Interferon-antagonistische Funktion des viralen ML-Proteins

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1 AUS DEM INSTITUT FÜR MIKROBIOLOGIE UND HYGIENE, ABTEILUNG VIROLOGIE, DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITÄT FREIBURG IM BREISGAU Interferon-antagonistische Funktion des viralen ML-Proteins INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2007 von Nico Büttner aus Stuttgart

2 Dekan: Prof. Dr. med. C. Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. med. O. Haller 2. Gutachter: Prof. Dr. med. R. Thimme Jahr der Promotion: 2008

3 Die vorliegende Arbeit entstand in den Jahren 2004 bis 2007 während meiner Tätigkeit am Institut für Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau. Auf dem Weg zu dieser Arbeit haben mich zahlreiche Menschen unterstützt und begleitet. Ihnen allen gebührt mein außerordentlicher Dank. Dank schulde ich zunächst Herrn Prof. Dr. Otto Haller, meinen geschätzten Doktorvater. Er hat mir die vorliegende Arbeit ermöglicht. Das außergewöhnliche Klima am Institut hat die Arbeit leicht gemacht. Die zahlreichen Gelegenheiten lehrreiche Tagungen und wissenschaftliche Veranstaltungen zu besuchen, waren mir ein zusätzlicher Ansporn. Herrn Prof. Dr. Thimme danke ich für die zügige Erstellung des Zweitgutachtens. In besonderem Maße möchte ich mich bei Herrn PD Dr. Georg Kochs für seine glänzende Betreuung bedanken. Seine fachlichen und persönlichen Ratschläge waren immer eine Bereicherung für mich. Hilfsbereit hat er mir unter die Arme gegriffen, und sein Einsatz ging weit über die Arbeit am Institut und an der Dissertation hinaus. Vielen Dank für die schöne Zeit. Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Haller sei herzlich für die wunderbare Arbeitsatmosphäre gedankt. Bei allen möchte ich mich für die Unterstützung und Freundschaft in den letzten Jahren und im Speziellen bei Jan (dem anderen Typen) für die gegenseitige Hilfe das große Ziel zu erreichen, bei Silke für die persönliche sowie fachliche und organisatorische Unterstützung in allen Bereichen, bei Carola und Ellen für die Diskussionen in der Thogotoforschung, bei Alex, Simone, Dirk, Iris, Daniel für die unvergesslichen Zeiten im Labor bedanken. Den Arbeitsgruppen Staeheli, Weber und Schwemmle danke ich herzlich für die offenen Türen und die bereitwillige Hilfe und Unterstützung und nicht zuletzt für die wunderbaren Abende und Ausflüge in geselliger Runde. Meinen Eltern schließlich habe ich nicht nur diese Arbeit, sondern auch mein Studium zu verdanken. Auf ihre kompromisslose und aufopfernde Unterstützung konnte ich mich immer voll und ganz verlassen. Ihnen ist diese Arbeit gewidmet. Freiburg i. Br. im Januar 2007 Nico Büttner

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Das Thogotovirus Genom und Partikelstruktur des THOV Replikationszyklus Das zelluläre Interferonsystem Interferone Interferon-induzierende Signalwege...8 Zytoplasmatische Helikasen und Toll-like Receptor 3 (TLR3)...9 Der Toll like receptor (TLR) vermittelte Signaltransduktionsweg...12 Transkriptionelle Kontrolle von Typ-II-Interferon Interferon-Rezeptoren und -Signaltransduktion Die Familie der interferon regulatory factors (IRFs) Interferon-stimulierte Genprodukte mit antiviraler Aktivität Virale Interferon-Antagonisten Zielsetzung Material und Methoden Material Materialien für Zellkultur Zellinien Interferone Viren Transfektionsreagenzien Dualer Luziferase-Reporterassay Plasmide Antikörper...28 Primärantikörper...28 Sekundärantikörper Materialien für molekularbiologische Methoden Oligonukleotide (Klonierungs/SequenzierungsPrimer) Materialien für Proteinchemische Methoden Geräte Sonstiges Methoden Zellkultur Kultivierung von Säugerzellen Virusinfektion Plaquereinigung von Virusstocks Herstellung von recthov-virusstocks Virustitration...34

5 II Inhaltsverzeichnis Plaque assay für Thogotovirus Transiente Transfektion Dualer Luziferase-Reporterassay Immunfluoreszenz Molekularbiologische Methoden Präparation von Plasmid-DNA Restriktionsverdau von DNA DNA-Gelelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen PCR Reinigung von DNA Ligation von DNA-Fragmenten Transformation kompetenter Bakterienzellen Herstellung von Glycerinkulturen Konstruktion von Plasmiden...41 pcaggs-ha-mirf Proteinchemische Methoden Proteinelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) Western Blot Analyse Strippen von Western Blot-Membranen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration nach Bradford Koimmunpräziptiationen Ergebnisse THOV-ML unterdrückt die TBK-1 vermittelte Aktivierung der IFN- Promotoren...45 Einfluß der THOV-Infektion auf die Aktivierung der IFN-α und ß Promotoren...45 THOV-ML unterdrückt konstitutiv aktive IRFs...47 Das ML-Protein verhindert die Dimerizierung von IRF Das ML-Protein verhindert nicht die Translokation von IRF7 in den Zellkern THOV-ML unterdrückt die TLR-vermittelte Aktivierung des IFNα- Promotors...51 THOV-ML inhibiert die IFNα 4 -Induktion via MyD88 und TRAF Das ML-Protein verhindert die Komplexbildung zwischen IRF7 und TRAF Das ML-Protein kann mit IRF7 koimmunpräzipitiert werden Das ML-Protein von THOV unterdrückt die IFNα/ß- Signaltransduktion auf Ebene von IRF Infektion mit rekombinantem THOV(ML+) unterdrückt die Aktivität des Mx1-Promotors...55 THOV ML-Protein unterdrückt die IFNß-vermittelte Mx1- Promotor Aktivität...56 THOV ML-Protein unterdrückt die Mx1-Promotor-Aktivierung durch ein konstitutiv aktives IRF9-STAT2-Hybrid-Protein...57 THOV ML-Protein unterdrückt die Funktion von IRF9 unabhängig von dessen DNA-Bindedomäne...58

6 III Inhaltsverzeichnis 3.4 Das ML-Protein von THOV unterdrückt die IFNγ- Signaltransduktion auf Ebene von IRF THOV-ML unterdrückt die IFNγ- und IRF1-vermittelte GBP- Promotor Aktivität Diskussion Ausmaß der IFN-antagonistischen Wirkung des ML-Proteins Die IFN-antagonistische Wirkung des ML-Proteins auf plasmazytoide dendritische Zellen Mechanismus der ML-vermittelten Unterdrückung der IRF-Funktion Hypothese zur IFN-antagonistischen Wirkungsweise des THOV ML- Proteins Zusammenfassung Abkürzungen Literaturverzeichnis Anhang...87

