6. Techniken der Protein- Reinigung

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1 6. Techniken der Prtein- Reinigung 1. Prtein-Islatin A) Wahl der Prteinquelle B) Methden der Slubilisierung C) Stabilisierung vn Prteinen D) Prtein Assays E) Generelle Strategien zur Prtein-Reinigung 2. Löslichkeit vn Prteinen A) Salzeffekte B) Organische Lösungsmittel C) ph-effekte D) Kristallisierung 3. Chrmatgraphische Separierung A) Inentauscher-Chrmatgraphie B) Papierchrmatgraphie C) Gelfiltratin D) Affinitätschrmatgraphie E) Andere chrmatgraphische Techniken 4. Elektrphrese A) Papier Elektrphrese B) Gel Elektrphrese C) SDS-PAGE D) Islelektrische Fkusierung E) Kapillar Elektrphrese 5. Ultrazentrifugatin A) Sedimentatin B) Präparative Ultrazentrifugatin

2 Prtein-Reinigung: Das Prblem Unser Prtein beträgt ~0.1% des Zelltrckengewichtes (ftmals liegt es gar nur in wenigen Kpien pr Zelle vr), muss aber zur Charakterisierung ~98% rein sein. Besseres Verständnis der bichemischen Abläufe geht Hand in Hand mit verbesserten Methden der Analyse. -> Verständnis der Methdik ist sehr wichtig.

3 1.Schritte in der Prtein- Reinigung 1. Selektin der Prteinquelle Hämglbin vn Erythrzyten Lac Repressr aus E. cli Rekmbinante Expressin 2. Methden der Slubilisierung Zytslisch <-> Membrangebunden / unlöslich Osmtische Lyse der Zelle durch hyptne Lösung Zellwand-Abbau bei Bakterien durch Lyszym Mechanische Zerkleinerung des Gewebes Klärung des Lysates (Filtratin/Zentrifugatin) -> Hmgenat Eventuelle Anreicherung für ein Organell (Mitchdrien,..) mittels differenzieller Zentrifugatin

4 Schritte in der Prtein-Reinigung (2) 3. Stabilisierung des Prteins Kntrlle des ph durch geeignete Pufferlösungen Temperatur (4 C), Salzgehalt Inaktivierung der Prteasen 4. Prtein Assay Unser Prtein muss gesehen werden Bsp. Enzyme über ihre Aktivität Bindungseigenschaften, Bsp. Rezeptr - Ligand Bilgische Aktivität, Bsp. Txin Immunlgische Techniken, Bsp. ELISA Antikörper: Mnklnal / Plyklnal

5 ELISA enzyme-linked immunsrbant assay Bsp. Schwangerschaftstest basierend auf ELISA detektieren Chrin Gnadtrpin im Urin

6 Generelle Strategie der Prteinreinigung James Summer (1926) erste Prteinkristallisatin, Urease aus Sjabhnen ~1940, ca. 20 Enzyme gereinigt Heute, tausende Prinzip: Alle physikchemischen und bilgischen Eigenschaften Ihres Prteins werden ausgenützt

7 2.Löslichkeit vn Prteinen Was bedeutet Löslichkeit? Da Prteine viele Säure-Base Gruppen besitzen, ist ihre Löslichkeit abhängig vn: ph Salzknzentratin Art vn Salz Temperatur Plarität des Lsm Ammnium Sulfate

8 Einfluss der Salzknzentratin Inenstärke: I = 1/2 c i Z i 2 c i mlare cnc. Z i inische Ladung Bei tiefer Inenstärke nimmt die Löslichkeit mit der Salzknzentratin zu (Einsalzen) Bei hher Inenstärke nimmt die Löslichkeit ab (Aussalzen) [Ammniumsulfat Fraktiinierung] Salzabhängige Löslichkeit vn Carbxy-Hemglbin bei pi

9 Einfluss rganischer Lösungsmittel Wasserlösliche rganische Lösungsmittel können zugesetzt werden, um dadurch die Plarität und Dielektrizitätsknstante der wässrigen Lösung zu erniedrigen -> Prezipitatin des Prteins, bei 4 C Organische Lösungsmittel mit hher Dielk. Hingegen sind gute Lsm für Prteine (DMF, DMSO) Vrsicht: Denaturierung vn Prteinen

10 ph-abhängigkeit der Löslichkeit Minimal beim iselektrischen Punkt, pi, des Prteins, iselektrische Prezipitatin pi eines Prteins: Summe der neg. = Summe der ps. Ladungen Keine Nettladung Keine Mbilität im elektrischen Feld.

