Diagnose und Therapieverlauf des equinen Cushing-Syndroms - Rolle des endogenen ACTH - INAUGURAL DISSERTATION

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1 Erratum Die Dosisangabe 0,01 mg Pergolidmesilat/kg Körpergewicht soll ersetzt werden durch: 0,002 0,01 mg Pergolidmesilat/kg Körpergewicht auf den Seiten 33, 46, 58 und 62

2 Zentrumsabteilung Chemische Analytik und Endokrinologie im Zentrum für Lebensmittelwissenschaften der Tierärztlichen Hochschule Hannover Diagnose und Therapieverlauf des equinen Cushing-Syndroms - Rolle des endogenen ACTH - INAUGURAL DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Christina Brüns aus Bremen Hannover 2001

3 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H.-O. Hoppen 1. Gutachter: Prof. Dr. H.-O. Hoppen 2. Gutachter: Prof. Dr. E. Deegen Tag der mündlichen Prüfung:

4 Meiner Familie

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6 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literatur Adrenokortikotropes Hormon Stellung in der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren Achse Konzentrationsbestimmung Handhabung der Blutentnahme Nachweisverfahren des ACTH im Plasma Normwerte von ACTH beim Pferd Equines Cushing-Syndrom Einleitung Klinik Pathophysiologie Diagnose Radiologische Methoden Endokrinologische Funktionsteste Therapie Material und Methoden Tiere Versuchsplan Experimentelle Studien Stabilitätsstudie... 33

7 3.2.2 Klinische Studien Dexamethason-Suppressionstest Klinische Symptome Blutprobenentnahme und aufbereitung Experimentelle Studien Stabilitätsstudie Klinische Studien Endokrinologische Untersuchungen Ergebnisse Experimentelle Studien Stabilität von Plasma-ACTH Klinische Studien Altersgruppenverteilung und Inzidenz Symptomatik Therapieverlauf Diskussion Experimentelle Studie Stabilitätsstudie Klinische Studie Inzidenz Altersgruppenverteilung Symptomatik Therapieverlauf Zusammenfassung...61

8 7 Summary Literaturverzeichnis...65 Tabellenanhang...79 Abbildungsverzeichnis...82 Tabellenverzeichnis...83

9 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ACTH Adrenokortikotropes Hormon AVP Arginin-Vasopressin CEA Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assay CRH Corticotropin-Releasing-Hormon DPI Dysfunktion der Pars Intermedia ECS Equines Cushing-Syndrom EDTA Ethylendiamintetraazetat IRMA Immunoradiometrischer Assay i.m. intramuskulär NNR Nebennierenrinde PI Pars intermedia PD Pars distalis Pro-OLMC Pro-Opiolipomelanocortin RIA Radioimmunoassay

10 Einleitung 1 Einleitung Während das equine Cushing-Syndrom (Equiner Hyperadrenokortizismus, Dysfunktion der Pars intermedia) früher als eine seltene, bei älteren Pferden vorkommende Krankheit galt, hat sich das Bild im Laufe der Zeit gewandelt. In den letzten Jahren haben neugewonnene Erkenntnisse und eine verbesserte Aufklärung die Tierärzteschaft für diese Thematik sensibilisiert, so dass immer häufiger die Diagnose des equinen Cushing-Syndroms gestellt wird. Abzugrenzen ist der iatrogene Cushing, der durch die Applikation einmalig überhöhter oder wiederholt verabreichter geringerer Dosierungen von Glukokortikoiden hervorgerufen wird. Für die Diagnose des ECS stehen eine Vielzahl endokrinologischer Funktionsteste zur Verfügung, die in der Literatur zum Teil kontrovers diskutiert werden. Die bei unseren Untersuchungen gestellten Diagnosen beruhen auf der klinischen Symptomatik, dem Dexamethason-Suppressionstest und der Plasma-ACTH-Bestimmung. Ziel dieser Arbeit ist es, die Plasma-ACTH-Bestimmung für die Diagnostik zu verbessern und zu untersuchen inwieweit sie bei der Kontrolle des Therapieverlaufs hilfreich ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollen folgende Aufgaben erarbeitet werden: Beurteilung der Therapieverläufe von Cushing-Pferden, die mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat behandelt wurden, hinsichtlich ihrer klinischen Entwicklung und den Ergebnissen von wiederholt durchgeführten Dexamethason-Suppressionstesten und ACTH-Bestimmungen. Stabilisierung des instabilen Plasma-ACTHs für den Probentransport bei Raumtemperatur

11 Literatur 2 Literatur 2.1 Adrenokortikotropes Hormon Struktur ACTH ist ein Polypeptid von 39 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 4540 Da (Müller 1978). Die ersten 24 Aminosäuren sind für alle Spezies identisch, während die ersten 18 Aminosäuren Träger der vollen biologischen Aktivität sind (Thorner et al. 1998, Wilson et al. 1982). Bei der Halbwertszeit des im Blut zirkulierenden ACTHs wird die biologische und die immunologische Halbwertszeit bzw. die Immunoreaktivität unterschieden. Besser et al. (1971) geben die biologische Halbwertszeit mit 4-8 Minuten an. Die immunologische Halbwertszeit wird im Gegensatz dazu durch die Aminosäuresequenz bestimmt, die der im Testverfahren verwendete Antikörper erkennt. Nach Lilly et al. (1995) ist die biologische Halbwertszeit kürzer als die Immunoreaktivität. Biosynthese Die Synthese des ACTHs findet in den corticotropen Zellen der Pars distalis und den melanotropen Zellen der Pars intermedia der Adenohypophyse statt. Das ACTH wird in den corticotropen Zellen der PD und den melanotropen Zellen der PI aus einem gemeinsamen Precursor, dem 33 kda pro-opiolipomelanocortin (pro-olmc) durch enzymatische Spaltung gebildet. Aus der enzymatischen Spaltung dieses Glykoproteins gehen viele verschiedene Peptide hervor (Wilson et al. 1982). In der Pars distalis (Abb. 1) gibt es bei der Biosynthese des ACTHs einen Hauptsyntheseweg und weitere Nebenwege mit unterschiedlichen Intermediärprodukten. Die Hauptprodukte dieser Synthese sind neben ACTH 1-39 (Adrenocorticotropes Hormon) das γ 3 -MSH (γ

12 Literatur Melanozytenstimulierendes Hormon), das -END ( -Endorphin) und das -LPH ( - Lipotropin) (Wilson et al. 1982). Letzteres wird in der PD teilweise weiter gespalten in -LPH ( -Lipotropin) und -END. Nach Liotta et al. (1978) liegen am Ende der enzymatischen Spaltung weitere folgende Peptide vor: -MSH (ACTH 1-13, -Melanozyten Stimulierendes Hormon), γ 3 -MSH, - MSH, CLIP (Corticotropin like intermediate lobe peptide, ACTH 18-39) und -END. Sie liegen in Konzentrationen vor, die ungefähr 26, 19, 23, 25 und 54 % der Mengen entsprechen, die von den genannten Peptiden in der Pars intermedia gefunden werden. Abb. 1: Pro-OLMC-Peptidsynthese in der Pars distalis gesunder Pferde (nach Froin et al. 1998) In der Pars intermedia verläuft die Biosynthese des ACTH in leicht abgewandelter Form (Abb. 2). Das ACTH entsteht hier aus dem 24,5 kda pro γmsh und dem 14,7 kda C- terminalen Fragment. Es wird dann zu 98% weiter gespalten in MSH und CLIP und führt somit zu keiner Stimulation der Nebennierenrinde (Wilson et al. 1982)

13 Literatur Abb. 2: Pro-OLMC-Peptidsynthese in der Pars intermedia gesunder Pferde (nach Froin et al. 1998) ACTH wird in Pulsen sezerniert (Livesey 1988). Die Frequenz dieser pulsatilen ACTH- Ausschüttung liegt bei 2-4 / Stunde (Froin 1998). In der Jugularvene sind die meisten ACTH- Pulse als solche nicht mehr meßbar, da sich das ACTH nach Ausschüttung in den Blutkreislauf dort gleichmäßig verteilt. Folglich bleibt in gesunden Tieren nur eine diurnale Rythmik feststellbar, die ihrerseits durch Licht und andere Faktoren reguliert wird (Thorner et al. 1998, Orth et al ), aber eine einzige Probe reflektiert ausreichend genau die sekretorische Aktivität der Hypophyse (Froin 1998). Physiologischer und psychologischer Streß lösen via CRH sowohl eine ACTH als auch Cortisol-Sekretion aus (Thorner et al. 1998)

14 Literatur Stellung in der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren Achse Die Regulation der ACTH-Sekretion basiert auf verschiedenen physiologischen Vorgängen, an denen im wesentlichen CRH (Corticotropin-Releasing-Hormon), AVP (Arginin- Vasopressin), eine Reihe weiterer Neurotransmitter und verschiedene Rückkopplungsmechanismen beteiligt sind (Alexander et al. 1994). Die ACTH-Freisetzung aus den corticotropen Zellen der Pars distalis wird durch CRH und AVP stimuliert, wobei AVP allein nur schwach stimulierend auf die ACTH-Ausschüttung wirkt (Thorner et al. 1998). Im Hypothalamus wird die Sekretion von CRH und AVP durch verschiedene Neurotransmitter moduliert. Beide Hormone erreichen den Hypophysen-Vorderlappen über das hypothalamisch-hypophysäre Portalsystem. Dort binden sie an spezifischen Rezeptoren der corticotropen Zellen der Pars distalis, wodurch die Adenylatzyklase und der Proteinkinase A aktiviert werden und innerhalb weniger Sekunden ACTH und andere pro-oplmc- Peptidabkömmlinge in den systemischen Blutkreislauf freigesetzt werden. Weiterhin kommt es zu einer erhöhten pro-olmc-gen Transkription und Biosynthese (Thorner et al. 1994; Watanabe u. Orth 1987). In der Nebennierenrinde wird unter dem Einfluß von ACTH das Glucocorticoid Cortisol gebildet und sezerniert, welches seinerseits über Rückkopplungsmechanismen zum einen mittels Glucocorticoidrezeptoren auf den corticotropen Zellen in der Pars distalis der Hypophyse zu einer Verminderung der ACTH- Sekretion führt, und zum anderen auf hypothalamischer Ebene die Synthese und die Sekretion von CRH und AVP senkt (Herrtage 1996). Aufgrund der fehlenden Glukortikoid-Rezeptoren gibt es diesen Rückkopplungsmechanismus bei den melanotropen Zellen der pars intermedia nicht. Sie unterliegen einer tonisch inhibitorischen Kontrolle des hypothalamischen Dopamins (Orth u. Kovacs 1998, Millington et al. 1988, Antakly u. Eisen 1984)

15 Literatur Konzentrationsbestimmung Handhabung der Blutentnahme Sowohl die Technik der Blutentnahme, als auch die Handhabung der Probe sind entscheidend für die Bestimmung der ACTH-Konzentration. Der Schmerz der Venenpunktion, ein Verweilkatheter oder die Gewöhnung an den Ort der Blutentnahme führen bei Versuchstieren zu keinem deutlichen Anstieg der Plasma-Cortisol-Konzentration (Knol et al. 1992). Nach Stouffer und Lipscomb (1963) kommt es zu einer reversiblen Bindung zwischen der Glasoberfläche und dem ACTH. Dieses Phänomen kommt bei Verwendung von Borosilikatglas aufgrund seines hohen Alkaligehaltes nicht vor (Ratcliff und Edwards 1971). Hegstad et al. (1990) messen sogar höhere ACTH-Konzentrationen in Borosilikat- Probenröhrchen als in Polypropylen-und Polystyrolröhrchen. Im Gegensatz dazu beschreiben Kemppainen et al. (1994) nur geringste Unterschiede der zu messenden ACTH- Konzentrationen in Glas- uns Plastikröhrchen, ohne aber genauere Angaben zur Glasart zu machen. Der Zusatz des Gerinnungshemmers Ethylendiamintetraazetat (EDTA) hat laut Vague et al. (1971) keinen Einfluß auf die ACTH-Konzentration im Plasma. Der Gerinnungshemmer Heparin ist ein Kohlehydrat, dessen Wirkung an die negativen Ladungen, den Sulfatresten, gebunden ist (Mutschler 1991). Ehrlich und Styvala (1973) beschreiben die Bindung des Heparins an verschiedene Proteine sowie an ACTH, Insulin, Oxytocin und Vasopressin. Auch Dopouy et al. (1985) führen die Absorption von ACTH durch Heparin und die daraus resultierende Molekülaggregation an. Im Radioligandenassay bewirken derartig heparinvernetzte ACTH-Molekülaggregationen eine Herabsetzung der Antigen-Antikörper- Bindung woraus zu hoch berechnete ACTH-Konzentrationen resultieren (Hegstad et al. 1990). Proteolytische Enzyme bewirken eine Instabilität von ACTH in Blut und Plasma (Rees et al. 1976). Beim Zerfall des 39-Aminosäurenmoleküls entstehen ACTH-ähnliche Fragmente, die den Antikörper binden, oder solche die den Antikörper nicht binden. Dieses Geschehen ist eine weitere Ursache für falsch hohe oder falsch niedrige ACTH- Konzentrationen (Dopouy et al.1985). Der enzymatische Abbau des Polypeptids ACTH geschieht durch Proteasen, sog. Kallikreine (Mutschler 1991). Aprotinin ist ein Proteasenhemmer, der neben Kallikrein die enzymatische Aktivität von Trypsin,