7 1 Einleitung 1.1 Das Thogotovirus Das Thogotovirus (THOV) wird zur Familie der Orthomyxoviridae gezählt (Haller and Kochs, 2002b). Zu dieser Familie gehören weiterhin das Influenza-A-, Influenza-B- und Influenza-C- Virus. THOV vertritt, neben dem Dhorivirus (DHOV) die Gattung der Thogotoviren (vgl. Tabelle 1-1). THOV und DHOV werden einer eigenen Gattung zugeteilt, weil sie in der Lage sind nicht nur in Vertebraten zu replizieren, sondern sich auch in Athropoden (Gliederfüßler) vermehren können (Nuttall, 1995). Es wird ebenfalls vorgeschlagen, ein Araguari Virus genanntes Arbovirus der Gattung Thogotovirus zuzuteilen (Da Silva et al., 2005). Die fünfte Gattung der Othomyxoviridae, Isavirus genannt, vertritt ein Fischvirus, Infectious-Salmon- Anaemia-Virus (Rimstad and Mjaaland, 2002). Tabelle 1-1: Charakteristische Vertreter der Orthomyxoviren Genus Vertreter Segmente Wirt Influenzavirus A Influenza-A-Virus (FLUAV) 8 Vertebraten Influenzavirus B Influenza-B-Virus (FLUBV) 8 Vertebraten Influenzavirus C Influenza-C-Virus (FLUCV) 7 Vertebraten Thogotovirus Thogotovirus (THOV) 6 Vertebraten, Arthropoden Dhorivirus (DHOV) 7 Vertebraten, Arthropoden Isavirus Infectious-Salmon-Anaemia- Virus (ISAV) 8 Vertebraten (Fische) Das Thogotovirus erhielt seinen Namen durch die Erstisolierung aus Rindern 1960 im gleichnamigen Gebiet, dem Thogoto forest in Kenia (Haig, Woodall, and Danskin, 1965). Es gehört zu den häufig aus verschiedenen Zeckenarten isolierten Viren in Zentralafrika (Sang et al., 2006) und konnte schon mehrfach im Iran (Sureau and Klein, 1980), in Sizilien (Albanese et al., 1972), Ägypten (Williams et al., 1973) und in Portugal (Filipe and Calisher, 1984) aus Zecken isoliert werden. Weiterhin konnten virusspezifische Antikörper in zahlreichen Nutztieren, wie Rindern, Schafen, Ziegen, Eseln, Kamelen und in Menschen nachgewiesen werden (Albanese et al., 1972; Haig, Woodall, and Danskin, 1965). Es wird angenommen, dass das THOV eine Rolle bei den zahlreichen Aborten von Schafen in der Tierzucht spielt, die jedes Jahr in Afrika, Europa und Nordostasien verzeichnet werden

8 2 1.1 Einleitung müssen (Davies, 1997). Als Arboviren (arthropod-borne virus) benutzen die Thogotoviren Zecken als Vektoren zur Verbreitung. Uninfizierte Zecken nehmen das Virus bei der Blutmahlzeit an infizierten Säugetierwirten auf. Die Viren vermehren sich in den Zecken und werden dann bei der nächsten Blutmahlzeit über den Zeckenbiss auf das nächste Tier übertragen. In Nutztieren kann die Infektion mit dem Virus zu Erkrankungen führen. So führt eine Infektion mit THOV in Schafen zu fiebrigen Erkrankungen und Spontanaborten bei trächtigen Tieren (Davies, 1997; Haig, Woodall, and Danskin, 1965). Trotz der hohen Prävalenz bei Nutztieren, wurden bis jetzt nur zwei Fälle beschrieben, bei denen Menschen erkrankten (Causey et al., 1969; Moore et al., 1975). Im ersten Fall wurde das Virus aus der Cerebrospinalflüssigkeit eines erwachsenen Nigerianers isoliert, der an einer bilateralen optischen Neuritis (Entzündung der Sehnerven) litt. Im zweiten Falle erkrankte ein Kind an einer fatalen Meningitis. Hier konnte das Virus aus dem Blut des Kindes, welches zusätzlich an einer Sichelzellanämie litt, isoliert werden Genom und Partikelstruktur des THOV Viele biologische Eigenschaften der THOV sind denen der Influenzaviren ähnlich. Die sechs einzelsträngigen RNA-Segmente mit negativer Polarität des THOV umfassen eine Größe von ungefähr 950 bis 2400 Nukleotiden. Die sechs Segmente des THOV kodieren für insgesamt sieben Proteine. Die 3 - und 5 -Enden der einzelnen Segmente sind hochkonservierte, nicht kodierende Regionen (non-coding regions, NCR). Sie sind über kurze Bereiche zueinander komplementär und bilden Doppelstränge aus, über welche die RNA-Moleküle in einer pfannenstielähnlichen Form gehalten werden (Weber, Haller, and Kochs, 1997). Diese Strukturen dienen als Promotor für die virale Polymerase bei der Initiation der Transkription und RNA-Replikation. Jedes Segment kodiert für ein bestimmtes Virusprotein. Nur das sechste und kleinste Segment kodiert für 2 Proteine, deren Translation von unterschiedlich gespleißten mrna-spezies ausgeht. Tabelle 1-2: Die Genomsegmente von THOV Segment Genomlänge (Nukleotide) Genprodukt Größe (kda) Referenz PB2 88,042 (Weber et al., 1999) PB1 81,284 (Leahy et al., 1997) PA 71,464 (Leahy et al., 1997) GP 57,550 (Morse, Marriott, and Nuttall, 1992) NP 51,850 (Weber, Haller, and Kochs, 1996)

9 3 1.1 Einleitung M 29,851 (Kochs et al., 2000) 955 ML 34,402 (Hagmaier et al., 2003) Die Viruspartikel der THOV sind ungefähr 100 nm groß und haben eine pleomorphe Gestalt. Sie enthalten jeweils 6 verschiedene Nukleokapside (viral ribonucleoprotein particles, vrnps), die von einer Hüllmembran umgeben sind (vgl. Abbildung 1-1). Die einzelsträngige, genomische RNA ist über ihre gesamte Länge durch basische Nukleoproteine (NP) verpackt. Zusätzlich sind an jedem Segment die Proteine des Polymerasekomplexes PB1, PB2 und PA an den Enden der Segmente assoziiert, die die Aktivität der RNA-abhängigen RNA- Polymerase besitzen. Das PB2-Protein (polymerase basic protein 2) ist in der Lage 5 -Cap- Strukturen zellulärer mrna als Primer für die eigene Transkription umzufunktionieren. Der PB1-Anteil (polymerase basic protein 1) besitzt die Polymerase-Aktivität und ist für die Elongation zuständig. Die Funktion des PA-Proteins (polymerase acidic protein) ist noch nicht vollständig geklärt. Das THOV besitzt keine Nichtstrukturproteine (NS) wie die Influenzaviren. Lipidhülle Glykoprotein Matrixprotein Nukleoprotein PB2 PB1 PA GP NP M PB2 PA PB1 Polymerasekomplex ss(-)rna-segmente Abbildung 1-1: Schematische und elektronenmikroskopische Abbildung eines THOV-Partikels In die Hüllmembran sind glykosylierte Oberflächenproteine eingelagert. Bei THOV handelt es sich dabei um das 57 kda große Glykoprotein (GP). Das GP vermittelt wahrscheinlich die Adsorption und Endozytose des Viruspartikels sowie die folgende Verschmelzung von Endosomenmembran und Virushülle (Portela, Jones, and Nuttall, 1992). Das sechste Segment des Genoms kodiert für zwei Proteine. Es ist das einzige Segment, welches ein Intron aufweist. So wird das M-Protein von dem gespleißten Transkript gebildet (vgl. Abbildung 1-2). Der Leserahmen für das M-Protein entsteht im Spleißprozess durch die Bildung eines Stopkodons, das aus Nukleotiden der Spleißakzeptor- und Spleißdonorstelle

