiven noch die optische Tubuslänge graviert sein (meist 160 oder 170 mm). Das Okular bildet das Zwischenbild vergrößert nach Unendlich ab. Die Okularvergrößerung berechnet sich aus 250 mm : Brennweite des Okulars. Unsere Augenlinse erzeugt ein reelles Objektbild auf der Netzhaut. Wenn wir ins Mikroskop schauen, sprechen wir von der (subjektiven) Vergrößerung. Sie berechnet sich aus Abbildungsmaßstab des Objektivs x Okularvergrößerung oder Objektivvergrößerung x Tubusfaktor x Okularvergrößerung Mikroskopische Bilder, die wir auf dem Bildschirm oder als Ausdrucke betrachten, haben einen Abbildungsmaßstab. Er berechnet sich, wie oben erwähnt, aus Bildgröße : Objektgröße Da die Objektgröße normalerweise nicht einfach bestimmt werden kann, hat es sich bewährt, die Objektfeldbreite anzugeben. Diese gibt an, welcher Strecke im Objekt die gesamte Bildbreite entspricht. Eine andere verbreitete Methode ist es, einen Referenzbalken bekannter Länge ins Bild zu setzen. 2

3 Weitere Gravuren auf Mikroskopkomponenten Die Gravuren auf den optischen Komponenten sind für deren typgerechte Verwendung notwendig: Objektive Neben Abbildungsmaßstab bzw. Vergrößerung und optischer Tubuslänge ist auf jedem Objektiv die numerische Apertur angegeben, häufig nur als Zahlenwert, z. B. 0,65, manchmal auch n. A. 0,65. Eine weitere wichtige Angabe ist die Deckglaskorrektur. Objektive mit Aperturen bis 0,30 können mit oder ohne Deckglas verwendet werden (übliche Gravur: - ). Bei höher aperturigen Objektiven ist entweder die Deckglasdicke angegeben, i.d.r. 0,17 (mm) oder, wenn kein Deckglas verwendet werden darf, 0. Darüber hinaus muss, außer bei einfachen Achromaten, die Korrektion angegeben sein: Plan oder Pl bei Objektiven mit geebnetem Bildfeld, Fl, Fluotar, Neofluar o. ä. bei Fluoritobjektiven (Halbapochromate), Apo o.ä. bei Apochromaten. Okulare Hier ist zu unterscheiden zwischen Huygensokularen (W oder keine Gravur neben der Vergrößerung) und Kompensationsokularen, die im Zusammenspiel mit dem Objektiv vor allem die Bildfeldwölbung kompensieren (z. B. kpl, Periplan). Ferner sind Brillenträgerokulare durch ein Brillensymbol gekennzeichnet. Bei diesen Okularen ist die Austrittpupille so weit vor die Augenlinse gelegt, dass die Okulare mit Brille benutzt werden können. Tuben Wenn ein Tubus die Vergrößerung des Mikroskops beeinflusst, muss Tubusfaktor graviert sein. Ist kein Faktor graviert, ist der Tubusfaktor 1. Kondensor Die Kondensorapertur ist i.d.r. graviert, manchmal findet man auch weitere Angaben über die Korrektion. Die Einstellung der Köhlerschen Beleuchtung Die Beleuchtungseinstellung nach Köhler (August Köhler ) ist bei den meisten mikroskopischen Verfahren unbedingte Voraussetzung für ein auswertbares Bildergebnis, Ausnahmen: Dunkelfeldbeleuchtung und alle Einstellungen mit gering vergrößernden Objektiven (M < 10:1 bzw. V < 10x). Man beginnt bei der Einstellung des Mikroskops mit einem schwach vergrößernden Objektiv zum Beispiel 10/0,22. Dieses hat einen Arbeitsabstand von mehreren Millimetern, so dass man beim Fokussieren nicht versehentlich das Präparat zerstören kann. Außerdem erleichtert das große überblickbare Objektfeld das Auffinden des Objekts. Da die Objektive untereinander abgeglichen sind (das bedeutet, der Abstand zwischen Anschraubfläche am Objektivrevolver und Fokusebene ist bei allen Objektiven gleich) kann nach Fokussierung mit einem schwachen Objektiv das nächst stärkere eingeschwenkt werden, ohne dass das Präparat beschädigt wird, 3

