1) Kaul/Koliogiannis/Sisic/Battista/Schlehe/Sohn/Fersis: Tumorzellnachweis im Blut
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- Ferdinand Ritter
- vor 8 Jahren
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1 1 Onkologisches Labor Projekt 1 Tumorzellnachweis im Blut Projekt 2 Tumorzellnachweis im Knochenmark Doktorarbeiten in 2006 abgeschlossen: V. Deckwart : Tumorzellnacheis im Blut bei Patientinnen mit Mammakrzinom: Entwicklung einer Duplex-RT-PCR für die Marker CK19 und Survivin. A.Leitz: Tumorzellnacheis im Blut bei Patientinnen mit Mammakrzinom: Entwicklung einer Duplex-RT-PCR für die Marker Mammaglobin1 und PSE Doktorarbeiten in 2006: L. Sisic: Entwicklung einer immunmagnetischen Anreicherungsmethode auf der Basis der Antikörper BM7 und VU1D9 D. Koliogiannis: Quantitative RT-PCR zum Nachweis der Surrogatmarker Survivin, HER2, CK19 und CXCR4. M. Aggarwal: Immunmagnetische Tumorzellanreicherung und molekularer Nachweis von Tumorzellen im Knochenmark 1) Kaul/Koliogiannis/Sisic/Battista/Schlehe/Sohn/Fersis: Tumorzellnachweis im Blut Im Onkologischen Labor der Frauenklinik wurde die Methodik für den Nachweis zirkulierender Tumorzellen in wesentlichen Punkten weiterentwickelt. Die Tumorselektion erfolgt beim Mammakarzinom über die Membranantigene MUC1 und EpCAM und setzt hier die hochaffinen Antikörper BM7 und VU1D9 ein (1). Der Antikörper BM7 ist eine Eigenentwicklung unseres Labors, das Hybridom VU1D9 ist in unserem Labor ebenfalls verfügbar. Für den molekulargenetischen Nachweis von Tumorzellen haben wir sowohl konventionelle als auch quantitative Real-time RT-PCR-Methoden eingeführt. In einer Basisanalyse werden die tumorassoziierten Markergene CK19, Mammaglobin1, MUC1, EpCAM, HER-2, Survivin, EpCAM und CXCR4 in konventioneller RT-PCR (Multiplex- und Duplex-Methoden) bestimmt (2,3). Die Ergebnisse der CTC-Analyse von über 300 Patientinnen mit Mammakarzinom ergaben Positivitätsraten von 18% bei primären und über 60% bei metastasierten Karzinomen. (4,5,6) Seit September 2006 konnten wir phasenweise ein Realltime PCR-Gerät nutzen. Erstmals beschreiben wir die Anwendung des UniversalProbeLibrarySystems (Fa. Roche AG, Basel) zum Nachweis der Marker CK19, Mammaglobin1, HER-2, Survivin, und CXCR4 in zirkulierenden Tumorzellen des Blutes und des Knochenmarks in dem Sensitivitätsbereich von 1-2 Tumorzellen in 7,5 ml Blut oder Knochenmark (Doktorarbeit D. Koliogiannis, 8). Die neue Anreicherungsmethodik und die neuen RT-PCR-Ansätze in wurden Fortführung der Adnagen-Studie bei a) Patientinnen mit primärem Mammakarzinom (n=205) b) im 6, 12, 18 und 24 Monats follow-up dieser Patientinnengruppe und bei c) Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom eingesetzt. Der frühe Nachweis einer generalisierten Metastasierung über die CTC-Analyse ist in der folgenden Abbildung 1 am Beispiel einer Patientinnen mit primärem Mammakarzinom dargestellt. Die quantitative RT-PCR dokumentiert weiterhin die Konversion eines histologisch HER2 negativen Primärtumors zu HER2-positiven zirkulierenden Tumorzellen (Abb. 2). Die Ergebnisse wurden auf 9 nationalen und internationalen Kongressen vorgestellt. In der Planung ist ein Kooperationsprojekt mit dem DKFZ (Dr. Arndt, Prof. Brenner) im Rahmen des Tumorzentrums Heidelberg/Mannheim zur Langzeitnachbeobachtung von Brustkrebspatientinnen: Analyse von prognostischen Markern in zirkulierenden Tumorzellen 5 und 10 Jahre nach Diagnose eine bevölkerungsbezogene Studie