11 Iselektrischer Punkt vn einigen häufigen Prteinen

12 Prteinkristalle Kristallisatin ausgehend vn hchgereinigten Prteinlösungen Induzierte, langsame Prezipitatin Röntgenkristallstruktur- Analyse

13 3.Chrmatgraphische Trennungen Chrmatgraphie: Gr. chrma, Farbe + graphie, schreiben Auftrennen vn Farbe in ihre Bestandteile Prinzip: Mbile Phase - statinäre Phase Dabei treten Wechselwirkungen zwischen dem in der mbilen Phase gelösten Analyten und der statinären Phase auf Klassifikatin nach Art der Wechselwirkung mit der statinären Phase, Bsp. Inentauscher Chr., Adsrptins Chr. Zur Prteinreinigung werden typischerweise mehrere Chr. Separatinen hintereinander durchgeführt.

14 Papierchrmatgraphie Set 1941, einfache Technik zur Separierung vn kleinen Mlekülen, AS, Oligpeptide Statinäre Phase ist plar (Cellulse), mbile Phase ist aplar -> Separatin aufgrund der Plarität der Substanz Migratinsrate hängt vm Partitinskeffizienten ab: Kp = cnc. Stat. Phase / cnc. Mbil Phase Migratinsrate charakteristisch für jede Substanz, R f = Distanz der Substanz /Distanz des Lsm Dedektin: Radiaktiv, Flureszenz, Derivatisierung, Bsp. Ninhydrin für AS Zwei-dimensinal

15 Reaktin vn Ninhydrin mit Aminsäuren

16 Zwei-dimensinale Papierchrmatgraphie

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18 Gradientenmischer (linear) C = C 2 -(C 2 -C 1 )ƒ C 1, cnc. Mixing chamber C 2, cnc. Reservir ƒ, remaining fractin f cmbined vlumes initially present

19 Inentauscher Chrmatgraphie Reversibler Austausch vn Inen an der inerten Matrix (statinäre Phase, R + ) mit Inen in der Lösung (mbile Phase, B - ) R + A - + B - <-> R + B - + A - (Aninen Tausch) Prteine sind Plyelektrlyte, können daher über Aninen- der Katinen-Tauscher gereinigt werden Affinität der Interaktin hängt vn der Präsenz anderer Bindungspartner ab, Salz, ph Vrgehen: 1. Bindung der Prteine an den Inentauscher unter gegebenen Bedingungen 2. Selektive Elutin entweder schrittweise der mittels eines Gradienten

20 Typen vn Inentauscher Resign: supprt Matrix der statinären Matrix, Bsp. Cellulse, crss-linked plyacrylamide, plydextran (alle sind kmprimierbar, daher nicht für HPLC geeignet). Beeinflusst Durchfluss, Inen-Zugang, Stabilität der Matrix Trägt die inisierbare Gruppe

21 Bsp. vn Inentauscher Matrix

22 Gel-Filtratins Chrmatgraphie Gel-Filtratin = Size Exclusin Chrmatgraphy = Mlekularsieb, Separierung aufgrund der Grösse und Frm vn Prteinen Statinäre Phase, Kügelchen (beads) mit kleinen Pren Exclusin Limit, Ausschluss Grenze, Grösse des kleinsten Mleküls, das nicht in die Pren eindringen kann. V t = V x + V 0 V t, Bett Vlumen der Säule; V x, Vlumen der Gelbeads; V 0, Vlumen des Lösungsmittel um die Beads (vid vlume), Typischerweise ist V 0 ~35% vn V t V e, Elutinsvlumen eines bestimmten Prteins Relatives Elutinsvlumen, charakteristisch für jedes Prtein, nrmalisiert für Säulengrösse, V e /V 0