4 obwohl die Baulänge des Objektivs mit der Vergrößerung steigt und damit der freie Arbeitsabstand kleiner wird. Im Folgenden werden die einzelnen Arbeitsschritte für die beiden Mikroskoptypen im Praktikum beschrieben Zeiss Standard 16 - Einschwenken des Objektivs 10/0,22 - Präparat auf den Objekttisch legen - Licht einschalten - Kondensor in Pos. J drehen, Kondensorkopf in den Strahlengang schwenken - Aperturblende und Leuchtfeldblende öffnen - Kondensor zum oberen Anschlag drehen - Objekt fokussieren - Leuchtfeldblende schließen - Kondensor absenken (nur wenige mm) bis die Leuchtfeldblende scharf im Objekt abgebildet wird - Blendenbild mittels der beiden Rändelschrauben am Kondensorträger zentrieren - Leuchtfeldblende öffnen - ein Okular aus dem Tubus ziehen - in die Öffnung schauen und die hintere Brennebene des Objektivs beobachten - Aperturblende schließen - Aperturblende mit den Einstellelementen am Kondensor zentrieren - Aperturblende so weit schließen, dass sie gerade die Objektivbrennebene freigibt - - Okular wieder einsetzen - Leuchtfeldblende so weit schließen, dass sie gerade das Bildfeld frei gibt Leitz Orthoplan - Einschwenken des Objektivs 10/0,30 - Präparat auf den Objekttisch legen - Licht einschalten - Hellfeldkondensor montieren, Kondensorkopf in den Strahlengang schwenken - Aperturblende und Leuchtfeldblende öffnen - Kondensor zum oberen Anschlag drehen - Objekt fokussieren - Leuchtfeldblende schließen - Kondensor absenken (nur wenige mm) bis die Leuchtfeldblende scharf im Objekt abgebildet wird - Blendenbild mittels der beiden Rändelschrauben am Kondensorträger zentrieren - Leuchtfeldblende öffnen - ein Okular aus dem Tubus ziehen - in die Öffnung schauen und die hintere Brennebene des Objektivs beobachten - Aperturblende so weit schließen, dass sie gerade die Objektivbrennebene freigibt - - Okular wieder einsetzen - Leuchtfeldblende so weit schließen, dass sie gerade das Bildfeld frei gibt 4

5 Anmerkung: um die Apertur des Objektivs und damit das Auflösungsvermögen voll auszunutzen, muss die Aperturblende die hintere Objektivbrennebene gerade ganz freigeben. In der Praxis hat es sich jedoch bewährt, vor allem bei kontrastarmen Objekten, die Aperturblende etwas weiter zu schließen minimal auf etwa dreiviertel des Durchmessers der Objektivbrennebene. Mit einem geringen Auflösungsverlust erhält man dann ein kontrastreicheres Bild. Bei Objektivwechsel sind Zentrierung und Blendeneinstellungen jeweils zu korrigieren. Beachte: je höher der Abbildungsmaßstab bzw. die Vergrößerung des Objektivs, desto höher ist seine Apertur und desto kleiner ist das beobachtete Objektfeld. Es muss also die Aperturblende bei steigender Vergrößerung weiter geöffnet und die Leuchtfeldblende weiter geschlossen werden. Die Aufgaben 1. Vergrößerungsreihe im Hellfeld-Durchlicht 2. Vergleich Hellfeld-Durchlicht Dunkelfeld-Durchlicht 3. Vergleich Hellfeld-Durchlicht Phasenkontrast-Durchlicht 4. Größenmessung im Mikroskop 5. Differential-Interferenzkontrast (DIC) 6. Messung von kleinen Niveauunterschieden auf Objektoberflächen sowie von Krümmungsradien sphärischer Flächen 7. Photowettbewerb Anfertigung einer ausstellungsreifen Mikrophotographie mit einem selbst gewählten Abbildungsverfahren zu einem der Themen Pollen, Sporen, Samen, Früchte Fasern und Gewebe (2 Ausdrucke im Format 30x40 cm, unbeschnitten, nicht aufgezogen, Daten-CD) 5

