Genetische Charakterisierung von. Anaplasma phagocytophilum Stämmen in Europa

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1 Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Genetische Charakterisierung von Anaplasma phagocytophilum Stämmen in Europa INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. vorgelegt 2008 von Sonja Maria Schauer geboren in Spaichingen

2 Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Christian Bogdan 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Johannes Hübner Promotionsjahr: 2008

3 Für meine Eltern Rita und Gerhard

4 Abkürzungsverzeichnis µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer A/ATP Adenin/Adenosintriphosphat AS Aminosäure bp Basenpaar (base pair) C/CTP Cytosin/Cytidintriphosphat dntp Desoxy-Nukleosidtriphosphat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FCS Fötales Kälberserum FSME Frühsommer-Meningoenzephalitis g Gramm G/GTP Guanin/Guanosintriphosphat h Stunde HGA Humane granulozytäre Anaplasmose HGE Humane granulozytäre Ehrlichiose IFT Immunfluoreszenztest kbp Kilobasenpaare kda Kilodalton kg Kilogramm KM Knochenmark LK Lymphknoten M Molar ma Milliampere mg Milligramm MgCl 2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter mm Millimolar mrna Boten-RNA (messenger ribonucleic acid) N Anzahl ORF offener Leserahmen (open reading frame) PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction) RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) rrna ribosomale Ribonukleinsäure (ribosomal ribonucleic acid) sec Sekunden T/TTP Thymin/Thymidintriphosphat Taq Thermophilus aquaticus TBF Weidefieber (tick-borne fever) Tm Schmelztemperatur (melting temperature) UPM Umdrehung pro Minute

5 Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG EINLEITUNG Die humane granulozytäre Anaplasmose Die Familie der Anaplasmataceae Der Erreger A. phagocytophilum Vektor Epidemiologie Klinik Klinik der humanen granulozytären Anaplasmose (HGA) Klinik der granulozytären Anaplasmose des Pferdes Klinik der granulozytären Anaplasmose des Hundes Diagnostik Therapie und Prophylaxe Genetische Charakterisierung S rrna Gen und groesl Operon ank Gen Stand der Forschung ZIELSETZUNG MATERIAL UND METHODEN Material Chemikalien und kommerzielle Analysesysteme Bakterienstamm und Zelllinie PCR-Primer Sequenzier-Primer Proben Geräte Software Methoden Zellkultur DNA Präparation aus Blut und Milz PCR Sequenzierung Sequenzauswertung Phylogenetische Analyse...25

6 Inhaltsverzeichnis 5 ERGEBNISSE Proben aus Deutschland und Bison-Proben aus Polen proben aus Deutschland Bisonproben aus Polen Übrige Proben Geographische Herkunft Sequenzanalyse des 16S rrna Gens Phylogramm A der 16S rrna Gensequenzen Phylogramm B der 16S rrna Gensequenzen Sequenzanalyse des ank Gens Nukleotididentität und abgeleitete Aminosäureähnlichkeit der ank Sequenzen Phylogramm A der ank Gensequenzen Phylogramm B der ank Gensequenzen Phylogramm A der Ank Proteinsequenzen Phylogramm B der Ank Proteinsequenzen DISKUSSION proben aus Deutschland und Bison-Proben aus Polen Sequenzanalyse des 16S rrna Gens Sequenzanalyse des ank Gens LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Alignment der 16S rrna Sequenzen Danksagung..73 Lebenslauf.74

7 Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Anaplasma phagocytophilum ist ein Gram-negatives, obligat intrazelluläres Bakterium, das durch Zecken der Art Ixodes ricinus übertragen wird und sich in neutrophilen Granulozyten des Wirtes vermehrt. Während das Bakterium bereits Mitte des 20. Jahrhunderts in Europa als Verursacher des Weidefiebers (tick-borne fever) bei Schafen und Rindern identifiziert wurde, wurde die entsprechende humane Erkrankung erst 1994 in den USA beschrieben. In Nordamerika sind seitdem fast 3000 Fälle gemeldet worden. Das Vorkommen der menschlichen Erkrankung in Europa ist dagegen auf vereinzelte Berichte beschränkt. In Deutschland wurde eine akute humane Erkrankung mit A. phagocytophilum bis zum heutigen Zeitpunkt nicht diagnostiziert, obwohl Seroprävalenzraten von bis zu 2,6% in der Normalbevölkerung auf das Vorkommen der Infektion hinweisen und die Durchseuchung der heimischen I. ricinus Population mit A. phagocytophilum gesichert ist (ca. 4%). Stammunterschiede sind als Ursache der unterschiedlichen epidemiologischen Situation vermutet worden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob die molekulargenetische Charakterisierung europäischer Stämme und der Vergleich mit nordamerikanischen Sequenzen Belege für diese Hypothese liefern. Außerdem sollte überprüft werden, ob über die A. phagocytophilum 16S rrna und ank Gen Sequenzen verschiedener infizierter Wirte Hinweise für eine Speziesadaptation des Erregers gefunden werden können. Die Amplifikation und Sequenzierung beider Gene wurde in insgesamt 73 Proben aus verschiedenen europäischen Ländern durchgeführt. 16S rrna Gen Sequenzen wurden in allen und ank Sequenzen in 47 Fällen erhalten. Die Sequenzanalyse und Datenbankabfrage ergab, dass in Europa und Nordamerika ähnliche oder identische Varianten beider Gene vorkommen. Eine deutliche Clusterung und Assoziation zwischen Sequenztyp und Wirtsspezies wurde bei Verwendung des ank Gens als molekularem Marker gefunden. Dieser Zusammenhang war bei der 16S rrna Genbasierten phylogenetischen Analyse weniger eindeutig. Während ein Zusammenhang von molekularen Markern mit der geographischen Herkunft der A. phagocytophilum Stämme nicht gezeigt werden konnte, fand sich eine Assoziation zwischen ank Sequenztyp und Wirtsspezies, die der weiteren Abklärung bedarf.

8 Einleitung 2 2 Einleitung 2.1 Die humane granulozytäre Anaplasmose Die humane granulozytäre Anaplasmose (HGA), früher humane granulozytäre Ehrlichiose (HGE), gehört zu den neu erkannten Infektionskrankheiten des Menschen und wird durch Anaplasma phagocytophilum hervorgerufen (24). Während das Bakterium bereits Mitte des 20. Jahrhunderts in Europa als Verursacher des Weidefiebers (tick-borne fever) bei Schafen (60) und Rindern (41) identifiziert wurde, wurde die entsprechende humane Erkrankung erst 1994 in den USA beschrieben (19). Aufgrund einer Revision der Taxonomie im Jahr 2001 in Folge molekularer und antigenetischer Untersuchungen wird der Erreger nicht mehr der Gattung Ehrlichia, sondern der Gattung Anaplasma zugeordnet (23). Abbildung 1 Morulae in einer mit A. phagocytophilum infizierten granulozytären Wirtszelle (HL 60) 2.2 Die Familie der Anaplasmataceae Die Gattungen Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia, Cowdria und Wolbachia wurden historischerseits der Familie der Rickettsiaceae zugeordnet. Phylogenetische Analysen führten jedoch dazu, dass diese Klassifikation revidiert wurde (23). Die Familie der Anaplasmataceae enthält nun nach neuer Nomenklatur die genannten Genera innerhalb der Ordnung der Rickettsiales. Tabelle 1 gibt eine Übersicht wichtiger Vertreter der Anaplasmataceae. E. phagocytophila (später Ehrlichia phagocytophila), der Erreger des Weidefiebers bei Schafen und Rindern, E. equi, der Erreger der granulozytären Ehrlichiose des

9 Einleitung 3 Pferdes und das HGE-Agens, der Erreger der humanen granulozytären Ehrlichiose, wurden aufgrund hoher Sequenzidentität des 16S rrna Gens und des groesl heat shock Operons sowie antigenetischer Verwandtschaft zu einer Spezies, A. phagocytophilum, zusammengefasst (23). Die Erkrankung des Menschen und des Tiers wird demnach konsequenterweise als granulozytäre Anaplasmose bezeichnet. Die Bezeichnung Weidefieber bzw. tick-borne fever wurde beibehalten, da bei Rindern eine zweite, schon länger bekannte Form der Anaplasmose, hervorgerufen durch A. marginale, existiert. 2.3 Der Erreger A. phagocytophilum A. phagocytophilum ist ein obligat intrazelluläres Bakterium, das sich in zytoplasmatischen Vakuolen seiner Wirtszellen, den neutrophilen Granulozyten, vermehrt (76). Die Aufnahme in die Zelle erfolgt wahrscheinlich durch Rezeptorvermittelte Endozytose (16). Durch das intrazytoplasmatische Wachstum des Erregers entsteht die im Lichtmikroskop sichtbare so genannte Morulaform (Maulbeerform, siehe Abbildung 1), die aus bakteriellen Aggregaten besteht (26).