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24 Gelfiltratin zur Mw Bestimmung Das relative Elutinsvlumen eines Prteins, V e /V 0, ist invers prprtinal zu seiner Masse

25 Gebräuchliche Materialien zur Gelfiltratin Resign: Dextran (plymer vn Glucse), Agarse (red algae), Plyacrylamid Prengrösse wird über den Grad an crsslinking kntrlliert Entsalzen vn Prteinlösungen

26 Dialyse Dialyse ist ebenfalls eine Art der Mlekulargewichts- Filtratin Semipermeable Membran aus Cellphan (Cellulse Acetat) Wechsel des Lsm. Dialyse gegen Plyethylenglykl zur Aufknzentratin der Prtein Lösung

27 Affinitätschrmatgraphie Nutzt die Eigenschaft vieler Prteine an Liganden zu binden aus, Bsp. Enzyme können an Substratanalga binden Ligand ist über Spacer kvalent an die Matrix gekppelt. Lösung der Ligand - Prteininteraktin zb. mit einem Liganden höherer Affinität der ph, Salz-Sprung Cyangen Brmid der Epxy aktivierte Resigns zur Kpplung des Liganden an die Matrix Immunaffinitätschrmatgraphie, spezifische Antikörper werden an die Matrix gebunden

28 Cyangen Brmid der Epxy-aktivierte Träger zur kvalenten Kpplung des Liganden an das Resign Epxy-aktivierte Agarse

29 Bsp. Affinitätsreinigung der Nuclease aus Staphylcccus

30 Bsp. Reinigung der Rattenleber Gluckinase

31 Weitere chrmatgraphische Techniken Adsrptins Chrmatgraphie zur Separierung vn aplaren Substanzen, Bsp. Lipide. Matrix(hydrphil): Silica Gel, Kieselguhr, Aluminium Oxid Hydrxyapatit, unlösliche Frm des Calzium Phsphates Dünnschicht Chrmatgraphie (TLC), Separierung rganischer Mleküle, Bsp. Lipide Reverse Phase Chrmatgraphy (RPC), (reversed relativ zu Papierchrmatgraphie) Statinäre Phase ist eine aplare Flüssigkeit, die mbile Phase ist plar, nrmalerweise denaturierend, Bsp. Lipide, Oligpeptide Hydrphbe Interaktinschrmatgraphie (HIC) wie RPC, aber die hydrphile Matrix ist nur leicht hydrphb derivatisiert (Octyl, Phenyl-Gruppen) HPLC

32 HPLC High pressure liquid chrmatgrapy unkmprimierbare Matrix basierend auf Glaskügelchen der Silica, welche derivatisiert werden -> Inentauscher, RPC, HIC, Affinitäts Chr. Lange, dünne Säulen in Metallröhrchen welche mit sehr hhem Druck (bis 5000 psi) gefahren werden Gute Auflösung Schnell <1h Sensitiv Autmatisierbar

33 4.Elektrphrese Migratin vn Inen in einem elektrischen Feld, Elektrische Kraft, F electric, auf In mit Ladung q in einem elektrischen Feld E ist: F electric = qe Diese Migratin wird durch einen Widerstand, F frictin, gebremst, der sich aus dem Prdukt der Beschleunigung, v (velcity), mit einem Widerstandskeffizienten, f, ergibt: F frictin = vf Bei Knstanz, d.h. Inen bewegen sich nicht: qe = vf Elektrphretische Mbilität eines Ins: µ = v/e = q/f

