Die Resistenzlage von Magen-Darm-Strongyliden gegenüber Moxidectin in deutschen Schafherden

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik und Institut für Parasitologie Die Resistenzlage von Magen-Darm-Strongyliden gegenüber Moxidectin in deutschen Schafherden INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Claudia Perbix aus Krefeld Hannover 2008

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Martin Ganter Univ.-Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martin Ganter 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Karsten Feige Tag der mündlichen Prüfung: 28. November 2008

3 Für meine Familie

4 Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: C. Perbix, M. Ganter (2006): Helminthen-Resistenzen gegen makrozyklische Laktone (Moxidectin (Cydectin )) in der deutschen Schafpopulation. Delegiertenversammlung des Schafzuchtverbandes NRW, Dortmund, Deutschland 24. Oktober 2006 C. Perbix 1, J. Demeler 2, G. v. Samson-Himmelstjerna 2, M. Ganter 1 (2007): The Development of Resistance to the macrocyclic Lactone Anthelmintics in parasitic Nematodes in the German Sheep Population. Spring Meeting of the Sheep Veterinary Society, Hannover, Germany Mai 2007 C. Perbix 1, J. Demeler 2, G. v. Samson-Himmelstjerna 2, M. Ganter 1 (2007): Die Resistenzlage von Magen-Darm-Strongyliden der Schafe gegenüber makrozyklischen Laktonen. Tagung der DVG-Fachgruppe Parasitologie und parasitäre Krankheiten, Celle, Deutschland Juni 2007 C. Perbix 1, J. Demeler 2, G. v. Samson-Himmelstjerna 2, M. Ganter 1 (2007): Die Resistenzlage von makrozyklischen Laktonen (Moxidectin (Cydectin )) in der deutschen Schafpopulation. Tagung der Schafgesundheitsdienste, Soest, Deutschland September 2007

5 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Literaturübersicht Biologie der Nematoden Struktur und Funktion der Nematoden Pharynx Differenzierung parasitärer Nematoden anhand von Pharynxmerkmalen Pharynxpumpe Somatische Muskulatur Neurophysiologie und Neurotransmitter Acetylcholin γ-aminobuttersäure (GABA) Glutamat Serotonin (5-Hydroxytryptamin) Befallsextensität mit Magen-Darm-Strongyliden bei Schafen Trichostrongyliden Cooperia Haemonchus contortus Ostertagiinae Trichostrongylus Epidemiologie Trichostrongylidosen Cooperiose Haemonchose Ostertagiose Trichostrongylose Parasitenkontrolle Haltungsformen und Weidemanagement Anthelminthika und Einsatz Alternative Bekämpfungsmaßnahmen Anthelminthika...45

6 2.3.1 Makrozyklische Laktone Allgemeines Chemische Eigenschaften Wirk- und Resistenzmechanismus Pharmakokinetik Benzimidazole Allgemeines Chemische Eigenschaften Wirk- und Resistenzmechanismus Pharmakokinetik Levamisol Allgemeines Chemische Eigenschaften Wirk- und Resistenzmechanismus Pharmakokinetik Anthelminthikaresistenz Formen der Resistenz Häufigkeit und Verbreitung der Anthelminthikaresistenz Entstehung von Resistenzen Resistenzdetektion Wissenschaftliche Methoden In vivo-versuche Eizahlreduktionstest Tierversuch In vitro-versuche Larvenschlupfhemmtest Larvenentwicklungshemmtest Molekularbiologische Verfahren Real-time PCR zur Larvendifferenzierung Nachweis von Resistenzgenen gegen Anthelminthika in Nematoden Material und Methoden Material Chemikalien...70

7 3.1.2 Puffer und Lösungen Enzyme Kits Methoden Auswahl der Betriebe Datenerfassung Auswertung des Fragebogens Eizahlreduktionstest Probenentnahme Kotuntersuchung Auswertung des Eizahlreduktionstestes Tierversuch Versuchstiere Verwendete Parasitenpopulationen Infektionsversuch Gewinnung der Eier aus dem Kot Aufreinigung der gewonnenen Eisuspension Larvenentwicklungshemmtest Herstellung der Verdünnungsreihen Durchführung des Larvenentwicklungshemmtestes Auswertung und Statistik des Larvenentwicklungshemmtest Larvenschlupfhemmtest Herstellung der Verdünnungsreihe mit Thiabendazol Durchführung des Larvenschlupfhemmtestes Auswertung und Statistik des Larvenschlupfhemmtestes Differenzierung von Nematodenlarven Larvenkulturen Entscheidung dritter Larvenstadien Extraktion der DNA Real-time Polymerasekettenreaktion Auswertung der real-time Polymerasekettenreaktion Ergebnisse Betriebe...91

8 4.1.1 Eizahlreduktionstest mit Moxidectin Tierversuch Ermittlung von Referenzwerten mittels Larvenentwicklungshemmtest und Larvenschlupfhemmtest an sensiblen Larvenstämmen Felduntersuchungen Larvenentwicklungshemmtest mit Levamisol Larvenschlupfhemmtest mit Thiabendazol Zusammenstellung der Ergebnisse aus dem in vivo- und den in vitro- Versuchen Larvendifferenzierung Fragebogen mit den Betriebsdaten Herdengröße Haltungsform Entwurmung Entwurmungsmanagement Eingesetzte Wirkstoffe Regelmäßiger Wechsel der Wirkstoffgruppen Gewichtsbestimmung Untersuchungen von Kotproben Hinweise auf mögliche Resistenzen Moxidectin und Fragebogen Moxidectin und Resistenzen Moxidectin und die Weideform Thiabendazol und Fragebogen Thiabendazol und Resistenzen Thiabendazol und die Weideform Levamisol und Fragebogen Levamisol und Resistenzen Zusammenfassung der wichtigsten Fragen Diskussion Betriebe Eizahlreduktionstest mit Moxidectin...116

9 5.3 Ermittlung von Referenzwerten mittels des Larvenentwicklungshemmtests und Larvenschlupfhemmtests an sensiblen Larvenstämmen In vitro-untersuchungen an Feldstämmen Larvenentwicklungshemmtest mit Levamisol Resistenzen gegen Thiabendazol Larvendifferenzierung Fragebogenuntersuchung Haltungsformen Entwurmungsmanagment Ergebnisse aus dem Fragebogen zu den einzelnen Wirkstoffen Schlussfolgerung Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Materialien Einwegartikel Mehrwegartikel Technische Geräte Software Fragebogen...166

10 Abkürzungsverzeichnis ACh Acetylcholin AH Anthelminthika ATP Adenosintriphosphat BB Brandenburg bidest. lat.: bidestilata BY Bayern B-W Baden-Württemberg BZ Benzimidazol C. curticei Cooperia curticei C. elegans Caenorhabditis elegans C. oncophora Cooperia oncophora CI Konfidenzintervall c t -Wert Schwellenwert D. dendriticum Dicrocoelium dendriticum dest. lat.: destilata DMSO Dimethylsulfoxid DNA engl.: desoxyribonucleic acid EC effektive Konzentration E. coli Escherichia coli EK Einzelkotprobe EpG Eier pro Gramm Kot et al. lat.: et alii (und andere) EZR Eizahlreduktion EZRT Eizahlreduktionstest FAM 6-Carboxy-Fluorecein F. hepatica Fasciola hepatica g Gramm / Erdbeschleunigung GABA γ-aminobuttersäure GIT Gastrointestinaltrakt GluCl glutamatgesteuerte Chloridkanäle Haem. Haemonchus H. c. Haemonchus contortus

11 H. contortus Haemonchus contortus Hess. Hessisch Inc. engl.: incorporation IVM Ivermectin k Kilo KGW Körpergewicht l Liter L 1 L 2 L 3 L 4 LAVES Lsg. LEHT LEV LSHT M erste Larven zweite Larven dritte Larven vierte Larven Landesamt für Verbraucherschutz und Ernährungssicherheit Lösung Larvenentwicklungshemmtest Levamisol Larvenschlupfhemmtest Molarität (mol/l) m milli, 10-3 MDS Magen-Darm-Strongyliden µ mikro, 10-6 min. Minute MGB engl.: minor groove binder ML makrozyklische Laktone mm Millimeter MMT Micromotility meter MOX Moxidectin MT Muscle tranducer MW Mittelwert n nano, 10-9 NDS Niedersachsen NK Negativkontrolle NRW Nordrhein-Westfalen oci obere Grenze des 95% Konfidenzintervalls o.g. oben genannt

12 O. circumcincta Ostertagia circumcincta O. leptospicularis Ostertagia leptospicularis O. ostertagi Ostertagia ostertagi Ost. Ostertagia PCR engl.: polymerase chain reaction P-gp P-Glykoproteine ph ph-wert p.i. lat.: post infectionem PK Positivkontrolle PPRI engl.: periparturient relaxation in immunity res. ROX RR s.c. sec. sen. SK spp. SZGD TBZ Tela. engl.: registered trademark resistent 6-Carboxy-X-Rhodamin resistent ratio lat.: sub cutanum Sekunde sensibel Sammelkotprobe Subspezies Schaf- und Ziegengesundheitsdienst Thiabendazol Teladorsagia T. axei Trichostrongylus axei T. colubriformis Trichostrongylus colubriformis T. vitrinus Trichostrongylus vitrinus TGD Tiergesundheitsdienst Tricho. U uci UV W.A.A.V.P. engl.: trade mark Trichostrongylus Umdrehung untere Grenze des 95% Konfidenzintervalls Ultraviolett World-Association-for-the-Advancement-of-Veterinary- Parasitology