10 Einleitung 4 Tabelle 1 Ausgewählte Vertreter der Familie Anaplasmataceae Spezies Erkrankung Wirt Wirtszelle Vorkommen Anaplasma marginale Anaplasmose der Wiederkäuer Rinder Erythrozyten weltweit Anaplasma phagocytophilum granulozytäre Anaplasmose tick-borne fever Schafe, Rinder, Pferde, Hunde, Katzen, Menschen Granulozyten Nordamerika, Europa Anaplasma platys zyklische canine Thrombozytopenie Hunde Thrombozyten weltweit Ehrlichia canis canine monozytäre Ehrlichose Hunde Monozyten/ Makrophagen weltweit Ehrlichia chaffeensis humane monozytäre Ehrlichiose Menschen, Hunde Monozyten/ Makrophagen Nordamerika Ehrlichia ewingii canine granulozytäre Ehrlichiose Hunde, Menschen Granulozyten Nordamerika Ehrlichia ruminantium Heartwater Wiederkäuer (Schafe, Ziegen, Rinder) Endothelzellen Afrika, Karibik Neorickettsia sennetsu Sennetsu Fieber Menschen Monozyten/ Makrophagen Südostasien Neorickettsia risticii Potomac horse fever / equine monozytäre Ehrlichiose Pferde Monozyten/ Makrophagen, intestinale Epithelzellen Nord - und Südamerika Neorickettsia helminthoeca Salmon poisoning disease Hunde Monozyten/ Makrophagen Nordamerika

11 Einleitung Vektor Die humane granulozytäre Anaplasmose wird in Europa durch Zecken der Art Ixodes ricinus (13, 115, 116) übertragen. Der Vektor in den östlichen Staaten der USA ist I. scapularis und an der Westküste Nordamerikas I. pacificus (24). Da A. phagocytophilum nur eine transstadielle, nicht aber transovarielle Transmission in der Zecke zeigt, ist das Larvenstadium nicht infektiös (61). Das Risiko einer zeckenbedingten Erkrankung ist generell während der Zeit der stärksten Zeckenaktivität von April bis Oktober erhöht. Prinzipiell kann eine Infektion mit A. phagocytophilum auch durch Blutkontakt erworben werden, wie der Fall einer perinatalen Übertragung zeigt (40). Allerdings dürfte dies eine extrem seltene Ausnahme darstellen. Borrelia burgdorferi und das Virus der Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) werden ebenfalls durch I. ricinus übertragen, so dass prinzipiell auch Koinfektionen vorkommen können. Gesicherte Doppelinfektionen mit B. burgdorferi und A. phagocytophilum sind vereinzelt berichtet worden (7, 22, 72, 100). 2.5 Epidemiologie In der Veterinärmedizin sind Erkrankungen durch A. phagocytophilum seit 1932 bekannt. Identifiziert wurde das Bakterium zuerst in Europa als Erreger des Weidefiebers (tick-borne fever) bei Schafen (60) und Rindern (41). Das Weidefieber äußert sich als akut fieberhafte Erkrankung und stellt eine Prädisposition für Superinfektionen dar, tödliche Verläufe werden jedoch selten beobachtet (103, 121, 122). Gut dokumentiert ist das Vorkommen der Erkrankung in Norwegen (106, 109), Schweden (28), Großbritannien (61, 75) und der Schweiz (39, 89). Vereinzelte Fälle wurden auch in Deutschland beobachtet (33). A. phagocytophilum Infektionen bei Pferden und Hunden sind sowohl aus Nordamerika (21, 62, 63, 99) als auch aus europäischen Ländern wie Schweden (9, 27), der Schweiz (38, 85, 86), Italien (93), Großbritannien (20, 49, 71, 95, 96), Frankreich (8) Österreich (47) und Deutschland (15, 35, 45, 53, 94, 118) bekannt. Die Empfänglichkeit von Katzen wird ebenfalls in letzter Zeit aus Europa und Nordamerika berichtet (10, 48, 51, 112). Eine humane Infektion mit A. phagocytophilum wurde erstmalig in den USA im Jahre 1994 beobachtet (19). Seitdem sind bis zum Jahr 2006 in Nordamerika 2963 Fälle an

12 Einleitung 6 die Gesundheitsbehörden gemeldet worden (25). Dagegen ist das Vorkommen der Erkrankung in Europa auf vereinzelte Berichte beschränkt (12, 102). Die erste europäische Infektion trat 1997 in Slowenien auf (80) und seither werden hier die höchsten Fallzahlen gefunden (3, 56-59). Aus Frankreich (91), den Niederlanden (114), Schweden (11, 46), Norwegen (50), Spanien (34), Italien (92), Österreich (120) und Polen (113) wurden ebenfalls gesicherte Erkrankungen berichtet. In Deutschland wurde eine akute humane Erkrankung durch A. phagocytophilum bis zum heutigen Zeitpunkt nicht diagnostiziert, obwohl Seroprävalenzraten von bis zu 2,6% in der Normalbevölkerung auf das Vorkommen der Erkrankung hinweisen (29, 42, 119) und die Durchseuchung der heimischen I. ricinus Population (Infektionsrate mit A. phagocytophilum ca. 4%) gesichert ist (6, 30, 37, 117). 2.6 Klinik Klinik der humanen granulozytären Anaplasmose (HGA) Zwei Drittel aller Infektionen verlaufen wahrscheinlich asymptomatisch. Die Krankheitssymptome der manifesten HGA nach einer Inkubationszeit von sieben bis elf Tagen sind unspezifisch wie Fieber, Abgeschlagenheit, Myalgien und Kopfschmerzen. Bei bis zu 50% der Patienten kommt es zu gastrointestinalen Symptomen mit Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Diarrhoe sowie zu einer respiratorischen Beteiligung mit Husten und Pneumonie. Hautmanifestationen im Sinne eines Exanthems werden dagegen selten beobachtet. Vereinzelt wurden schwere Krankheitsverläufe, z. T. mit tödlichem Ausgang, und das Auftreten opportunistischer Infektionen berichtet. Die Letalität ist jedoch gering und wird mit 0,5% angegeben (24-26, 76). Insgesamt scheint der klinische Verlauf der HGA in Europa milder zu sein (12, 102). Laborveränderungen insbesondere in der ersten Woche der Erkrankung bestehen in einer Thrombopenie, einer Leukopenie und seltener einer Anämie sowie in einer Erhöhung des C-reaktiven Proteins und eines mäßigen Anstiegs der Serumtransaminasen Klinik der granulozytären Anaplasmose des Pferdes Typische Symptome sind Fieber, Futterverweigerung, Bewegungsunlust und Gangataxie. Es zeigen sich eine erhöhte Atem- und Pulsfrequenz, trockene und ikterische Schleimhäute sowie beinbetonte Ödeme. Das Blutbild ist gekennzeichnet