2 2 Die in Heidelberg entwickelte Methodik ist geeignet, die Expressionshöhe klinisch relvanter Marker, die Zielstrukturen einer Tumortherapie darstellen, auf zirkulierenden Tumorzellen quantitativ zu bestimmen. Hierzu wurde eine neue Kalibratormethode eingeführt und am Beispiel der klinisch relevanten Antigene HER-2 und CXCR4 bereits validiert. Für diese Methodik ist eine Erfindungsmeldung mit dem Titel Methods and reagents for quantitative gene expression analysis in circulating tumor cells erarbeitet worden. Abb.1 Verlaufskontrolle des Tumormarkers Ca15-3 und zirkulierender Tumorzellen im Follow-up einer Brustkrebspatientin (HD004) nach der Primäroperation. Primäres Mammakarzinom (DIC,T2, N3) : CTC im Follow-up CA Chemotherapie GAIN Rad MUC EpC HER CK SU PSE MG CA Verlauf: 0, 3, 6, 9 und 12 Mo
3 3 Abb.2 Realtime qrt-pcr mit TaqMan Sonden: HER2-positive zirkulierende Tumorzellen der Patientin HD004.4 mit HER2 negativem Primärtumor. Preise und Ehrungen: Der Posterbeitrag Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut bei Patienten mit primärem Mammakarzinom mittels neuer Multiplex-PCR Ansätze für die Marker Cytokeratin-19 und Survivin sowie Mammaglobin und PSE, Deckwart V, Leitz A, Kaul S, Böcher O*, Eichler A, Sohn C, Fersis N präsentiert von Frau Verena Deckwart und Frau Alexandra Leitz erhielt beim 56. Kongress der DGGG in Berlin den 2. Posterpreis Drittmittelförderung klinische Multicenterstudie Tumorzellnachweis im Blut) Sponsor Fa. Adnagen, Langenhagen, Hannover /Jahr Spendenförderung: Patienten helfen Patienten /Jahr Private Forschungsspende der Eheleute Kuhnel /Jahr Publikationen und Konressbeiträge aus dem Projekt Tumorzellnachweis im Blut Publikationen und Kongressbeiträge Projekt 1) 2) Kongressbeitrag 2007 und Doktorarbeit: Validierung einer neuen immunmagnetischen Anreicherungsmethode für den molekularen Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen im Blut bei Patientinnen mit Mammakarzinom Sisic L., Kaul S., Sohn C., Fersis N. 2) Dr. Arbeit A. Leitz, Tumorzellnacheis im Blut bei Patientinnen mit Mammakrzinom: Entwicklung einer Duplex-RT-PCR für die Marker Mammaglobin1 und PSE. Universität Heidelberg, ) Dr. Arbeit V. Deckwart, Tumorzellnachweis im Blut bei Patientinnen mit Mammakarzinom:Entwicklung einer Duplex-RT-PCR für die Marker CK19 und Survivin. Universität Heidelberg, ) European Congress of Oncology, NICE, march 2006 Molecular profiling of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with primary and metastatic breast cancer, Fersis N, Deckwart V, Leitz A, Rom J, Eichbaum M, Zieglschmid V*, Böcher O*, Bastert G 2, Sohn C, Kaul S