13 Einleitung 1. Einleitung Resistenzen gegenüber Anthelminthika treten weltweit zunehmend in den Vordergrund. Eine besondere Rolle spielt dabei die Resistenzentwicklung bei Schafen, bei denen früher als bei anderen Tierarten verminderte Wirksamkeiten gegenüber verschiedenen Wirkstoffgruppen der Anthelminthika beobachtet werden. In manchen Regionen der Welt ist Schafhaltung auf der Weide aufgrund von Resistenzen bei den vorhandenen Magen-Darm-Strongyliden nicht mehr möglich. In Deutschland gibt es zurzeit wenige Publikationen über Resistenzen, und die Situation über den Resistenzstatus ist bisher nicht genau bekannt. Resistenzen gegenüber der Wirkstoffgruppe der Benzimidazole wurden durch Untersuchungen verschiedener Autoren in Deutschland festgestellt. Die Nachteile dieser Studien waren die regionale Begrenzung, es konnte nicht annähernd ein Überblick über die gesamtdeutsche Situation erstellt werden. Übereinstimmend stellen jedoch all diese Untersucher eine weite Verbreitung von Benzimidazol-Resistenzen in bis zu zwei Dritteln der untersuchten Schafherden fest. In einer Untersuchung zur Wirksamkeit von Praziquantel gegen Bandwürmer stellte der Untersucher, quasi als Nebenbefund, eine Verkürzung der Wirksamkeitsdauer von Moxidectin fest, was zu der folgenden Studie über die Untersuchung der Resistenz von Magen-Darm-Strongyliden gegenüber makrozyklischen Laktonen führte. Aufgrund der ungünstigen Resistenzlage der Benzimidazole und wegen seiner lang anhaltenden Wirkung wird zunehmend Moxidectin als Anthelminthikum auch in deutschen Schafherden eingesetzt. Ziel der Untersuchung ist es, Informationen über Resistenzen gegenüber Moxidectin zu bekommen. Gleichzeitig wird versucht, die Resistenzsituation nicht nur gegenüber makrozyklischen Laktonen, sondern mittels in vitro-tests auch gegenüber Benzimidazolen und Levamisol in den gleichen Herden festzustellen. Der Focus der Studie wurde bewusst auf die Berufsschäferei gelegt, um Daten aus den wirtschaftlich relevanten Betrieben zu erhalten. In Deutschland werden über 90 % der Schlachtlämmer in Berufsschäfereien geboren und gemästet, so dass hier ein besonderes Interesse an der Resistenzdetektion besteht. 13

14 Literaturübersicht 2. Literaturübersicht 2.1 Biologie der Nematoden Der Stamm der Nematoda umfasst derzeit bekannte Arten, deren Biotope von heißen Quellen (+ 53 C) bis ins Erdreich gehen. Als Parasiten sind sie von Bedeutung bei Pflanzen und Tieren. Der freilebende Nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) dient für verschiedenste biologische Fragestellungen als bedeutender Modellorganismus und stellt die am besten untersuchte Nematodenart dar. Daher wird C. elegans als Beschreibungsgrundlage in diesem Kapitel herangezogen. Im Folgenden wird der Schwerpunkt auf mögliche Angriffspunkte der Anthelminthika (AH) in den Nematoden gelegt Struktur und Funktion der Nematoden Nematoden sind unsegmentierte, bilateral symmetrische Würmer von zylindrischer Gestalt mit einem kegelförmigen Ende. Der Körper setzt sich aus einer äußeren und inneren Hülle zusammen, die durch einen flüssigkeitsgefüllten Hohlraum, das Pseudocoel, getrennt sind (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997). Das Integument (äußere Hülle) besteht von außen nach innen aus der Kutikula, der Hypodermis, Neuronen und der somatischen Muskulatur. Die Muskulatur setzt sich aus spindelförmigen, einkernigen, longitudinalen Muskelzellen zusammen, die mit der Epidermis verbunden sind und zwischen den einzelnen Schichten liegen. Die Hypodermis bildet die Kutikula und speichert Nährstoffe. Verschiedene Abschnitte des Verdauungstraktes, die Exkretionsöffnungen, Vulva, Anus und viele sensorische Öffnungen entlang des Körpers sind von Hypodermis ausgekleidet. Der Aufbau besteht aus einer einfachen, einschichtigen Zelllage, deren Zellen durch Zonulae adhaerentes miteinander verbunden sind. An der Spitze des Wurmes bildet die Hypodermis die Kutikula, am Schwanz die Basallamina. Bei genauerer Betrachtung ist eine kollagene Schichtung zu erkennen, bestehend aus Epikutikula, äußerem und innerem Cortex, mittlerer fibrillärer Zone und Basalzone. Die Epikutikula wird noch von einer Oberflächenschicht (Glykokalix) überlagert, bestehend aus Glykoproteinen und 14

15 Literaturübersicht Mukopolysacchariden, die in der Immunabwehr von Bedeutung ist. Zwischen der Kutikula und dem Pseudocoel liegt die Epidermis als Abgrenzung zur tiefer gelegenen Muskulatur. In der Epidermis werden Energiereserven für den Häutungsprozess, Enzyme und chemische Bestandteile für die Protein- und Kohlenhydratsynthese gelagert. Außerdem ist sie in einigen Bereichen mit dem Pseudocoel verbunden und bildet die lateralen Hypodermisleisten, die Teile des Exkretionssystems beinhalten. Die Kutikula bildet zusammen mit dem Pseudocoel das Skelett des Wurmes. Durch die flexiblen Verbindungen und den variierenden Druck ist ein hohes Maß an Motilität gegeben (LEE 1965; SCHNIEDER 2006a). Das Pseudocoel beinhaltet das Nervensystem, den Verdauungstrakt und Anteile des Reproduktionssytems. Das Gewebe steht unter einem hydrostatischen Druck und bildet so eine Art Skelett. Die Flüssigkeit dient dem Transport von Nähr- und Abfallstoffen sowie der Sauerstoffverteilung. Ein Blutkreislauf und Atmungsapparat fehlen (ROMMEL et al. 2005a). Das Nervensystem der Nematoden besteht aus einem zentralen und peripheren Anteil sowie aus verschiedenen Sinnesorganen. Die Neuronen beeinflussen durch ihre Impulse die Lokomotion, Eiablage, Bildung und Rückbildung des Dauerlarvenstadiums, Defäkation, Kopulation und anderes Verhalten. Das zentrale Nervensystem besteht aus Ganglien am Kopf und am Schwanz, wobei sich die meisten Neuronen circumpharyngeal im Kopf befinden. Die Ganglien sind untereinander durch einen ventralen und dorsalen Hauptstrang verbunden. Durch Muskelzellausläufer sind die Muskelzellen an die Ganglien und Längsnerven angefügt, um die Erregung der Nervenzellen aufzunehmen. Das periphere Nervensystem ist vorwiegend im kranialen Abschnitt des Wurmes angelegt und hat eine netzartige Struktur. Wahrscheinlich steht es in Verbindung mit dem zentralen Nervensystem und einigen Sinnesorganen. Durch diese Verbindungen übernimmt es die Koordination von Impulsen und die Steuerung der Lokomotion. Nematoden besitzen mechano-, thermo-, photo- und chemosensitive Sinnesorgane. Hauptsächlich sind sie am Vorder- (Mundöffnung) und Hinterende (Genitalregion) lokalisiert, aber auch entlang des gesamten Körpers verteilt (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997; ALTUN ; SCHNIEDER 2006a). In der Körperhöhle befinden sich die Mundhöhle, der Pharynx, das Intestinum, das Rektum und die Kloake (männliche Tiere), der Anus und die Reproduktionsorgane, die von der inneren Hülle der Körperhöhle umgeben sind (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997). Der Verdauungsapparat setzt sich von kranial nach kaudal zusammen aus der Mundöffnung, der 15