13 Einleitung 7 durch eine Anämie, Leukopenie und Thrombozytopenie. Außerdem besteht häufig eine Hyperbilirubinämie (27, 63) Klinik der granulozytären Anaplasmose des Hundes Ähnlich wie beim Pferd äußert sich die canine granulozytäre Anaplasmose durch A. phagocytophilum mit hohem Fieber, Inappetenz, Futterverweigerung und seltener in Form einer Polyarthritis. Laborveränderungen bestehen in einer Anämie, Thrombozytopenie, einem erhöhten C-reaktiven Protein und gelegentlich einer Hypoalbuminämie (21, 27). 2.7 Diagnostik Bei unklarem Fieber nach Zeckenstich kommt eine A. phagocytophilum Infektion differentialdiagnostisch in Frage. Zur Verfügung stehen folgende Methoden: 1. Mikroskopischer Direktnachweis von Morulae im Giemsa gefärbten Blut- oder buffy coat Ausstrich. Die Methode ist allerdings wenig sensitiv und stark von der Erfahrenheit des Untersuchers abhängig. 2. Nukleinsäurenachweis mittels PCR im EDTA-Blut mit nachfolgender Sequenzierung des PCR-Produkts. Die Untersuchung muss möglichst bald nach Beginn der Symptomatik und vor einer antibiotischen Therapie durchgeführt werden, da die Erreger-DNA nur kurzfristig im peripheren Blut detektiert werden kann. 3. Serologischer Nachweis von spezifischen Antikörpern mittels Immunfluoreszenztest (IFT). Untersucht werden sollten ein Akutphase- und ein 3-6 Wochen später entnommenes Rekonvaleszenzserum. Ein mindestens 4-facher Titeranstieg gilt als beweisend für eine durchgemachte Infektion, die Bestätigung der Diagnose ist jedoch nur retrospektiv möglich. Ein Nachteil der Methode ist die hohe serologische Kreuzreaktivität der verschiedenen Mitglieder der Anaplasmataceae. Auch Antikörper gegen nicht verwandte Erreger können ein Problem darstellen. 4. Anzucht des Erregers in der Zellkultur. Der kulturelle Nachweis gilt als Goldstandard, ist jedoch sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Dem Medium sollten keine Antibiotika zugesetzt werden, was die Kontaminationsgefahr erhöht. Die Kultur von A. phagocytophilum ist nur in wenigen Labors, wie dem unsrigen,

14 Einleitung 8 etabliert. Geeignete Materialien zur Diagnostik sind EDTA- oder Citrat-Blut sowie Serum. Heparin-Blut sollte nicht eingesetzt werden, da es eine inhibitorische Wirkung auf die PCR-Reaktion hat. Wird die Anzucht des Erregers angestrebt, sollte der Transport der Probe bei 4 C erfolgen (115, 116). 2.8 Therapie und Prophylaxe Das Mittel der Wahl ist Doxycyclin (2 x 100 mg pro Tag bis mindestens 3 Tage nach Entfieberung). Bei Kindern unter 8 Jahren kann eine verkürzte Doxycyclin-Therapie durchgeführt werden. Bei absoluter Kontraindikation gegen Tetracycline, wie bei Schwangerschaft, kann Rifampicin 1 x 600 mg pro Tag eingesetzt werden. A. phagocytophilum ist primär resistent gegenüber ß-Laktam-Antibiotika. Die Prophylaxe besteht aus der Vermeidung von Zeckenstichen und aus dem frühzeitigen Entfernen festgesogener Zecken. Je früher die Zecke entfernt wird, desto geringer ist die Erregerübertragungswahrscheinlichkeit (24-26, 76). 2.9 Genetische Charakterisierung S rrna Gen und groesl Operon Die genetische Charakterisierung der Anaplasmataceae erfolgte durch Sequenzanalyse von housekeeping Genen, im wesentlichen des 16S rrna Gens und des groesl Operons (111). Beide Gene sind stark konserviert und für die Spezieszuordnung geeignet. Auf der Subspeziesebene weisen sie jedoch nur wenige Nukleotidaustausche auf (18, 117) ank Gen Das ank Gen dagegen zeigt einen hohen Nukleotid- und Aminosäure- Polymorphismus (18, 68, 117). Es kodiert für ein immundominantes Protein, das reich an Ankyrin Motiven ist und als single copy-gen vorliegt (17, 101). Die genaue Funktion des Ank Proteins ist bisher nicht bekannt. Möglicherweise verändert es die Gentranskription der eukaryontischen Zelle (78). Außerdem wird vermutet, dass Ank ein Virulenzfaktor ist, der über ein Typ-IV Sekretionssystem transloziert wird. Nach

15 Einleitung 9 anschließender Tyrosin-Phosphorylierung greift das Protein vermutlich in Signalwege der Wirtszelle ein (43) Stand der Forschung Für die epidemiologischen Unterschiede zwischen Nordamerika und Europa (12, 102) kommen mehrere Erklärungen infrage. Möglicherweise gehört die HGA aufgrund ihres geringen Bekanntheitsgrades, der schwierigen Nachweisbarkeit des Erregers und seiner Nichtanzüchtbarkeit auf zellfreien Nährmedien in Europa zu den unterdiagnostizierten Erkrankungen. Alternativ könnten Stammunterschiede von Bedeutung sein. Interessant erscheint in diesem Zusammenhang, dass bisher keine Fälle von Weidefieber aus Nordamerika bekannt geworden sind. Als Reservoir für die humane Erkrankungen gilt in Nordamerika die Weißfussmaus, Peromyscus leucopus (52, 90, 98). Die Rolle des Weißwedelhirschs, Odocoileus virginianus, wird diskutiert, da dieser mit 16S rrna Gen Varianten infiziert ist, die beim Menschen bisher nicht gefunden wurden (65-67). Für Europa ist nicht klar, welche Tierspezies humanpathogene Stämme beherbergt, obwohl A. phagocytophilum in kleinen Nagern, Hirschen, en und anderen Wildtieren nachgewiesen wurde (1, 14, 54, 55, 74, 77, 79, 81). In der Mehrzahl der Fälle wurden hier jedoch 16S rrna Gen Varianten detektiert. Daten aus Deutschland liegen hierzu bisher nicht vor. Wahrscheinlich verläuft die granulozytäre Anaplasmose in Wildtieren subklinisch, da symptomatische Erkrankungen nur bei einem Elch- (44) und zwei -Kälbern (107, 108) bekannt geworden sind. Andererseits ist der Kontakt des Menschen mit diesen Spezies deutlich geringer als mit Haustieren wie Schafen, Rindern, Pferden, Hunden und Katzen, für die klinisch apparente Infektionen gesichert sind. Die pathogenetische Bedeutung der varianten Stämme für die humane Erkrankung ist bisher nicht geklärt und umstritten (67, 69, 117). Bis auf zwei Personen in Kalifornien (32) wurde beim Menschen bislang nur die Prototyp-Sequenz entsprechend der HGA-Erstbeschreibung (19) gefunden. Andererseits wurden Infektionen mit 16S rrna Gen Varianten bei Pferden (18), Schafen (109), Hunden (45, 82) und bei en (107, 108) berichtet. Klinische Unterschiede nach Infektion mit varianten Stämmen sind beim Schaf beobachtet worden (104), allerdings handelt es sich um die bisher einzige Studie dieser Art.

16 Einleitung 10 Hinweise für eine Wirtsspeziesadaptation verschiedener A. phagocytophilum Stämme stützen sich auf den sehr wechselhaften Ausgang verschiedener Kreuzinfektionsversuche, bei denen Isolate einer Wirtsspezies für die Infektion einer anderen empfänglichen Spezies benutzt wurden (31, 41, 84, 87, 88). Eingeschränkt ist die Aussagekraft dieser Versuche jedoch durch die Verwendung einer sehr begrenzten Anzahl von Stämmen und Versuchstieren. Gesichert zu sein scheint, dass Pferde mit humanen Isolaten infizierbar sind und nachfolgend vor der Reinfektion mit einem equinen Stamm geschützt sind (5, 64).