4 4 6) 19 th EBCOG Europ. Congr. of Obstetrics and Gynaecology, April 2006 TORINO, ITALY DETECTION OF TUMOR CELLS IN PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH PRIMARY BREAST CANCER, Fersis N, Deckwart V, Leitz A, Eichler A, Rom J, Zieglschmid V, Böcher O, Bastert B, Sohn, C, Kaul S 7) Deutscher Krebskongress BERLIN, März, 2006 IMMUNOMAGNETIC ENRICHMENT AND MOLECULAR DETECTION OF TUMOR CELLS IN PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH PRIMARY BREAST CANCER Fersis N, Deckwart V, Leitz A, Weber M, Rom J, Zieglschmid V*, Böcher O*, Bastert B, Sohn, C, Kaul S 8) Deutscher Krebskongress BERLIN, März, 2006 Tumor cell detection in peripheral blood of patients with primary lymph node negative breast cancer Leitz A, Kaul S, Deckwart V, Rom J, Eichbaum M, Zieglschmid V*, Böcher O*, Eichler A, Bastert G, Sohn C, Fersis N 9) ASCO ANNUAL MEETING 2006, June 2-6, Atlanta, Georgia Molecular profiling of circulating tumor cells in the peripheral blood of patients with primary and metastatic breast cancer, Fersis N, Deckwart V, Leitz A, Weber M, Rom J, Albert H, Böcher O, Bastert B, Sohn, C, Kaul S 10) 178. Tagung der Mittelrheinischen Gesellschaft für Geburtshilfe und Gynäkologie Kaiserslautern, September 2006,VORTRAG EXPRESSIONSANALYSE DER TUMORASSOZIIERTEN MARKER CYTOKERATIN UND SURVIVIN SOWIE MAMMAGLOBIN UND PSE BEI PRÄANALYTISCH ISOLIERTEN TUMORZELLEN AUS PERIPHEREM BLUT VON PATIENTINNEN MIT PRIMÄREM MAMMAKARZINOM Leitz A, Deckwart V, Kaul S, Böcher O*, Eichler A, Sohn C, Fersis N 11) 56. Kongress der DGGG, Berlin, September 2006, VORTRAG Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut bei Patienten mit primärem Mammakarzinom mittels neuer Multiplex-PCR Ansätze für die Marker Cytokeratin-19 und Survivin sowie Mammaglobin und PSE, Deckwart V, Leitz A, Kaul S, Böcher O*, Eichler A, Sohn C, Fersis N 12) SAN ANTONIO BREAST CANCER MEETING, Dec. 2006, POSTER Molecular analysis of metastasis associated markers in circulating tumor cells of patients with primary and metastatic breast cancer, Fersis N, Deckwart V, Leitz A, Weber M, Rom J, Bastert G, Sohn C, Kaul S 2) Kaul/Aggarwal/Sohn/Fersis: Tumorzellnachweis im Knochenmark Standardisierung molekulardiagnostischer Methoden für die Detektion disseminierter Tumorzellen (DTC) im Knochenmark von Patientinnen mit Brustkrebs Bei 1412 Patientinnen mit primärem Mammakarzinom ergab der immunzytologische Tumorzellnachweis im Knochenmark (KM) eine Positivitätsrate von 2,6%. Zur Verifikation dieses Befundes wurden 186 KM-Proben parallel in der Standardzytologie und einer neuen Kombination aus immmunmagnetischer Anreicherung mit nachfolgender molekularbiologischer Expressionsanalyse untersucht. Zytospinpräparate wurden mit der APAAP- bzw. der SA-AP Methodik mit dem Antikörper 5D3 (CK 8/18) gefärbt und mittels Bildanalyse ausgewertet. In die präanalytische immunmagnetische Tumorzellanreicherung (Targets EpCAM und MUC1) wurden 2 x 10 7 KM-Zellen eingebracht. Nach mrna-isolierung und c-dna-synthese wurden RT-PCR Ansätze entwickelt, um die Marker MUC1, EpCAM, HER-2, sowie CK19 und Mammaglobin1 zu bestimmen. Die Sensitivität für den molekularen Nachweis von CK19 und Mammaglobin1 wurde auf eine Zelle in 10 7 KM-Zellen eingestellt. Die Zytologie auf der Basis von 4x10 6 untersuchten KM-Zellen ergab bei 186 KM-Proben eine Positivitätsrate von 1,6% (2, 6 and 