16 Literaturübersicht Mundhöhle (Mundkapsel), dem Ösophagus, dem Mitteldarm, dem Rektum und abschließend dem Anus. Die Mundöffnung wird bei einigen Nematodenarten durch unterschiedliche Strukturen wie z.b. Lippen oder Blätterkränze begrenzt. Die zum Teil mit zahnartigen Strukturen ausgestattete Mundhöhle erweitert sich zu einer Mundkapsel, die in den Ösophagus übergeht. Der Ösophagus ist ein kutikuläres, mit Drüsen ausgestattetes Rohr, das von Muskel- und Stützgewebe umgeben ist und in verschiedenen Typen vorkommt (siehe ). Der Mitteldarm ist von einem einschichtigen Epithel ausgekleidet, das Mikrovilli trägt und einer Basalmembran aufliegt. Kaudal schließt der Verdauungsapparat mit dem Rektum, das von Kutikula ausgekleidet ist, ab und ist mit dem Hypoderm über den After verbunden (ALTUN ; SCHNIEDER 2006a). Die Exkretionsorgane erfüllen sekretorische und osmoregulatorische Funktionen. Das Aussehen der Exkretionsorgane ist sehr variabel. Bei den meisten Nematoden ist es H-förmig. Die lateralen Schenkel, in der Hypodermis gelegen, durchziehen in Längsrichtung den Körper der Nematoden. Teilweise sind sie mit Ventraldrüsen verbunden und enden in einem gemeinsamen Ausführungsgang, dem Exkretionsporus (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997). Die Würmer sind getrenntgeschlechtlich, die Weibchen sind größer als die Männchen (LINTS 2005b). Der weibliche Geschlechtsapparat lässt sich in drei Abschnitte einteilen. Er besteht aus zwei tubulären Ovarien, dem Ovidukt als Verbindung zum Uterus und der Vagina oder der Vulva. Die Lage der Vulvaöffnung kann zur Artdifferenzierung herangezogen werden. Ferner gibt es noch ein Receptaculum seminis zur Spermienspeicherung. Die sehr starke Uterusmuskulatur transportiert durch die Peristaltik eine große Menge an Eiern. Sie ist unabhängig von der somatischen Muskulatur und bildet bei einigen Arten den Ovijektor. Die Vagina ist ein mit einem einschichtigen Epithel ausgekleidetes muskulöses Rohr. Wahrscheinlich regulieren die beiden letzten Abschnitte die Eiablage (ALTUN ). Die männlichen Geschlechtsorgane bestehen aus einem einzelnen Hoden und dem Samenleiter, der die Verbindung zur Samenblase ist. Die Samenblase dient als Reservoir für Spermien und wird durch den Ductus ejaculatorius mit der Kloake, eine vom Rektum gebildete Ausbuchtung, verbunden. Dorsal der Kloake befindet sich die Bursa copulatrix, die mit Klappen ein oder zwei Spikula verdeckt. Die Spikula halten die Vulvalippen bei der Befruchtung geöffnet. Das Gubernakulum ist eine unpaare, stark kutikularisierte Scheide, die als Gleitschiene für die Spikula dient. Neben den Bursaklappen und dem Aussehen der 16

17 Literaturübersicht Spikula wird es zur Bestimmung der Arten verwendet (ALBERTSON u. THOMSON 1976; AVERY u. HORVITZ 1989). Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Körperbaus von Nematoden nach LEE (1965) modifiziert von SCHNIEDER et al. (2006a) Pharynx Der Pharynx stellt ein weiteres morphologisches Differenzierungsmerkmal verschiedener Nematodenarten dar. Es bestehen große Unterschiede in der Struktur und Funktion, die Aufschluss über das Nahrungsverhalten verschiedener Spezies geben. Während der Entwicklung verändert sich die Morphologie des Pharynx entsprechend der physiologischen Bedürfnisse und Umwelteinflüsse. Die Funktion des Pharynx ist die Aufnahme, Verdauung, Konzentration und Vorbereitung der Ingesta für das Intestinum (SCHNIEDER 2006a). 17

18 Literaturübersicht Differenzierung parasitärer Nematoden anhand von Pharynxmerkmalen Der Pharynx hat eine zylindrische Form und verbindet die Mundhöhle mit dem Darm. Man kann ihn in einen vorderen muskulösen und einen hinteren drüsenreichen Abschnitt einteilen. Nach der Mundhöhle schließt er sich mit dem Corpus an. Der Corpus ist mit der hinten gelegenen Verdickung (Bulbus) über einen Isthmus verbunden. Man unterscheidet bei den Nematoden mehrere Typen, bei denen ein, zwei oder alle Abschnitte vorhanden sind. Einer der wichtigen Ösophagustypen weist im kaudalen Abschnitt einen muskulösen Bulbus und einen Klappenapparat auf, wodurch er als Saugpumpe fungieren kann. Ein anderer Typ ist im kranialen Bereich vornehmlich muskulös ausgebildet, während er im kaudalen Bereich sekretorische Funktionen übernimmt. Es gibt einen zweigeteilten Pharynxtyp bestehend aus Ösophagus und Endbulbus bei der Spezies der Gattung Oxyurida und den L 1 und L 2 von MDS. Der rahbditoide Pharynxtyp besteht aus allen drei Abschnitten und kommt bei allen Nematodenlarven vor. Teilweise kann es noch zu einer Unterteilung des Corpus in Prä- und Metacorpus kommen. Der Bulbus hat drei Abschnitte: Präbulbus, Isthmus mit Klappenapparat und Endbulbus. Der strongyloide Typ bei L 3 und adulten MDS besteht aus einem muskulösen Ösophagus ohne ausgeprägten Bulbus. Bei dem trichuroiden Pharynxtyp wird das Lumen teilweise oder vollständig von einem Zellkörper (Strichosom) umfasst. Der Ösophagus ist drüsenreich und nur im Anfangsteil noch muskulös. Die Drüsen unterstützen wahrscheinlich die Ingestapassage durch Absonderung von Verdauungsenzymen. Dieser Pharynxtyp ist bei Trichuris spp., Capillaria spp. und Trichinella spp. ausgebildet (ECKERT et al. 1992; SCHNIEDER 2006a). Das Nervensystem des Pharynx ist autonom und durch zwei Interneurone mit dem zentralen Nervensystem verbunden. Es steuert über verschiedene Neurotransmitter die Muskulatur und somit die Nahrungsaufnahme (WHITE et al. 1986; ALTUN ) Pharynxpumpe Bestandteile der Pharynxpumpe sind Corpus, Isthmus und Bulbus, die durch zwei Bewegungsabläufe eine Pumpwirkung induzieren. Zuerst kontrahieren sich annähernd 18

19 Literaturübersicht simultan die Muskeln des Corpus. Diese Muskelbewegung öffnet das Lumen, ein Unterdruck entsteht und bedingt die Pumpwirkung auf die flüssige Ingesta aus der Mundhöhle. Der Corpus ist dabei vom Endbulbus durch einen geschlossenen Isthmus getrennt. Danach entspannen sich gleichzeitig Isthmus und Endbulbus. Es baut sich ein Überdruck auf, bis der hydrostatische Innendruck im Nematodenkörper überwunden werden kann und die Ingesta in das Intestinum geleitet wird. Bei C. elegans folgt auf vier Pumpmechanismen eine Entleerungsphase in den Darm, allerdings variiert die Pumprate je nach Nematodenart und Entwicklungsstufe (ALBERTSON u. THOMSON 1976; ALTUN ). Dieser Mechanismus setzt sich aus drei miteinander verbundenen Schritten zusammen. Zuerst findet eine sensorische Stimulation statt, dann kommt die Reaktion des circumpharyngealen Nervenrings und zuletzt die Aktion der Muskulatur. Die sensorische Stimulation ist umweltbedingt und basiert auf chemischen, thermischen, photosensiblen und anderen Reizen (WHITE et al. 1986) Somatische Muskulatur Die Muskulatur der Nematoden lässt sich in glatte und quergestreifte (somatische) Muskulatur unterteilen. Das Zusammenspiel dieser Muskeln steuert die Pharynxpumpe, die Gonadenkontraktion und die Defäkation. Die glatte Muskulatur befindet sich an inneren Organen wie dem Intestinum, Uterus und den Gonaden sowie am Pharynx, dem Anus und der Vulva. Die somatischen Muskelzellen sind mit den Neuronen über Cytoplasmafortsätze ( Muskelarme ) ausgehend von der Muskelzelle verbunden (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997). Die Verbindungen werden in der Embryonalentwicklung wie bei Neuron-Neuron- Synapsen geknüpft und von neuromuskulären Junctions gebildet. Die Synapsen liegen außerhalb der Nervenbündel in der Nähe der Muskelzellen. Durch die schnelle Weiterleitung von Aktionspotentialen wird eine synchrone Kontraktion der Körpermuskulatur bei der Embryonalentwicklung sowie die synchrone Bewegung der linken und rechten Abschnitte bei normaler Aktivität der Larven und der Adulten gewährleistet. Die Cytoplasmafortsätze stehen mit dem Nervensystem im gesamten Körper, am Kopf mit dem Nervenring in Verbindung. Die Junctions liegen innerhalb des Nervenrings und stellen die längste Verbindung zwischen 19

