Verdauung. Einführung

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1 Verdauung Seite 1 Verdauung Einführung Die verwertbaren Inhaltsstoffe der menschlichen Nahrung liegen zum größten Teil in einer Form vor, in der sie nicht resorbiert werden können, z.b. als Polymere, wie die Proteine, Kohlenhydrate und Nucleinsäuren oder als wasserunlösliche Tröpfchen, wie die Neutralfette. Im Verdauungstrakt gibt es daher zahlreiche Enzyme, die solche Nahrungsstoffe zu Bruchstücken abbauen, die von der Darmschleimhaut aufgenommen werden können. Diese sog. Verdauungsenzyme gehören ausnahmslos zur Gruppe der Hydrolasen, d.h. sie katalysieren die Spaltung von Bindungen unter Aufnahme von Wasser (Hydrolyse). Im vorliegenden Praktikumsblock untersuchen Sie die Wirkung einiger Verdauungsenzyme im Reagenzglas. Folgende Versuche werden durchgeführt 1. ph-optima der Proteinspaltung durch Trypsin und Pepsin 2. Hydrolyse von Stärke durch Speichel-Amylase 3. Spaltung von Triglyceriden durch Pankreas-Lipase Stichworte zu Vorbereitung Verdauungsenzyme, Lokalisierung im Magen-Darm-Trakt, Spaltungsspezifitäten, Enzymklassen, Hydrolasen, Endoenzyme, Exoenzyme, Hydrolasen aus dem Pankreas, Peptidasen (Proteinasen und Exopeptidasen), Proenzyme, Zymogenaktivierung, Enterokinase, Glycosidasen, Amylasen, Lipasen, Triglycerid- Lipase, Colipase, Zusammensetzung und Funktion der Galle, Gallensäuren, Gallensalze, Deteregens-Wirkung, Micellen, enterohepatischer Kreislauf der Gallensäuren. Struktur von Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden. Verdauung von Stärke, Glykogen und Disacchariden Struktur wichtigster Nahrungslipide Strukturen aus polaren und apolaren Lipiden. Hydrolyse und Resorption von Lipiden und lipidähnlichen Stoffen. Synthese und Sekretion von Chylomikronen, essentielle Fettsäuren. fettlösliche Vitamine, Resorption von Aminosäuren und Peptiden, essentielle Aminosäuren. Versuch 1 ph-optima der Proteinspaltung durch Trypsin und Pepsin Pepsin und Trypsin sind Endopeptidasen. Trypsin legt die Carboxylgruppe von Lysinund Argininresten frei; Pepsin spaltet bevorzugt Peptidbindungen, an denen Phenylalanin und Tyrosin beteiligt sind. So entstehen Peptide verschiedener Kettenlänge, die nicht mehr mit Säure fällbar sind. Als Substrat für die Proteolyse durch Trypsin und Pepsin wird Albumin verwandt, welches durch einen an Tyrosin- und Histidinresten gekoppelten Farbstoff markiert ist (Azoalbumin). Durch enzymatische Hydrolyse entstehen daraus Peptide, die nach Ausfällung des unverdauten Azoproteins und Abzentrifugation im Überstand photometrisch bestimmt werden können. Die Absorption bei 492 nm ist ein Maß für die proteolytische Wirkung ( d.h. die Aktivität) der beiden Proteinasen. 1