10 4 1.1 Einleitung zusammengesetzt wird (Kochs et al., 2000). Im Gegensatz dazu wird das ML-Protein von dem ungespleißten Transkript translatiert und stellt damit eine C-terminal verlängerte Version des M-Proteins dar (Hagmaier et al., 2003). 3 -NCR I N T R O N 5 -NCR Transkription Cap AUG UG A (A)n ML Spleißen Cap AUG UGA (A)n M Abbildung 1-2: Kodierungsstrategie des sechsten Segmentes von THOV Obwohl das ML-Protein nur um 38 Aminosäuren länger ist als das M-Protein, zeigt es dennoch ein völlig unterschiedliches Verhalten. Die Matrixproteine (M-Proteine) sind mit der Innenseite der Lipiddoppelschicht des Viruspartikels assoziiert und kleiden diese aus, indem sie miteinander wechselwirken. Sie besitzen keine Transmembranregion. Nach Innen stellt das M-Protein eine Verbindung zu den Nukleokapsiden her. Sie verleihen den Virionen ihre Struktur und helfen wahrscheinlich bei der Verankerung der GP in der Hüllmembran. Sie haben eine wichtige Funktion bei der Verpackung der Nukleokapside in die entstehenden Viruspartikel und hemmen die RNA-abhängige virale RNA-Polymerase am Ende des Replikationszykluses. Über alle diese Fähigkeiten verfügt das ML-Protein nicht, sondern es funktioniert viel mehr als ein Interferon-Antagonist (Hagmaier, Gelderblom, and Kochs, 2004; Hagmaier et al., 2003). Es ist in der Lage die Induktion von Interferon α/ß (IFN) durch dsrna oder Virusinfektion zu verhindern. Weitere Analysen konnten zeigen, dass ML die Dimerisierung von interferon regulatory factor 3 (IRF3) und die Assoziierung des IRF3 mit dem CREB-binding protein (CBP) verhindert, nicht jedoch die Translokation von IRF3 in den Zellkern (Jennings et al., 2005). Vor allem für die Infektion von Säugetieren, die mit dem IFN- System über eine effiziente Abwehr verfügen, stellt der IFN-Antagonist dieses Arboviruses wohl eine Anpassung an seinen Wirt dar Replikationszyklus Man geht bei der Replikation des THOV davon aus, dass eine grundsätzliche Ähnlichkeit zum Replikationszyklus der Influenza-Viren besteht. Durch das GP-Oberflächenprotein bindet THOV an einen bis lang noch nicht identifizierten Rezeptor an der Zelloberfläche und

11 5 1.1 Einleitung wird über Endozytose aufgenommen (vgl. Abbildung 1-3). Die Fusion der Virushülle mit der Endosomenmembran wird wahrscheinlich ebenfalls durch das GP-Protein vermittelt (Cros and Palese, 2003; Portela, Jones, and Nuttall, 1992). Durch die Fusion der Membranen werden die Nukleoproteinkomplexe (vrnps) aus den Vesikeln entlassen und können ins Cytoplasma gelangen. Beim FLUAV löst die Ansäuerung des Inneren des Virions durch den Protonenkanal des M2-Proteins die Interaktion zwischen den NP- mit den M- Proteinen, so dass diese nach der Fusion frei ins Zytoplasma gelangen können. Bei THOV konnte ein solcher Protonenkanal bislang noch nicht identifiziert werden und der Mechanismus des uncoating bleibt damit für das THOV noch unklar. Die segmentierten vrnps werden durch die Kernporen in den Zellkern transportiert (Cros and Palese, 2003), wo dann die folgenden Transkriptions- und Replikationsschritte ablaufen. Die Transkription der viralen mrna erfolgt durch die virale RNA-Polymerase in Zusammenarbeit mit dem NP- Protein (Weber et al., 1998). Die virale Polymerase ist allein nicht in der Lage die Initiation der Synthese einzuleiten. Wie FLUAV verwendet THOV für die Einleitung der Transkription den Mechanismus des Cap-Snatchings, wenn auch in einer modifizierten Art und Weise (Weber, Haller, and Kochs, 1996). Die virale Polymerase erzeugt einen Primer für die folgenden Polymerisationsschritte (Leahy, Dessens, and Nuttall, 1997; Weber, Haller, and Kochs, 1996). So wird zunächst die negativsträngige vrna in postitvsträngige mrna umgeschrieben (Primärtranskription). Die Elongation endet mit der Polyadenylierung der Transkripte. Die Transkripte entsprechen somit nicht der vollen Länge des Segmentes, ihnen fehlt die 5 -NCR des Segmentes. Die virale mrna wird nun aus dem Kern exportiert und anschließend im Zytoplasma translatiert. Die Proteine PB1, PB2, PA und NP besitzen in ihren Sequenzen Signale für den Transport in den Zellkern und werden dort für die anschließende Replikation der Genomsegmente benötigt.

12 6 1.1 Einleitung ML (-) vrna A n 3 Cap 5 A n 3 Cap 5 A n 3 (+) mrna Cap SPLICING PB1, PB2, PA, NP TRANSKRIPTION REPLIKATION 5 3 (+) crna 3 5 (-) vrna M, GP Abbildung 1-3: Schematische Darstellung des Replikationszykluses von THOV Für das Umschalten des Transkriptions- in den Replikationsmodus müssen freie, neusynthestisierte NP-Proteine im Kern angereichert werden. Deswegen werden früh im Zyklus vor allem NP (Siebler, Haller, and Kochs, 1996) und die Polymeraseuntereinheiten hergestellt. Die Replikation startet ohne Primer am 3 -Ende des Segmentes und kopiert das vollständige Segment. Entsprechend besitzen die komplementären crnas weder Cap- Struktur noch Polyadenylierung, sondern die komplementären NCRs am 3 - und 5 -Ende. Diese Antigenome assoziieren mit NP-Proteinen und werden als Matrizen zur Synthese neuer viraler RNA-Stränge in negativer Orientierung verwendet und werden zu neuen vrnps verpackt. Diese dienen nun entweder der Synthese weiterer viraler mrnas (Sekundärtranskription) oder werden zur Bildung neuer Partikel ins Zytoplasma exportiert. Spät im Replikationszyklus werden zunehmend GP und M synthetisiert. GP, als integrales Membranprotein, wird über den Golgiapparat zur Plasmamembran transportiert. Im Kern bindet M an die neuen vrnps und hemmt nun die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (Hagmaier, Gelderblom, and Kochs, 2004). Die Komplexe werden in das Zytoplasma und hier an die Stellen transportiert, an denen erhöhte Mengen an GP in die Zellmembran eingelagert sind. Hier werden die Nukleokapside mit Hilfe von assoziiertem M zu neuen