20 Literaturübersicht Muskelzellen und Neuron dar. Der Nervenring sowie der ventrale und dorsale Nervenstrang sind im Nacken mit den Muskelzellen verbunden. Entlang des restlichen Körpers stehen die Muskelzellen mit den am nächsten gelegenen Neuronen in Kontakt. Die Verbindungen variieren in Größe, Aussehen und Verzweigung (ALTUN ; SCHNIEDER 2006a). Durch die direkte Lage des sarkoplasmatischen Retikulums an der Plasmamembran besteht eine unmittelbare Übertragung des elektrischen Impulses an die Muskelzellfilamente. Die Erregungsleitung findet über cholinerge Neurotransmitter statt, die nicotinerge, ligandengebundene Ionenkanäle an der Muskelmembran öffnen und das Aktionspotential weiterleiten. Es sind keine spannungsabhängigen Na + -Kanäle vorhanden, nur spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle. An der Plasmamembran können diese Ca 2+ -Kanäle ohne Spannungsanstieg einen Einstrom von Ca 2+ aus dem Extrazellularraum induzieren und so eine direkte Kontraktion verursachen (EBERT 2002) Neurophysiologie und Neurotransmitter Das Nervensystem von C. elegans umfasst ungefähr 300 Neuronen in 118 verschiedenen Klassen mit einer Größe von jeweils 1 bis 13 Neuronen pro Klasse. Die Neuronen sind mit den Zellen über eine Vielzahl von chemischen Synapsen, gap junctions und neuromuskulären Verbindungen verbunden (MCINTIRE 1993). An den Synapsen werden über Neurotransmitter die nervalen Impulse zu anderen Neuronen oder den Muskelzellen weitergeleitet. Es werden folgende Gruppen unterschieden: Acetylcholin Aminosäuren und ähnliche Verbindungen (Glutamat, γ-aminobuttersäure) Biogene Amine (Serotonin, Dopamin, etc.) Gase (Stickoxid, Kohlenstoffmonoxid) Adrenalin und Noradrenalin Peptide (FMRFamid-artige Peptide, etc.) 20

21 Literaturübersicht Für die Nematoden sind nicht alle Gruppen der aufgeführten Neurotransmitter von Bedeutung. In den nächsten Abschnitten werden die als Angriffspunkte für AH relevanten Transmitter näher erläutert Acetylcholin Acetylcholin (ACh) ist ein exzitatorischer, muskulärer Neurotransmitter. An den Synapsen wird ACh durch die Cholinacetyltransferase synthetisiert, bei Erregung an der präsynaptischen Membran ausgeschüttet und diffundiert durch den synaptischen Spalt zur postsynaptischen Membran an den Rezeptor. Die Inaktivierung des Acetylcholins erfolgt durch die Acetylcholinesterase. Die Inaktivierungsprodukte Acetyl und Cholin diffundieren durch den synaptischen Spalt zurück, werden von der präsynaptischen Membran aufgenommen und in der Synapse wieder zu Acetylcholin verbunden. Durch diesen Vorgang wird eine Depolarisation somatischer Muskelzellen verursacht, die mit einer erhöhten Leitfähigkeit einhergeht. ACh wird an sog. cholinergen Synapsen ausgeschüttet und wirkt sowohl an Synapsen als auch an neuromuskulären Endplatten der somatischen, pharyngealen und uterinen Muskulatur. Die Wirkung erfolgt hauptsächlich auf nicotinerge Rezeptoren, weniger auf muskarinerge (MCINTIRE 1993) γ-aminobuttersäure Der Neurotransmitter γ-aminobuttersäure (GABA) kommt bei Vertebraten und Invertebraten vor. Die Synthese von GABA erfolgt bei C. elegans durch das Enzym Glutaminsäuredecarboxylase. GABA ist stark inhibitorisch und wirkt an somatischen Muskelzellen (DENT et al. 1997; LI et al. 1997). Der Transmitter verursacht eine Hyperpolarisation an der Muskulatur, die Permeabilität der Membran wird durch Öffnen der Cl - -Känale erhöht. Obwohl GABA als stärkster inhibitorischer Neurotransmitter gilt, beschrieben MCINTIRE et al. (1993) ebenso eine exzitatorische Wirkung. 21

22 Literaturübersicht Glutamat Glutamat ist ein inhibitorischer Neurotransmitter im Nervensystem von Nematoden, der an die ionotropen Glutamatrezeptoren bindet. Die inhibitorische Wirkung wird durch die Glutamat-gesteuerten Cl - -Kanäle hervorgerufen, die Ansatzpunkt der makrozyklischen Laktone sind. Es beeinflusst vorwiegend die pharyngeale Muskulatur und wird von den M3 Neuronen der Pharynxmuskulatur bei C. elegans ausgeschüttet (HORVITZ et al. 1982). Am Neuron hat es den Effekt, dass sich die Na 2+ /K + -Kanäle öffnen und eine dauerhafte Depolarisation induziert wird Serotonin (5-Hydroxytryptamin) Serotonin ist ein biogenes Amin, das durch Hydroxylierung und Decarboxylierung aus Tryptophan entsteht. Der Neurotansmitter wirkt auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (SCHAFER et al. 1996) und stimuliert so die Pharynxpumpe und die Eiablage, verringert aber die Bewegung (UNGEMACH 2003). Die Eiablage bei C. elegans wird durch das biogene Amin Dopamin inhibiert (STEEL 1993). 2.2 Befallsextensität mit Magen-Darm-Strongyliden bei Schafen Nematodenbefall stellt sowohl bei Heim- als auch bei Nutztieren ein ernst zu nehmendes Problem dar. Einerseits führt er zu gesundheitlichen Schäden, die das Wohlbefinden der Tiere einschränken und aus tierschützerischer Sicht zu vermeiden sind. Andererseits verursacht der Befall teilweise empfindliche ökonomische Einbußen bei der Fleisch-, Milch- und Wollproduktion. Unter den heutigen ökonomischen Rahmenbedingungen der Schafproduktion muss der Parasitenbekämpfung daher besondere Bedeutung beigemessen werden. Dabei stellt sich zunächst die Frage nach der Befallsextensität. In den 40er und 60er Jahren des 20. Jahrhunderts fanden durch FORSTNER (1960) in Baden- Württemberg an Wanderschafen und durch SCHNEIDER (1942) an einer Herde im Taunus Untersuchungen zum Endoparasitenbefall statt. Dabei wurden regionale Schwankungen in der 22

23 Literaturübersicht Befallsdichte festgestellt. WEBER-WERRINGHEN (1987) stellte eine Befallsextensität der Schafe mit Magen-Darm-Strongyliden (MDS) von 81,3-100 % fest. Auch in den letzten Jahren wurden einige Untersuchungen zur Feststellung des Befalls von Schafen mit Endoparasiten in Deutschland durchgeführt (s. Tab. 2.1) (GRÄNZER 1979; BENESCH 1993; REHBEIN et al und 1998; SCHWENK 1998; GRZONKA et al. 2000; MORITZ 2005). Der Anteil an MDS war bei den Untersuchungen meist einheitlich hoch und deckte sich mit den früheren Untersuchungen von WEBER-WERRINGHEN (1987). Im folgenden Kapitel werden die beim Schaf am häufigsten vorkommenden MDS vorgestellt. Tabelle 2.1: Ergebnisse vorheriger Untersuchungen zur Häufigkeit von MDS-Arten in Deutschland BAUER et al. BENESCH REHBEIN et al. (1996) (1988) (1993) Gattung Art Schlachtschafe Lämmer H. contortus % 46 % 45,6 % 45,5 % Ostertagia spp % O. circumcincta 60 % 68,4 % 67,7 % Trichostrongylus spp % T. axei 24 % 34,6 % 31,3 % T. vitrinus 25 % 33,8 % 37,4 % T. colubriformis 19 % 41,2 % 41,4 % Cooperia spp. C. curticei 24 % 74,3 % 73,7 % C. oncophora 2,2 % 3,0 % C. punctata 8,8 % 11,1 % C.= Cooperia; H.= Haemonchus; O.= Ostertagia; T.= Trichostrongylus; spp.= Subspezies Trichostrongyliden Trichostrongyliden gehören zur Familie der Trichostrongylidae. Der Name setzt sich aus den griechischen Wörtern für Haar (trichos) und rund (strongylus) zusammen und nimmt Bezug auf die meist haarfeine Körperform. Die Entwicklungszyklen der MDS aus dieser Familie sind sehr ähnlich und sollen für die Gattungen Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Teladorsagia und Trichostrongylus zusammen erläutert werden (SCHNIEDER 2006b). 23

24 Literaturübersicht Die Entwicklung ist monoxon (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997). Mit dem Kot werden eiförmige oder elliptische Eier ausgeschieden, die acht bis sechszehn Blastomere beinhalten. Nach der Eiausscheidung wird die Embryonalentwicklung mit der Entwicklung zur ersten Larve (L 1 ) (ca. 300 µm) abgeschlossen und die postembryonale Entwicklung begonnen. Die L 1 nimmt an Größe zu und streift die alte Kutikula als Scheide ab; es hat sich die zweite Larve (L 2 ) gebildet. Die L 2 ernährt sich im Kot von Fäkalbakterien und nimmt weiterhin an Größe zu. Es bildet sich eine zweite Kutikula, wobei diese diesmal nicht abgestreift wird, sondern als Scheide bestehen bleibt. Dieses Larvenstadium wird als dritte Larve (L 3 ) (ca. 800 µm) bezeichnet und stellt das Ansteckungs- und Dauerstadium dar. Nach oraler Aufnahme der infektiösen L 3 entwickelt sich diese z.b. im Labmagen oder Dünndarm des Wirtes durch Abstreifen der Scheide zur parasitischen L 3. Sie siedelt sich in Krypten der Schleimhaut und in Drüsenlumina der Organe an (s ). Die dritte Häutung zur vierten Larve (L 4 ) ist speziesabhängig und findet im Wirt statt. Über ein präadultes Stadium kommt es auf der Schleimhaut zur Geschlechtsreife der Würmer. Die Präpatenz der verschiedenen Spezies liegt bei ca. 20 Tagen (ROMMEL et al. 2000; SCHIEDER et al. 2006b). In Abbildung 2.2 ist eine Übersicht des Entwicklungszyklus von Trichostrongyliden zu sehen. Abbildung 2.2: Entwicklungszyklus von Trichostrongyliden bei Schafen (LARSEN 1991) 24