2 Verdauung Seite 2 Man beschickt eine Reihe trockener Zentrifugengläser wie folgt: Glas Nr. 0,3 N HCl ph 2,5 ph 4,7 ph 7,4 ph 8,5 Azoalbumin Trypsin Pepsin ph 10, Man mischt den Inhalt der Reagenzgläser gut und inkubiert 45 min in einem Wasserbad bei 37 C. Danach stellt man die Proben in Eis und versetzt sie nach 5 min mit je 3 ml eiskalter 20%iger Trichloressigsäure (TCA), schüttelt jede Probe einmal um (Reagenzgläser mit Parafilm verschliessen) und läßt diese mindestens 5 min auf Eis stehen. Anschließend werden 1,5 ml in ein 1,5 ml Eppendorfgefäss überführt und 5 min bei etwa Upm zentrifugiert. Man entnimmt dann vom Überstand 1ml und versetzt ihn in einem 2 ml Eppendorfgefäss mit 1ml 1,0 N NaOH. Die Probe wird gemischt und in eine Kunststoff-Küvette gegeben. Die Extinktion der Probe wird bei 492 mm bestimmt. Als Bezugswert für die Trypsinbestimmung dient Probe Nr.1. Als Bezugswert für die Pepsinbestimmung dient Probe Nr. 6 Zur graphischen Darstellung (siehe Anhang) werden die Extinktionen der Proben 2-5 und der Proben 7-10 jeweils gegen den ph-wert bei dem die Hydrolyse stattfand, aufgetragen. Wo liegen die ph-optima von Trypsin und Pepsin? Welchen ph-wert hat die Probe 7 (wie ist der ph Wert definiert)? Versuch 2 Enzymatische Hydrolyse von Stärke Stärke ist ein Gemisch von Amylose und Amylopektin. Die Amylose besteht aus langen, unverzweigten Ketten α-glycosidisch gebundener Glucose (Maltoseeinheiten) die helixartig angeordnet sind. Durch Einlagerung von Jod in die Helix gibt Amylose eine blaue Farbreaktion, die auf der Wechselwirkung des in der Stärke eingelagerten Jods (Einschlußverbindung) mit den Glucoseeinheiten zurückzuführen ist. Die α Amylase des Speichels, eine Endoglycosidase, spaltet das Stärkemolekül an mehreren Stellen, so daß sich längere Fragmente, sogenannte Dextrine, bilden. Dadurch verschwindet die Jodreaktion schnell, jedoch werden reduzierende Zucker erst nach längerer Inkubationszeit gebildet. Je Zweier-Gruppe wird von einer Person etwas Speichel (ca. 2ml) in einem Eppendorfgefäss gesammelt und 5 min bei Umdrehungen zentrifugiert. Der Speichel aus der mittleren Phase wird kurz bevor die Hydrolyse durchgeführt wird 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 und 1:50 mit Amylasepuffer verdünnt. Die und Reagenzien werden in der angegebenen Reihenfolge pipettiert, das Jod wird direkt vor Zugabe der Stärkelösung zugegeben. Der verdünnte Speichel wird als Letztes in die Gläser pipettiert, danach wird kurz geschüttelt (=Reaktionsstart!!!!; Beginn der Zeitnahme!!!!!) 2

3 Verdauung Seite 3 Reagenzglas Nr. Amylase- Speichel (Verdünng) Jodlösung (µl) Stärkelösung 1 3,0 2,0 (1 : 10) 5 1,0 2 3,0 2,0 (1 : 20) 5 1,0 3 3,0 2,0 (1 : 30) 5 1,0 4 3,0 2,0 (1 : 40) 5 1,0 5 3,0 2,0 (1 : 50) 5 1,0 Blindwert 5,0-5 1,0 Die Regenzgläser werden dann bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zeitpunkt, an dem die Blaufärbung komplett verschwindet (vergleiche mit dem Blindwert), wird notiert. Auswertung: Die Zeizten bis zur Entfärbungs werden graphisch aufgetragen und innerhalb der Gruppe verglichen. Was bedingt die z.t. stark unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeit. Versuch 3 Hydrolyse von Triglyceriden durch Pankreas-Lipase Die Substrate der Lipase sind hauptsächlich Di-und Triglyceride. Monoglyceride werden nur in sehr geringem Maß gespalten. Bevorzugt werden die Fettsäuren abgespalten, welche in den α- bzw. α'-stellungen verestert sind. Hochmolekulare Di- und Triglyceride sind schwer wasserlöslich und daher der enzymatischen Hydrolyse nur schwer zugänglich. Im Darm muß die effektive Konzentration dieser Substrate durch den Zusatz emulgierender Substanzen, z.b. den Gallensalzen (u.a. Desoxycholat) erhöht werden. Ca 2+ -Ionen stimulieren die Hydrolyse, welche bei alkalischem ph- Wert durchgeführt werden muß. Als Produkt der Hydrolyse entstehen freie Fettsäuren, die anschließend titriert werden können. Die in einer bestimmten Zeit gebildete Menge dient als Maß für die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion. In einem Reagenzglas mit Stopfen versetzt man 15 ml Olivenöl mit 170 µl einer 1 N NaOH-Lösung und schüttelt etwa 10 mal auf und ab. Man erhält so eine stabile Emulsion. Man beschickt 5 Reagenzgläser in der folgenden Reihenfolge: Glas Nr. H 2 0 Desoxycholat (1 %) 10 mm CaCl 2 Öl-Emulsion Lipase- Verdünnung Leerwert 3,0 2,5 2,0 1 2,0 2,5 2,0 1,0 2 1,0 2,5 1,0 2,0 1,0 3 1,0 2,5 1,0 2,0 1,0 4 2,5 1,0 1,0 2,0 1,0 : 30 mm Tris/HCl, ph 7.7; Lipaseverdünnungen: 1µg/µl. Man inkubiert die Proben 30 min bei 37 C und schüttelt alle 5 min kräftig durch (Vortex). Danach überführt man den Inhalt in 50 ml-erlenmeyer-kolben, spült die Reagenzgläser mit je 5,0 ml Alkohol, um eine quantitative Überführung zu erhalten, gibt 200 µl Phenolphtalein-Lösung als Indikator dazu und titriert mit 0,1 N bis zu einer stabilen, für alle Proben gleichen, Rosafärbung. Da sich die Proben nach einigen Minuten wieder entfärben können ist ggf. eine "Nachtitrtion" erforderlich. Der Verbrauch an Alkali ist der enzymatischen Wirkung proportional. Die Titration der einzelnen Proben 3