6 Aufgabe 1: Vergrößerungsreihe im Hellfeld-Durchlicht Hinweis: Bevor man die unten beschriebenen Arbeitsschritte durchläuft, ist es notwendig, die Grundeinstellung nach Köhler wie oben beschrieben vorzunehmen. Am Mikroskop Zeiss Standard 16 soll von einem histologischen Schnitt mit den Objektiven eine Bilderserie mit den Objektiven 3,2/0,07, 10/0,22, 40/0,65 Ph2 und 100/1,25 Öl angefertigt werden. Bei Verwendung eines Leitz Mikroskops (Orthoplan / Metalloplan) weichen die Objektivdaten ab. Mit schwachen Objektiven (bis M=6,3:1) ist die Einstellung der Köhlerschen Beleuchtung wie oben beschrieben nicht möglich. Die Leuchtfeldblende fungiert hier als Aperturblende. Arbeitsschritte am Mikroskop Standard (Bei Verwendung der Leitzmikroskope obige Beschreibung beachten) - Einschwenken des Objektivs 3,2/0,07 - Präparat auf den Objekttisch legen - Licht einschalten - Kondensor in Position J drehen - Aperturblende und Leuchtfeldblende öffnen - Kondensorkopf und Hilfslinse aus dem Strahlengang schwenken - Kondensor zum oberen Anschlag drehen - Objekt fokussieren - ein Okular aus dem Tubus nehmen - in die Öffnung schauen und die Leuchtfeldblende so schließen, dass sie gut zwei Drittel der hinteren Objektivbrennebene freigibt - 1. Aufnahme - Hilfslinse und Kondensorkopf wieder einschwenken (Achtung: die Hilfslinsenhalterung muss über einen kleinen Widerstand hinweg einrasten) - Objektiv 10/0,22 einschwenken, nachfokussieren und Mikroskop nach Köhler einstellen - 2. Aufnahme - Objektiv 40/0,65 Ph2 einschwenken, nachfokussieren und Blendeneinstellungen korrigieren - 3. Aufnahme 6

7 - Objektivrevolver in eine Stellung zwischen Objektiv 40/0,65 und 100/1,25 Öl schwenken - einen Tropfen Immersionsöl auf die beleuchtete Objektstelle geben und Objektiv 100 einschwenken, das Öl muss eine blasenfreie Verbindung zwischen Deckglas und Frontlinse des Objektivs bilden - Aperturblende öffnen - nachfokussieren - 4. Aufnahme - anschließend Objektiv und Präparat mit Zellstoff reinigen Beim Objektivwechsel darauf achten, dass das Objekt nicht verschoben wird. 7

8 Aufgabe 2: Vergleich Hellfeld-Durchlicht Dunkelfeld-Durchlicht Am Mikroskop Leitz Orthoplan sollen im Durchlicht Hellfeld- und Dunkelfeldbild eines Diatomeenpräparats miteinander verglichen werden (Diatomeen = Kieselalgen sind Protozoen = Einzeller, die nach dem Absterben Kieselskelette hinterlassen, deren feine Strukturen zum Test des Auflösungsvermögens von Mikroskopen verwendet werden). Dunkelfeldbilder sind äußerst empfindlich gegen Schmutzpartikel oberhalb und unterhalb der Fokusebene. Das Präparat ist daher sorgfältig zu reinigen. Arbeitsschritte: - Einstellen der Köhlerschen Beleuchtung mit dem Objektiv 40/0,65 und dem - Hellfeldkondensor - 1. Aufnahme - Hellfeldkondensor gegen Dunkelfeldkondensor tauschen und darauf achten, dass das Objekt dabei nicht verschoben wird und die lose aufliegende Zentralblende im Kondensor verbleibt - Kondensor bei halb geöffneter Leuchtfeldblende in Z-Richtung verschieben und dabei die Entstehung eines mehr oder weniger zentralen runden Schattens beobachten, der beim Heben und Senken des Kondensors größer oder kleiner wird - Schatten mit den Schrauben am Kondensor zentrieren - Leuchtfeldblende öffnen - durch Heben und Senken des Kondensors möglichst dunklen Untergrund einstellen - 2. Aufnahme Aufgabe 3: Vergleich Hellfeld-Durchlicht Phasenkontrast-Durchlicht Ein Diatomeenpräparat soll mit dem Zeiss Standard 16 Mikroskop im Hellfeld und im Phasenkontrast nach Zernike (Frits Zernike, , 1953 Nobelpreis in Physik) eingestellt und photographiert werden. Arbeitsschritte - Hellfeldbild mit dem Objektiv 40/0,65 Ph2 einstellen - 1. Aufnahme - ein Okular gegen ein Einstellfernrohr (Bertrandlinse) tauschen und durch herausziehen der Augenlinse das Fernrohr auf den grauen Ring in der hinteren Objektivbrennebene (Phasenring) fokussieren - Kondensor in Stellung 2 bringen, dabei das Objekt nicht verschieben - Ringblende im Kondensor mittels der Zentrierhebel mit dem Phasenring in Deckung bringen (beachte: der Phasenring ist etwas breiter als das Ringblendenbild) - Okular wieder einsetzen - 2. Aufnahme 8