17 Zielsetzung 11 3 Zielsetzung Obwohl das Vorkommen von A. phagocytophilum Infektionen bei Menschen und Tieren in Europa gezeigt ist, ist nach wie vor unklar, warum die humane Erkrankung in Nordamerika häufiger aufzutreten scheint. Stammunterschiede sind hier als Ursache vermutet worden. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob die molekulargenetische Charakterisierung europäischer Stämme und der Vergleich mit nordamerikanischen Sequenzen Belege für diese Hypothese liefern. Außerdem sollte überprüft werden, ob anhand von 16S rrna und ank Gen Sequenzen verschiedener infizierter Wirte Hinweise für eine Speziesadaptation des Erregers gefunden werden können.

18 Material und Methoden 12 4 Material und Methoden 4.1 Material Chemikalien und kommerzielle Analysesysteme Ultra pure water ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit Desoxynucleoside Triphosphate Set PCR Grade Diff-Quick DMSO Ethanol (100%) Fötales Kälberserum (FCS) Natriumacetat Oligonukleotidprimer Proteinase K puc Mix Marker 8 QIAmp DNA Mini Kit QIAquick PCR Purification Kit RNase A RPMI 1640 Medium + L-Glutamin Taq DNA Polymerase, rekombinant Trypanblau Biochrom, Berlin Applied Biosystems, Darmstadt Roche Diagnostics Medion Diagnostics, Düdingen, Schweiz Sigma Aldrich, Steinheim Carl Roth, Karlsruhe PAA Laboratories, Pasching, Österreich Sigma Aldrich, Steinheim Metabion, Martinsried Amresco, Solon, OH, USA Fermentas, St. Leon-Rot Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden Invitrogen, Karlsruhe Invitrogen, Karlsruhe Invitrogen, Karlsruhe Invitrogen, Karlsruhe Bakterienstamm und Zelllinie A. phagocytophilum MRK S. Dumler, The Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD, USA HL60 ATCC, Manassas, VA, USA

19 Material und Methoden PCR-Primer Tabelle 2 PCR-Primer mit Nukleotidsequenzen PCR-Primer Nukleotidsequenz (5 3 ) Nachweis von Wirts-DNA Bison f CAC CCA CAC CCA CAT TTA TC Bison r ACC TGC GTT GTC TTC TTT G humanes ß-globin 1 (HBG 1) (4) GAA GAG CAA AGG ACA GGT AC humanes ß-globin 2 (HBG 2) (4) CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC Hund f AGA CGG AGA TAC AAT TTC ATG C Hund r CCT GAA GAC GAT TCC TGG AC Kuh f CTG GGT GGC AAC TAT TGT G Kuh r GAG GGG GAA GAG AAG AGA AAG Pferd TNF sense (118) AAG CAG ATG GGA TGT GGA GGA Pferd TNF antisense (118) GCT AAG CGG CTG ATG GTG TGG f CAA GAA TGG GCA GTC CAA C r ACA AGG AAA CAA GGG GAG AG Schaf f GCA TCT GCG TTT GAC CTT Schaf r TTA CCC CAT CAC CTA TCA GC 16S rrna Gen (70) GE2 GGC AGT ATT AAA AGC AGC TCC AGG GE3a CAC ATG CAA GTC GAA CGG ATT ATT C GE9f AAC GGA TTA TTC TTT ATA GCT TGC T GE10r TTC CGT TAA GAA GGA TCT AAT CTC C ank Gen Sequenztyp 1 (68) 1F ATG TTA CGC TGT AAT AGC ATG GAC 1R TGC CCC AGC TTC TAC AAC AC 1R1 TAT ACA CCT GGA GTA GGA AC 1R2 AAT AAC TAC TCT TCC TTC C 1R4 CAT ACT GTA CTG CAC TCA TCC 1R7 TGC ATC GTC ATT ACG CAC AAG GTC 2F1 CTG ATG TAA ATG CGT CTC CA 2R1 ACC ATT TGC TTC TTG AGG AG 3F GTC TCG AAA GCA TTT GTC AAA C 3R TTT CTC CCT TAG ATG ACG CC 4F1 GCT GCA ATT ACT TCC GAG GC 4F2 TGC TCC GGA TTC TAC CAA AG

20 Material und Methoden 14 4F3 4R1 D1 D2 U3 U5 U7 U8 U3 ank Gen Sequenztyp 2 (117) 1Fmod2 1Rmod 1R2mod 1R4mod 1R7mod 2F1mod 2R1mod 3Fmod 4R1mod U3mod U5mod ank Gen Sequenztyp 3 SS1 SS2 SS3 SS4 SS12 SS13 f SS14 r U8rSS AAG GAA CTA ACA AAA GCT CC GCG ACC TCC TTT TAC AGA CTT AG TAT TGA TCA AAG TAC CTC AGC G GCC TAA ATA CTC AGA AGC GCG GAG GGC AAT CGC GAG TGT GCA G GAA CAA GCA CGT GAG AAG GCA GG GCG TCT GTA AGG CAG ATT GTG TAA GAT AGG TTT AGT AAG ACG GAG GGC AAT CGC GAG TGT GCA G GTA TTC TGC AGT CTG CTC TTA G CTT AGT GCT TCA GCG GTC AG GCG TAG GAA ACT TAG AAC TA CAT ACT GCA CTG CAC TCA TCC ATA TCT GCT CCA TAC CAC TG CAC TGA AGT GGT TGC TGT AA GAA TAT AAA GCC TCA TGT AAC G GCT GCA AGC CGC TCC ATT CT CTT TGA GGA GCT TCT GGT TG GCG TAT GGA TCA CGA GAA AA GCA AGC ACG TGA GGC AGC G TCG TAC TCA GTG GTA TGG AG CTG CGG ATT AGG CTC ACG GTG CTG CTG TAG AGG GCG TT AGG AGC TGT TTC AGG AGA TG CAA CTA CGT CTG CTG CTC TAG TAT GTG CTG CCC TAA CC CAT ATG AAG CAC AGC TCT GC GCT GAA CGG CTT GCA TCA

21 Material und Methoden Sequenzier-Primer Tabelle 3 Sequenzierprimer mit Nukleotidsequenzen Sequenzier-Primer Nukleotidsequenz (5 3 ) 16S rrna Gen (117) 342f CTA CGG GAG GCA GCA GT 356r TGC TGC CTC CCG TAG GA ank Gen Sequenztyp 1 (117) FvL ank1 GAA GAA ATT ACA ACT CCT GAA FvL ank2 GCA GCT GCT AAT GGT GAC GG FvL ank3 TAT CAT CCT TGG GTA GTG G FvL anku1 CAC TCC GCT TCA TAT TGC TA FvL anku2 ACT CCT GAG TCT GTT GTA AA FvL anku3 TAA CAC ATC CTC TTT CAA CC ank Gen Sequenztyp 2 (117) 3Fmod Seq1 CCA TTT GCT CTT TGC TGA GAA 3Fmod Seq2 CTG GGG CAA CAG CAT CAG T 3Fmod Seq3 CAG TGG AGA ATA AAG AAG TAG G 3Fmod Seq4 ATG CAA CAG TGA AAA AGG GTC 3Fmod Seq5 CTT TTT GAG AAG TAT CAC TC 3Fmod Seq6 GCT GAA GGT CTA GGA ACG CC U3 Seq1 GCT CAG GTT CCC CAG AAG TA U3 Seq2 AAT TTT GGC TAT CAT TAG AAG AT U3 Seq3 GAA CAC CCT CAA TCA ACA TC U3 Seq4 CAT CTC CAG TGA CAG GTG TA ank Gen Sequenztyp 3 SS5 CCC TCA ATA TTT GAC GAC AC SS6 GCT GGG AAG GTC TTT GAG SS7 CTG GAC CCT CAG ATC CTG SS9 AAT GAT GGA GCC GCA ACA SS10 GGT CAG CAT AGG TAG ATT SS11 GGT CAG CAT AGA TAG AGT A phag end AGG GTG ATG CAG GAG CGG AA