25 Literaturübersicht Einige Arten wie Haemonchus contortus, Trichostrongylus axei und Trichostrongylus colubriformis sind zur Hypobiose befähigt (SCHIEDER et al. 2006b). Unter bestimmten Bedingungen wie z.b. Verkürzung des Tageslichtlänge werden die Larven in ihrer Weiterentwicklung gehemmt und können einen längeren Zeitraum (Winter) in einem meist metabolisch reduzierten Zustand persistieren, bis spezifische Reize (Zunahme der Tageslänge) die Weiterentwicklung induzieren Cooperia Cooperia-Infektionen beim Schaf werden vorwiegend von den Arten Cooperia curticei und seltener Cooperia oncophora im Dünndarm verursacht. Die Würmer der Gattung Cooperia sind klein, rötlich und oft eingerollt. Das Vorderende ist kugelförmig erweitert. Dorsal und ventral treten deutlich Längsgrate hervor; lateral sind nur wenige, niedrige Grate vorhanden. Die Männchen von C. curticei sind 5-7 mm groß. An der Dorsalrippe ist eine Bursa mit lyraförmigen Seitenästen gelegen. Die Spikula sind am Vorderende knopfförmig und besitzen einen kammartigen Fortsatz im mittleren Drittel des Spikulums. Die Weibchen werden 6 mm groß. Das Hinterende ist spitz ausgezogen. Die Männchen von C. oncophora sind 5-8 mm groß. Die Bursa hat eine große, nach kranial abgebogene posteroventrale Rippe. Die Spikula sind leicht geschwungen mit einem glatten Mediankamm. Ein Gubernakulum ist nicht vorhanden. Die Weibchen haben eine Größe von 6-11 mm. Die Vulva besitzt einen Querschlitz ohne Klappe im hinteren Körperviertel (ROMMEL et al. 2000; ECKERT et al ; SCHNIEDER et al. 2006b). 25

26 Literaturübersicht Haemonchus contortus Haemonchus contortus, auch roter, gedrehter oder großer Magenwurm genannt, ist der einzige seiner Gattung, der vorwiegend bei Schaf und Ziege parasitiert. Die anderen Unterarten kommen vorwiegend beim Rind vor (ROMMEL et al. 2000). Der Wurm hat eine kleine Mundkapsel mit einem starken Zahn. Im Ösophagusbereich befindet sich ein Paar große, nach kaudal gerichtete Papillen. Männchen haben eine Größe von mm. An der Bursa befinden sich asymmetrische Dorsallappen. Die Spikula sind schlank mit Endhaken. Das Gubernakulum ist kahnförmig. Die Weibchen sind mm lang. Ihre weißlichen Geschlechtsorgane sind um den rötlichen Darm gewunden. Die Vulva befindet sich im hinteren Körperfünftel (LUCIUS u. LOOS-FRANK 1997) Ostertagiinae Zur den Ostertagien-Arten gehören die eng verwandten Gattungen Ostertagia (O.) und Teladorsagia. Beim Schaf kommen überwiegend Ostertagia (Teladorsagia) circumcincta, Ostertagia leptospicularis und seltener Ostertagia ostertagi vor (ROMMEL et al. 2000; SCHNIEDER et al. 2006b). Alle Ostertagia-Arten haben eine kleine, flache Mundkapsel, sind am Kopfende verjüngt und besitzen zwei kleine seitliche Nackenpapillen. Auf der Kutikulaoberfläche sind viele, gleichmäßig hohe Längsgrate zu finden. Die Männchen von O. circumcincta haben eine Größe von 7-10 mm. Die Spikula sind stabförmig; der längste und stärkste Ast hat einen gallertigen, distalen Kopf und verzweigt sich in zwei weitere Äste. Das Gubernakulum hat die Form eines Tennisschlägers. Die Weibchen sind 9-12 mm lang. Die Vulva hat eine Klappe, und in der Nähe von der Schwanzspitze ist eine Auftreibung aus drei bis fünf Querringeln. Ostertagia ostertagi wird auch brauner Magenwurm genannt. Die Männchen sind 6-8 mm groß und haben an der Bursa einen akzessorischen Lappen. Die Spikula sind lang und das 26

27 Literaturübersicht Gubernakulum blattförmig. Die Weibchen haben eine Größe von 8-12 mm. Ihre Vulva ist von einer lappenförmigen Vorderlippe, der Vulvaklappe, bedeckt Trichostrongylus In der mitteleuropäischen Klimazone kommen bei Schafen vorwiegend Trichostrongylus axei (T. axei), Trichostrongylus colubriformis (T. colubriformis) und Trichostrongylus vitrinus (T vitrinus) vor (ROMMEL et al. 2000; SCHNIEDER et al. 2006b). Die verschiedenen Trichostrongylus-Arten sind haardünn, rötlichbraun und verjüngen sich zum Vorderende hin. An der Mundöffnung befinden sich drei Lippen. Die Männchen von T. axei sind 3-5 mm groß. Die Spikula sind ungleich, kaudal spitz zulaufend und mit einem kleinen, medianen Fortsatz versehen. Das Gubernakulum ist spindelförmig. Die Weibchen werden 4-6 mm lang. Bei der Art T. colubriformis (s. Abb. 2.3) sind die Männchen 4-7 mm lang. Die ungleichen Spikula sind bootförmig aufgebogen und enden distal mit einer dreieckigen, ankerartigen Spitze. Das Gubernakulum ist schmal und wellenartig. Die Weibchen sind 5-8 mm groß. T. vitrinus zeichnet sich durch gleich lange Spikula aus, die gerade, distal spitz ausgezogen sind. Die Männchen haben eine Größe von 4-7 mm, die Weibchen von 5-7 mm. Abbildung 2.3: Adulte T. colubriformis (DEMELER, unveröffentlicht) 27

28 Literaturübersicht Epidemiologie Trichostrongyliden sind weltweit verbreitet und kommen vorwiegend in den gemäßigten Klimazonen sowie in den Tropen und Subtropen vor, in denen ausreichend Feuchtigkeit zur Entwicklung der Larven vorhanden ist (ROMMEL et al. 2000; SCHNIEDER et al. 2006b). Die Entwicklung vom ausgeschiedenen Ei bis zur infektiösen L 3 ist artspezifisch. Sie dauert unterschiedlich lang und ist vornehmlich temperatur- und feuchtigkeitsabhängig. Die ideale Temperatur zur Entwicklung von etwa C wird in Deutschland nur kurzfristig im Sommer erreicht. Durchschnittlich dauert die Entwicklung zur L 3 im Sommer drei bis fünf Wochen, kann sich aber unter idealen Bedingungen in ein bis zwei Wochen vollziehen. Im Herbst verlängert sich die Entwicklungsperiode auf zwei bis drei Monate. Haemonchus contortus ist Temperaturschwankungen gegenüber sehr empfindlich und benötigt eine Temperatur von deutlich über 15 C zur Entwicklung (GOLDENSTEIN et al. 1978). Ostertagia spp. und Trichostrongylus spp. dulden auch Temperaturen bis 7 C und verlieren auch nach Minusgraden im Winter die Infektiösität im darauf folgenden Frühjahr nicht (VLASSOFF et al. 2001). Einige Parasiten wie z.b. H. contortus, Teladorsagia spp. und T. axei haben die Fähigkeit, in einem hypobiotischen Zustand im Tier den Winter zu überdauern (SCHILLINGER u. BARTH 1993; ABBOTT et al. 2004). Im Frühjahr wird durch spezifische Reize wie die Zunahme der Tageslichtlänge das hypobiotische Stadium der L 4 im Wirt beendet, und die L 4 entwickeln sich weiter zu Adulten. Die infektiösen L 3, die auf der Weide überwintert haben, werden nach dem ersten Austrieb mit dem Gras von den Tieren aufgenommen und entwickeln sich ebenfalls im Wirt zu adulten Stadien und scheiden Eier aus, die mit dem Kot vom Wirt verteilt werden. Ein Anstieg der Eiausscheidung kommt bei infizierten Mutterschafen ca. zwei bis vier Wochen vor der Geburt bis ca. sechs bis acht Wochen nach der Geburt vor. Dieses Phänomen wird als periparturient rise oder periparturient relaxation in immunity (PPRI) genannt (SOUTHCOTT et al. 1972; HERD et al. 1983). Die Ursache für die PPRI wird in einer geschwächten Immunitätslage der Muttertiere gesehen, verursacht durch eine verminderte Resistenzlage infolge von Geburtsstress und Laktation. Folglich scheiden die Nematoden mehr Eier aus, Adulte werden in geringerem Maße aus dem Labmagen oder Darm eliminiert, und neu aufgenommene 28