8 Tumorzellen/10 6 KM-Zellen). Nach präanalytischer Anreicherung waren in der RT-PCR 5 von 186 Proben (3,3%) mit dem Marker CK19 und 3 von 151 (2%) mit dem Marker Mammaglobin1 positiv. Tumorzellen im Knochenmark werden routinemäßig in der Immunzytologie mit Zytokeratinspezifischen Antikörpern (A45/B3, AE1/AE3 und 5D3) nachgewiesen. Wir haben erstmals gezeigt, dass Stromazellen des Knochenmarks Zytokeratin-positiv sind. Eliminierung dieser kleinen Zelltypen (Frequenz etwa 1-2 Zellen/10 6 KM-Zellen) führt zu umorzelldetektionsraten von 2,6% bei 1412 KM-Proben in unserer Klinik. Diese niedrige Detektionsrate wird jetzt durch eine uabhängige präanalytische Tumorzellanreicherung mit nachfolgender molekularer CK19- und Mammaglobin1-Markeranalyse bestätigt. Im Zuge der methodischen Weiterentwicklung wurde 2006, eine neue immunmagnetische Tumorzellisolierungsmethode mit einer multi- Marker RealTime RT-PCR kombiniert. Die
5 5 Surrogatmarker Cytokeratin-19 (CK19), Mammaglobin-1 (MG) und HER-2/neu (HER2) sollten für den hochempfindlichen Tumorzellnachweis im KM standardisiert werden. KM Zellen von 47 Brustkrebspatientinnen wurden durch eine Ficoll-Trennung isoliert. Davon wurden 1x10 6 mononukleäre Zellen für konventionelle Immunzytologie und 1x10 7 Zellen für molekularbiologische Tumorzelldetektion genutzt.. Parallel wurde der Nachweis zirkulierender Tumorzellen in 10 ml Blut durchgeführt. Anreicherungstechniken mit BM7- (MUC1) und VU1D9- (EpCAM) Antikörper beschichteten Magnetbeads haben wir vom Blut auf das KM übertragen. Aus der Lysefraktion der Tumorzellen wurde mrna über oligo-(dt) 25 Beads isoliert und cdna anschließend mit dem Sensiscript RT-System (Qiagen, Deutschland) synthetisiert. Die Sensitivität wurde durch Zusetzen von 2, 4 und 8-10 Tumorzellen (TZ) der TZ-Linien HD-ZE und SKBR-3 in 1x10 7 KM-Zellen bestimmt. Anschließend wurden die Proben in einer RealTime RT-PCR (BioRad, DNA Engine Thermal Cycler mit Chromo-4 System) mit TaqMan Probe Master (Roche) analysiert. In einer ersten Analysenphase wurden 47 KM- und Blutproben ausgewertet. In diesem Kollektiv waren 25,5% der KM Proben (12/47) CK19 positiv. Eine typische RT-PCR Analyse ist in Abb.3 dargestellt. Die Auswertung der Kontrollproben mit 8-10 TZ ergab mittlere C(t)- Werte von 33,76 für CK19, 28,98 für MG und 33,93 für HER2. Bei 4 der CK-positiven Proben (8,5%) ergibt sich aus den C(t)-Werten eine Tumorzellkonzentration im Bereich von 2 bis 10 TZ pro 10 7 KM-Zellen (Abb. 4). Gegenwärtiger Stand und Weiterentwicklung: Mit der RealTime RT-PCR konnten wir durch Zumisch-Experimente reproduzierbar die Marker CK19, MG und HER2 für 2, 4 und 8-10 TZ standardisieren. Erstmals können Tumorzellen im Knochenmark in diesem Empfindlichkeitsbereich für quantitative Multimarkeranalysen herangezogen werden. Die Nutzung der Surrogatmarker CD44, CD131, TROP2 ist in der Entwicklung. Knochenmark- Proben von nicht an Karzinomen erkrankten Spendern werden derzeit zur Bestimmung des Cut-off Wertes der verschiedenen Realtime RT-PCR-Ansätze herangezogen. Abb3. Real-time RT-PCR zum Nachweis von DTC im Knochenmark am Beispiel eines CK19- und MG-positiven Befundes.