9 Aufgabe 4: Größenmessung im Mikroskop Die Software zur Motic 2300 Kamera enthält ein Messwerkzeug für laterale Größenmessungen in der Objektebene. Dieses muss für das jeweilige Objektiv, mit dem gemessen werden soll, kalibriert werden. Zur Kalibrierung dient ein Testobjekt (Calibration slide), das ein Kreuz von Messlinien (unterteilt in 1/100 mm-intervalle) und 4 Messkreise unterschiedlichen Durchmessers enthält. Für die Kalibrierung soll bei dieser Aufgabe das Linienkreuz verwendet werden. Dazu wird das Zentrum des Kreuzes aufgenommen. Anschließend wird das Werkzeug Messung / Kalibrierassistent aufgerufen und die Kalibrierung nach Anleitung für ein Objektiv durchgeführt. Abschließend wird in einem Diatomeenpräparat die Größe eines Objekts gemessen und das Ergebnis dokumentiert. Aufgabe 5: Differential-Interferenzkontrast (DIC) DIC ist ein Abbildungsverfahren, das, wie der Phasenkontrast, Phasenverschiebungen im Objekt sichtbar macht. Im Gegensatz zum Phasenkontrast ist die Untersuchung auch von dickeren" Präparaten möglich. Dem gegenüber besteht der Nachteil, dass die Kontrastierung richtungsabhängig ist, regelmäßig strukturierte Objekte wie Gitter müssen deshalb unter Beobachtung gedreht werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden. Für die Versuche steht jeweils ein Leica DM-Mikroskop für Durchlicht und Auflicht zur Verfügung. Die Aufgabe kann wahlweise am Durchlicht- oder Auflichtmikroskop durchgeführt werden. A DIC Durchlicht Es ist ein Präparat anzufertigen (rote Blutkörperchen oder Epithelzellen der Mundschleimhaut) und im DIC am Leica Mikroskop DM R mit folgenden Einstellungen zu photographieren: a) ohne λ-platte mit grauem und schwarzem Untergrund b) mit λ-platte mit mindestens zwei verschiedenfarbigen Untergründen c) zum Vergleich im Phasenkontrast und im Hellfeld Präparation eines Blutausstrichs Wegen Infektionsgefahr darf jeder nur sein eigenes Blutpräparat und seine eigene Blutlanzette verwenden. Alle Präparate und Lanzetten sind in einer bereitstehenden Plastik-Petrischale zu entsorgen. Ein kleiner Blutstropfen wird auf einen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt und dieses mit Paraffin umrandet. Idealerweise sollte der Tropfen so klein sein, dass er sich beim Auflegen des Deckglases nicht bis an dessen Rand ausbreitet. Die Deckglasoberfläche darf nicht mit dem Finger berührt werden, zum Andrücken Pinzette verwenden. Präparation von Mundschleimhaut-Epithelzellen Man schabt mit dem Finger etwas Speichel von der Wangenschleimhaut, tupft ihn auf einen Objektträger, legt ein Deckglas auf und umrandet mit Paraffin. Die Deckglasoberfläche darf nicht mit dem Finger berührt werden, zum Andrücken Pinzette verwenden. 9