22 Material und Methoden Proben Tabelle 4 Proben mit Angabe der Materialart und der Herkunft Spezies Probennummer Materialart Herkunft 1 Blut, Milz Allmannsweier 2 Milz Schneid 3 Blut, Milz Langenhard 4 Blut, Milz Langenhard 5 Blut, Milz Langenhard 6 Blut, Milz Langenhard 7 Blut, Milz Langenhard 8 Blut, Milz Langenhard 9 Blut, Milz Allmannsweier 10 Blut, Milz Allmannsweier 11 Blut, Milz Bad Mergentheim 12 Blut Bad Mergentheim 13 Blut, Milz Bad Mergentheim 14 Blut, Milz Bad Mergentheim 15 Blut, Milz Bad Mergentheim 16 Blut, Milz Bad Mergentheim 17 Blut, Milz Bad Peterstal 18 Blut, Milz Bad Peterstal 19 Blut, Milz Bad Mergentheim 20 Blut, Milz Willstätt 21 Blut, Milz Bad Mergentheim 22 Blut, Milz Bad Mergentheim 23 Blut, Milz Bad Mergentheim 24 Blut, Milz Bad Mergentheim 25 Blut, Milz Bad Mergentheim 26 Blut, Milz Willstätt 27 Milz Ottenhöfen 28 Blut, Milz Bad Mergentheim 29 Blut, Milz Bad Mergentheim 30 Blut, Milz Bad Mergentheim 31 Blut, Milz Bad Mergentheim DNA Spanien [1] DNA Spanien [1] DNA Spanien [1] DNA Spanien [1] Bison 1 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 2 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 3 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 4 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 5 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 6 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2]

23 Material und Methoden 17 7 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 8 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 9 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 10 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 11 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 12 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 13 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 14 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 15 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 16 Blut Bialowieza, Polen [2] 17 Blut Bialowieza, Polen [2] 18 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 19 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 20 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 21 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 22 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 23 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 24 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] 25 Blut Bialowieza, Polen [2] 26 Blut, Milz Bialowieza, Polen [2] Pferd 2 FR Blut Zecklab [3] 3 FR Blut Zecklab [3] 4 FR Blut Zecklab [3] 5 FR Blut Pettenkofer Institut [4] Hund 2 Blut Laboklin [5] 3 DNA Laboklin [5] 6 DNA (LK, KM) Zecklab [3] 7 Blut Zecklab [3] 9 Blut Zecklab [3] 11 Blut Zecklab [3] 12 Blut Zecklab [3] 13 Blut Zecklab [3] 1816 DNA Slowenien [6] 1980 DNA Slowenien [6] 2234 DNA Slowenien [6] 2514 DNA Slowenien [6] Mensch 1566 DNA Slowenien [6] 1567 DNA Slowenien [6] 2118 DNA Slowenien [6] 3027 DNA Slowenien [6] 3537 DNA Slowenien [6] 6219 DNA Slowenien [6] Kuh DNA Spanien [1] DNA Spanien [1] DNA Norwegen [7] Schaf A. phagocytophilum Blut Norwegen [7] variant variant 1 1 (S.

24 Material und Methoden 18 [1] Dr. Ana Garcia-Perez NEIKER, Department of Animal Health Derio, Spanien [2] Dr. Anna Grzeszczuk Department of Infectious Diseases Medical University of Bialystok Bialystok, Polen [3] Dr. Gabriele Liebisch Zecklab Labor für klinische Diagnostik und Prüfung Burgwedel, Deutschland [4] Dr. med. Volker Fingerle Max von Pettenkofer Institut München, Deutschland [5] Alexandra Kehl LABOKLIN Bad Kissingen, Deutschland [6] Dr. Miroslav Petrovec Institute of Microbiology and Immunology University of Ljubljana Ljubljana, Slowenien [7] Dr. Snorre Stuen Norwegian School of Veterinary Science Sandnes, Norwegen Geräte 3130 Genetic Analyser Applied Biosystems, Darmstadt Cytospin3 Shandon, Frankfurt am Main GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems, Darmstadt Software HUSAR-Sequence analysis package DNAStar nucleotide-nucleotide BLAST DKFZ, Heidelberg Lasergene, Madison, WI, USA NCBI,

25 Material und Methoden Methoden Zellkultur Uninfizierte HL60 Zellen wurden in RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin und 10% FCS bei 37 C und 5% CO 2 kultiviert. Mit A. phagocytophilum infizierte HL60 Zellen wurden in Medium mit 1% FCS gehalten, bei Bedarf wurde der FCS-Gehalt auf 5% erhöht. Antibiotika- und Antimykotikazusätze wurden nicht verwendet. Eine Passage der Zellen erfolgte alle zwei bis drei Tage, die Zelldichte wurde auf 2 x 10 5 Zellen/ml eingestellt. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Bei weniger als 2 x 10 5 Zellen/ml wurde zu den infizierten Kulturen eine entsprechende Menge uninfizierter Zellen gegeben. Zum mikroskopischen Direktnachweis der Infektion wurden 200 µl Zellsuspension (ca. 4 x 10 4 Zellen) per Zytozentrifugation (5 min, 700 U/min) in der Zytozentrifuge (Cytospin 3) auf Objektträger appliziert und mit Diff-Quick angefärbt. Bei 1000-facher Vergrößerung wurde beurteilt, welcher Prozentsatz der Wirtszellen Morulae enthielt. Zur Kryokonservierung wurden die Zellen bei 300 x g 10 min. abzentrifugiert, anschließend gezählt und in Einfriermedium (RPMI 1640 mit L-Glutamin 30%, FCS 10%, DMSO) aufgenommen und dabei auf eine Zellzahl von 5 x 10 6 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden 1 ml Aliquots der Zellen in Kryoröhrchen überführt und bei -196 C in flüssigem Stickstoff gelagert. Zum Auftauen von Zellen aus dem Stickstofftank wurden die Kryoröhrchen im Wasserbad bei 37 C fast vollständig aufgetaut und anschließend in 10 ml Zellkulturmedium, supplementiert mit 10% FCS, überführt. Die Zellen wurden bei 300 x g 10 min. abzentrifugiert, um DMSO auszuwaschen. Anschließend wurden die Zellen in 10 ml Medium aufgenommen und wie oben beschrieben kultiviert DNA Präparation aus Blut und Milz DNA aus EDTA-antikoaguliertem Blut wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit nach Herstellerangaben aufgereinigt. 100 µl Blut wurden mit 100 µl PBS verdünnt und dann in die Präparation eingesetzt. Die Elution erfolgte in 100 µl Elutionspuffer nach 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Zur DNA-Präparation aus Organen wurde der QIAamp DNA Mini Kit verwendet. Es wurden jeweils ca. 20 mg Milzgewebe zur Präparation eingesetzt. Alle Schritte mit Ausnahme des Waschens wurden mit doppelter Menge an Reagenz durchgeführt.