6 6 Tab.1 DTC und CTC Analyse in immunmagnetisch angereicherten Proben aus dem Knochenmark (1x10 7 Zellen) und dem Blut (2x5ml). OL RT KM Du. CK MG CK MG PBL Cyt. RT Ad. T N M G Neo Met a c a nd nd - nd nd nd nd nd nd nd b a nd nd - nd 2 2a nd nd + nd 3 1a nd - 3 1a nd nd nd nd b is c nd nd - nd nd b 1a c c nd nd c nd a nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd - nd 1c 1mic nd nd nd - nd 1c nd nd nd - nd nd nd nd + nd nd nd nd - nd nd nd nd - nd nd nd nd - nd nd nd nd + nd nd nd nd - nd nd nd nd + nd nd nd nd - nd nd nd nd - nd
7 7 Publikationen und Kongressbeiträge Projekt 2 14) Deutsche Gesellschaft für Senologie,26. Jahrestagung, August 2006, Dresden, VORTRAG DISSEMINIERTE TUMORZELLEN IM KNOCHENMARK: PRÄANALYTISCHE IMMUNMAGNETISCHE ANREICHERUNG UND NACHFOLGENDE RT-PCR-ANALYSE VON CYTOKERATIN 19 UND MAMMAGLOBIN 1 ERGIBT EINE POSITIVITÄTSRATE VON 3,3% BEI PATIENTINNEN MIT PRIMÄREM MAMMAKARZINOM Kaul S, Fersis N, Sohn C 15. Kongress der DGGG, Berlin, September 2006, POSTER SAN ANTONIO BREAST CANCER MEETING, Dec POSTER Tumor cell detection in bone marrow of patients with primary breast cancer side by side comparison of immunocytology and immunomagnetic enrichment followed by molecular analysis of CK19 and mammaglobin1 expression, Kaul S, Fersis N, Bastert B, Sohn C 16) Kongressbeitrag 2007und Doktorarbeit: Standardisierung molekulardiagnostischer Methoden für die Detektion disseminierter Tumorzellen (DTC) im Knochenmark von Patientinnen mit Brustkrebs Aggarwal Meenakshi, Kaul Sepp, Sohn Christof, Fersis Nikos Zusammenarbeit mit anderen Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern Arbeitsgruppe Prof. Bastert Prof. Dr. med. Gunther Bastert Klinik Bad Trissl, 3080 Oberaudorf CTC bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom, Generierung einer c-dna-bank, die im Labor in Heidelberg molekularbiologisch charakterisiert wird. Arbeitsgruppe Dr. Weidle Dr. rer.nat. U.H. Weidle, Dr. V. Evtimova Program Director Oncology,Roche Diagnostics, Division Pharma D Penzberg Primerdesign und Sondenentwicklung für neue Metastasierungsmarker des Mamma- und Ovarialkarzinoms aus den jüngsten Publikationen und weitergehenden genetischen Analysen. 5.3 Arbeiten im Ausland und Kooperation mit Partner im Ausland Arbeitsgruppe Arbeitsgruppe Dr. Alberti Prof. Dr. S. Alberti Unit of Cancer Pathology, Universität Chieti, Italien Weiterentwicklung und Spezifitätstestung einzelner Surrogatmarker so u.a. TROP-2 und CRASH Primer/Sonden-Entwicklung. Parallel Nutzung der immunmagnetischen Anreicherungsmethodik und der Primer-Kombinationen des Projektes zur Analyse von CTC an der Klinik in Chieti
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