10 Arbeitsschritte Die Nummerierungen im Text beziehen sich auf die Bilder in der Anleitung (Beispiel: 1/7 bedeutet Abb.1, Nr. 7). Hinweis: Folgende Komponenten, die in den Bildern dargestellt sind, sind am DM Durchlichtmikroskop nicht vorhanden: 1/3, 1/4, 1/5, 1/9; 2/3, 2/4, 2/8, 2/9, 2/10, 2/11 ; 3/6 - Licht einschalten (2/14), ggf. mit (2/13) auf Durchlicht schalten - Objektiv 10x einschwenken - Objekt auflegen - Kondensor-Revolverscheibe in Pos. H (= Hellfeld) schwenken 2/6) - Revolverscheibe (2/5) in Pos. HF (=Hellfeld) schwenken - Aperturblende öffnen - Kondensor zum oberen Anschlag fahren (1/12) - Objekt fokussieren (1/20 oder 2/12) - Leuchtfeldblende schließen (1/22) und ins Objekt fokussieren (1/12) - Objektiv 20x einschwenken, nachfokussieren, dann Objektiv 40x einschwenken, nachfokussieren und Leuchtfeldblende einstellen - Aperturblende nach Köhler einstellen - wenn der Blutausstrich betrachtet wird, Objektiv 100x Öl mit Immersionsöl verwenden - Analysator (1 /2) mit der Beschriftung P" nach oben bis zur zweiten Raste einschieben (3/1), Schwenkhebel in Grundposition stellen - Polarisator (1/25) einschwenken und auf 90 drehen, der Bilduntergrund muss jetzt dunkelgrau erscheinen - Kondensor-Revolverscheibe dem Objektiv entsprechend in Pos. 20/40 bzw. 100 schwenken (2/6) - Revolverscheibe (2/5) in Pos. D, wenn der Kontrast schwach ist, in Pos. D1 schwenken - mittels Rändelschraube (3/7) (rechts am Tubusunterteil) mittelgrauen Untergrund einstellen (dadurch wird das obere Wollastonprisma verschoben) 1. Aufnahme - mittels Rändelschraube (3/7) am Tubusunterteil) dunkelst möglichen Untergrund einstellen 2. Aufnahme - Analysatorschieber mit der Beschriftung λ" nach oben bis zur zweiten Raste einschieben - Untergrundfarbe mit Rändelschraube 3/7 einstellen 3. und 4. Aufnahme mit zwei deutlich unterschiedlichen Untergrundfarben zum Vergleich Phasenkontrast einstellen, dazu - Polarisator und Analysator aus dem Strahlengang nehmen - dem Objektiv entsprechende Ringblende 2 oder 3 auf der Kondensor- Revolverscheibe einschwenken 10

11 - Aperturblende ganz öffnen - Zentrierung der Ringblende kontrollieren, dazu Bertrandlinse einschwenken(2/2) und mit dem schwarzen Schwenkhebel fokussieren - wenn die Ringblende nicht zum Phasenring im Objektiv zentriert ist, mit Schlüsseln (1/10) (beidseitig des Kondensorträgers) korrigieren, dazu die gefedert montierten Schlüssel eindrücken und drehen - Bertrandlinse ausschwenken 5. Aufnahme schließlich Hellfeld einstellen, dazu - Kondensor-Revolverscheibe in Stellung H bringen - Aperturblende nach Köhler einstellen 6. Aufnahme B DIC Auflicht Es ist eine Waferoberfläche im DIC am Leica Mikroskop DM RM mit folgenden Einstellungen zu photographieren a) ohne λ-platte mit grauem und schwarzem Untergrund b) mit λ-platte mit mindestens zwei verschiedenfarbigen Untergründen c) zum Vergleich im Hellfeld und im Dunkelfeld Arbeitsschritte Die Nummerierungen im Text beziehen sich auf die Bilder in der Anleitung (Beispiel: 1/7 bedeutet Abb.1, Nr. 7). Folgende Komponenten, die in den Bildern dargestellt sind, sind am DM RM Auflichtmikroskop nicht vorhanden: 1/3, 1/4, 1/5, 1/8, 1/9, 1/10, 1/12, 1/13, 1/14, 1/15, 1/16, 1/25; 2/2, 2/3, 2/6, 2/10; 3/6 - Licht einschalten (2/14), ggf. mit (2/13) auf Auflicht schalten - Auflichtmodul (Abb. 4) einschieben - Objektiv 10x einschwenken, Objekt auflegen - Revolverscheibe (2/5) in Pos. BF (bright field = Hellfeld) schwenken Aperturblende öffnen (4/3) - Objekt fokussieren (1/20 oder 2/12) - Objektiv auswählen, nachfokussieren und Leuchtfeldblende und Aperturblende nach Köhler einstellen (Zentrierhebel für Aperturblende 4/4 in Pos. 0, die Leuchtfeldblende ist fokussiert und muss nicht zentriert werden) - Analysator (1/2) mit der Beschriftung P" nach oben bis zur zweiten Raste einschieben (3/1), Schwenkhebel in Grundposition stellen - Polarisator (2/4) bis zur zweiten Raste einschieben 11