26 Material und Methoden 20 Um mitpräparierte RNA zu degradieren, wurden 40 µl RNase A zugegeben. Die Elution erfolgte in 100 µl AE Puffer nach 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur PCR Um die Qualität der präparierten DNA zu überprüfen und Inhibitionsereignisse auszuschließen, wurde zunächst Wirts-DNA amplifiziert. Danach wurde zum Nachweis von A. phagocytophilum in der Probe eine 16S rrna Gen basierte nested PCR, wie bereits beschrieben (70), durchgeführt. Im positiven Fall wurde das ank Gen ebenfalls mittels nested PCR amplifiziert. Mit Ausnahme der PCR zum Nachweis des 16S rrna Gens (70) wurden immer die gleichen PCR-Bedingungen verwendet. 50 µl PCR-Reaktionen enthielten 1 x PCR- Puffer, 200 µm dntp, 2 mm MgCl 2, 400 nm jeden Primers und 1 U Taq Polymerase. In die erste Runde der PCR wurden 2 µl DNA eingesetzt, in die zweite Runde 1 µl. Es wurde eine Annealing Temperatur gewählt, die 4 C unter der niedrigsten Schmelztemperatur der verwendeten Primer lag. Die Schmelztemperatur wurde nach folgender Formel abgeschätzt: Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C). Die Extensionszeit betrug pro 500 bp Amplifikatlänge 30 sec, es wurden 40 PCR Zyklen durchgeführt. In jedem PCR-Ansatz wurden eine Positiv- und eine Negativkontrolle mitgeführt. Die PCR-Produkte wurden im 2% Agarosegel mittels Ethidiumbromidfärbung unter UV-Licht visualisiert. Vordenaturierung: 94 C 3 min Denaturierung: 94 C 30 sec Annealing: x C 30 sec x 40 Extension: 72 C x sec Finale Extension 72 C 10 min

27 Material und Methoden 21 Die nested PCR-Reaktionen zum Nachweis des 16S rrna Gens und des ank Gens wurden nach dem folgenden Schema durchgeführt: Tabelle 5 PCR Schema mit Angabe der Primer und Sequenzier-Primer Primer für die erste PCR Primer für die zweite PCR zusätzliche Sequenzier- Primer 16S rrna Gen GE3a+GE10r GE9f + GE2 356r 342f ank Gen Sequenztyp 1 U7 + 1R1 U8 + 1R7 FvL anku3 U5 + 1R4 FvL anku1 U3 + 1R2 FvL anku2 1F + 4R1 1F + 1R FvL ank1 2F1 + 2R1 FvL ank2 3F + 3R FvL ank3 4F1 + 4R1 4F2 + D2 4F3 + D1 ank Gen Sequenztyp 2 U8+1Rmod 1F+4R1mod U8+1R7mod U5mod+1R4mod U3mod+1R2mod 1Fmod2+1Rmod 2F1mod+2R1mod U3 Seq1 U3 Seq2 U3 Seq3 U3 Seq4 1Fmod2+D1 3Fmod+D1 3Fmod Seq1 3Fmod Seq2 3Fmod Seq3 3Fmod Seq4 3Fmod Seq5 3Fmod Seq6 4F2 + D2 4F3 + D1 ank Gen Sequenztyp 3 U8 + SS2 SS13f + SS4 U8 + U8rSS SS1 + SS2 SS13f + SS14r SS3 + SS4 U3mod SS5 SS6 SS7 SS9 SS10 SS11 SS3 + D1 SS12 + D1 A phag end

28 Material und Methoden 22 Die Lage der Primer zur Amplifikation der verschiedenen Sequenztypen des ank Gens sind in den folgenden Abbildungen 2 bis 4 gezeigt. Die Primer sind maßstabsgetreu gemäß ihrer Position und Leserichtung in den offenen Leserahmen (ORF) eingezeichnet. PCR Schema ank Sequenztyp bp U7 1R1 U8 1R7 1F 4R1 U5 1R4 1F 1R U3 1R2 2F1 2R1 3F 3R erste PCR zweite PCR 4F1 4F2 4F3 4R1 D1 D2 Abbildung 2 PCR Schema ank Sequenztyp 1 PCR Schema ank Sequenztyp bp U8 1R1mod U8 1R7mod 1F 4R1mod U5mod 1R4mod U3mod 1R2mod 1Fmod2 1Rmod 2F1mod 2R1mod erste PCR zweite PCR 1Fmod 2 3Fmod 4F2 D1 D1 D1 4F3 D2 Abbildung 3 PCR Schema ank Sequenztyp 2

29 Material und Methoden 23 PCR Schema ank Sequenztyp bp U8 SS2 U8 U8rSS SS13f SS4 SS1 SS2 SS13f SS14R SS3 SS4 erste PCR zweite PCR SS3 SS12 D1 D1 Abbildung 4 PCR Schema ank Sequenztyp 3 16S rrna PCR PCR ank Sequenztyp 1 Bp M + A B + A B + A B + A B GE9f/GE2 U8/1R7 U5/1R4 U3/1R2 PCR ank Sequenztyp 1 Banden des nested PCR Produktes M: puc Mix Marker 8 + : pos. Kontrolle : neg. Kontrolle Proben: A, B, C. Primer 2%iges Agarosegel Bp M + A B + A B + A B + A B M + A B 1F/1R 2F1/2R1 3F/3R 4F1/4R1 4F3/D1 Bp Nachweis -spezifischer DNA M A B C D E F + f/r Abbildung 5 Exemplarische Darstellung von Ergebnissen der 16S rrna und der ank Gen spezifischen PCRs sowie des Nachweises von Wirts-DNA.

30 Material und Methoden Sequenzierung Die PCR-Produkte wurden mittels QIAquick PCR Purification Kit nach Herstellerangaben aufgereinigt. Die Elution erfolgte in 50 µl Elutionspuffer nach 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. 20 µl Sequenzierreaktion enthielten 3 µl gereinigtes PCR-Produkt, 1 x Sequenzier-Puffer, 500 nm Primer und 1 µl BigDye Terminator v3.1. Folgendes PCR-Programm wurde benutzt: 96 C 1 min 96 C 10 sec 50 C 5 sec x C 4 min Nicht eingebaute Nukleotide wurden durch Ethanolfällung entfernt. Das Fällungsreagenz setzte sich wie folgt zusammen: Fällungsreagenz Ethanol absolut 250 µl Ultra pure water 80 µl 3 M Natriumacetat 10 µl 340 µl Die Sequenzierreaktion wurde mit 340 µl Fällungsreagenz gemischt und 15 min bei Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet mit 250 µl 70%igem Ethanol 5 min bei Upm gewaschen. Das Pellet wurde in 20 µl Ultra pure water aufgenommen und vor der Analyse (3130 Genetic Analyser) auf 1:2 bis 1:8 verdünnt Sequenzauswertung Grundsätzlich wurden alle PCR-Produkte bidirektional sequenziert. Das Assembling der einzelnen Sequenzen und die Korrektur eventueller Sequenzierfehler erfolgten mit dem SeqMan Programm des DNAstar Software Pakets. Die erhaltene Consensus Sequenz wurde mit GenBank Einträgen unter Verwendung des nucleotide-nucleotide BLAST Algorithmus abgeglichen.

31 Material und Methoden 25 Abbildung 6 Exemplarische Darstellung der Sequenzauswertung mittels SeqMan Phylogenetische Analyse Für die phylogenetische Analyse wurden Programme des HUSAR-Sequence analysis package verwendet. Zunächst wurde ein Alignment mittels PileUp unter Anwendung der Voreinstellungen errechnet. Aus dem erzeugten Alignment wurden mit dem Programm Distances unter Zuhilfenahme der Jukes Cantor- (Nukleotid- Sequenzen) bzw. Kimura-Korrekturmethode (Proteinsequenzen) die Sequenzabstände bestimmt und anschließend mit dem Programm GrowTree nach der UPGMA Methode die phylogenetischen Bäume berechnet.