34 Wandernde Grenze 1937, erste elektrphretische Trennung vn Prteinen durch Arne Tiselius

35 Papierelektrphrese Eine Art znaler Elektrphrese, die Prbe muss auf einem Träger und nicht in Lösung wandern ~20 V/cm Hchspannungs Elektrphr. ~200 V/cm Kmbinatin vn Papierelektrph. (Trennung aufgrund der Ladung) und Papierchrmatgraphy (Trennung aufgrund der Plarität) wird zum Fingerprinting eingesezt

36 Gelelektrphrese Eine der häufig gebrauchten und besten Methden, um Makrmleküle zu trennen. Agarse und Plyacrylamide als Träger Kmbinatin vn Elektrphrese mit Gel Filtratin

37 PAGE Plyacrylamid Gelelektrphrese Die Plymerisatin vn Acrylamid wird durch freie Radikale (Ammnium Persulfat, TEMED als Stabilisatr) induziert Prengrösse wird durch den Anteil an Acrylamid und Bisacrylamid bestimmt Lauf bei ph ~9 -> Prteine sind negativ geladen

38 Elektrdenreaktin in der Elektrphrese

39 Sammel- und Trenngele erhöhen die Auflösung Diskntinuierlicher ph, Disc Elektrphrese Knzentratin der aufgetragenen Prbe in einem dünnen Bereich durch Sammelgel + Trenngel Trick: ph im Sammelgel 2 Einheiten Tiefer + grössere Pren -> Fkusierung der Prteine an der Grenzschicht

40 Färbung vn Prteinen Cmassie-Färbung, detektiert µg Fraktinen Silber-Färbung, ca. 50x sensitiver Flurescamin mdifiziert Lys Radiaktive Prben -> Autradigraphie Scintillatins Zählung

41 Western bltting Zur Detektin spezifischer Prteine mittels Antikörper

42 SDS-PAGE SDS, starkes aninisches Detergents, Bindung vn ca. einem SDS Mlekül pr 2 AS -> negative Ladung Alle Prteine haben die selben Ladung-zu- Masse Verhältnisse und eine ähnliche Frm, da denaturiert Trennung aufgrund der Masse durch die Gel Filtratin PAGE vn

43 Iselektrische Fkusierung Elektrphrese durch einen ph-gradienten, Wanderung stppt, wenn das Prtein seinen islektrischen Punkt erreicht Der stabile ph-gradient wird durch ein Gemisch vn Plyamphlyten mit unterschiedlichen pi realisiert. Diese wandern im elek. Feld und bauen den ph-gradienten auf. Mit Zusatz vn Harnstff zur Denaturierung der Prteine

44 Zwei-dimensinale Gelelektrphrese Iselektrische Fkusierung gepaart mit SDS-PAGE

45 5.Ultrazentrifugatin Separatin aufgrund unterschiedlicher Dichte Die Kraft, F sed, welche auf ein Partikel mit Masse m, welches in einer Distanz vn r vm Drehzentrum, um welches es sich mit der Geschwindigkeit ω dreht (in rad s -1 ), entspricht der Zentrifugalkraft des Partikels (mω 2 r) abzüglich der Auftreibkraft durch die Lösung (V p ρω 2 r): F sed = mω 2 r - V p ρω 2 r ; wbei V p das Partikelvlumen und ρ die Dichte der Lösung Ein Partikel hat eine charakteristische Sedimentatinsknstante (analg zur elektrphretischem Mbilität), in Svedbergs (S) (10-13 s) Die Partikelmasse kann durch analytische Ultzrazentrifugatin bestimmt werden

46 Physikalische Parameter einiger Prteine

47 Sedimentatins- Keffizienten in Svedbergs

48 Preparative Ultrazentrifugatin Preparative Trennung vn Partikeln durch: Differenzielle Zentrifugatin Znale Zf. Equilibriums Zf.

49 Znale Ultrazentrifugatin In Dichtegradienten (linear, step), Bsp. Sucrse, CsCl Trennung aufgrund der Masse (Beschleunigung)

50 Gleichgewichts / ispyknische Ultrazentrifugatin In linearen Dichtegradienten Trennung aufgrund der Dichte