13 7 1.2 Einleitung Viruspartikeln verpackt und durch Knospung von der Zytoplasmamembran freigesetzt (Booth et al., 1989). 1.2 Das zelluläre Interferonsystem Die unspezifische, nichtadaptive Immunreaktion bildet eine erste Verteidigungslinie, welche eindringende Erreger früh als fremd erkennt und eliminiert. Die zweite spezifische, adaptive Immunabwehr stellt eine spätere Verteidungungslinie dar, welche eine lang anhaltende, schützende Immunität gegen den Erreger aufbaut. Der wichtigste Spieler in der ersten Abwehrreihe des Immunsystems bei einer Virusinfektion ist das Typ-I-Interferonsystem. Es wurde 1957 von Alick Isaacs und Jean Lindenmann entdeckt (Isaacs and Lindenmann, 1957). Sie beobachteten, dass wenn man den mit Hitze inaktivierten Zellkulturüberstand von Influenza-infizierten Hühnerembryo-Zellen auf frische Zellkulturen gibt, diese resistent gegenüber einer neuen Infektion werden. So konnte Resistenz gegen Influenza oder auch andere Viren durch einen sezernierten Faktor im Überstand übertragen werden. Das Typ-I-Interferonsystem ist absolut essentiell für jedes Säugetier um virale Infektionen zu kontrollieren. Tiere und Menschen, bei denen das Interferonsystem defekt ist, sind absolut schutzlos gegen virale Infektionen und sterben schon zu einem frühen Zeitpunkt nach der Infektion, obwohl ansonsten die Immunantwort auf z.b. bakerielle Erreger normal ausfällt (Dupuis et al., 2003; Muller et al., 1994) Interferone Der Name Interferon entstand aus dem Phänomen der Interferenz: Die Infektion eines Wirtes durch ein Virus verhindert die gleichzeitige Infektion mit einem anderen Virus, sodass ein Wirt selten mit zwei verschiedenen Viren zeitgleich infiziert sein kann. Aber die Bedeutung der Interferone reicht noch weiter als ihre antivirale Aktivität. Sie erfüllen auch zahlreiche immunregulatorische Funktionen und greifen sowohl in die unspezifische als auch die spezifische Immunabwehr ein. Auch in der Zellphysiologie spielen sie eine zentrale Rolle bei Zellwachstum, Differenzierung, Apoptose. Sie unterdrücken die Zellteilung und haben so tumorhemmende Eigenschaften. Zu den Interferonen gehört eine ganze Familie induzierbarer Zytokine. Interferone werden, basierend auf Sequenzhomologien und anhand des Rezeptorkomplexes, an den sie binden, in 3 Klassen eingeteilt. So unterscheidet man Typ-I-IFN, Typ-II-IFN und die Typ-III-IFN (auch λ-ifn genannt).

14 8 1.2 Einleitung Zu den Typ-I-Interferonen gehören mindestens 5 große Klassen an Interferonen beim Menschen: IFNα, IFNß, IFNω, IFNκ und IFNε. Es existiert jeweils nur 1 menschliches IFNß und ein IFNω, jedoch existiert eine ganze Familie von IFNα (Schultz, Kaspers, and Staeheli, 2004). IFNα und IFNß werden direkt durch virale Infektionen induziert. Die Familie der α-ifn wird hauptsächlich von Leukozyten und von spezialisierten plasmazytoiden Dendritischen Zellen gebildet (Liu, 2005), wohingegen IFNß von fast allen Zelltypen, vor allem Fibroblasten, synthetisiert werden kann. Es ist nicht bekannt, warum es so viele verschiedene IFNα-Gene gibt. Wenn man jedoch das einzige IFNß-Gen auf Chromosom 4 der Maus deletiert, so werden diese Mäuse höchst anfällig für gewisse virale Infektionen (Deonarain et al., 2000). Dies zeigt, dass die Familie der IFNα-Gene den Verlust von IFNß nicht immer kompensieren können und dass beide IFN-Arten eine einzigartige Rolle in der Abwehr spielen und beide für die volle antivirale Aktivität der Zelle benötigt werden. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen IFN existiert nur ein Typ-II-Interferon, IFNγ. IFNγ hat eine abweichende Proteinstruktur und bindet auch an einen anderen Rezeptor. Es wird nur von spezialisierten Zellen des Immunsystems, wie Makrophagen, natürlichen Killer (NK) Zellen, CD4 Th1 oder CD8 zytotoxischen Zellen gebildet und hat vor allem immunmodulatorische AKtivität. IFNγ scheint also ein ganz anderes Cytokin zu sein als die anderen IFN, zeichnet sich jedoch ebenfalls dadurch aus, dass es gemäß der Definition mit der Infektion gewisser Viren interferieren kann (Schroder et al., 2004). In den letzten Jahren wurde eine weitere Gruppe von Interferonen identifiziert. Bis jetzt werden zu dieser Gruppe, den Typ-III-Interferonen, IFN-λ 1 (= IL-29), IFN-λ 2 (= IL-28A) und IFN-λ 3 (= IL-28B) gezählt (Ank, West, and Paludan, 2006; Kotenko et al., 2003; Sheppard et al., 2003). Auch sie zeigen Interferon-typische antivirale Eigenschaften und so erfolgt die Induktion direkt durch virale Infektionen. IFN-λs haben kaum Sequenzhomologien zu den anderen IFN und binden an einen eigenständigen Rezeptorkomplex (Vilcek, 2003). Sie werden beim Menschen auf einem anderen Chromosom kodiert als die Typ-I-Interferone und diese strukturellen und genetischen Unterschiede führten zur Definition einer neuen IFN- Familie Interferon-induzierende Signalwege Fremde Strukturen von mikrobiellen oder viralen Erregern, sogenannte PAMPs (pathogenassociated molecular patterns), können sowohl extrazellulär als auch intrazellulär durch eine Reihe besonderer Rezeptoren, pattern recognition receptors (PRRs), erkannt werden. Zu den viralen PAMPs zählen Zwischenprodukte des viralen Replikationszykluses wie Doppelstrang RNA (dsrna) und Einzelstrang RNA (ssrna). Die Erkennung der PAMPs

15 9 1.2 Einleitung führt zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie interferon regulatory factors (IRFs) und nuclear factor kappab (NF-κB). Die meisten Zellen des Körpers, darunter Fibroblasten, Hepatozyten und konventionelle dendritische Zellen (cdcs) benutzen den so genannten klassischen Weg der IFN-Induktion. Im Gegensatz dazu existieren so genannte natürliche IFN-produzierende Zellen, plasmazytoide dendritische Zellen (pdcs), die große Mengen an IFNα produzieren (Colonna, Trinchieri, and Liu, 2004). Diese Zellen benutzen einen Toll-like receptor (TLR) -vermittelten Weg zur Induktion von IFNα. Beide Wege sind vollkommen unabhängig von einander und spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion der IFN (vgl. Abbildung 1-4, Abbildung 1-6). Zytoplasmatische Helikasen und Toll-like Receptor 3 (TLR3) Der sogenannte klassische Weg der IFN-Typ-I-Induktion spielt hauptsächlich eine Rolle in Virus-infizierten Fibroblasten. Die während einer Infektion gebildete genomische virale RNA (dsrna oder 5 -Triphosphat-ssRNA), wird im Cytoplasma der Fibroblasten durch zwei intrazelluläre, zytoplasmatische Sensoren, RIG-I (Yoneyama et al., 2004) und MDA5 (Andrejeva et al., 2004) erkannt (vgl. Abbildung 1-4). Beide Proteine besitzen eine Domäne, die von der Familie der DexD/H-box-Helikasen bekannt ist, sowie eine N-terminale caspase recruitment domain (CARD). Anhand der Helikase-Domäne wird die virale Nukleinsäure erkannt, welche daraufhin eine Konformationsänderung induziert und das Signal über die CARD-Domäne weitergibt. Wichtig für die beiden Sensoren ist, dass sie fremde Nukleinsäuren von körpereigener DNA oder RNA unterscheiden können. Die Erkennung der körperfremden Nukleinsäure erfolgt anhand struktureller Unterschiede der viralen RNA. So wird von RIG-I 5 -Triphosphat-RNA erkannt (Hornung et al., 2006; Pichlmair et al., 2006). Unmodifizierte und ungecappte 5 -Triphosphat-RNA kommt im Zytosol uninfizierter Säugetierzellen praktisch nicht vor, da die körpereigene RNA eukaryoter Zellen zahlreichen Modifikationen unterliegt. Manche Viren, wie die Picornavieren, können jedoch der Erkennung von 5 -Triphosphat-RNA durch RIG-I entkommen, indem sie die 5 -Enden mit ihren Genom-bindenden VPg-Proteinen abdecken. Solche Viren werden durch die Helikase MDA5 erkannt, welche Nukleinsäuren im Zytoplasma mit einem andersartigen molekularen Muster erkennen kann (Kato et al., 2006). So teilen sich beide Proteine eine identische Funktionsweise, aber ergänzen sich auch funktionell, da sie eine gewisse Spezifität für verschiedene Viren zeigen (Yoneyama et al., 2005).