32 Ergebnisse 26 5 Ergebnisse 5.1 -Proben aus Deutschland und Bison-Proben aus Polen proben aus Deutschland Es wurden insgesamt 31 proben aus Deutschland untersucht. Die e wurden von Jägern routinemäßig erlegt und wiesen keine erkennbaren Krankheitszeichen auf. Die genaue Herkunft der Proben ist in Tabelle 4 angegeben. Mit Ausnahme dreier Tiere wurden Blut und Milz parallel analysiert. Der Nachweis spezifischer - DNA gelang in jedem Fall. In 28 von 31 (90,3%) Tieren konnte A. phagocytophilum mittels 16S rrna Gen spezifischer PCR nachgewiesen werden. Die Spezifität der Amplifikate wurde durch bidirektionale Sequenzierung der PCR-Produkte bestätigt. In 28 Fällen standen sowohl Blut als auch Milz für die Analyse zur Verfügung. Bei 22 von 28 (78,6%) Tieren ergaben beide Materialien den Nachweis von A. phagocytophilum. Dreimal (10,7%) war lediglich die Milz positiv, so dass die Sensitivität bei Untersuchung dieses Organs etwas höher sein dürfte. Tabelle 6 Vergleich des A. phagocytophilum Nachweises in Blut und Milz der 28 e, für die beide Materialien zur Verfügung standen. N =28 N Milz positiv N Milz negativ N Blut positiv 22 (78,6%) 0 22 (78,6%) N Blut negativ 3 (10,7%) 3 (10,7%) 6 (21,4%) 25 (89,3%) 3 (10,7%) 28 (100%) Bisonproben aus Polen Es konnten 26 Bisonproben, die alle aus dem Bialowieza-Nationalpark stammten, untersucht werden. Die Tiere wurden routinemäßig zur Kontrolle der Population abgeschossen und wiesen keine erkennbaren Krankheitszeichen auf. Mit Ausnahme dreier Bisons wurden Blut und Milz parallel getestet. Der Nachweis spezifischer Bison-DNA gelang in jedem Fall. In 15 von 26 (57,8%) Tieren konnte A. phagocytophilum mittels 16S rrna Gen spezifischer PCR nachgewiesen werden. Die Spezifität der Amplifikate wurde durch bidirektionale Sequenzierung der PCR- Produkte bestätigt. In 23 Fällen standen sowohl Blut als auch Milz für die Analyse zur

33 Ergebnisse 27 Verfügung. Bei zehn von 23 (43,5%) Tieren ergaben beide Materialien den Nachweis von A. phagocytophilum. Viermal (10,7%) war lediglich die Milz positiv, so dass auch hier die Sensitivität bei Untersuchung dieses Organs etwas höher sein dürfte. Tabelle 7 Vergleich des A. phagocytophilum Nachweises in Blut und Milz der 23 Bisons, für die beide Materialien zur Verfügung standen. N =23 N Milz positiv N Milz negativ N Blut positiv 10 (43,5%) 0 10 (43,5%) N Blut negativ 4 (17,4%) 9 (39,1%) 13 (56,5%) 14 (60,9%) 9 (39,1%) 23 (100%) 5.2 Übrige Proben Alle übrigen DNA- und Blut Proben stellten ein vorselektioniertes Untersuchungsmaterial dar, da sie von Kooperationspartnern positiv für A. phagocytophilum getestet worden waren und zwar entweder mittels PCR-Analyse oder durch den Nachweis von Morulae im Blutausstrich. In jedem Fall konnte die spezifische Wirts-DNA (Pferde-, Hunde-, Kuh-, Schaf- oder humane DNA) nachgewiesen und die Positivität der Proben mittels 16S rrna Gen PCR bestätigt werden. Die proben aus Spanien stammten von Tieren ohne erkennbare Krankheitszeichen. Alle anderen Wirte (Pferde, Hunde, Kühe, Menschen und das Schaf) zeigten eine akut fieberhafte Symptomatik. 5.3 Geographische Herkunft Die Abbildung 7 gibt einen Überblick über die geographische Herkunft der Proben. In vier Fällen (Hund 3, Hund 4, Hund 11 und Hund 12) wurde die Probe von einem Labor aus Deutschland zur Verfügung gestellt, der Infektionsort wurde jedoch einmal mit Dänemark (Hund 4), einmal mit Luxemburg (Hund 5) und zweimal mit Schweden (Hund 11 und 12) angegeben.

34 Ergebnisse 28 Herkunft der Proben Infektionsort Norwegen Schweden Finnland Portugal Irland Lettland Dänemark Litauen England Niederlande Luxemburg Deutschland Polen Tschechien Slowakei Schweiz Österreich Ungarn Frankreich Slowenien Rumänien Kroatien Italien Bosnien Spanien Abbildung 7 Europakarte mit Markierung der geographischen Herkunft der Proben bzw. des Infektionsorts. 5.4 Sequenzanalyse des 16S rrna Gens Alle PCR-Produkte aus der 16S rrna Gen PCR wurden bidirektional sequenziert und mit Einträgen der GenBank abgeglichen. Bis auf eine Probe wurde eine 100%ige Identität zu bekannten Sequenzen gefunden. Bei 29 wurde eine neue Variante mit einer Base Abweichung detektiert. Die Tabelle 8 gibt einen Überblick über die gefundenen 16S rrna Gen Varianten. Die Prototypsequenz entsprechend der HGA- Erstbeschreibung (19) wurde zwar am häufigsten bei Hunden, Menschen und Pferden gefunden. Andererseits erbrachten auch drei Proben vom Hund und eine vom Menschen den Nachweis der Frankonia II Variante. Bei den Wiederkäuern waren vier verschiedene 16S rrna Genvarianten häufiger vertreten. Eine klare Assoziation zwischen Wirtsspezies und Variante konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Ebenso wurden sowohl Varianten gefunden, die aus Europa bekannt waren als auch solche, die zuerst in den USA beschrieben wurden.

35 Ergebnisse 29 Tabelle 8 16S rrna Gen Varianten U02521, Prototypsequenz, Mensch, USA (19) Häufigkeit Hund 2 9 x Hund Hund 3 5 x Mensch Hund 9 4 x Pferd Hund x insgesamt Hund 12 Hund 13 Hund 1816 Hund 1980 Hund 3068 Mensch 1566 Mensch 1567 Mensch 3027 Mensch 3537 Mensch 6219 Pferd 2 FR Pferd 3 FR Pferd 4 FR Pferd 5 FR M73220, Old Sourhope Stamm, Schaf, Schottland (2) Häufigkeit Bison 1 15 x Bison Bison 7 2 x Kuh Bison 8 1 x Schaf Bison 9 18 x insgesamt Bison 10 Bison 11 Bison 12 Bison 15 Bison 16 Bison 18 Bison 19 Bison 20 Bison 21 Bison 22 Bison 23 Kuh 2513/656 Kuh 2654/1 Schaf AF136713, Variante Frankonia I, Häufigkeit I. ricinus, Deutschland (6) 2 13 x 4 1 x Kuh 9 14 x insgesamt

36 Ergebnisse / / /176 Kuh 355/04 AF136714, Variante Baden, I. ricinus, Deutschland (6) /40 AF384214, Isolat 99,, Schweiz (55) AF136712, Variante Frankonia II, I. ricinus, Deutschland (6) Hund 6 Hund 2234 Hund 2514 Mensch 2118 AY281785, Isolat I80, I. ricinus, Deutschland (6) 3 neue Variante, 99% (496/497 bp) identisch zu AF136713, Variante Frankonia I, I. ricinus, Deutschland (6) 29 Häufigkeit 13 x 13 x insgesamt Häufigkeit 9 x 9 x insgesamt Häufigkeit 3 x Hund 1 x Mensch 4 x insgesamt Häufigkeit 1 x 1 x insgesamt Häufigkeit 1 x 1 x insgesamt Bei den in Tabelle 9 aufgeführten fünf Tieren wurden Doppelinfektionen mit mehreren Varianten nachgewiesen. Es fanden sich Doppelpeaks im Chromatogramm.