29 Literaturübersicht Larven siedeln sich leichter an. Bei Aufnahme von mit Parasiten befallenem Futter kommt es nach ca. drei Wochen zur erneuten Ausscheidung von MDS-Eiern. Hierbei sind besonders die Mutterschafe und Lämmer betroffen (HERD et al. 1983). Durch die erhöhte Ausscheidung von MDS besteht auch eine erhöhte Exposition der Tiere. Es findet eine ständige Reinfektion und somit eine Gefährdung der Tiere vorwiegend im Spätsommer und Frühherbst statt (SCHNIEDER 2006b). In Abbildung 2.4 ist die Saisondynamik der Trichostrongylidosen anhand eines Entwicklungsmodells beim Rind verdeutlicht. Abbildung 2.4: Epidemiologie der Trichostrongylidosen der Rinder in Norddeutschland: Eiausscheidung erstsömmriger Rinder und Kontamination des Grases mit infektiösen Larven auf einer Standweide (SCHNIEDER 2006b). Eine Aufnahme von infektiösen L 3 ist nur alimentär möglich. Die L 3 gelangen auf die Vegetation über aktive Migration in Flüssigkeiten, passiv verteilt z.b. über Regentropfen oder durch Zertreten des Kotes durch die Tiere selbst. Es werden drei Hauptursachen für das Entstehen von Helmintheninfestationen auf der Weide diskutiert. Als erstes ist der Infektionsdruck zu nennen, der durch die Anzahl der infektiösen Larven pro Fläche bestimmt wird. Der Infektionsdruck wird nicht nur von der Anzahl der überwinterten Larven auf der Weide sowie den hypobiotischen Larven im Wirt beeinflusst, sondern auch durch die Immunitätslage der Tiere sowie das Herdenmanagement (z.b. Besatzdichte). Der zweite Einflussfaktor ist die Immunitätslage der Herde. Es besteht sowohl eine erhöhte 29

30 Literaturübersicht Empfänglichkeit bei Mutterschafen während der Trächtigkeit und Laktation als auch bei allen Tieren, die unter Stress z.b. durch Umstallen oder qualitativ minderwertige Futtermittel stehen. Medikamentell kann der Einsatz von Glucokortikoiden durch Herabsetzen der Immunantwort eine Infektion begünstigen. Der dritte und wahrscheinlich häufigste Grund einer Weideinfektion ist das Aufbringen der Herde auf eine bereits kontaminierte Weide. Die Präpatenz ist abhängig von Alter, Geschlecht, Rasse und Immunstatus (GANTER 2001) Trichostrongylidosen Trichostrongylidosen sind weltweit verbreitete und häufig auftretende Weidehelminthosen. Sie kommen überwiegend als Mischinfektionen und Jungtiererkrankung vor, wobei sie sowohl als subklinisch-leistungsmindernde als auch in Form klinisch-manifester, akuter und chronischer Erkrankungen bei Absatzlämmern und Jungschafen von Bedeutung sind. Die Schwere der Erkrankung ist abhängig von Alter, Immunitätslage, Kondition der Schafe, Rassedisposition sowie der Infektionsdosis und der Spezieskombination. Klinisch werden bei den Tieren Gastroenteritiden mit teilweise hohen Leistungseinbußen diagnostiziert (ROMMEL et al. 2000; HIEPE et al. 2001; ECKERT et al. 2005; SCHNIEDER et al. 2006b) Cooperiose Durch die Gattung Cooperia verursachte Helminthosen treten meist in Form von Mischinfektionen z.b. mit Ostertagia (Teladorsagia) spp. auf, was eine wechselseitige Potenzierung des pathogenen Potenzials der beteiligten Spezies zur Folge hat (ROMMEL et al. 2000; SCHNIEDER et al. 2006b). Die L 4 sowie die Adulten siedeln sich in den Schleimhautkrypten des proximalen Dünndarms an, bei schweren Infektionen auch bis hinab ins proximale Ileum. Bei langer schwerer Infektion sammeln sich Adulte in Nestern auf der Schleimhaut (HIEPE et al. 2001). Die Dünndarmzotten sind pathologisch verändert, d.h. das Epithel ist abgeflacht, die Spitzen der Villi abgeschilfert oder in den Spitzen durch undifferenzierte Zellen ersetzt. Allgemein sind die Zotten verkürzt und verbreitert. Die Anzahl der Becherzellen ist erhöht und 30

31 Literaturübersicht verursacht eine vermehrte Schleimbildung. Lokal an den Ansatzstellen der Parasiten wird eine Hyperämie mit gelegentlicher Ödembildung durch den Verlust von Blut und Albumin induziert (ROMMEL et al. 2000). Durch die Zerstörung der Belegzellen steigt der ph-wert. Ein Überschuss an Gastrin verringert die Motilität des Gastrointestinal-Traktes (GIT) und verursacht Inappetenz. Durch die unausgereiften und undifferenzierten Zellen ist die Blut- Darmschranke in ihrer Funktion beeinträchtigt, was zu einer vermehrte Resorption von Pepsinogen führt. Folglich sind die Plasmaspiegel von Pepsinogen und Gastrin erhöht, der von Albumin durch die Hyperämie vermindert (HIEPE et al. 2001). Außerdem findet eine Verdickung der Schleimhaut durch die Ödembildung sowie eine Abnahme der Resorptionsfläche durch die Abschilferung der Villi im Darm statt. Gekennzeichnet ist die Cooperiose durch eine Enteritis mit vermehrtem Proteinverlust ins Darmlumen. Bei einer verminderten Futteraufnahme und erhöhter Stickstoffausscheidung über den Harn ist die Stickstoff-Retention herabgesetzt, und es kommt zu verminderten Gewichtszunahmen (COOP 1979). Klinische Symptome treten vorwiegend zwischen Juli und September auf. Die Symptome bei erkrankten Lämmern sind breiiger Kot bis hin zu schwerer Diarrhöe, Appetitlosigkeit und Minderzunahmen. Die Tiere sind fieberfrei, matt und werden teilweise exsikkotisch. Todesfälle sind selten und treten meist in Folge der hochgradigen Diarrhöe bei starken Primärinfektionen von Jungtieren auf (HIEPE et al. 2001) Haemonchose Der Erreger der Haemonchose bei Schaf und Ziege ist H. contortus. Generell tritt die Erkrankung bei Weidelämmern zum Sommeranfang auf. Die Infektion findet oral-alimentär statt. In der histotropen Phase, d.h. in der Entwicklungsphase der Larven in der Schleimhaut, treten wenig auffällige klinische Symptome auf (HIEPE 2006). Die L 4 siedeln sich in den Krypten des Labmagens an. Es entsteht eine Hypergastrinämie, die mit vermehrter Schleimbildung einhergeht. Kurz nach Infektionsbeginn sind die Plasmaspiegel von Natrium und Carbonat erhöht, während die Kalium- und Chloridspiegel erniedrigt sind. Der Sauerstoffpartialdruck im Blut sinkt. Zusätzlich kommt es zu Permeabilitätsstörungen, so dass die Anzahl der anaeroben Bakterien im Labmagen zunimmt und die Mikroflora im Labmagen 31

32 Literaturübersicht denen der Vormägen ähnelt. Der duodenale Chymusfluss ist gesteigert, die Wasserausscheidung im Kot vermindert. Im Plasma sind die Enteroglukagon-, Gastrin- und Pepsinogenspiegel durch die vermehrte Mukosapermeabilität erhöht (SCHNIEDER 2006b). In den hyperämischen und ödematösen Bereichen wie Falten und Rugae kann man in der Sektion weißliche Flecken oder Knötchen erkennen. Die Labmagendrüsen sind erweitert, das Epithel ist verändert und desquamiert. Durch zerstörte Belegzellen steigt der ph-wert (MERKELBACH 2000). Das wichtigste klinische Symptom ist anfangs eine normozytäre, hypochrome Anämie mit gesteigerter Erythropoese, die bei Eiweiß-Unterversorgung und langem, starkem Befall makrozytär werden kann. Makroskopisch ist in der Sektion eine allgemeine Blässe der Organe, hochrotes Knochenmark, an den Saugstellen im Labmagen rote Punkte und an der erodierten Schleimhaut Blutgerinnsel und Schleim zu erkennen. Der Blutverlust von ca. 50 µl pro Wurm und Tag verursacht eine gesteigerte Erythropoese sowie eine Leukopenie, insbesondere eine Lymphopenie. Außerdem tritt durch die Permeabilitätssörungen eine Hypoproteinämie in Form einer Hypalbuminämie auf (ROMMEL 2000). Durch die veränderte Mikroflora und teils durch H. contortus selbst werden die Proteine zu Ammoniak abgebaut. Der Stickstoff steht dem Wirt für die Aminosäurensynthese nicht mehr zur Verfügung. Essentielle Aminosäuren werden vom Körper für die Woll-, Milch- und Fleischproduktion benötigt. Stehen diese Aminosäuren dem Körper nicht in ausreichendem Maße zur Verfügung oder fehlen gänzlich, so kann es zu qualitativen und quantitativen Einbußen kommen. Ferner verringern die veränderten physiologischen Verhältnisse im Abomasum die Resorption aus der Nahrung und beeinflussen den Energiehaushalt negativ. Der Kot ist von fester Konsistenz und dunkel bis schwarz, verursacht durch erhöhtes Hämoglobin und Eisen im GIT. Die Tiere sind matt, appetitlos, ermüden leicht und sind leistungsschwach. Bisweilen lässt sich klinisch ein geringgradiger Ikterus, eine erschwerte Atmung und Ödeme im Kehlgang, an Triel und Unterbrust ( Flaschenbildung ) erkennen (GANTER 2001). Nach wochen- bis monatelangem Siechtum können die Tiere ohne Behandlung sterben. Bei infizierten Mutterschafen, die kurz vor der Geburt stehen oder in der Laktation sind, findet eine erhöhte Ausscheidung an MDS-Eiern statt, und es kann zu plötzlichen Todesfällen kommen. 32