16 Literatur Chymotrypsin und Plasmin hemmt. Es zeichnet sich durch extreme Stabilität gegenüber Siedetemperaturen und der Behandlung mit Trichloressigsäure aus (Gebhard et al. 1986). Meakin und Nelson (1960), Besser et al. (1971) und Zynar (1981) beschreiben eine Verminderung des enzymatischen Abbaus von ACTH durch Anwesenheit des Proteasenhemmers Aprotinin. Auch Kempainen et al. (1994) sind der Meinung, dass native Blut- oder Plasmaproben im Vergleich zu Aprotininversetzten Proben, bei sonst gleicher Vorgehensweise, geringere ACTH-Konzentrationen aufweisen. Dahingegen finden Hegstad et al. (1990) in ihren Experimenten mit Heparin oder EDTA versetzten Probengefäßen durch Zusatz von Aprotinin keine signifikant höheren ACTH-Konzentrationen. Der enzymatische Abbau von ACTH in Blut und Plasma vollzieht sich bei niedrigen Temperaturen langsamer, so dass Hogan et al. (1976), Orth (1979), Peterson (1984), Lambert et al. (1985), Feldmann und Nelson (1996) die Entnahme in gekühlte Probengefäße, die Lagerung und Transport auf Eis und eine Zentrifugation bei 4 C für sinnvoll halten. Hegstad et al. (1990) und Kempainen et al. (1994) sind dahingegen der Auffassung, dass die Aufbewahrung einer Blutprobe für 90 Minuten bei Raumtemperatur keinen signifikanten Unterschied bezüglich der ACTH- Konzentration im Vergleich zu einer Blutprobe, die in einem gekühlten Röhrchen gewonnen und binnen 15 Minuten zentrifugiert wurde, aufweist. Einen Konzentrationsabfall beobachten Hegstad et al. (1990) nach 4-wöchiger Lagerung bei 20 C nicht. Laut Kempainen et al. (1994) verringert sich die ACTH-Konzentration bei gleicher Lagerungstemperatur nach 6 Monaten deutlich, nach 4 Tagen bei 86 C und -20 C sind die Veränderungen jedoch unwesentlich. Gutkowska et al. (1982) beschreiben unveränderte ACTH-Konzentrationen nach 2-jähriger Lagerung bei -70 C. Kempainen et al. (1994) beobachten einen stabilisierenden Effekt von Aprotinin auf die ACTH-Konzentrationen bei verschiedenen Lagerungstemperaturen (-86 C, 4 C, 22 C, 37 C ) und unterschiedlicher Lagerungsdauer (1-4 Tage) Nachweisverfahren des ACTH im Plasma Aufgrund der hohen Empfindlichkeit für Eiweißverbindungen im Piko- und Nanogrammbereich beschreiben zahlreiche Autoren Radioimmunoassays als Nachweisverfahren des ACTH im Plasma (Demura et al. 1996, Berson u. Yalow 1968, Orth

17 Literatur 1979, Gutkowska et al. 1982). Radioimmunoassays gehören in die Familie der Immunoassays, welche als Meßverfahren die spezifische Bindungsreaktion zwischen Antikörpern und dem gesuchten Reagenz oder umgekehrt, nutzen. Immunoassays können in 4 Gruppen klassifiziert werden: 1. Label-free assays 2. Reagent-excess assays 3. Reagent-limited assays 4. Ambient analyte Der typische Vertreter der 3. Gruppe ist der Radioimmunoassay (RIA), häufig auch als kompetetive Analyse aufgeführt. Das Grundprinzip besteht hier in der Konkurrenz zwischen radioaktiv markierter und unmarkierter Substanzmoleküle um die Bindungsstellen eines im Unterschuß vorliegenden Bindungsreagenz. In die zweite Gruppe gehört der Immunoradiometrische Assay (IRMA). Charakteristisch für die 2. Gruppe ist der im Überschuß vorliegende, für die gesuchte Substanz spezifische, Antikörper. Binden zwei verschiedene Antikörper für jeweils verschiedene Bindungsstellen (Epitope) an die gesuchte Substanz, spricht man von einem two-site Assay oder Sandwich- Assay (Gosling 2000), wobei der 2. Antikörper radioaktiv markiert ist. Hierbei nimmt die Radioaktivität im Gegensatz zum RIA mit steigender Antigenkonzentration zu. Nach einem Vergleich der ACTH-Bestimmung mittels der beiden beschrieben Methoden sehen Gibson et al. (1989) in der größeren Sensitivität und dem weiteren Meßbereich des IRMA deutliche Vorteile gegenüber dem RIA. Babson (1991) beschreibt ein automatisiertes System des Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assays (CEA). Der CEA ist eine Sandwichmethode bei der der zweite Antikörper mit einem Enzym markiert ist, welches ein später zugefügtes Chemilumineszenzsubstrat zur Lichtemission katalysiert. Die Stärke der Lichtemission wiederum wird gemessen und entspricht der Konzentration des gesuchten Antigens in der Probe

18 Literatur Normwerte von ACTH beim Pferd McFarlane et al. (1998) finden keinen Unterschied zwischen Plasma-ACTH-Werten bei jungen und älteren (über 20 Jahre) gesunden Pferden. Moore et al. (1979) sehen eine Abhängigkeit der Werte von der Tageszeit. Wilson et al. (1982) haben die Plasma-ACTH- Werte bei 10 gesunden und einem Cushing-Pferd mittels zwei verschiedener Antikörper bestimmt, von denen einer Epitope des ACTH(11-24) und der andere Epitope des ACTH(25-39) erkannte (siehe Tabelle 1). Autor Plasma-ACTH-Gehalt n- Pferde Van der Kolk et al. (2001) < 55,0 pg/ml 7 Froin et al. (1997/1998) 17,6 +/- 1,6 pg/ml 41 Couёtil (1996) 18,68 +/- 6,79 pg/ml Pferd 8,35 +/- 2,92 pg/ml Pony Orth et al. (1982) 32,0 +/- 5,0 pg/ml 10 Moore et al. (1979) Wilson et al. (1982) 35,0 +/- 10 pg/ml ,4 +/- 9,6 pg/ml ,5 +/- 5,0 pg/ml ACTH(11-24) 60,0 +/- 4,0 pg/ml ACTH(25-39) Brüns (2001) 20,7 +/- 11,3 pg/ml 21 Tab. 1: Normwerte ACTH beim Pferd in pg/ml Plasma

19 Literatur 2.2 Equines Cushing-Syndrom Einleitung Erstmalig berichtete Pallaske 1932 über das ECS in Form eines Adenomes der Pars intermedia. Während das equine Cushing-Syndrom früher mit einer geringen Inzidenz beschrieben wurde (Loeb et al. 1966, Evans 1972), berichten Veröffentlichungen der jüngeren Vergangenheit über ein höheres Vorkommen dieser Krankheit (Orth und Nicholson 1982, Allen et al. 1988, Horvath et al. 1988, Froin 1997, Assmann et al. 1997). Heinrichs et al. (1990) führen histologische und immunzytologische Untersuchungen an Adenomen der Pars intermedia von 19 Pferden durch weisen van der Kolk et al. 21 Fälle in 2 Jahren vor. Feige et al. berichteten über 13 Cushing-Pferde (2000). In einer Studie von Schott et al. (2001) wird bei 67 Pferden das equine Cushing-Syndrom diagnostiziert. Nach Beech (1999), Mair et al. (1998) und Freestone et al. (1995) erkranken hauptsächlich ältere Pferde an dem equinen Cushing-Syndrom. Ein durchschnittliches Alter von 20 Jahren, der am Cushing-Syndrom erkrankten Pferde, beschreibt van der Kolk (1995). Die Altersstruktur der Patienten zeigt eine deutliche Häufung der Erkrankung ab dem 18. Lebensjahr. In einigen Fällen tritt die Erkrankung jedoch auch in einem frühen Alter von 8-12 Jahren auf (Assmann et al. 1997). Mair et al. (1998) schreiben, dass über equines Cushing bei jüngeren Pferden keine Berichte vorliegen. Heinrichs et al. (1990) hingegen finden bei ihren Untersuchungen ein siebenjähriges Pferd mit Mikroadenomen in der Pars intermedia der Hypophyse. Beech (1987 b) berichtet, dass das equine Cushing-Syndrom vorwiegend bei Stuten vorkommt. Nach der Meinung Heinrichs et al. (1990) ist eine Prädisposition für das equine Cushing-Syndrom bei Stuten ungeklärt. Hillyer et al. (1992) halten hingegen männliche Pferde und Ponies für prädisponiert. Dybdal et al. (1994) beschreiben die DPI als eine langsam progressiv verlaufende Krankheit, die bei Pferden aller Rassen vorkommt

20 Literatur Klinik Die klinische Symptomatik ist breit gefächert. Das auffälligste Symptom der hypophysären Dysfunktion der Pars intermedia ist der Hirsutismus. Er wird gemeinhin als das Kardinalsymptom dieser Erkrankung betrachtet, tritt nach Beobachtung von Assmann et al. (1997) aber nicht immer in seiner klassischen Form auf, so dass sich unter Umständen nur ein unvollständiger oder verzögerter Fellwechsel zeigt, der aber auch gänzlich fehlen kann. Neben der DPI ist keine andere Erkrankung bekannt, die einen Hirsutismus auslöst (Bevier 1991). Des weiteren zeigen sich Hufrehe, Hyperhidrosis, Apathie, Leistungsinsuffizienz, allgemeine Muskelatrophie mit disproportionalen Fettablagerungen, ausgeprägte supraorbitale Fettpolster, Epiphora, Mineralisierungsprobleme (Spontanfrakturen, Zahnverluste), sekundäre Infektionen (Nasennebenhöhlenvereiterung, Hautinfektionen, Pneumonie), Haut- und Haarveränderungen, Kreislaufkollaps, Krämpfe, Polydipsie, Polyurie, visuelle Störungen und Fertilitätsstörungen (Feige et al. 2000, Assmann et al. 1997, Munoz et al. 1996, Bevier 1990). Über Veränderungen der Laborwerte berichtet Munoz (1996) in Form einer Neutrophilie und einer Lymphopenie. Hyperglykämie, Hyperlipämie, Elektrolytveränderungen und Anämie beobachten Peters et al. (1995). Nach Beech (1999) sind die Serum-Elektrolyte gewöhnlich unverändert. Obwohl die Blutglukose-Spiegel stark erhöht sein können und eine Hyperglykämie schon fast pathognomisch ist, berichtet sie über viele Cushing- Pferde mit normalen Blutzuckerwerten. Der Cortisol-Basalwert kann stark variieren bei Pferden, die an einer Dysfunktion der Pars intermedia leiden. Er kann erniedrigt, normal oder erhöht sein (Beech 1999, Beech 1987, Kolk et al. 1995, Dybdal et al. 1994). Van der Kolk et al. (1993) beobachten in ihrer Studie, dass das spezifische Gewicht des Urins normal ist und in einigen Fällen eine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphortase im Serum. Die einmalige Cortisolbestimmung ergab keine signifikanten Unterschiede bei gesunden und kranken Tieren und das weiße und rote Blutbild sowie die Immunglogulinverteilung lagen im Normbereich Pathophysiologie Die Hypophyse bestehend aus der Adenohypophyse (Lobus anterior) und der Neurohypophyse (Lobus posterior), liegt ventral des Hypothalamus in der Sella turcica des os

