Jackson Laboratories, Boston MA, USA Charles River, Sulzfeld, D Cambridge University, Cambridge, UK Dt. Rheumaforschungszentrum, Berlin, D

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1 2 MATERIAL 2.1 Versuchstiere Mausstamm B10.PL BALB/c TG4 DO11.10 Anbieter Jackson Laboratories, Boston MA, USA Charles River, Sulzfeld, D Cambridge University, Cambridge, UK Dt. Rheumaforschungszentrum, Berlin, D Alle Tiertötungen waren unter der Nummer T 0181/99 (Verantwortlicher: Prof. Dr. Robert Nitsch) und alle Tieersuche unter der Nummer G 0067/04 (Verantwortlicher: Dr. Sven Hendrix) vom Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin (LAGetSi) genehmigt und wurden unter Einhaltung der dort vorgeschriebenen Regeln durchgeführt. 2.2 Chemikalien 1,4-Dithiothreitol (DTT) Invitrogen, Karlsruhe, D 100 bp DNA Ladder 2-Mercaptoethanol Stratagene, Cedar Creek TX, USA 2-Methylbutan 2-Propanol Aceton Agarose FMC, Rockland ME, USA Ammoniumchlorid Borsäure Bromphenolblau Natriumsalz Sigma, Taukirchen, D Citronensäure Concanavalin A (ConA) Desoxyribonuclease (DNAse I) Ambion, Austin TX, USA Dimethylsulfoxid (DMSO) Riedel de Haen, Seelze, D Dinatriumhydrogenphosphat 32

2 Dinatriumhydrogenphosphat Heptahydrat DNA-Probenpuffer 5x Blue Run dntp Set Essigsäure Ethanol, unvergällt Ethidiumbromid Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) FACS Clean FACS Flow FACS Rinse Glucose-20 Glycerin Histopaque-1083 Insulin crystalin Ionomycin Calciumsalz Kaliumchlorid Kaliumdihydrogenphosphat Ketamin Kollagen Typ I L-Glutamin MEM Hepes M-MLV Reverse Transkriptase M-MLV Reverse Transkriptase-Puffer Natriumazid Natriumcarbonat Natriumchlorid Natriumdihydrogenphosphat Natriumhydrogencarbonat Natriumhydrogencarbonat-Lösung 7,5 % Natriumhydroxid oligo DT Paraformaldehyd Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x) Amersham, Freiburg, D Roth, Karlsruhe, D BBraun, Melsungen, D CuraMed Pharma GmbH, Karlsruhe, D Fluka, Buchs, CH Invitrogen, Karlsruhe, D Invitrogen, Karlsruhe, D Amersham, Freiburg, D 33

3 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Ribonuclease-Inhibitor (RNAsin) Rompun Saccharose Salzsäure Schwefelsäure Tetramethylbenzidin Dihydrochlorid t-octylphenoxypolyethoxy Ethanol (Triton X-100) Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Trisbase) Trypanblau- Lösung Vitamin C Wasserstoffperoxid Xylen Cyanol FF Bayer HealthCare, Leverkusen, D 2.3 Peptide Peptid Sequenz MBP Ac1-11 NH 2 -Ac-ASQ KRP SQR SK-CONH 2 Biosyntan, Berlin, D OVA NH 2 -ISQ AVH AAH AEI NEA GR-COOH Pepscan, Lelystad, NL 2.4 Rekombinante Proteine Human NT-3 Human NT-4 Mouse IFN-γ Mouse IL-2 Mouse IL-4 Mouse IL-10 Mouse IL-12 Mouse IL-13 Mouse NGF (7S) Tebu-Bio, Offenbach, D Tebu-Bio, Offenbach, D R&D Systems, Wiesbaden, D Tebu-Bio, Offenbach, D R&D Systems, Wiesbaden, D Tebu-Bio, Offenbach, D 34