33 Literaturübersicht Eine Immunität kann extrem unterschiedlich ausgebildet sein und sich erst nach dem sechsten Lebensmonat bei Lämmern bzw. sieben Wochen bei erstmals exponierten Schafen aufbauen und manifestieren. Bei manchen Rassen besteht eine genetisch bedingte stärkere Immunantwort gegenüber H. contortus, wobei keine negativen genetischen Korrelationen zu relevanten Leistungsmerkmalen beobachtet wurden. Die Heritabilität im weitesten Sinne gibt den Anteil der genetischen Varianz an der phänotypischen Varianz an. Immune Schafe haben bei einer Reinfektion eine Ansiedlungsrate von ca. 3,5 % (ROMMEL 2000). Ferner kann es bei Reinfektion mit H. contortus zum Selbstreinigungsphänom (self cure and protection) kommen. Durch Aufnahme einer großen Menge an infektiösen Larven kommt es zur Superinfektion, wobei die Adulten aus dem Labmagen entfernt werden und die Ansiedlung der aufgenommenen Larven behindert wird. Bei einer geringen Menge an aufgenommenen Larven findet eine Ansiedlung neben den Adulten statt. Ein weiterer Abwehrmechanismus kann die Inhibition der Entwicklung der L 4 sowie die Verhinderung einer vermehrten Eiausscheidung sein. Bei der Exklusion werden mehrere Mechanismen diskutiert. Zum einen ist eine allergische Sofortreaktion des Wirtes denkbar, zum anderen eine Blockade an der Schleimhautoberfläche des Labmagens, so dass die entscheideten L 4 sich nicht ansiedeln können. Eine andere Möglichkeit der Immunisierung ab dem sechsten Lebensmonat ist die Vakzinierung mit normalen oder durch Röntgenstrahlung vorgeschädigter L 3. Die Bildung einer Immunität wird durch die Behandlung der Tiere mit einem AH verhindert, danach sind die Tiere wieder voll empfänglich (COLES 2002) Ostertagiose Ostertagia (Teladorsagia) siedelt sich wie H. contortus in den Drüsen des Labmagens der Wirtstiere an. Infektionen mit Ostertagia spp. finden hauptsächlich im Spätsommer und Herbst, gelegentlich durch hypobiotische Larven im Frühjahr statt. Oft sind Mischinfektionen mit T. colubriformis zu beobachten (ROMMEL et al. 2000; ECKERT et al. 2005). In der Pathogenese unterscheidet man die histotrope Phase, die Luminalphase und die Reparationsphase. In der histotropen Phase dringen die entscheideten L 3 in das Lumen der Labmagendrüsen ein, es entstehen genabelte Knötchen von ca. 2 mm Durchmesser (ROMMEL et al. 2000). Die Salzsäure produzierenden Belegzellen in der Schleimhaut 33

34 Literaturübersicht werden durch undifferenzierte, nicht sezernierende Zellen ersetzt. Mit Größenzunahme des Parasiten werden auch die Nachbarzellen involviert, und bei starkem Befall entsteht auf der Schleimhaut ein kopfsteinpflasterartiges Aussehen. Es sind vorwiegend Lämmer betroffen, die nach Aufnahme einer großen Menge von L 3 nach einer verkürzten histotropen Phase von nur zehn Tagen (O. circumcincta) klinische Symptome zeigen (HIEPE et al. 2001). Die Luminalphase ist durch das Auswandern der Würmer aus den Drüsen bis zur Elimination der Adulten durch eine hyperplastische Gastritis gekennzeichnet. Die pathophysiologischen Veränderungen im Labmagen induzieren einen Anstieg des ph-wertes. Dies hat zur Folge, dass sich gramnegative und -positive Bakterien vermehren und eine Diarrhöe begünstigt wird. Die ph-wert-abhängige Aktivität von Pepsinogen zu Pepsin ist vermindert und beeinträchtigt die Eiweißverdauung. Die undifferenzierten Zellen in der Schleimhaut bedingen eine leichtere Passage von Makromolekülen durch die Interzellularspalte. Es findet ein endogener Proteinverlust ins Darmlumen statt, eine Hypalbuminämie entsteht. Im Blut sind die Plasmaspiegel von Pepsinogen und Gastrin erhöht (GANTER 2001). Die Folgen einer subklinischen Infektion bei Lämmern sind ein vermindertes Wachstum und Mineralisierung der Knochen. Es kommt zu Zwergenwuchs und Matrixosteoporose. Im Juli bis September kann man bei den Lämmern intermittierende, wässrige Diarrhöe feststellen. An anderen Tagen ist der Kot von breiiger oder nur leicht erweichter Konsistenz. Das ganze Hinterteil ist kotverschmutzt, oder zumindest das Perineum und die Schwanzbasis sind verdreckt. Klinisch stehen Mattigkeit, Appetitlosigkeit, Kachexie, Zwergenwuchs, herabgesetzte Zunahmen und eine verminderte Wollproduktion im Vordergrund. Unbehandelte Tiere können verenden (SCHNIEDER et al. 2006b). Eine Immunität kann sich in Abhängigkeit vom Genotyp der Schafe sowie der Wurmbürde nach einmaliger Infektion vier Wochen p.i. aufbauen. Bei einer Immunisierung der Lämmer verringert sich die Wurmbürde nach drei Monaten. Im ersten Drittel lagern sich Larven zu den Adulten an (Hyperinfektion), danach werden die Adulten im klassischen self cure von den anlagernden Larven eliminert. Nach 12 Wochen besteht das self cure and protection-phänomen. Die etablierten Würmer werden ausgeschieden, eine Neuansiedlung findet nicht statt. Bei immunen, entwurmten Mutterschafen scheint dieser Mechanismus außer Kraft gesetzt zu sein. Kommt es peripartal zu einer Belastungsinfektion, ist die 34

35 Literaturübersicht Eiausscheidung erhöht, die Wurmbürde wird nur langsam verringert, und die Larvenentwicklung ist ungehemmt (ROMMEL et al. 2000). Im Vordergrund stehen eher die subklinischen Verläufe, die eine Leistungseinbuße in der Nutzung der Schafe bedingen Trichostrongylose In gemäßigten Klimazonen gelten T. colubriformis und T. vitrinus als Erreger der Dünndarmtrichostrongylose des Schafes. Die Erkrankung tritt meistens im Herbst auf und verläuft häufig subklinisch (ROMMEL et al. 2000; HIEPE et al. 2001; SCHNIEDER et al. 2006b). Die infektiösen L 3 werden oral aufgenommenen und liegen im Epithel zwischen den Dünndarmzotten nahe der Zottenspitze. Die Folge ist eine Verkürzung bzw. ein Fehlen der Zotten. Die Krypten sind verlängert und dilatiert, die Mukosa verdickt. Der Bürstensaum ist reduziert, die Anzahl der Enterozyten vermindert. Die Bildung der Enzyme, die im Bürstensaum gebildet werden, wie alkalische Phosphatase, Leucinaminopeptidase und Maltase, ist herabgesetzt. Die undifferenzierten Enterozyten schilfern schneller ab, und es kommt zu kleinen Erosionen. Die Schleimhaut ist verdickt. Bei immunen Schafen befinden sich in sonst unauffälligen Bereichen napfartige Läsionen, die durch eine Schleimhautatrophie hervorgerufen werden.. Es findet ein Stickstoffverlust in Form von Plasmaprotein (Hypalbuminämie) und eine vermehrte Schleimsekretion in das Darmlumen statt. Durch den enteralen Proteinverlust kommt es zu Einbußen in der Gewichtszunahme, der Fleisch- und der Wollproduktion. Außerdem kommt es zur Beeinträchtigung des Energie- und Mineralstoffwechsels sowie zur Störung der Darmmotorik. Die motorischen Störungen verzögern die Entleerung des Labmagens und verringern die duodenale Durchflussrate. Die Knochen sind durch eine Hypophosphatämie in Länge, Gestalt und Volumen verändert sowie in der Mineralisation gestört (ROMMEL et al. 2000; ECKERT et al. 2005). Der klinische Verlauf ist meist chronisch und subklinisch. Symptome sind eine reduzierte Futteraufnahme, verlangsamtes Wachstum, Zwergenwuchs bis hin zu Knochenverformungen sowie schlechtes Wollwachstum und gelegentliche Diarrhöe (GANTER 2001). Die Immunitätslage ist abhängig von Genotyp, Geschlecht, Ernährungszustand und Alter der Schafe (ROMMEL et al. 2000). Eine vorher stattgefundene Schädigung und die damit 35