21 Literatur sphenoidale. Dabei bildet der Hypothalamus eine Brücke zwischen dem zentralen Nervensystem und dem endokrinen System. Die aus drei Anteilen bestehende Adenohypophyse ist beim Pferd gegenüber der Neurohypophyse stärker ausgebildet. Die Pars distalis (PD) stellt dabei eine den vorderen, größten Abschnitt des Hypophysenvorderlappens dar. Die Pars tuberalis zieht aufwärts und umgreift das Infundibulum. Die Pars intermedia (PI) befindet sich zwischen dem Lobus posterior und der PD (Nickel et al. 1992). Das equine Cushing-Syndrom ist fast ausnahmslos auf Neoplasien der Pars intermedia der Hypophyse zurückzuführen (Heinrichs et 1990). Ein Hyperadrenokortizismus, basierend auf adrenocorticalen Neoplasien, wie er bei anderen Spezies häufig vorkommt, ist beim Pferd in der Literatur nur fünfmal beschrieben worden (Evans et al. 1968, Fix et al. 1987, Raker et al.1965, van der Kolk et al. 1994, Froin 1998). Während in allen 4 Fällen kein funktioneller Tumor nachgewiesen werden konnte, beschreiben van der Kolk et al. (2001) eine funktionelle adrenocorticale Neubildung beim Pferd, die die Symptome des equinen Cushing-Syndroms hervorruft. Über eine Entartung der ACTH (Adrenocorticotropes Hormon, ACTH 1-39) bildenden corticotropen Zellen der Pars distalis ( PD) beim Pferd liegen in der Literatur keine Berichte vor. Die Processierung der proolmc-peptide in der adenomatösen Pars intermedia ähnelt der einer gesunden PI, dennoch gibt es qualitative und quantitative Unterschiede (Abb. 3). Das ACTH geht aus drei verschiedenen Vorläufern hervor: 24,5 kda- MSH, 16 bzw. 18 kda C-terminales Fragment. Es wird ein größerer Anteil des 24,5 kda pro- MSH gebildet, bei dem möglicherweise weniger - abgespalten wird. Die bei einer DPI entstehenden Peptide ( 3 MSH), -MSH, CLIP, -LPH, ß-MSH und ß-END sind vergleichbar mit denen einer gesunden PI. Jedoch liegen im Plasma von Cushing-Pferden unproportional erhöhte Konzentrationen der proolmc-peptide vor allem aber des ACTHs vor (Wilson et al. 1982). Drei immunreaktive Peptide, die deutlich länger waren als die Komponenten in der gesunden Pars intermedia fanden Wilson et al. (1982). Alle drei besaßen eine ACTH 11-24, ACTH und ß-END, ß-LPH Immunreaktivität. Ihr Gewicht betrug 38,5; 47,0 und 63 kda. Das ACTH der adenomatösen PI ist verantwortlich für die Hyperplasie der Nebennierenrinde (Orth et al. 1982, Cappen 1990). Die Sekretion von ACTH kann bei einer DPI bis zu 600-fach höher gegenüber gesunden Pferden sein und zu einer Erhöhung der Cortisol-Produktion und

22 Literatur Sekretion führen (Orth et al. 1982, Orth u. Nicholson 1982, Moore et al. 1979, Wilson et al. 1982, Kolk et al. 1993). Die Ursache für den nicht gleichermaßen hohen Anstieg der Cortisolproduktion liegt nach Orth u. Nicholson (1982) möglicherweise in dem Unterschied zwischen der biologischen und immunologischen Aktivität des ACTHs begründet. Durch das Fehlen von Glukokortikoid-Rezeptoren auf den melanotropen Zellen ist keine negative Rückkopplung möglich und es kommt zum Verlust der diurnalen Rhytmik der Cortisol-Sekretion (Orth et al. 1982, Cappen 1990). Weiterhin können die Peptide MSH und ß-END die Wirkung von ACTH potenzieren und damit einen weiteren Anstieg der Cortisol- Produktion bewirken (Shanker et al. 1979, Vinson et al. 1985). Abb. 3: Schematische Darstellung der pro-olmc-peptidsynthese bei einer Dysfunktion der Pars intermedia (nach Froin et al. 1998). Für die klinischen Erscheinungen werden zwei Mechanismen diskutiert. Ein Teil der Symptome ist auf das Tumorwachstum selbst zurückzuführen. Die in der Sella turcica befindliche, tumorös entartete PI drückt bei entsprechender Expansion auf den Hypothalamus sowie auf die kappillären und neuralen Verbindungen zwischen Hypophyse und Hypothalamus. Letzterer steuert den Fellwechsel, die Temperatur und den Appetit, so dass

23 Literatur Druck durch die neoplastische PI zu einer Entgleisung dieser Funktionen führen kann (Thompson et al. 1995, Heinrichs et al. 1990). Weiterhin können durch Druckatrophie und Demyelinisierung der Sehnerven am Chiasma opticum visuelle Störungen hervorgerufen werden (Froin et al. 1997). Der andere Teil der Symptome ist durch die endokrine Wirkung der vom pro-olmc abstammenden Peptide und des Cortisols bedingt, obwohl die Pathogenese nicht für alle klinischen Erscheinungen geklärt ist (Thompson et al. 1995, Heinrichs et al. 1990). Nicht die Höhe des Cortisol-Spiegels, der gewöhnlich im Normbereich liegt, ist verantwortlich für die Wirkung, sondern der Verlust der diurnalen Sekretionsrhythmik (Orth et al. 1982, Cappen 1990). Van der Kolk et al. (2001) berichten in einem Fall eines hypophysenunabhängigen Cushing-Syndroms über die gleichen Symptome wie bei einer DPI. Sie sind deshalb der Auffassung, daß sich die klinischen Symptome beim ECS generell eher durch die Wirkung des Cortisols der NNR als durch die Peptide der Hypophyse oder das Tumorwachstum entwickeln. Erhöhte Konzentrationen des zirkulierenden Cortisols wirken immunsupressiv und bedingen eine erhöhte Anfälligkeit für chronische und wiederkehrende Infektionen v.a. der Haut und des Atmungstraktes. Als Ursache für die Hufrehe bei Pferden mit einem Hyperadrenokortizismus werden die adrenerge Stimulation der Blutgefäße einerseits, und der zu einer Vasokonstriktion führende erhöhte Cortisolspiegel andererseits, angesehen. Durch den antagonistische Effekt des Cortisol auf das Insulin bildet sich nicht selten ein Steroiddiabetes aus. Der Polyurie und Polydipsie liegt ein multifaktorielles Geschehen zu Grunde: Die Hyperglykämie führt zur Glucosurie und osmotischer Diurese, Cortisol stimulierter Anstieg der glomerulären Filtrationsrate und eine verminderte Sekretion des ADH aus dem Hypophysenhinterlappen. Bei Stuten führt ein erhöhter Cortisolspiegel zu Zyklusstörungen und einer Anfälligkeit für Genitalinfektionen (Freestone et al. 1995). Die allgemeine Muskelatrophie und disproportionale Fettablagerungen sind durch den vorwiegend katabolen Stoffwechsel erklärbar. Als Ursache für die Apathie werden ein erhöhtes Auftreten von Zwischenmetaboliten z.b. Endorphinen diskutiert (Assmann et al. 1997)

24 Literatur Abb. 4: Circulus vitiosus nach Field (1988) Diagnose Neben eindeutigen klinischen Symptomen (vgl Klinik) werden für die Diagnostik des equinen Cushing-Syndroms in der Literatur radiologische Methoden sowie eine Reihe endokrinologischer Funktionsteste beschrieben. Die diagnostische Aussagekraft der einzelnen Verfahren wird kontrovers diskutiert Radiologische Methoden Allen et al. (1988) beschreiben die Computer-Tomographie als sicheres diagnostisches Verfahren in vivo für das equine Cushing-Syndrom. Für nachteilig halten Heinrichs et al. (1990) hier die Notwendigkeit einer Vollnarkose bei diesem Verfahren

25 Literatur Levy et al. (1993) demonstrieren erfolgreich an 2 Pferden und 2 Ponys eine ventrodorsaler Röntgenaufnahme der Hypophyse unter Narkose mit vorheriger Kontrastmitteleingabe ins Blutgefäßsystem. Somit kommt es zu einer künstlichen Steigerung des Kontrastunterschiedes von der Hypophyse zum umliegenden Gewebe Endokrinologische Funktionsteste ACTH-Stimulationstest Beech (1987a) und Eustace (1991) sehen in dem ACTH-Stimulationstest einen geeigneten Test für die Diagnose des equinen Cushing-Syndroms. Eine adrenocorticale Hypertrophie läßt sich ihrer Meinung nach durch den starken Anstieg des Cortisols infolge einer intravenösen ACTH-Injektion demonstrieren. Nach Eiler et al. (1979) zeigen Cushing-Pferde 2 Stunden nach ACTH-Injektion 100 IU (iv.) einen 80 % igen Anstieg des Cortisols. Hillyer et al. (1992) finden in ihren Versuchsserien 6 Cushing-Pferde, die den oben beschriebenen Cortisolanstieg zeigen, während bei 2 der pathologisch bewiesenen erkrankten Pferde der Anstieg unter 60 % liegt und damit kein Unterschied im Vergleich mit gesunden Pferden erkennbar ist. Dybdal et al. (1994) finden nach Applikation von 1 IU ACTH Gel /kg KGW einen zwei- dreifachen Anstieg der Plasma-Cortisol-Werte sowohl bei den Kontrolltieren als auch bei den erkrankten Pferden, so daß ihnen dieser Test zur Diagnose von Pferden mit einer Pars intermedia Dysfunktion ungeeignet erscheint. Van der Kolk et al. (1993) applizieren 25 IU ACTH iv. um 9 Uhr. Es zeigt sich kein signifikant höherer Anstieg der Cortisolwerte bei den erkrankten Tieren. Die Werte betrugen 2 Stunden post injectionem bei den gesunden 302+/- 21 und bei den erkrankten Tieren 478 +/- 58 nmol/l. Dexamethason-Suppressionstest Bei gesunden Tieren führt parenteral verabreichtes Dexamethason über einen negativen Feedback-Mechanismus zu verminderter ACTH-Freisetzung und in Folge auch zu verminderter endogener Cortisol-Sekretion (Livesey et al. 1988). Der Low-dose- Dexamethason-Suppressionstest (0,01 mg/kg KGW i.m.) führt nach Angaben von Dybdal et

26 Literatur al. (1994) zu keinen eindeutigen Ergebnissen hinsichtlich der Unterscheidung zwischen gesunden und Cushing-Pferden. Sie entwickeln folgendes Protokoll für einen Dexamethason- Suppressionstest, bei dem auch der bei gesunden Pferden bestehende diurnale Rhythmus des endogenen Cortisolspiegels berücksichtigt wird. Um verläßliche Ergebnisse zu erhalten ist Dexamethason in einer Dosis von mindestens 0,04 mg/kg KGW zu injizieren (i.m.). Die Autoren empfehlen die Dexamethason-Injektion um Uhr vorzunehmen, sowie unmittelbar vorher eine Blutprobe für den Basal-Cortisolwert zu entnehmen. Eine zweite und dritte Blutprobe werden dann 15 bzw. 19 Stunden, also um 8.00 und Uhr des folgenden Tages entnommen. Bei klinisch gesunden Pferden wurden die Cortisolwerte h post injectionem unter 1,0 µg/dl supprimiert, während die Cortisolwerte aller 52 klinisch diagnostizierter und mittels Sektion nachgewiesenen Pferde mit Hypophysenadenom deutlich über 1.0 µg/dl lagen. Dieses Schema, auch als Über-Nacht -Dexamethason-Suppressionstest bezeichnet gilt heute als das Verfahren der Wahl in der Diagnostik des ECS (Dybdal et al. 1997, Freestone et al. 1995, Froin et al. 1997,1998, Feige et al. 2000). Es gibt in der Literatur Hinweise nach denen durch die Gabe von Kortikosteroiden eine Hufrehe ausgelöst wird (Eyre, et al. 1979). Nach Meinung von Eustace (1991) steigt das Risiko einer Hufrehe durch hohe Dosen von Kortikosteroiden. Andere Autoren sehen für die Dosierung von 0,04 mg Dexamethason/ kg KGW kein Risiko im Bezug auf das Auslösen einer Hufrehe - auch nicht bei Cushing-Pferden (Dybdal et al. 1994, Freestone et al. 1995, Froin et al. 1997, 1998) Der kombinierte Dexamethason-Suppressionstest und ACTH-Stimulationstest nach Eiler et al. (1980) erwies sich als nicht aussagekräftig (Dybdal et al. 1994). Cortisol-Basalwert-Bestimmung Die Einzelwertbestimmung des Cortisol-Basalwertes kann bei Pferden mit einer Dysfunktion der Pars intermedia sehr variabel sein und ist für die Diagnose nicht zuverlässig. So werden niedrige, normale und sehr hohe Werte gefunden (Beech 1987, Couëtil et al. 1996, van der Kolk et al. 1993, 1995, Dybdal et al. 1994). Nach Froin et al. (1998) ist der Cortisol- Basalwert bei Tieren mit einer DPI mit (68,3 +/- 8,2 ng/ml) gegenüber gesunden Tieren (39,1-25 -