4 2.5 Antikörper Anti-mouse CD 8a Micro Beads Anti-mouse CD11b Micro Beads Anti-mouse CD45R Micro Beads Chicken anti-human NT-3 Chicken anti-human NT-4 Chicken control IgY Donkey anti-goat FITC Goat anti-mouse NF-L Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Isolectin-B4 FITC K252a Streptavidin PE Rabbit anti-mouse GAP43 Rabbit anti-mouse GFAP Rabbit anti-mouse NF 200 Rabbit anti-mouse NGF Rabbit anti-mouse p75ntr Rabbit anti-mouse TrkA Rabbit anti-mouse TrkB Rabbit anti-mouse TrkC Rabbit control IgG Rat anti-mouse CD4 FITC Rat anti-mouse CD25 PE Rat anti-mouse GFAP Rat anti-mouse IL-4 Rat anti-mouse IL-12 Rat anti-mouse IFN-γ Rat anti-mouse Vβ8.1/2 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Dianova, Hamburg, D Santa Cruz, Santa Cruz CA, USA Molecular Probes, Leiden, NL Molecular Probes, Leiden, NL Calbiochem, Schwalbach, D Biozol, Eching, D Dako, Hamburg, D IBT, Reutlingen, D Santa Cruz, Santa Cruz CA, USA Santa Cruz, Santa Cruz CA, USA Santa Cruz, Santa Cruz CA, USA Santa Cruz, Santa Cruz CA, USA IBT, Reutlingen, D Zymed, San Francisco CA, USA 35

5 2.6 Seren Eselserum (DS) Fötales Kälberserum (FCS) Normales Pferdeserum (NHS) Normales Ziegenserum (NGS) Santa Cruz, Santa Cruz CA, USA Biochrom, Berlin, D Linaris, Wertheim, D 2.7 Medien DMEM HBSS RPMI 1640 mit Glutamin 2.8 Kits Absolutely RNA RT-PCR Microprep Kit Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit AmpliTaq DNA Polymerase mit GeneAmp BDNF Emax ImmunoAssay System First Strand cdna Synthese Kit NGF Emax ImmunoAssay System NT-3 Emax ImmunoAssay System NT-4 Emax ImmunoAssay System OptEIA Set Human TGF-β OptEIA Set Mouse IFN-γ OptEIA Set Mouse IL-4 OptEIA Set Mouse IL-6 OptEIA Set Mouse IL-10 OptEIA Set Mouse TNF-α Stratagene, Cedar Creek TX, USA Stratagene, Cedar Creek TX, USA Applied Biosystems, Foster City CA, USA Amersham, Freiburg, D 36

6 2.9 Primer Primer Sequenz 5`> 3` Produkt Annealing β-aktin BDNF IFN-γ IL-1β IL-2 IL-4 IL-10 NGF NT-3 NT-4 TGF-1β CTA GGC ACC AGG GTG TGA TGG CGT AGA TGG GCA CAG TGT GGG GCA GGT TCG AGA GGT CTG AC CTT CAG TTG GCC TTT TGA TAC C AAC GCT ACA CAC TGC ATC T GAC TTC AAA GAG TCT GAC G TTG AAG AAG AGC CCA TCC TCT G GAT CCA CAC TCT CCA GCT GC GCA GGA TGG AGA ATT ACA GGA TCA GAG CCC TTT AGT TTT AC ACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC ACG AGT AAT CCA TTT GCA TGA TGC AGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG A ATC GAT GAC AGC GCC TCA G GAT CGG CGT ACA GGC AGA AC CCA TGT GGA AGA CTG GGT GG CAG CCA ATG ATT GCA ACG GA GGC CTG GCT TCT TTA CAT CTC G GTC AGT ACT TCT TCG AGA CGC G TGA GAG TCT GCA GTC AAC GC GCT GCG CTT GCA GAG ATT AAA TTG CTG TAC TGT GTG TCC AG 387 bp 62 C 389 bp 55 C 236 bp 55 C 321 bp 61 C 225 bp 55 C 278 bp 64 C 231 bp 55 C 353 bp 57 C 355 bp 55 C 153 bp 57 C 551 bp 57 C 2.10 Zubehör Dako Pen Deckgläschen Einbettmedium Einfrierbox Eppendorf-Reaktionsgefäße (0,5/1,5/2 ml) FACS-Röhrchen Immu-Mount Kanülen (0,9x40/0,5x25 mm) Dako, Hamburg, D Jung, Nussloch, D Roth, Karlsruhe, D Eppendorf, Hamburg, D Shandon, Pittsburgh PA, USA BBraun, Melsungen, D 37