12 - Revolverscheibe (3/7) bei Verwendung der Objektive 10x und 20x in Pos. B2, bei Verwendung der Objektive 50x und 100x in Pos. C schwenken - mittelgrauen Untergrund durch Drehung der Revolverscheibe im Tubus aus der Rastposition nach links (Objektive 10x und 20x) bzw. nach rechts (Objektive 50x und 100x) einstellen (dadurch wird das obere Wollastonprisma verschoben) 1. Aufnahme - durch weiteres Verdrehen der Revolverscheibe (3/7) dunkelst möglichen Untergrund einstellen 2. Aufnahme - Analysatorschieber mit der Beschriftung λ" nach oben bis zur zweiten Raste einschieben - Untergrundfarbe durch Drehen der Revolverscheibe im Tubus aus der Rastposition wie oben einstellen 3. und 4. Aufnahme mit mindestens zwei deutlich unterschiedlichen Untergrundfarben zum Vergleich Dunkelfeldbild einstellen, dazu - Polarisator und Analysator aus dem Strahlengang nehmen - Modul (Abb. 4) aus dem Strahlengang nehmen - Revolverscheibe (3/7) in Pos. BF schwenken 5. Aufnahme Aufgabe 6: Messung von kleinen Niveauunterschieden auf Objektoberflächen sowie von Krümmungsradien sphärischer Flächen Eine der klassischen Anwendungen des Zweistrahl-Interferenzmikroskops ist die Messung von Niveauunterschieden an Oberflächen sowie von Krümmungsradien sphärischer Flächen. Das 1933 von Linnik (Vladimir Pavlowitsch Linnik, ) vorgestellte Auflicht-Interferenzmikroskop wurde eigens für diesen Zweck entwickelt und arbeitet nach dem Michelson-Prinzip. Das rhombische Teilerprisma 7 spaltet das von der Lampe 1 ausgehende Strahlenbündel in zwei interferenzfähige Teilbündel gleicher Intensität auf. Diese durchlaufen die Objektive 9 und 11, werden vom Vergleichsspiegel 10 und dem Objekt 12 reflektiert und interferieren nach Durchgang durch das Teilerprisma 7. Das feststehende Teilerprisma 13 entwirft die Bilder des Vergleichsspiegel und des Objektes zusammen mit der Interferenzerscheinung in der Zwischenbildebene 15 und in der Filmebene 14. Bei den hier durchzuführenden Versuchen wird normalerweise im grünen Licht (λ = 546 nm) gearbeitet. Wenn keine eindeutige Zuordnung der Interferenzstreifen möglich ist, muss Weißlicht verwendet werden. 12

13 1 Lampe 6V 15W 4 Beleuchtungslinsen 2 Beleuchtungslinsen 5 Interferenzfilter (ausschwenkbar) 3 Aperturblende 6 Kondensorsystem 7 Teilerprisma 19 Klemmhebel für Tubuskopf 8 Blende zum Ausschalten des 20 Schalter für Haftmagnet Vergleichstrahlengangs 21 Hebel für Aperturblende 9 Vergleichsobjektiv 22 Rändelring zum Ausschwenken 10 Vergleichsspiegel des Grünfilters 11 Prüfobjektiv 23 Rändelknopf für die Fokussierung 12 Prüfling des Vergleichsspiegels 13 Teilerprisma 24 Hebel zum Drehen des Spiegels 14 Filmebene 25 Rändelschraube(n) zum Einstellen 15 Bildebene von Richtung und Breite der 16 Okular Interferenzstreifen 17 Feintrieb 26 Steuerrad zur Einstellung des 18 Grobtrieb optischen Ausgleichs 21 ) Hebel für Aperturblende 27 Hebel zu Blende 8 13