27 Literatur +/- 2,4 ng/ml) zwar signifikant erhöht (p< 0,001), aber nur wenige Tiere wiesen einen massiv erhöhten Cortisol-Basalwert auf, der auch als Einzelwert auffällig war. Cortisol-Konzentration im Speichel Der von Lebelt et al. (1996) beschriebene diurnale Rhythmus der Speichel-Cortisol- Konzentration kann von van der Kolk et al. (2001) nicht bestätigt werden. Letztere testen die Speichel-Cortisol-Konzentrationen unter dem Dexamethason-Suppressionstest. Jedoch sind die Ergebnisse noch nicht eindeutig und bedürfen weiterer Bestätigung. Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration Die Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration hat sich hinsichtlich der Aussage über die Funktion der Pars intermedia als eindeutig erwiesen (Wilson et al. 1982, Couëtil 1996, Froin et al. 1997,1998, van der Kolk 1993, Orth u. Nicholson 1982). Die ACTH-Konzentrationen sind je nach Autor bis zu 600-fach gegenüber gesunden Tieren erhöht. Nach Thompson et al. (1995) ist die Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration anhand einer einzelnen Blutprobe das sinnvollste Verfahren zur Diagnostik des equinen Cushing-Syndroms. Nach Froin et al. (1998) ermöglicht die parallele Untersuchung mittels der Plasma-ACTH- Konzentration und des Dexamethason-Suppressionstestes eine Differenzierung zwischen einem hypophysären und dem sehr seltenen adrenalen Cushing. TRH-Stimulationstest Beech und Garcia (1985) berichten über den Cortisolanstieg bei Cushing-Pferden als Antwort auf die Applikation von 1mg TRH iv.. Blutproben wurden 0; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 3; 4; 5 und 6 Stunden post injectionem entnommen. Dabei zeigten die gesunden Pferde keinen signifikanten Anstieg der Cortisolwerte, während die Pferde mit klinischen Anzeichen des equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus einen durchschnittlichen Anstieg des Cortisols von 120 % 30 min. post injectionem zeigten. Sie bewerten den TRH- Stimulationstest als nützliches diagnostisches Hilfsmittel bei Pferden mit einer hypophysären Dysfunktion, vor allem wenn ein zusätzlicher Dexamethason-Suppressionstest und eine

28 Literatur Insulinbestimmung vorgenommen werden. Thompson et al. (1995) stellen fest, dass sowohl klinisch gesunde als auch Pferde mit Hypophysenadenom einen auffallenden Anstieg der Cortisolkonzentrationen nach TRH-Stimulation zeigen. Das Testsystem scheint ihrer Meinung nach nicht geeignet für eine Diagnose von hypophysären Adenomen. Weiterhin führen sie kritisch an, dass in der Arbeit von Beech und Garcia (1985) die Standardabweichungen in beiden Gruppen so groß waren, dass es zu einer Überlappung der Werte der Kontolltiere und der Pferde mit einer Dysfunktion der Pars intermedia kommt. Daher sei dieses Testsystem ohne weitere Kontrollstudien nicht zu empfehlen. Entgegengesetzt der Meinung von Beech und Garcia (1985) berichten Hillyer et al. (1992) über die Abhängigkeit des Cortisolanstiegs von dem Cortisol-Basalwert. So beobachten sie einen offensichtlich geringeren Cortisolanstieg wenn der Ausgangswert des Cortisols hoch ist und umgekehrt. Der Mechanismus des Cortisolanstiegs nach TRH-Applikation ist ungeklärt (Matsurka et al. 1977). Intravenöser Glukose-Toleranztest Beech und Garcia (1986) werten diesen Test als weitere Möglichkeit für die Dysfunktion der Pars intermedia. Sie injizieren nüchternen Pferden 0,5 g Dextrose /kg KGW in einer 50%igen Lösung und nehmen Blutproben 0 (Basalwert); 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 und 6 Stunden post injectionem. Nach 15 Minuten zeigen gesunde Pferde einen Anstieg ihres Blutzuckers um mehr als 300% des Ausgangswertes. Der Blutzuckerspiegel normalisiert sich anschließend rasch. Bei Cushing-Pferden, deren Blutzucker vor der Glukosegabe häufig schon erhörte Werte aufweist, ist ein geringerer prozentualer Anstieg meßbar, und der Abfall zum Ausgangswert hin benötigt deutlich mehr Zeit. Die Plasma-Insulin-Konzentrationen der gesunden Pferde zeigten Parallelität zu den Glukose-Konzentrationen. Bei den Tieren mit einem Hypophysenadenom bestand eine andauernde Hyperinsulinämie. Die Autoren geben Die Basal-Glukosewerte für gesunde Pferde mit 80 +/- 7 und für Tiere mit DPI mit 121 +/- 64 mg/dl an. Nach Moore et al. (1979) haben letztere einen Basal-Glukosewert von 189 mg/dl. Van der Kolk et al. (1993) geben für gesunde Tiere einen durchschnittlichen Wert von 140 +/- 16,2 mg/dl und bei kranken einen Wert von 162 mg/dl an

29 Literatur Insulin-Toleranztest Der equine hypophysäre Hyperadrenokortizismus wird häufig begleitet durch einen sekundären Diabetes mellitus und ist meist durch erhöhte Insulinspiegel gekennzeichnet. Bei gesunden Pferden sinkt der Blutglukosewert 2 Stunden nach Gabe 0,4 IE/kg KGW Insulin i.m. um ca. 75% ab. Nach i.v. Injektion von 0,05 IE/ kg KGW kristallinen Insulins ist nach 30 Minuten ein Abfall des Glukosewertes um 60% zu erwarten. Zwei Stunden später sollte der Ausgangswert wieder erreicht sein (Beech und Garcia 1986). Die oft erhöhten Blutzuckerspiegel von Pferden mit dem equinen Cushing-Syndrom erweisen sich gegenüber den oben angegebenen Dosierungen meist als insulinresistent. Die Höhe der zur Blutzuckersenkung erforderlichen Insulindosis in solchen Fällen scheint prognostische Anhaltspunkte geben zu können (Love 1993). Bestimmung des Cortisol-Creatinin-Quotienten im Urin Die Bestimmung des Cortisol-Creatinin-Quotienten nach Webb (1994) führt zu Überlappung der Werte zwischen gesunden und am Cushing-Syndrom erkrankten Pferden (van der Kolk et al. 1994) Therapie Therapieansätze bei der Cushing Erkrankung beinhalten Chirurgie, Bestrahlung und medikamentelle Behandlung, wobei für den equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus in der Literatur keine Berichte über eine chirurgische Behandlung oder eine Bestrahlungstherapie vorliegen. Zur medikamentellen Behandlung stehen drei Kategorien von Pharmaka zur Verfügung: Selektiv adrenolytische Substanzen (z.b. o,p -DDD) Serotoninantagonisten Dopaminagonisten (z.b. Bromocriptin und Pergolidmesilat)

30 Literatur Das Mittel der Wahl beim caninen Cushing ist das selektiv adrenolytisch wirkende o,p -DDD (o,p-dichlordiphenyldichlorethan, Lysodren). Es bewirkt an der Nebenniere eine selektive Atrophie der Zona fasciculata und reticularis während die Zona glomerulosa und damit die Aldosteron Sekretion unberührt bleiben. Die Behandlung des equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus mit o,p -DDD wäre prinzipiell denkbar, ist aber nach Erfahrung von Mair et al. (1998), Freestone und Melrose (1995) nicht wirkungsvoll. Serotonin ist ein Neurotransmitter, der im Hypothalamus zu einer Freisetzung des Corticotropin Releasing Hormons (CRH) führt, welches seinerseits an den corticotropen Zellen der Pars distalis eine ACTH-Produktion bewirkt (Orth and Kovacs 1998). Cyproheptadine (Periactinol R, ein 5-HAT (5-Hydroxytryptamin, Serotonin) -Antagonist wird in der Humanmedizin beim hypophysären Hyperadrenokortizismus eingesetzt. Serotoninantagonisten führen zu einer Verminderung der CRH-Ausschüttung im Hypothalamus und bewirken in vitro eine direkte Inhibition der ACTH-Sekretion humaner Hypophysentumorzellen (Aronin und Krieger 1989, Suda et al. 1983). Beim Menschen liegen meist Mikroadenome der corticotropen Zellen der Pars distalis vor, während es sich beim Pferd um Makroadenome der melanotropen Zellen der Pars intermedia handelt (Heinrichs et al. 1990). Die autonome ACTH-Produktion des Pars-intermedia-Tumors beim Pferd bleibt somit durch die 5-Hydroxytryptamin-Antagonisten wahrscheinlich unberührt (Froin et al. 1998). Der Einsatz von Cyproheptadine beim equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus wird in der Literatur mehrfach und mit unterschiedlichen Behandlungserfolgen beschrieben. Traver und Bottom (1981) verwendeten eine initiale orale Dosis von 0,1 mg/kg KGW /Tag und erhöhten die Dosis jeden zweiten Tag um 0,08 mg, um schließlich eine Dosis von 0.26 mg /kg KGW/Tag zu erreichen. Beech (1983) verabreichte eine initiale Dosis von 0,6 mg/kg KGW7Tag, die über mehrere Wochen bis auf 1,2 mg/kg KGW/Tag erhöht wurde. Couëtil (1996) behandelte insgesamt 29 Pferde mit Cyproheptadine (0,25 +/- 0,05 mg/kg täglich). Davon zeigten 20 Pferde (69 %) eine Verbesserung der klinischen Symptomatik. Die Kontrolle der Plasma-ACTH-Konzentration 4-20 Wochen nach Behandlungsbeginn ergab bei 9 dieser 20 Pferde niedrigere ACTH-Werte als vor Behandlungsbeginn. Drei Pferde zeigten trotz klinischer Verbesserung höhere ACTH-Werte

31 Literatur Dopaminagonisten bewirken bei den unter einer tonisch inhibitorischen dopaminergen Kontrolle stehenden melanotropen und adenomatösen Zellen der Pars intermedia eine dosisabhängige Verminderung der pro-olmc-peptid-sekretion (Love 1993, Willemse und Mol 1994). Die Mutterkornalkaloide Bromocriptin- und Pergolidmesilat sind Dopaminagonisten. Die erfolgreiche Behandlung des equinen hypophysären Hyperadrenokortizismus ist sowohl mit Bromocriptin- (Beck 1992, Orth et al. 1982), als auch mit Pergolidmesilat (Froin et al. 1998, Munoz et al. 1996, Beech 1999) beschrieben worden. Orth et al. (1982) beobachten einen Abfall der erhöhten pro-olmc-peptid-spiegel und des Cortisols im Serum. Die Bioverfügbarkeit von oral verabreichtem Bromocriptinmesilat ist nur gering, so dass bei Verwendung von höheren Dosen die Nebenwirkungen deutlich zunehmen. Die Behandlung mit dem Injektionspräparat Parlodel LA R (Sandoz, Nürnberg) zeigte nur sehr geringe Nebenwirkungen am Tag der i.m. Applikation. Das Präparat hatte den Vorteil, dass es nur alle 4-6 Wochen verabreicht werden mußte, ist aber nicht mehr im Handel (Froin et al.1998). Pergolidmesilat besitzt gegenüber Bromocriptinmesilat eine bessere Verträglichkeit und eine höhere gastrointestinale Resorption, so dass geringere Dosen verwendet werden können (Froin et al. 1998). Obwohl das Medikament potentiell auf die Gefäße wirkt, konnte Beech (1999) auch bei sehr hohen Dosen keine auf das Medikament zurückzuführenden Effekte wie z.b. Hufrehe beobachten. Normalerweise verursacht Pergolidmesilat keine Nebenwirkungen (Munoz et al. 1996). Lediglich bei einer zu hohen Einstiegsdosis 3 mg Pergolidmesilat p.o./ Tag berichtet er über Nebenwirkungen wie Schwitzen, Dyspnoe, Schwindelanfälle und Austrocknen der Maulschleimhaut. Daraufhin verringerte er die tägliche Dosis auf 0,5 mg erhöhte diese Dosis alle drei Tage um 0,5 mg bis 3 mg. Klinische Symptome (Gewichtsabnahme, Polyurie, supraorbitalen Fettpolster, Änderung der Fellfarbe) und Blutwerte (Neutrophilie, Lymphopenie und Hyperglykämie) verbesserten sich innerhalb der folgenden 6 Monate. Nach 7 Monaten verringerte er die Dosis auf 2 mg /Tag und der Zustand des Pferdes blieb weiterhin konstant. Aufgrund von Anorexie und anderen Nebenwirkungen empfiehlt Beech (1999) eine Initialdosis von 0,5 mg /Tag p.o.. Danach wird die Dosis alle 3 Tage um 0,5 mg gesteigert bis zu einer Menge von 2-3 mg / kg KGW. Diese Dosis wird für einige Wochen beibehalten und je nach Bedarf weiter heraufgesetzt bis zu 5 mg /