7 Küvetten Metamorph Software Midi MACS LS Columns Midi MACS Separation Unit Mikroliterspritze Hamilton (10 µl) Millipore Memranen (0,4 µm) Neubauer-Zählkammer Neutralit-Teststäbchen Objektträger Pasteurpipetten Petrischalen (35x10/100x20 mm) Pipetten (2/5/10/25 ml) Pipettensatz Pipettenspitzen Präparierbesteck Spritzen (2/5/10 ml) Sterilfilter Superfrost Plus Objektträger Wound Autoclip, Clay Adams Zellkulturflaschen Zellkulturplatten (6/24/96 wells) Zellkulturröhrchen (15/50 ml) Zellkulturschalen quadriperm (4 wells) Zellsiebe VWR, Darmstadt, D Visitron Systems, Puchheim, D Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Roth, Karlsruhe, D Millipore, Eschborn, D VWR, Darmstadt, D VWR, Darmstadt, D VWR, Darmstadt, D Fisher scientific, Loughborough, UK Nunc, Wiesbaden, D Falcon/BD, Heidelberg, D Eppendorf, Hamburg, D Eppendorf, Hamburg, D Aesulap, Tuttlingen, D BBraun, Melsungen, D Falcon/BD, Heidelberg, D Roth, Karlsruhe, D BD, Heidelberg, D Nunc, Wiesbaden, D Falcon/BD, Heidelberg, D Falcon/BD, Heidelberg, D VWR, Darmstadt, D Falcon/BD, Heidelberg, D 2.11 Geräte Binokkular GZ 6 Brutschrank Digitale Kamera Photometric Coll Snap ES Leica, Bensheim, D Heraeus Instruments/Thermo Electron, Langenselbold, D Visitron Systems 38

8 Digitale Kamera Intas Intas, Göttingen, D Easycast B1A Electrophoresis System Bio-Rad, München, D Easycast B2 Electrophoresis System Bio-Rad, München, D ELISA Washer Opsys MW Dynex Technologies, Sullyfield Cirdle V, USA Elix-5 Water Purification System Millipore, Eschborn, D FACS Calibur BD, Heidelberg, D Fluoreszenz/Durchlichtmikroskop Olympus Olympus, Hamburg, D BX 50 Fluoreszenz/Durchlichtmikroskop Olympus Olympus, Hamburg, D BX 51 Gel Imaging System Herolab, Wiesloch, D Heizplatte und Rührer RCT basic IKA Labortechnik, Staufen, D Inverses Fluoreszenz/Durchlichtmikroskop Olympus, Hamburg, D Olympus IX 70 Kryostat CM 1900 Leica, Bensheim, D Milli-Q Synthesis A10 System Millipore, Eschborn, D Netzgerät Power Pac 200 Bio-Rad, München, D Peltier Gradient Thermocycler MJ Research, Waltham MA, USA ph Meter Schott Instruments, Mainz, D Plattenreader ELX 800 Biotech Instruments, Bad Friedrichshall, D Schüttler Titramax 100 Heidolph, Schwabach, D Sterilbank Antares 48 Anthos Mikrosysteme, Köln, D Sterilbank Laminar Flow Steag, Pliezhausen, D Tissue chopper Technical Products International, St. Louis MO, USA Vortex NeoLab, Heidelberg, D Wasserbad E 100 Lauda, Lauda-Königshofen, D Zentrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg, D Zentrifuge Megafuge 1.0 Kendro/Thermo Electron, Langenselbold, D 39