14 1. Messung eines Niveauunterschieds auf einer Waferoberfläche Arbeitsschritte Das Objekt wird auf den Kreuztisch gelegt (beachte, dass der Kreuztisch exakt auf den vier Justierschrauben im Mikroskopfuß liegt) und die Beleuchtung eingeschaltet. Der Vergleichsstrahlengang wird mittels des Knebelgriffes 27 geöffnet (zum Betrachter drehen). Mit dem Hebel 24 wird der Spiegel 10 so weit gedreht, dass die Grenzlinie zwischen dem stark (50%) und dem schwach (5%) reflektierenden Teil des Spiegels sichtbar wird. Diese Grenzlinie wird durch Drehen des Rändelknopfes 23 fokussiert (dabei 24 fixieren). Diese Fokussierung erleichtert das Auffinden der Messlinien in der Mitte der beiden Spiegelhälften. Je nach Reflektionsgrad des Objektes wird auf die Mitte des stark oder des schwach reflektierenden Spiegels eingestellt. Dazu stellt man den Hebel 24 auf eine waagerechte Position (Hebel nach links für die helle, nach rechts für die dunkle Spiegelhälfte) und fokussiert exakt auf die Messlinien, was auf dem schwach reflektierenden Teil des Spiegels äußerst schwierig ist. Das Reflexionsvermögen von Objekt und Vergleichsspiegel sollte möglichst ähnlich sein. Bei Wafern mit unterschiedlich stark reflektierenden Zonen ist mit beiden Spiegelhälften ein gutes Bild einstellbar. - Messlinien aufnehmen - Nach Ausschalten des Vergleichstrahlenganges 27, mittels Grobtrieb 18 und Feintrieb 17 das Objekt fokussieren. Wird der Vergleichsstrahlengang wieder eingeschaltet erscheinen auf der Objektoberfläche Interferenzstreifen, vorausgesetzt die optischen Weglängen des Objekt- und des Vergleichsstrahlengangs sind annähernd gleich. - Mittels des Steuerrades 26 lässt sich die optische Weglänge zwischen Vergleichsspiegel und Teilerprisma korrigieren (Einstellung zwischen 140 und 160º) - Interferenzbild aufnehmen An Stufen in der Objektoberfläche werden die Interferenzstreifen versetzt. Zur genauen Bestimmung der Niveaudifferenz an einer Objektstelle werden die Interferenzstreifen durch Drehen der beiden Rändelschrauben 25 senkrecht zur auszumessenden Stufe gelegt und so breit eingestellt, dass eine Auswertung möglich ist. Wegen der Instabilität des beobachteten Bildes ist die Auswertung auf dem Bildausdruck der Vermessung im Mikroskop mit einem Schraubenmikrometerokular vorzuziehen. Es gilt d = k/2 λ mit d = Niveaudifferenz k = relative Streifenauslenkung λ = Wellenlänge, hier: 546 nm Die relative Streifenauslenkung ist der Quotient aus Streifenversatz und Streifenbreite. Diese umfasst stets eine gesamte Periode, also einen hellen und einen dunklen Streifen. 14

15 2. Messung des Krümmungsradius einer sphärischen Oberfläche Bei der Interferenz zweier Wellenzüge, die von einer planen (Vergleichsspiegel) und einer sphärischen Oberfläche (Objekt) reflektiert werden, entstehen Interferenzringe. Ist das Objekt eine Kugel, so kann man ihren Radius aus einem kleinen Teil ihrer Oberfläche bestimmen. r = Radius des n-ten Rings Es gilt H = R - h mit h = n λ / 2 = R - n λ / 2 H²= R² - r² = (R-h)² R² - r² = R² - 2Rh + h² 2Rh = h² + r² R = (h² + r²) / 2h Für h «r gilt R = r² / 2h = r² / n λ 15

16 Vorbemerkung: die Spiegelkippung wird bei dieser Messung nicht benötigt. Der Referenzspiegel sollte in etwa senkrecht zur optischen Achse stehen. Arbeitsschritte - Objekt (verspiegelte Linse) so auf den Objekttisch legen, dass der Zenit ungefähr zentrisch im Strahlengang liegt. - Referenzspiegel fokussieren (s. o.) - Objekt fokussieren - falls keine Interferenzlinien zu sehen sind, optischen Ausgleich korrigieren (je nach dem, wie weit der Zenit der Linse von der Bildmitte entfernt ist, sind die Interferenzlinien dann mehr oder weniger stark gekrümmt) - Objekt unter ständigem Nachfokussieren verschieben, bis das Zentrum der Interferenzringe in der Mitte des Gesichtsfeldes liegt - Kontrast durch Nachfokussieren von Objekt und Referenzspiegel sowie durch Korrektur des optischen Ausgleichs optimieren - im Kamerabildfeld das Zentrum der Ringe in eine Ecke schieben, so dass der erste Ring gerade noch im Bild liegt - Bild aufnehmen Zur Auswertung wird, je nachdem, ob das Zentrum hell oder dunkel ist, der Radius des dunklen oder hellen n-ten Rings auf dem Bildausdruck gemessen. 16

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