4 Verdauung Seite 4 muß schnell hintereinander geschehen, da die enzymatische Reaktion weiterläuft und das Ergebnis sonst verwischt wird. Berechnen Sie für die einzelnen Ansätze die Lipase-Aktivität in Internationalen Einheiten (U). 1 U ist diejenige Menge, die pro Minute ein µmol Fettsäure freisetzt. Wie groß sind die spezifischen Aktivitäten ( in U/mg Protein). Diskutieren Sie die gemessenen Aktivitäten. Welche Substanzen übernehmen im Verdauungstrakt die Funktion von Desoxycholat? Fragen: 1) Kann ein Protein durch Pepsineinwirkung vollständig zu einzelnen Aminosäuren verdaut werden? 2) Welche anderen Proteasen außer Pepsin und Trypsin kommen im menschlichen Organismus vor? 3) Welchen Wirkung hat Trichloressigsäure (TCA) auf langkettige Proteine? 4) Was versteht man unter Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartär- Struktur von Proteinen? 5) Nennen Sie Funktionen von Proteinen im Organismus (mindestens 5) 6) Wie sind Amylose bzw. Amylopektin aufgebaut? 7) Wenn Glycogen bei der Verdauung durch α-amylasen gespalten wird, kommt es zur quantitativen Zerlegung in Monosaccharide. Warum? 8.) Was sind β-amylasen und wo kommen sie vor? 9.) Wie wird Glykogen in der Leber zu Monosacchariden abgebaut? 10.) Was sind reduzierende Zucker? 11.) Funktion von Kohlenhydraten in der Natur (mindestens 4). 12.) Welche Faktoren können die Geschwindigkeit der beobachteten Triglycerid- Hydrolyse beeinflussen? 13.) Wie werden die im Dünndarm verdauten Fettsäuren nach der Resorption tranportiert? 14) Was sind Chylomikronen? 15.) Funktion von Lipiden in der Natur (mindestens 5) 16.) Welche ernährungsabhängige Krankheiten kennen Sie und wodurch werden sie verursacht? 17.) Wie sieht der tägl. Mindestbedarf an Kohlenhydraten, Fetten und Eiweiss im Vergleich zu tatsächlich zugeführten Menge (Industriestaaten) aus? 4

5 Verdauung Seite 5 VERSUCHSAUSWERTUNG: VERSUCH 1: Bestimmung des ph Optimums von Pepsin und Trypsin Grafische Darstellung der gemessenen Extinktion (y) versus der verschiedenen ph-werte (x) 5

6 Verdauung Seite 6 VERSUCH 2: Grafische Darstellung der Amylase Kinetik. Speichelverdünnung (y) / Zeit bis zur Entfärbung (x) 6

7 Verdauung Seite 7 VERSUCH 3: Einfluss von Ca 2+ und Desoxycholat auf die Aktivität derlipase Säulendiagramm: 7

8 Verdauung Seite 8 Beschreibung und Diskussion der Ergebnisse: 8