32 Literatur kg KGW täglich. Einige Ponies behandelte Beech (1999) erfolgreich mit einer Dosis von 0,5-1,0 mg /Tag. Peters et al. (1995) berichten über eine Low-dose (0,75 mg täglich) -Behandlung mit Pergolidmesilat. Acht von neun Pferden sprachen gut auf die Therapie an. Eine Besserung der klinischen Symptomatik ohne Nebenwirkungen wurde mit einer täglichen Dosis von 0,5-1,0 mg erzielt. Beech (1999) hingegen beobachtet bei einigen Pferden eine Verschlechterung des Zustandes beim Herabsetzen der täglichen Dosis unter 2 mg. Die Zeit bis sich eine Besserung der klinischen Symptome einstellt ist nach Erfahrung von Beech (1999) von Pferd zu Pferd sehr unterschiedlich. Eine Abnahme der Apathie und Trägheit zeigt sich ihrer Beobachtung nach schon nach einigen Wochen. Eigene Erfahrungen bestätigen dies

33 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Tiere Die Stabilitätsstudie wurde bei insgesamt 29 Pferden, die unabhängig von Rasse, Geschlecht und Alter zusammengestellt wurden, durchgeführt. Im Rahmen der klinischen Studie wurden 63 Pferdepatienten der Klinik für Pferde G. Assmann, Opfenbach untersucht. Es handelte sich dabei um Pferde, bei denen der Verdacht auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms bestand. Davon wurden im Rahmen einer Verlaufskontrolle 13 Pferde untersucht, bei denen das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms sicher diagnostiziert war, und die derzeit mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat behandelt wurden. Als sicher diagnostiziert galten Pferde: Mit klinischer Symptomatik des equinen Cushing-Syndroms. Mit einer mangelhaften Suppression des Cortisols im Dexamethason-Suppressionstest (d.h. Plasma-Cortisolwerte die 15 Stunden nach i.m. Applikation von Dexamethason (40 µg/ kg KGW) über 4,3 +/- 0,4 ng/ml liegen und im 19 h-wert ansteigen). Mit einem ACTH-Wert über 60 pg/ml. 3.2 Versuchsplan Der Versuchszeitraum verlief über 5 Jahre, von Juli 1996 bis August

34 Material und Methoden Experimentelle Studien Stabilitätsstudie Zur Auswahl kamen ausschließlich Pferde, die nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren. Die Tiere wurden in 2 Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe enthielt 21 Pferde aus dem Patientengut der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover, welche im Bezug auf das equine Cushing-Syndrom klinisch unauffällig waren. Die zweite Gruppe bestand aus 8 Pferden, bei denen das equine Cushing-Syndrom eindeutig diagnostiziert war Klinische Studien Bei dem Verdacht auf das Vorliegen eines Hyperadrenokortizismus wurde ein Dexamethason-Suppressionstest durchgeführt. Bei 13 Pferden wurde im Rahmen einer Verlaufskontrolle der Therapie des equinen Cushing-Syndroms neben dem Dexamethason- Suppressionstest und der Bestimmung des Plasma-ACTH Spiegels zusätzlich eine Beobachtung der klinischen Symptomatik vorgenommen. Der Therapieplan sah die tägliche Verabreichung von 0,01 mg Pergolidmesilat/ kg KGW per os vor. Die Medikamenteneingabe erfolgte täglich, in 24 stündigem Abstand morgens oder abends Dexamethason-Suppressionstest Der Dexamethason-Suppressionstest wurde nach dem von Dybdal et al. (1994) beschriebenen Protokoll durchgeführt. Hierfür sind Dexamethasonpräparate (9a-Fluor-16amethylprednisolon) ohne Depoteffekt in wäßriger Lösung oder Suspension zu verwenden

35 Material und Methoden Protokoll des Dexamethason-Suppressionstest: 1. Blutprobe (Basalwert) Uhr unmittelbar danach i.m. Injektion von 40 µg Dexamethason /kg KGW 2. Blutprobe nach 15 Stunden 8.00 Uhr 3. Blutprobe nach 19 Stunden Uhr Klinische Symptome Zur Diagnostik sowie im Rahmen des Therapieverlaufes standen folgende Symptome zur Beobachtung: Hirsutismus, bzw. verzögerter oder unvollständiger Fellwechsel Hufrehe Apathie Leistungsinsuffizienz Allg. Muskelatrophie Gewichtsabnahme Progressive Debilitation Disproportionale Fettablagerungen, v.a. an den supraorbitalen Fettpolstern Epiphora Hyperhidrosis Polydipsie Polyurie Kreislaufkollaps Krämpfe Visuelle Störungen Fertilitätsstörungen Hyperglykämie Sekundäre Infektionen 3.3 Blutprobenentnahme und aufbereitung Für alle Studien wurden Röhrchen aus Polypropylen der Firma Sarstedt AG & Co., Nümbrecht verwendet. Sowohl für die Bestimmung von ACTH, als auch für die Bestimmung von Cortisol, waren die Röhrchen mit 1,2-2,0 mg EDTA/ ml Probenvolumen versetzt. Für die Stabilitätsstudie wurde in die Hälfte aller Probenröhrchen Aprotinin (500 KIE/ml Blut Trasylol R -Injektionslösung, Bayer Leverkusen) vorgelegt. In den klinischen Studien wurden alle zur Plasma-ACTH Bestimmung verwendeten Röhrchen mit Aprotinin versehen

36 Material und Methoden Experimentelle Studien Stabilitätsstudie Die Stabilitätsstudie wurde bei zwei Gruppen von Tieren (Gruppe 1: Tiere ohne Verdacht auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms; Gruppe 2: Tiere mit deutlicher klinischer Symptomatik des equinen Cushing-Syndroms) nach derselben folgenden Vorgehensweise durchgeführt: Die Blutproben wurden nach Reinigung und Desinfektion der Punktionsstelle aus der Vena jugularis externa entnommen. Hierzu wurden EDTA-beschichtete Monovetten (10 ml) der Firma Sarstedt verwendet. Nach der Blutentnahme wurde die Probe behutsam geschwenkt und zur Hälfte in ein mit Aprotinin vorgelegtes Röhrchen überführt und ein weiteres Mal geschwenkt. Die andere Hälfte der Probe wurde in ein zusatzfreies Röhrchen verbracht und ebenso geschwenkt. Anschließend wurden beide Proben innerhalb der folgenden zwanzig bis dreißig Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde abpipettiert und jeweils auf drei Röhrchen verteilt. Die daraus resultierenden 3 nativen und 3 aprotininhaltigen Plasmaproben wurden bis zur endokrinologischen Untersuchung 24 Stunden bei jeweils -22 C, + 6 C und + 20 C gelagert (siehe Abb. 5)

37 Material und Methoden Abb. 5: Vorgehensweise bei der Stabilitätsstudie (Modifiziert nach Rotermund) Klinische Studien Die Blutentnahme für die Dexamethason-Suppressionsteste wurde, nach Reinigung und Desinfektion der Punktionsstelle, aus der Vena jugularis externa mittels einer EDTAbeschichteten Monovette (10 ml) vorgenommen. Nach dem vorsichtigen Schwenken und Zentrifugieren der Probe wurde der Plasmaüberstand abpipettiert und bis zur Untersuchung bei 22 C gelagert. Proben der Klinik für Pferde G. Assmann, Opfenbach wurden dann in gekühltem Zustand mit der Post an das Endokrinologische Untersuchungslabor der Tierärztlichen Hochschule Hannover geschickt. Bei der Blutprobenentnahme für die Plasma-ACTH Bestimmung wurde genauso verfahren, jedoch wurde die Blutprobe nach dem Schwenken in der Monovette in ein mit Aprotinin vorgelegtes Röhrchen überführt und ein weiteres Mal geschwenkt

38 Material und Methoden 3.4 Endokrinologische Untersuchungen Die Auswertung der Plasmaproben wurde in der Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften durchgeführt. Es wurden folgende Hormone (Tab. 2) in einem Analyseautomaten (IMMULITE, DPC Biermann, Bad Nauheim ) untersucht. Der Immulite-Test für ACTH und für Thyroxin (Canine Total T4) ist ein Festphasen-Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung dieser Hormone im EDTA-Plasma. Der Cortisol-Immulite-Test ist ein Festphasen- Chemilumineszenz-Immunoassay. Hormon Katalog N Nachweisgrenze Variationskoeffizient ( %) untere obere Intraassay- Interassay- ACTH LAC1 5,00 pg/ml 1250,0 pg/ml 3,1-9,6 5,1-9,4 Cortisol LKCO1 2,00 pg/ml 500,0 pg/ml 6,8-9,0 9,9-10,3 Tab. 2: Nachweiskriterien der verwendeten Hormonassays Das ACTH-Antiserum für ACTH zeigt nach Angaben der Firma DPC Biermann (Diagnostic Product Corporation, Los Angeles) nur eine geringe Kreuzreaktivität (Tab. 3) zu ACTH-Fragmenten, die unter Umständen im Plasma vorliegen. Das IMMULITE- System wurde für die Messung von equinem ACTH validiert (Froin 1998). Dabei ergibt sich ein Intraassayvariationskoeffizient, der zwischen 3,9-13,5 % liegt

39 Material und Methoden ACTH-Fragmente Zusatz (pg/ml) Konzentration pg/ml Kreuzreaktivität (%) ACTH 1-13 (α-msh) ACTH , ACTH , ,010 ACTH (CLIP) ACTH Tab. 3: Spezifität des Antiserums zu ACTH-Fragmenten (Froin 1998)

40 Tabellenanhang 4 Ergebnisse 4.1 Experimentelle Studien Stabilität von Plasma-ACTH Die ACTH-Konzentration wird durch den Zusatz von Aprotinin und durch die Lagerungstemperatur deutlich beeinflußt. Sowohl bei den Blutproben der gesunden Pferde, als auch bei den Blutproben der Cushing-Pferde liegen die Plasma-ACTH-Konzentrationen der Aprotinin versetzten Proben 24 Stunden nach Blutentnahme bei allen drei Lagerungstemperaturen über denen der Proben ohne Zusatz (siehe Abb. 6 und 7, Tab. 8 und Tab. 9 im Anhang). Abb. 6: ACTH-Verlauf bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen - Messwerte bei gesunden Pferden

41 Tabellenanhang Abb. 7: ACTH-Verlauf bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen - Messwerte bei Cushing-Pferden In der Gruppe der gesunden Pferde beträgt der Abbau des ACTHs im Nativblut gegenüber den Aprotininproben bei 22 C, +6 C und +20 C durchschnittlich 7,21%, 8,45 % und 5,62 %. In der Gruppe der Cushing-Pferde liegt der durchschnittliche Abbau des ACTHs bei 12,88 %; 11,73 % und 10,75 % (siehe dazu Tab. 4, 5 und Abb. 8). Die Lagerungstemperatur wirkt sich folgendermaßen auf die Plasma-ACTH- Konzentrationen. Innerhalb der Testreihen liegen die Plasma-ACTH-Konzentrationen bei den Nativ-Proben und bei den Aprotinin versetzten Proben nach 24 Stunden Lagerung bei 22 C deutlich höher als bei 20 C. Die nativen Blutproben und die Aprotinin versetzten Blutproben der gesunden Pferde weisen bei 20 C gegenüber 22 C einen Abbau des ACTHs von 5,62 % und 7,24 % auf. In der Gruppe der Cushing-Pferde liegt der Abbau des ACTHs bei 8,35 % und 9,34 % (siehe dazu Tab. 4, 5 und Abb. 9)

42 Tabellenanhang -22 C 6 C 20 C Differenz Nativproben pg/ml Mittelwert 19,2 17,76 18,12 1,08 Abbau des ACTH im Nativblut bei 20 C gegenüber 22 C 5,62 % Aprotininproben pg/ml Mittelwert (korrigiert um 5%) 20,7 19,4 19,2 1,5 Abbau des ACTH in Aprotininproben bei 20 C gegenüber 22 C 7,24 % Differenz 1,5 1,64 1,08 Abbau des ACTH im Nativblut gegenüber den Aprotininproben 7,25 % 8,45 % 5,62 % Tab. 4: Durchschnittliche Plasma-ACTH Konzentration in Nativ- und Aprotinin-Blutproben Gruppe 1: Gesunde Pferde -22 C 6 C 20 C Differenz Nativproben pg/ml Mittelwert 225,75 210,25 206,88 18,87 Abbau des ACTH im Nativblut bei 20 C gegenüber 22 C 8,35 % Aprotininproben pg/ml Mittelwert (korrigiert um 5%) 255,7 238,2 231,8 23,9 Abbau des ACTH in Aprotininproben bei 20 C gegenüber 22 C 9,34 % Differenz 32,95 27,95 24,92 Abbau des ACTH im Nativblut gegenüber den Aprotininproben 12,88 % 11,73 % 10,75 % Tab. 5: Durchschnittliche Plasma-ACTH Konzentration in Nativ- und Aprotinin-Blutproben Gruppe 2: Cushing-Pferde