37 Ergebnisse 31 Tabelle proben mit Doppelinfektion AF384214, Isolat 99,, Schweiz (55) AY281785, Isolat I80, I. ricinus, Deutschland (6) AF136713, Variante Frankonia I, I. ricinus, Deutschland (6) AF136714, Variante Baden, I. ricinus, Deutschland (6) AF384214, Isolat 99,, Schweiz (55) AF136714, Variante Baden, I. ricinus, Deutschland (6) AF136713, Variante Frankonia I, I. ricinus, Deutschland (6) neue Variante, 99% (496/497 bp) identisch zu AF136713, Variante Frankonia I, I. ricinus, Deutschland (6) AF384214, Isolat 99,, Schweiz (55) AF136714, Variante Baden, I. ricinus, Deutschland (6) Die Nukleotiddifferenzen des analysierten 497 bp langen Abschnitts des 16S rrna Gens sind in Tabelle 10 dargestellt. Für die Tiere mit Doppelinfektion wurde nur jeweils eine der erhaltenen Sequenzen aufgeführt. Entsprechendes gilt für die phylogenetische Analyse. Austausche sind rot markiert.

38 Ergebnisse 32 Tabelle 10 Nukleotiddifferenzen 16S rrna Gen Probe Nukleotidpositionen Probe Nukleotidpositionen A A A G C G Kuh 2654/1 A A A A C G 10 A A A G C G Bison 1 A A A A C G 11 A A A G C G Bison 10 A A A A C G 15 A A A G C G Bison 11 A A A A C G 16 A A A G C G Bison 12 A A A A C G 17 A A A G C G Bison 15 A A A A C G 23 A A A G C G Bison 16 A A A A C G 24 A A A G C G Bison 18 A A A A C G 25 A A A G C G Bison 19 A A A A C G 28 A A A G C G Bison 20 A A A A C G 31 A A A G C G Bison 21 A A A A C G A A A G C G Bison 22 A A A A C G 21 A A A G C G Bison 23 A A A A C G Mensch 1566 A A A G C G Bison 7 A A A A C G Mensch 3027 A A A G C G Bison 8 A A A A C G Mensch 3537 A A A G C G Bison 9 A A A A C G Mensch 6219 A A A G C G Schaf A A A A C G Mensch 1567 A A A G C G 3 A A G A C G Hund 1816 A A A G C G 2 A G A A C G Hund 1980 A A A G C G 4 A G A A C G Hund 3068 A A A G C G 9 A G A A C G Hund 11 A A A G C G 12 A G A A C G Hund 12 A A A G C G 13 A G A A C G Hund 13 A A A G C G 27 A G A A C G Hund 2 A A A G C G 30 A G A A C G Hund 3 A A A G C G A G A A C G Hund 8 A A A G C G A G A A C G Hund 9 A A A G C G A G A A C G Pferd 2 FR A A A G C G 20 A G A A C G Pferd 3 FR A A A G C G Kuh A G A A C G Pferd 4 FR A A A G C G 6 A G A A A G Pferd 5 FR A A A G C G 7 A G A A A G Mensch 2118 A A A G C A 8 A G A A A G Hund 2237 A A A G C A 19 A G A A A G Hund 2514 A A A G C A 26 A G A A A G Hund 6 A A A G C A 22 A G A A A G Kuh 2513/56 A A A A C G 29 G G A A C G Auch die phylogenetische Analyse der 16S rrna Sequenzen, deren Ergebnis in den folgenden Abbildungen 8 und 9 gezeigt ist, ergab keine klare Assoziation zwischen Wirtsspezies und Genvariation.

39 Ergebnisse Phylogramm A der 16S rrna Gensequenzen AF Baden U02521 Prototypsequenz Mensch AF Frankonia II M73220 Old Sourhope AY Isolat I80 AF Frankonia I AF Isolat 99 Neue Variante Abbildung 8 Phylogenetischer Baum der 16S rrna Gensequenzen, der wie im Abschnitt Material und Methoden beschrieben, berechnet wurde.

40 Ergebnisse Phylogramm B der 16S rrna Gensequenzen Mensch Mensch Mensch Mensch Mensch Hund Hund Hund Hund Hund Hund Hund Hund Hund Pferd Pferd Pferd Pferd Mensch Hund Hund Hund Kuh Kuh Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Schaf Kuh AF Baden U02521 Prototypsequenz Mensch AF Frankonia II M73220 Old Sourhope AY Isolat I80 AF Frankonia I AF Isolat 99 Neue Variante Abbildung 9 Phylogenetischer Baum der 16S rrna Gensequenzen, der wie im Abschnitt Material und Methoden beschrieben, berechnet wurde.

41 Ergebnisse Sequenzanalyse des ank Gens Die Amplifikation des ank Gens wurde für alle 16S rrna Gen positive Proben versucht. Wenn Blut und Milz zur Verfügung standen, wurde nur die aus der Milz präparierte DNA zur Analyse verwendet. Es wurden einander überlappende nested PCR-Produkte generiert und anschließend sequenziert. Aus dem Alignment der erhaltenen Sequenzen wurde eine Consensus-Sequenz ermittelt. Auf diese Weise konnte der gesamte ORF für alle Proben vom Hund, vom Pferd, von der Kuh, vom Schaf und vom Menschen bestimmt werden. Dies gelang nur für zwölf von 28 proben und für neun von 15 Bisonproben. Die Ergebnisse des Abgleichs mit Einträgen der GenBank sind in Tabelle 11 dargestellt. Die beste Übereinstimmung ist in Prozent angegeben. Tabelle 11 GenBankabgleich der ank Sequenzen AF100887, Mensch, Slowenien (68) Hund 2 100% Hund % Hund % Hund % Hund % Mensch % Mensch % AF100886, Mensch, Slowenien (68) Mensch % Mensch % Mensch % AF100888, Mensch, Schweden (68) Pferd 5 FR 100% Pferd 2 FR 99% Pferd 3 FR 99% Pferd 4 FR 99% Hund 3 100% Hund 11 99% Hund 13 99% AY282374, Isolat I121, I. ricinus, Deutschland (117) Hund 6 99% Hund 9 99% Hund % Hund % Mensch %

42 Ergebnisse 36 AF100889, Kuh, Schweden (68) Bison 1 98% Bison 7 98% Bison 8 98% (ohne Repeats) Bison 9 98% Bison 11 98% (ohne Repeats) Bison 1 98% Bison 18 98% Bison 20 98% Bison 21 98% Kuh 355/04 98% Kuh 2513/656 98% Kuh 2645/1 98% AY282371, Isolat G26, I. ricinus, Deutschland (117) 5 99% 6 99% 9 99% 10 99% 15 99% AY282370, Isolat G24, I. ricinus, Deutschland (117) 12 98% 2 97% 4 96% % AY282368, Isolat D20, I. ricinus, Deutschland (117) % AY282375, Isolat I20, I. ricinus, Deutschland (117) 1539/25 99% AY282376, Isolat I158, I. ricinus, Deutschland (117) 2189/176 99% AY282384, Isolat W271, I. ricinus, Deutschland (117) Schaf 87%

43 Ergebnisse 37 Wie die in Prozent angegebene Darstellung der Nukleotididentität und der Aminosäureähnlichkeit in Tabelle 12 zeigt, konnten anhand der ank Genanalyse klar drei Sequenztypen unterschieden werden Nukleotididentität und abgeleitete Aminosäureähnlichkeit der ank Sequenzen Tabelle 12 Darstellung der Nukleotididentität und der abgeleiteten Aminosäureähnlichkeit (kursiv) der erhaltenen ank Sequenzen in Prozent Sequenztyp Sequenztyp Mensch Mensch Hund Hund Hund Hund Mensch Hund Mensch Pferd 2 FR 23. Mensch Hund Hund Pferd 3 FR 27. Hund Pferd 5 FR 29. Pferd 4 FR 30. Hund Hund Mensch Hund Hund Bison Bison Bison Bison Bison Bison Bison Kuh Kuh Kuh Bison Bison 8 Sequenztyp Schaf