16 Einleitung Interferon-Induktion dsrna ppp 5 -Triphosphat ssrna PKR TRAF FADD / RIP RIG-I / MDA-5 IPS-1 (MAVS) TRIF TLR3 TIR dsrna IKKα/ß TRAF3 TBK-1 / IKKε RIP-1 TRAF6 NF-κB IRF-3 AP-1 IFN-ß IFN Interferon-Signalling IFNAR JAK-1 TYK-2 Mx ISG20 dsrna STAT-1/-2 OAS PKR IRF-3/-7 IRF-9 ISGF-3 IFN-α IFN-ß ISRE ISG Abbildung 1-4: Der klassische Signaltransduktionsweg

17 Einleitung Das Signal der CARD-Domäne wird über den erst kürzlich entdeckten Faktor Interferon-ß-promotor stimulater 1 (IPS-1) (Kawai et al., 2005) oder mitochondrial antiviral signaling (MAVS) (Seth et al., 2005) (in der Literatur auch noch Cardif und VISA genannt) ebenfalls über eine CARD-ähnliche Domäne, welche an RIG-I oder MDA5 binden kann, weitergeleitet. IPS-1/MAVS lokalisiert anhand seiner hydrophoben C-terminalen Domäne an der Membran von Mitochondrien und diese Lokalisation ist entscheidend für die Funktion des Proteins. Damit übernehmen Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der antiviralen Immunantwort (Seth et al., 2005). IPS-1/MAVS stellt eine Schnittstelle bei der Signalweiterleitung dar. Einerseits führt IPS-1/MAVS indirekt zur Aktivierung der IRF3- Kinasen IκB kinase ε (IKKε) und TANK-binding kinase-1 (TBK-1), welche für die Phosphorylierung von IRF3 und IRF7 verantwortlich sind (Paz et al., 2006). Andererseits konnte auch gezeigt werden, dass IPS-1/MAVS zur Aktivierung des NF-κB-Promotors in der Lage ist. Zu diesem Zweck interagiert IPS-1/MAVS mit dem Fas-associated Death Domain Protein (FADD) und dem Receptor-interacting protein 1 (RIP-1) in einer Region außerhalb der CARD-Domäne, um die Aktivierung von NF-κB zu erleichtern (Kawai et al., 2005). Zusammengefaßt erscheint IPS-1/MAVS ein Adapterprotein zu sein, welches die Informationen der Rezeptoren RIG-I und MDA5 an tiefer stehende Signalmoleküle wie FADD, RIP-I, TBK-1 und IKKε weiterleitet und kritische Transkriptionsfaktoren wie IRF3, IRF7 oder NF-κB aktiviert. Die Aktivierung von IRF3 und IRF7 führt zur Produktion von Typ-I-IFN. Für die Phosphorylierung von IRF3 und 7 wurden zwei Kinasen identifiziert. TBK-1 und IKKε (Fitzgerald et al., 2003; Sharma et al., 2003). Das Bindeglied zwischen IPS-1 und den Kinasen stellt der tumor necrosis factor receptor (TNF-R) associated factor 3 (TRAF3) dar (Oganesyan et al., 2006; Saha et al., 2006). Der Kinase TBK-1 wird die Hauptrolle bei der Phopshorylierung der IRFs zugeschrieben, da sie ubiquitär und konstitutiv exprimiert wird, wohingegen IKKε hauptsächlich durch IFN induziert wird und vor allem in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird (Conzelmann, 2005). IRF3 und IRF7 sind Mitglieder der Familie der IRFs, welche eine zentrale Rolle bei der Aktivierung des IFNß-Promotors spielen (Lin et al., 1998; Wathelet et al., 1998; Yoneyama et al., 1998). Phosphoryliertes IRF3 und IRF7 bilden Homo- und Heterodimere und wandern so aktiviert in den Zellkern. Neuere Untersuchungen anhand von Knockout-Mäusen lassen vermuten, dass IRF7 die wesentliche Rolle in der Regulation der IFN-Synthese spielt und dass IRF7 und IRF3 für volle Aktivität kooperieren müssen (Honda et al., 2005). Im Zellkern wird der transkriptionelle Coaktivator CREB-binding protein (CBP) an die IRF3/7-Dimere rekrutiert um die Aktivierung des IFNß-Promotors einzuleiten (Hiscott et al., 1999). IRF3 und IRF7 unterscheiden sich in ihrer Affinität zu verschiedenen DNA-Abschnitten und durch ihre

18 Einleitung unterschiedliche Fähigkeit zur Assoziation mit CBP/p300 (IRF7 alleine kann nicht mit CBP assozieren). Auch dadurch erklärt sich ihre unterschiedliche Präferenz verschiedene Gene zu induzieren (Lin et al., 2000). Auch NF-κB und c-jun/atf-2 (AP-1)-Heterodimere werden für die volle Aktivierung des IFNß-Promotors benötigt und werden ebenfalls durch dsrna aktiviert (Chu et al., 1999; Falvo et al., 2000). Alle Transkriptionsfaktoren zusammen genommen sorgen für maximale Genexpression vom IFN-ßPromotor (vgl. Abbildung 1-5). ATF2/ C-Jun IRF IRF NF-κB gaaaatgacagaggaaaactgaaagggagaactgaaagtgggaaattcctctgagg IFN-ß 1 PRD IV PRD III -100 PRD I PRD II -50 IRF agtaaagaaagtgaaaagagaattggaaagcaaggggagggtattccgaaagggaga IFN-α 4 PRD-LE Abbildung 1-5: Schematischer Aufbau des IFNß und α-promotors Die Promotorregion des IFNß-Gens enthält mindestens vier regulatorische Elemente: Die positive regulatory domains (PRDs) I, II, III und IV (vgl. Abbildung 1-5). PRD Abschnitte I und III werden durch Mitglieder der IRF-Familie aktiviert. Die Elemente PRD II und IV werden durch die Transkriptionsfaktoren NF-κB und ATF-2/c-Jun aktiviert. Für das IFNα-Gen konnte eine Region namens PRD I- and III-like elements (PRD-LEs) identifiziert werden. Es können aber bis heute weitere Transkriptionsfaktoren, die an der Aktivierung der Gene beteiligt sein könnten, nicht ausgeschlossen werden (Taniguchi et al., 2001; Taniguchi and Takaoka, 2002). Die Entschscheidung, ob hauptsächlich NF-κB oder IRFs gesteuerte Gene aktiviert werden sollen, erfolgt hauptsächlich über einen selektiven Einsatz passender IKKs, welche die Aktitiverung des einen Transkriptionsfaktors, ohne Berücksichtigung des anderen Transkriptionsfaktors, auslösen. Ein Steuerelement dieses Prozesses ist das Protein suppressor of IKKepsilon (SIKE) (Huang et al., 2005). So schaltet SIKE gezielt die IRFvermittelte Promotoraktivierung zu Gunsten der NF-κB-vermittelten Promotoraktivierung aus. Der Toll like receptor (TLR) vermittelte Signaltransduktionsweg Toll-like receptors (TLRs) sind Rezeptoren, die fremde Strukturen von Pathogenen aller Art (Bakterien, Viren, Pilze, etc.) erkennen. TLRs können je nach Ligand, den sie binden, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Lipidhaltige Strukturen werden von TLR2 und 4 erkannt. Bakterielle oder virale Nukleinsäuren (unabhängig von deren Replikation) werden