43 Tabellenanhang Abb. 8: Vergleich des prozentualen Abbaus von ACTH bei 20 C gegenüber 22 C in Nativ- und Aprotinin-Proben Abb. 9: Prozentualer Abbau von ACTH in Nativ- gegenüber Aprotin-Proben bei unterschiedlicher Lagerungstemperatur

44 Tabellenanhang 4.2 Klinische Studien Altersgruppenverteilung und Inzidenz Bei 63 Pferden konnte der Verdacht auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms durch einen positiven Dexamethason-Suppressionstest oder durch erhöhte Plasma-ACTH-Spiegel bestätigt werden. Es wurden insgesamt 56 positive Dexamethason-Suppressionsteste durchgeführt und 7 erhöhte Plasma-ACTH-Spiegel bestimmt (siehe dazu Tab. 7 und 8). Diese 63 Cushing-Pferde wiesen folgende Altersgruppenverteilung auf: Alter Pferde in % -10 Jahre 5 7, Jahre 21 33, Jahre 37 58,73 insgesamt Tab. 6: Altersgruppenverteilung Pferd Nr. ACTH in pg/ml Tab. 7: Basale Plasma-ACTH-Werte

45 Tabellenanhang Pferd Nr Pferd Nr , , , , , , , ,7 9, , , ,8 25, , Tab. 8: Dexamethason-Suppresionsteste Symptomatik Die Tab. 9 zeigt die zahlenmäßige Häufigkeit der einzelnen Symptome bei 63 Cushing- Pferden. Der Hirsutismus und die Hufrehe sind mit n=40 bzw. 38 die häufigsten Symptome des equinen Cushing-Syndroms. Eine Kombination der beiden Symptome lag in 22 Fällen vor, während 4 Pferde weder einen Hirsutismus noch eine Hufrehe zeigten. In diesem Zusammenhang ist eine Besonderheit in der Gruppe der jungen Pferde (-10 Jährigen)

46 Tabellenanhang herauszustellen. Keines dieser Pferde zeigte einen Hirsutismus, bzw. einen unvollständigen oder verzögerten Fellwechsel. Die Verdachtsdiagnose wurde allein aufgrund einer unergründlichen Lahmheit bzw. aufgrund von Hufrehe gestellt. Symptome Hirsutismus bzw. verzögerter / unvollständiger Fellwechsel 40 Hufrehe 38 Apathie 11 Leistungsinsuffizienz 22 Allg. Muskelatrophie 17 Gewichtsabnahme 16 Zunehmende Schwäche 9 disproportionale Fettablagerungen vor allem an den supraorbitalen Fettpolstern 14 Epiphora 5 Hyperhidrosis 17 Polydipsie 16 Polyurie 15 Kreislaufkollaps 3 Krämpfe 1 visuelle Störungen 2 Fertilitätsstörungen 5 Sekundäre Infektionen 4 Hyperglykämie 10 Tab. 9: Vorkommen bzw. Häufigkeit der einzelnen Symptome in einer Zusammenstellung von 63 Cushing-Pferden Therapieverlauf Die Ergebnisse der Therapie-Verlaufskontrolle (Siehe Tab. 10, Seite 47) zeigen bei allen 13 Pferden eine deutliche Besserung der klinischen Symptomatik. Die bei 9 Pferden vorliegende

47 Tabellenanhang Hufrehe heilte in allen Fällen ab, und es kam zu keinen neuen Reheschüben. Alle Pferde zeigten einen Hirsutismus, der sich unter Therapie ausnahmslos bei allen Pferden zurückbildete und sich bei 11 Pferden zu einem normalen Fellwachstum wandelte. Leistungsinsuffiziente und apathische Pferde waren unter Therapie munterer und agiler. Symptome wie Hyperhidrosis, Epiphora, Polydipsie, Polyurie und supraorbitale Fettpolster verschwanden ebenfalls. Symptome, die den Körperbau betreffen, wie allg. Muskelatrophie, Gewichtsabnahme, disproportionale Fettablagerungen veränderten sich langsamer (6-12 Monate), bei einem Teil der Pferde unvollständig und bei einem anderen Teil sehr gut. Bei 9 der 13 unter Therapie stehenden Pferden (Tab. 10, Pferd Nr.5-13) wurde jeweils ein wiederholter Dexamethason-Suppressionstest und / oder eine Bestimmung des Plasma- ACTH-Spiegels vorgenommen. Die Pferde Nr. 5, 6 und 13 zeigten sowohl eine im Normbereich liegende Suppression der Cortisolwerte als auch normale ACTH-Werte. Bei den anderen 6 Pferden (Nr. 7-12) lag eine ungenügende Suppression der Cortisolwerte und ein erhöhter ACTH-Spiegel vor, die jedoch im Vergleich mit Werten vor Therapiebeginn besser sind. Darunter befand sich ein Pferd (Nr. 12), das zum Zeitpunkt des Wiederholungstestes erst seit 6 Wochen unter Therapie stand. Bei den Pferden Nr wurde der Wiederholungstest nach 1,5-4 Jahren durchgeführt. Im Verlauf des Falles Nr. 9 kommt es zunächst zu einer gänzlichen Normalisierung des ACTH- Wertes (53,2 pg/ml) innerhalb vier Monate nach Therapiebeginn und einem erneuten Anstieg des ACTH-Wertes auf 251 pg/ml nach 4-jähriger Behandlungszeit. Anzumerken ist, dass alle 13 Pferde unabhängig von ihren Laborwerten eine deutliche Besserung der klinischen Symptomatik aufweisen. Bei den Pferden Nr. 1-4 liegen weder aus der Zeit vor Therapiebeginn noch aus der Zeit während der Behandlung Labordiagnostische Werte vor. Hier stützt sich die Beurteilung des Therapieerfolges einzig auf die hervorragende Besserung der klinischen Symptomatik, die zum Teil in Bildmaterial dokumentiert worden ist (s. Abb. 10 und 11). In keinem der aufgeführten Fälle wurden Nebenwirkungen aufgrund der Parkotil-Behandlung (0,01 mg Pergolidmesilat /kg KGW) beobachtet

48 Tabellenanhang Tab. 10: Therapie-Verlaufskontrolle

49 Tabellenanhang Fortsetzung Tab. 11: Therapie-Verlaufskontrolle

50 Tabellenanhang Fortsetzung Tab. 11: Therapie-Verlaufskontrolle

51 Ergebnisse Abb. 10: Patient vor Therapiebeginn Abb. 11: Patient nach viermonatiger Behandlung

52 Diskussion 5 Diskussion Ziel dieser Arbeit ist es, den Vorgang der Plasma-ACTH-Bestimmung so zu verbessern, dass er unter Feldbedingungen für die Diagnostik und Therapiekontrolle des equinen Cushing- Syndroms leicht und zuverlässig angewendet werden kann. Im Weiteren soll im Rahmen einer klinischen Studie der Verlauf dieser Krankheit bei Pferden, die mit dem Dopaminagonisten Parkotil R behandelt werden, anhand der ACTH-Plasma-Konzentration, des Dexamethason-Suppressionstestes und klinischen Symptomen beobachtet werden. 5.1 Experimentelle Studie Stabilitätsstudie Der experimentelle Teil dieser Arbeit besteht aus einer Stabilitätsstudie mit welcher der enzymatische Abbau des ACTHs im Vollblut bzw. im Plasma von Pferden untersucht wurde. Ziel ist es, dass instabile Plasma-ACTH für den Probentransport bei Raumtemperatur zu stabilisieren. Zur Untersuchung standen Proben mit Normwerten und stark erhöhten ACTH- Werten. Mit den Proben beider Gruppen wurde gleichermaßen verfahren (Abb. 5, Seite 36). Die vierundzwanzigstündige Lagerung entspricht dem Postweg der Proben bei Zusendung durch den Tierarzt ins Untersuchungslabor. Die Ergebnisse beider Gruppen weisen die gleichen Tendenzen auf und lassen die gleichen folgend dargestellten Aussagen und Schlussfolgerungen zu: Nach Hegstad et al. (1990) hat eine vierwöchige und nach Kemppainen et al. (1994) eine viertägige Lagerung keine bedeutende Auswirkung auf die Immunoreaktivität des ACTHs, so dass die Konzentrationen der bei 22 C gelagerten Proben als Ausgangswerte angesehen werden können. Danach müssen die voneinander abweichenden durchschnittlichen ACTH- Konzentrationen der bei 22 C gelagerten Aprotinin versetzen Proben und der zusatzfreien Proben in beiden Gruppen auf den Versuchsaufbau zurückgeführt werden. Es ist davon auszugehen, dass die Zeitspanne von der Blutentnahme bis zum Einfrieren den enzymatischen

53 Diskussion Abbau des ACTHs in den nativen Blutproben ermöglicht, was in den unmittelbar nach der Entnahme mit Aprotinin versetzten Proben in sehr viel geringerem Umfang möglich ist. Die durchschnittliche ACTH-Konzentration liegt in beiden Gruppen in den Aprotinin versetzten Proben bei allen drei Lagerungstemperaturen höher als in den zusatzfreien Proben. Daraus wird ersichtlich, dass der Proteasenhemmer Aprotinin den enzymatischen Abbau des ACTHs verringert. In der Gruppe der gesunden Pferde ergeben sich bei den Lagerungstemperaturen 22 C, +6 C und +22 C durchschnittliche Abbauraten des ACTHs von 7,21 %; 8,45 % und 5,62 %. Der durchschnittliche Abbau liegt hier bei allen drei Lagerungstemperaturen unter 10 %. In den Proben der Cushing-Pferde liegt der durchschnittliche Abbau des ACTHs bei 12,88 %; 11,73 % und 10,75 % und bleibt somit unter 15 %. Eine geringe Lagerungstemperatur wirkt sich ähnlich stabilisierend auf die ACTH- Konzentration in den Proben aus wie der Zusatz von Aprotinin. In beiden Gruppen liegen die ACTH-Konzentrationen sowohl in den Aprotinin- als auch in den zusatzfreien Proben nach 24 Lagerung bei 22 C höher als bei Raumtemperatur. Die Abbauraten liegen hier unter 10 % (Tab. 4 und Tab. 5, Seite 41). Die Normwerte für equines ACTH (Tab. 1, Seite 17) werden je nach Untersuchungsmethode verschieden hoch angegeben, liegen aber insgesamt betrachtet in einem Rahmen zwischen 17,6 und 55,0 pg/ml. Der in dieser Studie ermittelte durchschnittliche ACTH-Wert in der Gruppe der gesunden Pferde (n= 21) liegt bei 20,7 pg/ml. Für Cushing-Pferde reichen die Angaben über durchschnittliche ACTH-Werte in der Literatur von 314 bis hin zu pg/ml. Die Cushing-Pferde dieser Studie zeigten im Durchschnitt ACTH-Werte von 255,7 pg/ml. Weder für die Gruppe der eindeutig gesunden Pferde noch für die Cushing-Pferde würde der oben beschriebene Abbau von 10 % bzw. von 15 % die Diagnosestellung beeinflussen. Jedoch würde sich ein Problem in der Diagnostik der Grenzfälle, bei Pferden mit ACTH- Werten zwischen 50,0 und 60.0 pg/ml, ergeben. Hier würde ein 10-15% Abbau des ACTH unter Umständen das Bild verfälschen. Ein solcher Fall wäre zum Beispiel das Pferd Nr. 13 der Tab. 10, S.47. Hier lag neben den eindeutigen klinischen Symptomen und einem positiven Dexamethason-Suppressionstest ein mit 61,8 pg/ml nur ggr. erhöhter ACTH-Wert vor!