9 2.12 Lösungen und Puffer Millipore Typ I Wasser Milli-Q Synthesis A10 System Aus Elix-5 Water Purification System: Ultrareines Wasser, für molekularbiologische Zwecke geeignet. Millipore Typ II Wasser Elix-5 Water Purification System Aus Leitungswasser: Deionisiertes und gefiltertes Wasser, für analytische Zwecke geeignet. Soweit keine anderen Angaben, wurde immer Millipore Typ II Wasser verwendet. Phosphatpuffer ph 7,4 (PB) 0,1 M Dinatriumhydrogenphophat (Na 2 HPO 4 ) 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat (NaH 2 PO 4 ) Phosphatgepufferte Salzlösung ph 7,4 (PBS) 140 mm Natriumchlorid (NaCl) 2,7 mm Kaliumchlorid (KCl) 10 mm Dinatriumhydrogenphosphat Heptahydrat (Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O) 1,8 mm Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4 ) Salzsäure für ph Werteinstellung 1 M Salzsäure (HCl) Natronlauge für ph Werteinstellung 1 M Natriumhydroxid (NaOH) EDTA-Lösung für Blut 200 mm Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA) in PBS 40

10 Lysepuffer für T-Zellen 9 ml 0,16 M Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) 1 ml 0,17 M Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Trisbase) Präparationsmedium für T-Zellen 10 % FCS in RPMI 1640 Medium mit Glutamin Inkubationsmedium für T-Zellen 10 % FCS 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x) 0,1 % 2-Mercaptoethanol in RPMI 1640 Medium mit Glutamin Einfriermedium für T-Zellen 10 % FCS in Dimethylsulfoxid (DMSO) MACS-Puffer 1% FCS 0,01 % Natriumazid (NaN 3 ) in PBS FACS-Puffer 2 % FCS 0,01 % Natriumazid (NaN 3 ) in PBS Essigsäure für Kollagen-Kokulturen 0,1 M Essigsäure (CH 3 COOH) Kollagen-Rekonstituierungspuffer 0,8 M Natriumhydroxid (NaOH) 2,2 % Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3 ) 41

11 Kollagenlösung 2 mg/ml Kollagen in 0,1 M Essigsäure (CH 3 COOH) Kollagenlösung ph 7,4 1ml Kollagenlösung 50µl DMEM Medium 100µl Rekonstituierungspuffer Präparationsmedium für Kollagen- und Membran-Kokulturen ph 7,4 16 g/l MEM 2 mm L-Glutamin 0,8 mm Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Trisbase) Inkubationsmedium für Kollagen- und Membran-Kokulturen ph 7,4 25 % NHS 25 % HBSS Medium 4 mg/l Insulin 0,8 mg/l Vitamin C 5 mm Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Trisbase) 4 mm L-Glutamin 0,58 % Natriumhydrogencarbonat-Lösung 7,5 % (NaHCO 3 ) 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x) 1,2 % Glucose-20 8 g/l MEM Fixierlösung für Membran-Kokulturen und Gehirne 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PB Saccharosepuffer für Membran-Kokulturen 0,8 M Saccharose 0,01 % Natriumazid (NaN 3 ) 42

12 Saccharosepuffer für Gehirne ph 6,9 10 % Saccharose 70 mm Dinatriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4 ) 30 mm Natriumdihydrogenphosphat (Na H 2 PO 4 ) 0,01 % Natriumazid (NaN 3 ) Trisbase-Borsäure-EDTA-Puffer ph 7,5 (TBE-Puffer) 90 mm Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Trisbase) 90 mm Borsäure 2 mm Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA) Agarose-Gel 1,5 % Agarose in TBE-Puffer Ketamin-Rompun-Gemisch zur Anästhesie 2 % Ketamin 0,8 % Rompun 2 % in 0,9 % Natriumchlorid-Lösung (NaCl) 43