19 Einleitung durch TLR 3 (dsrna), 7 (ssrna), 8 und 9 (CpG haltige DNA) erkannt (Alexopoulou et al., 2001; Diebold et al., 2004; Heil et al., 2004). Obwohl die meisten TLRs auf der Oberfläche der Zellmembran exprimiert werden um extrazelluläre PAMPs zu erkennen, finden die TLRs 3, 7, 8, 9 ihre Liganden in intrazellulären Kompartimenten, wie den Endosomen, nach Phagozytose der fremden Strukturen. Wahrscheinlich ist diese intrazelluläre Lokalisation wichtig um zu verhindern, dass körpereigene Moleküle fälschlicherweise zur Aktivierung dieses Warnsystemes führen. So konnte im Falle von TLR9 gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lokalisation des Rezeptors hilft zwischen viraler und körpereigener ssrna zu unterscheiden (Barton, Kagan, and Medzhitov, 2006). Einige Zellen des Immunsystems, speziell konventionelle dendritische Zellen (cdcs), exprimieren TLR3 in hohen Mengen auf der Zellmembran. Nach erfolgter Endozytose löst die Bindung von extrazellulärer dsrna (oder in vitro von poly(i:c) [ Inosin und Cytosin]) an den TLR3 eine spezifische Signalkaskade aus (vgl. Abbildung 1-4). Alle TLRs besitzen eine intrazelluläre Toll/IL-1 receptor (TIR) Domäne, welche durch die Rekrutierung weiterer Adaptermoleküle das Signal weiterleitet. Im Falle von TLR3 erfolgt die Übermittlung über das Adaptermolekül TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon β (TRIF), welches die Aktivierung der Kinase TBK-1 einleitet. Kürzlich konnte auch das fehlende, dazwischen liegende Protein ermittelt werden. TNFR-associated factor 3 (TRAF3) bindet sowohl an TRIF als auch an TBK-1 und IKKε. Das deutet daraufhin, dass TRAF3 als kritische Verbindung zwischen den TLR-Rezeptoren und den darunter liegenden regulatorischen Kinasen dient (Hacker et al., 2006; Oganesyan et al., 2006). Es ist noch nicht bekannt, wie TRAF3 die Kinasen aktiviert und eventuell bildet es einen Komplex mit TRIF, TBK-1, IKKε und weiteren, noch unidentifizerten Proteinen. Wie auch TRAF6 verfügt TRAF3 über eine Ubiquitin-Ligase- Aktivität, mit deren Hilfe solche und andere Moleküle der Signaltransduktionskette für weitere Modifikationen ubiquitinyliert werden könnten (Chen, 2005). Die Kinasen TBK-1 und IKKε initiieren durch die Phosphorylierung und Aktivierung von IRF3/7 auch hier die Produktion von IFNß. Die Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1, welche für die volle transkriptionelle Aktivität der Typ-I-Interferone und weiterer inflammatorischer Zytokine benötigt werden, werden ebenfalls über TRIF-abhängige Wege aktiviert (Yamamoto et al., 2002). Hierfür steht das receptor interacting protein 1 (RIP-1) als Bindeglied zur Verfügung. RIP-1 bindet über sein RIP homotypic interaction motif (RHIM) an TRIF und vermittelt so die TRIF-induzierte NF-κB Aktivierung (Meylan et al., 2004). Wichtigster Unterschied zur RIG-I vermittelten Immunantwort ist, dass die Zelle nicht infiziert sein muss um das Gefahrensignal auszulösen. So stammt die endozytierte dsrna vielmehr von zu Grunde gegangenen infizierten Zellen oder lysierten Viruspartikeln. Dies ist von

20 großem Vorteil, da viele Viren Mechanismen Wirtszelle zu blockieren (vgl. Kapitel 1.2.6) Einleitung entwickelt haben die Abwehrsignale der Plasmazytoide dendritische Zellen (pdcs) sind spezialisierte Typ-I-Interferon-Produzenten, die auf die meisten Viren reagieren (Colonna, Trinchieri, and Liu, 2004). Sie sind die Hauptproduzenten von IFNα in der frühen Phase einer Infektion und wurden daher auch als die natürlichen IFN-Produzenten, natural interferon producing cells (NIPC) bezeichnet. Im Gegensatz zu cdcs exprimiern pdcs hauptsächlich TLR7 und 9 auf ihrer Zelloberfläche. TLR7 und 9 leiten das Signal einzig über das Adapterprotein Myeloid differentiation primary response gene (MyD88) weiter (Asselin-Paturel and Trinchieri, 2005). MyD88 bindet die TIR- Domäne des TLR-Rezeptors und bildet einen Komplex mit den Kinasen interleukin-1 receptor-associated kinase (IRAK) 4 und 1, dem Adapterprotein TRAF6 und IRF7 (vgl. Abbildung 1-6). IRF7, dass normalerweise streng IFN-reguliert ist, wird in pdcs konstituiv exprimiert (Prakash et al., 2005) und steht damit sofort für die Induktion IFN-Gene zur Verfügung. Das aktuelle Modell schlägt die direkte Phosphorylierung von IRF7 durch die Kinase IRAK1 vor, welche ihrerseits durch IRAK4 aktiviert wird (Uematsu et al., 2005). Jedoch konnte kürzlich gezeigt werden, dass auch die IKKα für die Transkription vom IFNα- Promotor in pdcs essenziell ist (Hoshino et al., 2006) und es ist momentan unklar, wie die Kinasen IRAK1 bzw. 4 und IKKα miteinander kooperieren. Ein weiterer Aktivierungsschritt liegt in der Ubiquitinylierung von IRF7 durch TRAF6 (Kawai et al., 2004). Aktiviertes IRF7 transloziert in den Kern und initiiert die Transkription vielfältiger IFNα Gene (Iwasaki and Medzhitov, 2004).

21 Einleitung Interferon-Induktion ssrna CpG DNA IRAK-4 IRAK-1 TIR MyD88 IRF-7 TLR 7-9 TRAF6 IRF-7 IFN-α Abbildung 1-6: Der TLR(7-9)-induzierte Signaltransduktionsweg Auch die Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1 werden über den TLR7/9 Signalweg aktiviert. TRAF6 vermittelt zusammen mit TAB1, TAB2, TAB3 und TAK1 die Aktivierung der IKKα und IKKß, welche die Phosphorylierung und folgende Degradation von Inhibitor of nuclear factor kappa B (IκB), und damit die Aktivierung von NF-κB einleitet. Über TRAF6, TAB1, TAB2, TAB3, diverse mitogen-activated protein (MAP) Kinasen wird auch die Aktivierung von AP-1 gesteuert (Kawai and Akira, 2006). Transkriptionelle Kontrolle von Typ-II-Interferon Die IFNγ-Produktion wird hauptsächlich durch die Zytokine IL-18 und IL-12 kontrolliert, die von Antigen-präsentiernden Zellen wie Makrophagen sezerniert werden. Diese Zytokine dienen als Brücke, zwischen dem Ereignis einer Infektion und der Sekretion von IFNγ, wobei jedoch die genauen molekularen Hintergünde im Verborgenen bleiben. Diese Zytokine fördern nicht nur die IFNγ-Synthese, sondern ziehen auch NK-Zellen in das Gebiet der Entzündung (Malmgaard, 2004).