54 Diskussion Aus diesen Daten ergeben sich folgende Konsequenzen für die Vorgehensweise der Probenentnahme unter Feldbedingungen: Um den enzymatischen Abbau des ACTHs so gering wie möglich zu halten, sollte der Blutentnahme der unmittelbare Zusatz von 500 IE Aprotinin / ml Blut folgen, und die Zentrifugation und das Einfrieren des Plasmas binnen Minuten vollzogen sein. Wenn kein Aprotinin zur Verfügung steht sollte entsprechend mehr Wert auf die schnellstmögliche Zentrifugation und das Einfrieren des Plasmas gelegt werden. Der Versand zum Untersuchungslabor sollte in jedem Fall in einem Kühlkontainer unter Beilage eines Kühlmittels vorgenommen werden, während dies bei Aprotinin-Zusatz nicht nötig ist. In der Diagnostik des equinen Cushing-Syndroms werden zahlreiche Verfahren, in der Regel endokrinologische Funktionsteste, hinsichtlich ihrer diagnostischen Aussagekraft unterschiedlich diskutiert, d.h. es kommt teilweise zu einer Überlappung der Werte gesunder und erkrankter Pferde. Nach Wilson et al. (1982), Orth und Nicholson (1982), Couëtil (1996), Froin et al. (1997;1998), van der Kolk (1993), und Thompson et al. (1995) ist mit der Bestimmung der Plasma-ACTH-Konzentration eine eindeutige Aussage über die Funktion der Pars intermedia der Hypophyse zu machen. Ein weiterer entscheidender Vorteil liegt bei dieser Methode in der einmaligen Probenentnahme. Während mit der Plasma-ACTH- Konzentration die Funktion der Pars intermedia der Hypophyse beurteilt werden kann, läßt die parallele Untersuchung mit dem Dexamethason-Suppressionstest eine Differenzierung zwischen adrenalem und hypophysärem Cushing zu (Froin et al. 1998). Wenn der ACTH- Wert eines Pferdes im Normbereich liegt, die Suppression des Cortisols aber unzureichend ist, kann man davon ausgehen, dass der Grund für die mangelhafte Suppression des Cortisols in der Nebennierenrinde in Form eines Nebennierenrinden-Tumors liegt (Froin et al. 1998). Eine Entartung der Pars distalis der equinen Hypophyse wird in der Literatur nicht beschrieben. Froin et al. (1997) beschreiben die Inzidenz der adrenocorticalen Neoplasie beim Pferd als sehr gering, konnten aber in einem Fall durch die Plasma-ACTH-Bestimmung eine autonome Nebennierenrindenüberfunktion gegenüber einer Dysfunktion der Pars intermedia labordiagnostisch abgrenzen. Weiterhin gibt es in der Literatur vier gut dokumentierte Fälle einer primären adrenocorticalen Neoplasie, über die Raker and Fegley (1965), Evans et al. (1968), Fix and Miller (1987) und van der Kolk et al. (1994) berichten. Van der Kolk et al

55 Diskussion 2001 stellen einen Fall von equinem Cushing vor, der auf einer funktionellen adrenocorticalen Neubildung basiert. Er beschreibt die klinische Symptomatik mit anfallsartigem Appetit, allgemeiner Muskelatrophie, disproportionaler Fettablagerung, supraorbitalen Fettpolstern, verzögertem Fellwechsel, Hyperhidrosis, Lethargie und im fortgeschrittenem Stadium zusätzlich Polydipsie, Polyurie, Hufrehe und ausgeprägtem Hirsutismus. Labordiagnostisch lag eine Hyperglykämie, ein erhöhter Cortisol-Creatinin-Quotient und im weiteren ein erhöhter Cortisolwert vor. Demzufolge ist das klinische Erscheinungsbild dem des hypophysär bedingten Cushing-Syndroms sehr ähnlich bis identisch. Aus diesem Grund scheint es um so wichtiger durch eine geeignete Diagnostik beide Formen voneinander abzugrenzen, da im Falle des Hypophysen-unabhängigen Cushing-Syndroms eine Behandlung mit Dopaminagonisten wenig hilfreich wäre (Froin et al. 1998). Während Froin et al. (1998) eine Differenzierung anhand der parallelen Durchführung des Dexamethason- Suppressionstestes und der Plasma-ACTH-Bestimmung erzielen, gehen van der Kolk et al. (2001) folgendermaßen vor: Sie differenzieren das hypophysär bedingte Cushing-Sydrom von einem funktionellen NNR-Tumor mittels eines ACTH-Stimulationstest und einer diagnostischen Behandlung mit dem Dopaminagonisten Bromocriptin. Zwar konnten sie den NNR-Tumor in dem aktuellen Fall durch eine Sektion beweisen, jedoch scheint nach eigener Erfahrung und nach Lage der Literatur (Dybdal et al. 1994) diese Vorgehensweise nicht schlüssig. Es erscheint nicht vorhersehbar, wie unterschiedliche NNR-Tumoren auf ACTH reagieren. Aufgrund dieser beschriebenen Unstimmigkeiten und dem geringeren Aufwand bei der Plasma-ACTH-Bestimmung und dem Dexamethason-Suppressionstest scheinen die beiden genannten Verfahren eine sinnvolle Vorgehensweise in der Diagnostik des equinen Cushing- Syndroms zu sein

56 Diskussion 5.2 Klinische Studie Inzidenz Im Rahmen der experimentellen und der klinischen Studie wurde bei insgesamt 63 Pferden aufgrund ihrer klinischen Symptomatik, des Dexamethason-Suppressionstestes und oder einer Plasma-ACTH-Bestimmung das equine Cushing-Syndrom diagnostiziert. Bei dem überwiegenden Teil der Pferde wurden labordiagnostische Maßnahmen eingeleitet weil die klinische Symptomatik auf das Vorliegen des equinen Cushing-Syndroms hinwies. Bei anderen Pferden stellte der Hyperadrenokortizismus einen reinen Zufallsbefund dar. Evans et al. (1972) sehen in dem Hypophysenadenom eine besonders für ältere Pferde nicht ungewöhnliche Erkrankung. Bei 4000 jährlich in der Praxis behandelten Pferden beschreiben sie ein Vorkommen von 3-6 Fällen pro Jahr. Andere, neuere in den letzten Jahren veröffentlichte Studien (Schott et al. 2001; Froin et al. 1998,1997; Assmann 1997) bezeugen eine viel höhere Inzidenz des equinen Cushing-Syndroms als sie gewöhnlich in der Literatur angegeben wird. Die dargestellten Ergebnisse dieser Studie sprechen ebenfalls für ein sehr viel höheres Vorkommen des equinen Cushing-Syndroms, als es in früheren Jahren beschrieben wurde Altersgruppenverteilung Nicht nur die hohe Inzidenz, sondern auch die von der in der Literatur bisher beschriebene abweichende Altersverteilung der an dem equinen Cushing-Syndrom erkrankten Pferde, ist eine neue Erkenntnis. Nach Beech (1999), T. Mair et al. (1998) und Freestone et al. (1995) erkranken hauptsächlich ältere Pferde an dem equinen Cushing-Syndrom. T. Mair et al. (1998) schreiben, dass über equines Cushing bei jüngeren Pferden keine Berichte vorliegen. Heinrichs et al (1990) hingegen finden bei ihren Untersuchungen ein siebenjähriges Pferd mit Mikroadenomen in der Pars intermedia der Hypophyse. Evans et al. (1972) diagnostizieren hauptsächlich bei älteren Pferden eine DPI, während ihr jüngster Fall ein 13 jähriges Pferd

57 Diskussion war. Ein durchschnittliches Alter von 20 Jahren der am Cushing-Syndrom erkrankten Pferde beschreibt van der Kolk (1995). Eigene Untersuchungen bestätigen die beschriebenen Aussagen über die höhere Inzidenz bei älteren Pferden. Von den 63 Cushing-Pferden waren 59 % in der Altersgruppe der Jährigen und 33 % in der Gruppe der Jährigen. Auffallend ist jedoch die Gruppe der bis 10 jährigen Pferde, die mit einem Vorkommen von 8 % eine ernstzunehmende Patientengruppe darstellen. Damit ergibt sich eine gänzlich neue Patientenschaft, für die das equine Cushing-Syndrom bislang als unwahrscheilich galt. Wichtig ist es, in diesem Zusammenhang herauszustellen, dass die Verdachtsdiagnose bei diesen jüngeren Pferden allein aufgrund einer vorliegenden unergründlichen Lahmheit bzw. Hufrehe gestellt wurde oder sogar ein reiner Zufallsbefund ohne Vorhandensein klinischer Symptome war, der nur durch erhöhtes Plasma-ACTH erfasst wurde Symptomatik Unter diesem Aspekt sollte in der vorliegenden Arbeit ein Bild erstellt werden, welche Symptome sich im wesentlichen beim equinen Cushing-Syndrom zeigen, bzw. welche Besonderheiten sich hinsichtlich dem klinischen Erscheinungsbild ergeben. Dazu ist anzumerken, dass es aufgrund des Versuchsaufbau zwar eine genaue Auszählung der aufgelisteten Symptome möglich war, aber davon ausgegangen werden muß, dass nicht bei jedem Pferd jedes einzelne Symptom erwähnt wurde und deshalb auch nicht zur Auszählung kam. Das ergab sich zum einen dadurch, dass die Symptomatik der Pferde, deren Krankheitsgeschichte schon länger zurück liegt als der Beginn dieser Arbeit, von anderen Tierärzten oder den Besitzern selber beschrieben wurden oder aber einfach durch die großen räumlichen Distanzen nicht eigenhändig untersucht worden konnten. Zum anderen handelt es sich zum Teil um Symptome die unter verschiedenen Haltungsbedingungen nicht beobachtet werden konnten und deshalb nicht erwähnt wurden. Beispielsweise sind Polyurie und Polydipsie bei entfernter Weidehaltung der Pferde schwer zu kontrollieren. Im weiteren ist es mit zunehmendem Alter der Patienten nicht immer leicht, natürliche geriatrische Erscheinungen von Symptomen wie allgemeiner Muskelatrophie, Leistungsinsuffizienz,

58 Diskussion zunehmender Schwäche und Gewichtsabnahme in ihrer Genese vom equinen Cushing- Syndrom abzugrenzen. Laborparameter wie Blutbilder, Blutglukose und Glukosewerte im Harn lagen nicht immer vor. Demnach können anhand dieser Aufstellung (s. Tab. 9, Seite 45) Erkenntnisse und Aussagen in erster Linie über die sehr augenscheinlichen Symptome wie den Hirsutismus und die Hufrehe formuliert werden. Bezüglich der anderen Symptome können nur Tendenzen aufgezeigt werden. Van der Kolk et al. (2001) sind der Meinung, dass Cushing-Pferde initial als bemerkenswertes klinisches Symptom nur einen Hirsutismus zeigen. Als bedeutende Folgeerscheinungen der Dysfunktion der Pars intermedia nennen sie den Diabetes mellitus und die Hufrehe (van der Kolk et al. 1993b). In dieser Studie zeigten 40 der 63 Cushing-Pferde einen Hirsutismus, 38 Pferde hatten Hufrehe, in 22 Fällen lag eine Kombination der beiden Symptome (neben weiteren Symptomen) vor und 4 Pferde zeigten weder einen Hirsutismus noch Hufrehe. Diese Zahlen zeigen, dass das Kardinalsymptom, der Hirsutismus, in dieser Studie bei einem Drittel der Cushing-Pferde fehlte. Demnach sind auch Pferde, denen das typische, lockige und lange Fell fehlt potentiell verdächtig und sollten beim Auftreten anderer Symptome wie z.b. Hufrehe, Polydipsie, Polyurie, allg. Muskelatrophie, Leistungsinsuffizienz, Fertilitätsprobleme usw. unbedingt durch den Dexamethason-Suppressionstest und die Plasma-ACTH Bestimmung kontrolliert werden. Letzteres gilt insbesondere für die Symptomatik der Hufrehe. Zwei Drittel bzw. 38 der Cushing-Pferde dieser Studie hatten Hufrehe, 16 Pferde davon zeigten keinen Hirsutismus und bei 5 Pferden war die Hufrehe das einzige Symptom. Bei einem Vergleich der klinischen Daten dieser 5 Rehe- Pferde fiel auf, dass alle unter 10 Jahre alt sind und somit die Gruppe der ganz jungen Pferde dieser Studie bilden. Hier bietet sich die Vermutung an, dass eine bei jungen Pferden auftretende Hufrehe, die nicht auf eine zu hohe Belastung oder eine falsche Fütterung zurückzuführen ist, das erste Anzeichen des equinen Cushing-Syndroms sein kann. Somit sollte in jedem Fall sowohl jungen als auch alten Rehe-Pferden eine erhöhte Aufmerksamkeit zukommen und das equine Cushing-Syndrom als Ursache in Erwägung gezogen werden