22 Einleitung Interferon-Rezeptoren und -Signaltransduktion Nach Sekretion binden alle Typ-I-Interferone an den gleichen heterodimeren IFNα Rezeptor (IFNAR) auf ihren Zielzellen. Dieser besteht aus zwei Untereinheiten, IFNAR-1 und IFNAR-2 (vgl. Abbildung 1-4, Abbildung 1-7). IFNγ bindet an den IFNγ-Rezeptor (IFNGR), der sich ebenfalls aus zwei Untereinheiten, IFNGR-1 und IFNGR-2, zusammensetzt. Jede dieser Rezeptoruntereinheiten interagiert mit einem Mitglied der Janus activated kinase (JAK) Familie. Die IFNAR1 Untereinheit ist assoziiert mit der Tyrosin Kinase 2 (TYK2), wohingegen IFNAR2 mit JAK1 interagiert. Dazu verschieden, interagiert die Untereinheit IFNGR1 mit JAK1 und die IFNGR2-Untereinheit mit JAK2. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zu Heterodimerisierung und Neuanordnung der Rezeptoruntereinheiten und aktiviert eine Signalkaskade über die Phosphorylierung der JAK-Moleküle. Dies wiederum führt zu Rekrutierung und Phosphorylierung der signal transducers and activators of transcription (STAT) Proteine, die in der Folge dimerisieren und in den Zellkern translozieren. Im Falle der Typ-I-IFN-Antwort bilden sich STAT1/STAT2-Heterodimere aus, welche mit dem DNAbindenden Protein p48/irf9 assoziieren und den heterotrimeren Komplex interferon stimulated gene factor (ISGF3) ausbilden. Dieser akkumuliert im Zellkern und bindet an das interferon-stimulated response element (ISRE), eine den meisten IFNα/ß-induzierten Genen stromaufwärts gelegene Sequenzregion und stimuliert die Transkription einer Vielzahl von Genen, deren Produkte zur Etablierung des antiviralen Zustands der Zelle beitragen. Der IFNγ-aktivierte Signalweg führt über die Phosphorylierung von JAK2 zur Rekrutierung von STAT1 und zur Bildung von STAT1-Homodimeren, die auch als gamma-activated factor (GAF) bezeichnet werden. GAF bindet an die gamma-activated sequence (GAS)-Elemente im Promotor von interferon-stimulated genes (ISGs) und induziert deren Transkription (Stark et al., 1998). Neuere Studien schlagen die Bildung eines Komplexes, bestehend aus IFNγ, IFNGR1 und STAT1α vor, der im Zellkern direkt an die GAS-Elemente von IFNγinduzierbaren Genen bindet. (Ahmed et al., 2003; Ahmed and Johnson, 2006). Die IFN lösen die Expression von hunderten von verschiedenen Genen aus, von denen zahlreiche biologische Aktivitäten vermittelt werden. Einige dieser Gene werden sowohl durch Typ-I als auch durch Typ-II-IFN reguliert, manche dieser Gene dagegen nur spezifisch durch einzelne IFN. So wird zum Beispiel die Expression des Gens für die antivirale Oligoadenylat-Synthetase (OAS) oder des Mx-Gens ausschließlich durch IFNα/ß, die des IRF1-Gens hingegen ausschließlich durch IFNγ eingeleitet (vgl.abbildung 1-7).

23 Einleitung Die Familie der interferon regulatory factors (IRFs) Die Induktion und Regulation der IFN-Antwort wird zu einem großen Teil über die Transkriptionsfaktoren der Familie der IRFs vermittelt. Zu dieser Familie werden bis heute neun Mitglieder gezählt. Weiterhin konnten auch schon viral kodierte Formen der IRF- Proteine im Genom des Humanen Herpes Virus 8 (HHV-8/KHSV) gefunden werden (Jenner and Boshoff, 2002). Die Mitglieder der IRF-Familie stimmen in ihren strukturellen Eigenschaften weitgehend überein. So besitzen alle IRFs eine hoch konservierte, N-terminale DNA-Bindedomäne, welche die ISRE-Sequenz in den Promotoren der ISGs erkennen und binden kann (siehe Abschnitt 1.2.2, Interferon-Promotoren). Diese Sequenz ist der PRD-Sequenz oder PRD-LE- Sequenz ähnlich, die man in den Promotoren der IFNα/ß-Gene findet. Der C-Terminus der IRF-Proteine 3 bis 9 enthält eine konservierte IRF assciation domain (IAD), die der homound heterodimeren Interaktion der IRF-Proteine dient, sowie zur Interaktion mit transkriptionellen Kofaktoren benötigt wird. Die IAD besitzt zudem eine transaktivierende Funktion, die in IRF3, IRF4, IRF5 und IRF7 durch eine autoinhibitorische Struktur unterdrückt wird (Qin et al., 2003). Alle beschriebenen IRFs enthalten ein nuclear localisation signal (NLS), wodurch ihnen die Translokation in den Zellkern ermöglicht wird. Die Aktivierung der IRF-Proteine ist auf verschiedene Weise reguliert. Einige IRFs werden konstitutiv exprimiert und direkt durch virale Infektionen aktiviert, um in den Zellkern zu translozieren, wie zum Beispiel IRF3 und IRF9, wohingegen die Synthese anderer erst durch sezerniertes IFN induziert wird, wie IRF7 durch IFNα/ß oder IRF1 durch IFNγ. Die Transkriptionsfaktoren der IRF-Familie bilden die Basis für eine zeitlich geordnete Aktivierung des IFN-Systems und tragen durch positive Rückkopplung zur Verstärkung der IFN-Antwort bei (vgl. Abbildung 1-7). Nach erfolgter Virusinfektion wird IRF3 phosphoryliert, aktiviert und induziert einer Reihe ISGs und die Produktion von IFNα und IFNß.

24 Einleitung IFN α/ß Tyk2 Jak1 IFN γ IRF-3 TBK-1 / IKKε STAT-1/-2 Jak2 STAT-1/-1 Jak1 GAF ISGF-3 IRF-9 IRF-3 CBP/p300 PRD IFN-ß PRD-LE IFN-α ISRE ISRE ISG15 ISG56 ISRE ISRE Mx OAS GAS IRF-1 inos GBP ISRE IP-10 ISRE PKR IRF-7 ISRE IRF-7 ssrna CpG DNA TLR 7-9 MyD88 TRAF6 IRF-7 IRF-7 IRF-1 Abbildung 1-7: Übersicht über die Funktion der IRF-Proteine als Koordinatoren der IFN-Antwort Nach Sekretion der IFNs, wird der Jak-STAT-Signaltransduktionweg aktiviert (siehe Abschnitt 0) und die Bildung des IRF9-enthaltenden Transkriptionsaktivators ISGF3 oder die Bildung des STAT1-Homodimers gamma-activated factor (GAF) induziert. Während ISGF3 die Transkription von IRF7 und weiteren ISGs induziert, aktiviert GAF durch Bindung an das gamma-activated sequence (GAS)-Element das IRF1-Gen. IRF1 wiederum induziert exklusiv Gene wie die inducible nitric oxide synthetase (inos) (Kleinert et al., 2004) oder guanylate binding protein (GBP). Manche ISGs, wie ISG15 und IP-10, können während einer Infektion auch in der Abwesenheit von ISGF3 exprimiert werden. Diese Gene werden direkt durch IRF3 induziert, jedoch nicht durch IRF7. Das läßt darauf schließen, dass diese Gene der Zelle auch zur Verfügung stehen, selbst wenn die IFN-Produktion durch virale IFN-Antagonisten blockiert wurde (vgl ). Diese Doppelaktivierung mancher ISGs durch ISGF3 oder IRF3 könnte zu frühen Infektionszeitpunkten wichtig sein für die Verstärkung der Genexpression. Dem gegenüber stehen Gene wie IRF7, OAS, PKR oder Mx, die vollkommen von der IFN- Sekretion und einer ISGF3-Aktivierung abhänigig sind, und so vor allem noch uninfizierte Zellen vor Infektion schützen.

25 Einleitung Eine massive Produktion von IFN im Falle einer Infektion kann durch eine positive Feedbackschleife erreicht werden. IRF7 kommt dabei eine besondere Rolle zu, da es nach einer IFNα/ß-induzierten Synthese von IRF7 zur massiven Synthese einer Vielzahl verschiedenartiger IFNα-Subtypen kommt. Dieser Feedback-Mechanismus gewährleistet eine Verstärkung der IFN-Antwort und garantiert somit ein potentes System zur Abwehr viraler Pathogene (Taniguchi and Takaoka, 2002) Interferon-stimulierte Genprodukte mit antiviraler Aktivität Die Replikation einer großen Bandbreite von DNA- und RNA-Viren wird durch die antivirale Aktivtivität von IFN unterbunden. Hierfür stehen dem IFN-System eine Anzahl von IFNinduzierbaren Effektorproteinen zur Verfügung. Die Myxovirus resistance (Mx) Proteine gehören zu einer Familie Dynamin-ähnlicher GTPasen, welche hauptsächlich durch IFNα/ß induziert werden. Gemeinsam mit den übrigen Orthomyxoviren wird das TOHV in seiner Vermehrung durch die interferoninduzierten Mx- Proteine stark gehemmt (Haller and Kochs, 2002a). Deswegen ist es für das THOV essentiell die IFN-Produktion zu einem frühen Zeitpunkt zu unterdrücken (Haller, Kochs, and Weber, 2006). Der MxA-Promotor enthält zwar mehrere ISRE-Sequenzen, kann jedoch nicht durch eine direkte Virusinfektion induziert werden, sondern benötigt die vorherige Produktion von IFN und die IFN-Signaltranduktion zur Expression des Mx-Proteins (Holzinger, 2005). Im Falle des THOV verhindert das menschliche MxA den Transport der Nukleokapside in den Zellkern und verhindert so die ordnungsgemäße Replikation des Viruses (Kochs and Haller, 1999). Ebenso sind adulte Labormäuse mit einem funktionellen Mx1-Protein (Haller et al., 1995) oder transgen veränderte Labormäuse, die konstituiv das menschliche MxA-Gen exprimieren (Thimme et al., 1995), vor einer THOV-Infektion geschützt. Die hohe Sensitivität des THOV bezüglich der Wirkung von MxA könnte auch ein Grund dafür sein, weshalb symptomatische THOV-Infektionen des Menschen nur sehr selten sind. Die PKR und die 2-5 -Oligoadenylatsynthetase (OAS) gehören zu den am besten untersuchten ISGs mit antiviraler Aktivität. Beide werden durch dsrna aktiviert, die bei der Virusinfektion entsteht. Die PKR hemmt durch Phosphorylierung des Translationsinitiationsfaktors eif-2α die Translation der viralen und zellulären Proteinsynthese (Williams, 1999). Sie ist auch bekannt dafür, dass sie den Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert (Williams, 2001), und somit eine Verbindung zu den Signaltransduktionswegen hat, die zur Produktion von IFN-α/ß führen (vgl. Abbildung 1-4). Ein weiterer Weg die Virusvermehrung zu unterbinden führt über das OAS/RNAse L-System. Die RNAse L, über die OAS aktiviert, baut virale ssrna und damit auch die Erbinformation

26 Einleitung von Viren ab. Selbst bei der Abwesenheit aller drei Gene für die PKR, Mx, und RNAse L kann das IFN-System immer noch eine ausreichende verbleibende antivirale Antwort aufbauen (Zhou et al., 1999). So sind viele weitere antivirale Proteine bereits bekannt und Geganstand aktueller Forschung. Ebenso, wie die Mx-Proteine gehört das guanylate-binding protein (GBP) zu der Gruppe Dynamin-ähnlicher GTPasen. Das GBP wird zu einem großen Teil IFNγ-abhängig exprimiert und zeigt in seinem Promotor ISRE- und GAS-Elemente, die abhängig von der Neusynthese von IRF1 aktiviert werden. Das GBP zeigt antivirale Effekte für andere Viren als die Mx- Proteine aber bis jetzt ist die Basis ihres antiviralen Effektes noch nicht vollständig verstanden (MacMicking, 2004). Dem IFN-System stehen eine große Anzahl weiterer IFN-induzierbarer Effektorproteine zur Verfügung, wie z.b. die interferon-stimulieten Gene (ISG) ISG56 (Hui et al., 2003), ISG20 (Espert et al., 2003; Espert et al., 2005) oder IP-10 (Mackay, 2001) Virale Interferon-Antagonisten Viren haben vielfältigste und effiziente Mechanismen entwickelt um dem IFN-System zu entkommen (Haller, Kochs, and Weber, 2006). IFN-Antagonisten haben ihre Wirkungsstätte an praktisch allen Stellen des IFN-Systems. Die verschiedenen Wirkungsweisen reichen dabei vom breiten Abschalten des Wirtszellstoffwechsels (Host protein shut off) bis hin zum fein abgestimmten Ausschalten ganz spezifischer Schlüsselproteine (vgl. Abbildung 1-8). Ein generelles Abschalten der zellulären Transkription wird zum Beispiel von den Bunyaviren oder dem vesicular stomatitis virus (VSV) bewirkt. Das Nichtstruktur-Protein (NSs) des Rift- Valley-Fever Virus (RVFV) hat den Kofaktor TFIIH der zellulären RNA-Polymerase II (RNAP II) zum Ziel. Es verhindert durch Bindung an die p44-untereinheit die korrekte Zusammensetzung von TFIIH (Le May et al., 2004) und führt zur Hemmung der zellulären Transkription (Billecocq et al., 2004). Auf eine ähnliche Art und Weise funktioniert der IFN- Antagonist des VSV. Das M-Protein von VSV inaktiviert TFIID, einen weiteren RNAPII- Kofaktor (Yuan, Puckett, and Lyles, 2001; Yuan, Yoza, and Lyles, 1998). Das komplette Abschalten der Wirtszelltranskription hat den Sinn, nicht nur die Synthese von IFN, sondern auch die Expression der ISGs zu unterbinden, da Zytokin-induzierte Gene sensibler auf Störungen der basalen Trankription reagieren als normale Housekeeping-Gene. Dagegen ist die virale Transkription und Replikation nicht betroffen. Der nächste Verwandte des THOV ist das Influenzavirus. Das FLUAV verwendet für die Unterdrückung der IFN-Induktion ein Nicht-Strukturprotein (NS1) welches ansonsten nicht essentiel für das Viruswachstum ist. NS1 ist, wie die meisten IFN-Antagonisten, ein