59 Diskussion Therapieverlauf Von den 63 Pferden standen nur 13 Pferde zur Verfügung, bei denen labordiagnostische Maßnahmen und klinische Erscheinungen vor und während der Therapie dokukumentiert werden konnten. Die Kontrolle des Therapieverlaufes beinhaltet die Entwicklung des klinischen Erscheinungsbildes, welches mit den Ergebnissen des Dexamethason- Suppressionstestes und der Plasma-ACTH-Bestimmung verglichen werden. Jedem Pferd dieser Studie werden bzw. wurden täglich 0,01 mg Pergolidmesilat/kg KGW verabreicht. Wie schon bei den Ergebnissen aufgeführt, ist der Therapieverlauf der 13 mit dem Dopaminagonisten Parkotil R behandelten Cushing-Pferde insgesamt als positiv zu bewerten. Im Bezug auf die klinische Symptomatik kam es zu einer deutlichen Besserung der einzelnen Symptome und des Allgemeinbefindens bishin zum gänzlichen Abklingen aller Symptome. Bei dem Versuchsaufbau muß berücksichtigt werden, dass die 13 Probanden mit unterschiedlichen Voraussetzungen gestartet sind: Es ist davon auszugehen, dass die Erkrankung bei jedem Pferd zu Behandlungsbeginn unterschiedlich weit vorangeschritten war, ebenso ist hier das uneinheitliche Alter der einzelnen Pferde zu nennen, welches nach Meinung von Froin et al. (1998) zu unterschiedlich stark progressiven Krankheitsverläufen führen kann. Letztlich ist noch die zum Zeitpunkt der klinischen Beurteilung und Durchführung der Wiederholungsteste unterschiedliche lange Behandlungsdauer aufzuführen. Danach kann man die 13 behandelten Cushing-Pferde wie folgt in Gruppen zusammenstellen um Aussagen zu treffen. : Bei vier Pferden liegen keine Wiederholungsteste vor. Diese vier Pferde wurden allein nach ihrem klinischen Erscheinungsbild 2-5 Monate nach Therapiebeginn beurteilt. Bei allen vier Pferden kam es zu guten Resultaten im Bezug auf die jeweiligen vorliegenden Symptome (vgl. dazu Tab. 10, Pferde Nr. 1-4). Drei Pferde (Tab. 10, Pferd Nr. 5,6 u.13) zeigten 5 Monate, 1 Jahr bzw. 3 Wochen nach Therapiebeginn hervorragende Ergebnisse sowohl in den wiederholten Dexamethason- Suppressionstesten und Plasma-ACTH-Bestimmungen als auch in der klinischen Entwicklung. Ein Pferd (Tab. 10, Pferd Nr. 12) wies in den Ergebnissen eine Diskrepanz im Hinblick auf die gute klinische Entwicklung und dem derzeitigen Allgemeinbefinden auf. Die

60 Diskussion Suppression der Cortisolwerte war ungenügend, aber besser als im vorausgegangenen Test. Der Plasma-ACTH-Spiegel lag bei 55,8 pg/ml und ist als grenzwertig bis ggr. erhöht anzusehen. Dieses Pferd stand zum Zeitpunkt der Wiederholungsteste erst seit kurzer Zeit (seit 2 Monaten) unter Therapie. Die 5 übrigen Pferde (vgl.tab. 10, Pferd Nr. 7-11) werden jeweils seit 2 bis 3 Jahren täglich mit Parkotil R behandelt. Ursache für die mangelhafte Suppression der Cortisolwerte und die erhöhten ACTH-Werte bei den Wiederholungstesten ist in diesen Fällen möglicherweise ein Fortschreiten des Krankheitsprozesses. Die Behandlung mit dem Dopaminagonisten Parkotil R unterdrückt lediglich die Auswirkungen des Hypophysenadenoms, nicht aber den progressiven Verlauf des equinen Cushing-Syndroms (Munoz et al. 1996). An dieser Stelle ist zu überlegen, ob eine höhere Dosis des Parkotil R einen fortgeschrittenen Krankheitsverlauf günstig beeinflussen könnte. Es gibt in der Literatur Angaben über höhere tägliche Dosen von Parkotil R. So verabreichten Munoz et al. (1996) einem Pferd 3 mg / Tag und erzielten gute klinische und biochemische Resultate, allerdings ist zum jetzigen Zeitpunkt sicherlich auch der finanzielle Aspekt dieser sehr kostspieligen Behandlung zu berücksichtigen. Die Einteilung der im voraus beschriebenen Gruppen lässt folgende Aussagen über die Behandlung der Dysfunktion der Pars intermedia mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat zu. Durch die Therapie werden die Symptome des ECS in der Regel deutlich gemildert bis hin zum gänzlichen Schwinden der Symptomatik. Das Ausmaß und die Dauer des Therapieerfolges ist vermutlich davon abhängig, wieweit die Krankheit zum Zeitpunkt des Behandlungsbeginns fortgeschritten war. Die DPI ist ein progressiv verlaufendes Krankheitsgeschehen, dessen Auswirkungen durch die Behandlung eine gewisse Zeit unterdrückt werden können. Es zeigt sich in dieser Studie, das Pferde, die seit mehreren Jahren unter Therapie stehen, bei noch gutem klinischen Erscheinungsbild schlechte Ergebnisse in den Wiederholungstesten aufweisen, was als ein Hinweis auf ein weiteres Fortschreiten der DPI verstanden werden kann. Aus den vorliegenden Daten wird ersichtlich, dass sich das equine Cushing-Syndrom nicht immer in seiner klassischen Form darstellt und eine höhere Inzidenz, als sie in der Literatur beschrieben wird, aufweist. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, einfache labordiagnostische Testverfahren wie den Dexamethason-Suppressionstest und die

61 Diskussion Bestimmung des Plasma-ACTH-Spiegels viel häufiger auf Verdacht hin durchzuführen. Die Behandlung der Dysfunktion der Pars intermedia mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat, Parkotil R führt für eine gewisse Zeit zu einer deutlichen Besserung der klinischen Symptomatik und damit des Allgemeinbefindens und kann somit als lebensverlängernde Maßnahme angesehen werden

62 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Das equine Cushing-Syndrom (ECS) galt lange Zeit als eine seltene, bei älteren Pferden auftretende Krankheit. Durch neue Erkenntnisse über die klinischen Erscheinungen, die Diagnostik und eine verbesserte Aufklärung der Tierärzteschaft wurde der equine Hyperadrenokortizismus in den vergangenen Jahren immer häufiger diagnostiziert. In der vorliegenden Arbeit sollte im Rahmen der Diagnostik des ECS die Plasma-ACTH- Bestimmung dahingehend verbessert werden, das instabile Plasma-ACTH für den Probentransport bei Raumtemperatur zu stabilisieren. Danach wurde der Therapieverlauf von Cushing-Pferden, die mit dem Dopaminagonisten Pergolidmesilat behandelt wurden, hinsichtlich ihrer klinischen Entwicklung und den Ergebnissen von wiederholt durchgeführten Dexamethason-Suppressionstesten und ACTH- Bestimmungen beurteilt. Stabilitätsstudie Die Stabilität des equinen Plasma-ACTHs wurde in einer Studie mit 29 Pferden untersucht. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: Blutproben wurden in EDTA-Polypropylenröhrchen mit und ohne Zusatz des Proteasenhemmers Aprotinin entnommen, binnen 30 Minuten zentrifugiert und für 24 Stunden bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen (-22 C, +6 C, +20 C) gelagert. Es zeigte sich, dass sowohl eine niedrige Lagerungstemperatur als auch der Zusatz von Aprotinin die ACTH-Konzentration in den Blut- bzw. Plasmaproben stabilisiert und der Abbau des ACTHs in Nativ-Proben bei Raumtemperatur nicht so massiv ausfiel wie ursprünglich erwartet. Für die praktische Anwendung in der täglichen Praxis kann somit folgende Vorgehensweise beim Probenhandling und Probentransport empfohlen werden. Im Hinblick auf eine größtmögliche diagnostische Aussagekraft sollten die Proben mit Aprotinin versetzt werden oder mindestens gekühlt versandt werden, da für die Beurteilung von ACTH- Konzentrationen, die im Grenzbereich liegen, sehr genaue Werte von Bedeutung sind

63 Zusammenfassung Klinische Studien In der klinischen Studie wurde die Krankengeschichte von 63 Cushing-Pferden beurteilt. In die Auswertung kamen Pferde mit einem eindeutigen klinischen Erscheinungsbild des ECS, einem positiven Dexamethason-Suppressionstest und/oder einer erhöhten Plasma-ACTH- Konzentration. Die Altersgruppenverteilung dieser 63 Cushing-Pferde zeigt ein neues, von dem bisher in der Literatur beschriebenen abweichendes, Bild auf. Neben den alten (20-40 Jahre) und den mittelalten (10-20 Jahre) Pferden, die auch in dieser Studie den größten Anteil bilden, fällt eine Gruppe junger Pferde (bis 10 Jahre) auf, die nach den hier gewonnenen Ergebnissen eine ernstzunehmende Patientengruppe darstellt. Bei der Auswertung der Symptomatik wird deutlich, das diese jungen Pferde klinisch nur durch eine Hufrehe auffällig wurden oder als Zufallsbefund durch die Plasma-ACTH- Bestimmung als Cushing-Pferde diagnostiziert wurden. Vierzig der 63 Pferde zeigten einen Hirsutismus, 38 Pferde hatten Hufrehe und in 22 Fällen lag eine Kombination der beiden Symptome vor. Im weiteren konnte festgestellt werden, dass sich das Kardinalsymptom der Hirsutismus nicht immer vorhanden ist und somit auch Pferde, denen das lange lockige Fell fehlt, potentiell als verdächtig angesehen werden müssen. Sie sollten beim Auftreten weiterer Symptome unbedingt durch den Dexamethason-Suppressionstest oder die ACTH- Bestimmung kontrolliert werden. Der Therapieverlauf wurde bei 13 Cushing-Pferden labordiagnostisch und klinisch kontrolliert. Jedem Pferd dieser Studie wurde täglich eine Dosis von 0,01 mg Pergolidmesilat/kg KGW verabreicht. Nach unterschiedlichen Behandlungszeiträumen die zwischen 3 Wochen und 4 Jahren liegen wurde die klinische Erscheinung beurteilt und mit den Ergebnissen der wiederholten Dexamethason-Suppressionstesten und ACTH- Bestimmungen verglichen. Alle 13 Probanden zeigten unter Behandlung eine deutliche Besserung ihrer Symptomatik, während in einigen Fällen die Suppression des Cortisols ungenügend und die ACTH-Konzentration erhöht war

64 Summary Diagnosis and long-term Treatment of equine Cushing syndrome - the role of the endogeneous ACTH- Christina Brüns 7 Summary The equine Cushing syndrome (ECS) has been considered a rare disease, confined to older animals in the past. Improved diagnostic methods, better understanding of clinical symptoms and a better informed veterinary profession have led to an increased number of cases being recognised. The present paper describes attemps to stabilise plasma ACTH for transport to the laboratory to facilitate routine ACTH assays for the diagnosis of ECS. Using these measurements and dexamethasone suppression tests, patients under therapy with the dopamine agonist Pergolid mesylate were monitored. Stabilising ACTH Blood samples from 29 horses were collected in EDTA polypropylene tubes with and without addition of the protease inhibitor Aprotinin, centrifuged within 30 min. of collection and stored for 24h at 22 C, +6 C and 20 C and assayed for ACTH by an immunochemiluminescence assay. Low temperature and the presence of Aprotinin stabilise plasma ACTH. Therefore it is recommended that either Aprotinin be added to blood plasma samples before transportation or frozen if the protease inhibitor is not available. Clinical study Case histories of 63 confirmed ECS patients wich had been selected on the basis of their clinical symptoms, positiv dexamethasone suppression tests and/or elevated plasma ACTH were studied. The age distribution of these cases differs from that described in the literature in that we found a significant number of young (< 10 years) animals amongst the majority of elderly patients. Surprisingly the younger patients had Hufrehe as the only symptom or did not show any clinical signs and had been detected through random ACTH measurements. Fourty of 63 animals had developed hirsutism, 38 had Hufrehe and 22 had both symptoms. It

65 Summary should be pointed out that the leading clinical symptom hirsutism is not always present, and that horses without the typical curly long hair can be potentially suspect for ECS. Therapy was monitored in 13 ECS patients both clinically and through ACTH measurements as well as by dexamethasone suppression tests. All animals received a daily dose of 0,01 mg of Pergolide mesylate per kg body weight. Clinical success and hormonal response were juged repeatly over a period of up to 4 years. All patients improved considerably under the therapy however the dexamethasone suppression tests were not back to normal in all cases and plasma ACTH remained elevated in some patients

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80 Abbildungsverzeichnis Tabellenanhang Tab. 11: ACTH-Konzentration pg/ml bei verschiedenen Lagerungstemperaturen mit und ohne Aprotinin 24 Std. nach Blutentnahme, Gruppe

81 Abbildungsverzeichnis Tab. 12: ACTH-Konzentration pg/ml bei verschiedenen Lagerungstemperaturen mit und ohne Aprotinin 24 Std. nach Blutentnahme, Gruppe

82 Abbildungsverzeichnis Tab. 13: Stabilitätsstudie - Auswertung