36 Literaturübersicht verbundene Wachstumshemmung kann nicht durch eine gebildete Immunität ausgeglichen oder aufgehoben werden. Je nach Infektionsalter tritt sie im Alter von fünf bis neun Monaten auf. Es gibt Tiere mit einem hohen immunologischen Potential (high responder) und mit einem niedrigen immunologischen Potential (low responder). Die high responder reagieren früher und stärker auf eine Infektion, die Heritabilität dieser Reaktion ist hoch. Die Immunität bedingt zunächst eine Exklusion der Larven, dann eine Elimination der Adulten. Die Weibchen scheiden weniger Eier aus, und die Anzahl der Männchen verringert sich in der Population. Die Ansiedlung der Larven wird in zwei Schritten verhindert. Zuerst wird eine immunologisch spezifische erste Phase ausgelöst, danach wird mittels chemischer Mediatoren ähnlich einer allergischen Sofortreaktion eine immunologisch unspezifische zweite Phase induziert (SCHNIEDER 2006b) Parasitenkontrolle Hohe wirtschaftliche Verluste und ein Fortschreiten der Resistenzentwicklung erfordern Maßnahmen zur Eindämmung und Verlangsamung der Ausbreitung von Resistenzen. So liegt neben dem Einsatz verschiedener Chemotherapeutika ein Schwerpunkt auf einem strukturierten Weidemanagement und der Entwicklung von Alternativen, wie z.b. Vakzinen oder Futtermitteln mit anthelminthischer Wirksamkeit gegenüber Nematoden (WEBER- WERRINGHEN 1987). Aus wirtschaftlichen und ökologischen Beweggründen heraus ist eine Maßnahme die Minimierung des AH-Einsatzes. Dabei ist nicht nur die Therapie allein von Bedeutung, sondern auch die Prophylaxe und die Metaphylaxe Haltungsformen und Weidemanagement In Deutschland sind hauptsächlich drei verschiedene Haltungsformen verbreitet. Man unterscheidet zwischen Koppelhaltungsbetrieben, standortgebundenen Hütehaltungsbetrieben und Wanderschäfereien (REHBEIN et al und 1998). Je nach Möglichkeit und Aufbau des Betriebes sind Kombinationen unter den einzelnen Haltungsformen zusammen mit oder vereinzelt ohne Stallhaltung im Winter möglich. BAUER et al. (1992) untersuchten mittels 36

37 Literaturübersicht einer Umfrage das Management verschiedener Schafherden in Deutschland und stellten signifikante Unterschiede in der Befallsintensität mit MDS zwischen Haltungsformen fest. Die Koppelschafhaltung ist als Halten von Schafen auf abgegrenzten, bewachsenen Flächen ohne ständige Aufsicht durch den Menschen definiert. Dies wird weiter differenziert in Standund Wechselweide. Die Standweide ist meistens stärker mit MDS kontaminiert als die Weidefläche bei einer Wechselweide oder Wanderschäferei (REHBEIN et al. 1998). Die Kontamination der Weide entsteht durch ausscheidende Muttertiere oder Überwinterung der Larven auf der Weide. Nach dem Winter infizieren sich die Lämmer, und Alttiere werden reinfiziert. Eine andere Haltungsform ist die Hütehaltung. Sie ergibt sich aus der Notwendigkeit, räumlich wechselnde und zum Teil weit auseinander liegende, nicht eingezäunte Weideflächen durch das Hinführen der Herde an das Futter bei zeitlich begrenzter Fresszeit unter ständiger Aufsicht durch den Menschen zu nutzen. Bei der standortgebundenen Hütehaltung werden die Tiere nachts in einem Schafstallersatz eingepfercht. Zumeist verweilen die Tiere je nach Besatzdichte zwei bis vier Tage auf einer Weide. Unter Hütehaltung wird auch die Beweidung marginaler Standorte wie etwa Naturschutzgebieten verstanden. Diese Form der Hütehaltung soll eine Reinfektion der Tiere beim Grasen sehr effektiv verhindern, weil 70 % der Kotmenge in der Nacht abgesetzt werden. In der Wanderschäferei werden die Tiere durch relativ große Gebiete getrieben und beinhaltet die jahreszeitliche Wanderung der Schafherde von einer Weide zur anderen. Hierbei findet zumeist keine Zweitbeweidung einer Fläche in einem Jahr durch die gleiche Herde statt. Nachts werden die Tiere zum Teil gepfercht, im Winter stehen meist nur kurzfristig gepachtete Scheunen zur Verfügung. Der Infektionsdruck in dieser Haltungsform ist deutlich geringer als in anderen Weideformen und entsteht meistens durch ausscheidende Tiere aus der Herde oder durch Kreuzung des Weges einer anderen infizierten Herde (ROHRSSEN 1987; ROMMEL 2000; ABBOTT et al. 2004; SCHNIEDER 2006b). Die Stallhaltung stellt für die Infektion mit MDS ein vergleichsweise geringes Risiko dar. Die Tiere fressen Heu, die Verteilung der Larven durch Umweltfaktoren wie Regentropfen ist verhindert, und die Entwicklung der MDS ist im Winter durch niedrige Temperaturen unterbrochen. 37

38 Literaturübersicht Das Weidemanagement hat einen maßgeblichen Einfluss auf den Infektionsdruck in einer Herde. Ziel ist es, durch eine optimale Nutzung der Fläche den Infektionsdruck durch parasitische Stadien zu minimieren. Allgemein sollten kleine Wiederkäuer im Frühjahr möglichst nicht auf kontaminierte Weiden ausgetrieben werden. Eine alternierende Nutzung der Weide, z.b. die Beweidung mit Rindern oder Pferden oder die Mähnutzung der Fläche zur Heugewinnung, senkt den Infektionsdruck. In der Pferdehaltung wird der Kot von der Weide abgesammelt, damit kann der Infektionsdruck auf der Weide deutlich reduziert werden. Diese Art der Weidepflege ist in der Schafhaltung nicht zu praktizieren, allerdings kann alternativ die Weide abgeschleppt werden. Jungtiere werden im Idealfall auf saubere Flächen ausgetrieben und alle 14 Tage ebenfalls auf saubere Flächen umgetrieben. Die Kontamination mit Nematoden wird durch die längere Präpatenz der Parasiten verringert bzw. verhindert. Die Nachteile bei dieser Art des Managements sind der hohe Zeit- und Flächenaufwand sowie die Einteilung der Flächen. Dieses Management ist nur bei großen Betrieben rentabel. Die Weide sollte der Größe der Herde entsprechen. Bei zu großer Besatzdichte wird das Gras bis auf die Narbe abgefressen und somit die maximale Menge an infektiösen Larven aufgenommen (MORLEY u. DONALD 1980). Eine Trennung der Herde in die verschiedenen Altersgruppen, um die verschiedenen Immunitätslagen auszunutzen, ist in der Schafhaltung nicht so effektiv wie in der Rinderhaltung und kommt nicht zum Einsatz (UNGEMACH 2003; SAMSON- HIMMELSTJERNA 2004) Anthelminthika und Einsatz Die wirtschaftliche Situation in der Schafhaltung beeinflusst maßgeblich den Einsatz von anthelminthischen Chemotherapeutika. Eine Kombination mit gutem Weidemanagement und Verringerung des Infektionsdrucks auf die Jungtiere ist wirtschaftlich unumgänglich. Der strategische Einsatz von AH als alleinige Maßnahme wird heute in Frage gestellt. Die Chemotherapeutika sollten als Metaphylaxe eingesetzt werden (ABBOTT et al. 2004). 38

39 Literaturübersicht Anthelminthika sind Chemotherapeutika zur Kontrolle und Verhinderung parasitärer Infektionen. Die Anzahl der zur Verfügung stehenden Präparate ist groß, allerdings stehen nur wenige Wirkstoffgruppen zur Verfügung. Die Einteilung erfolgt nach der chemischen Struktur und Wirkungsweise. Als AH stehen beim kleinen Wiederkäuer hauptsächlich fünf Wirkstoffgruppen zur Verfügung (ALI 1993) (s. Tab. 2.2): 1. (Pro-) Benzimidazole wie z.b. Albendazol, Fenbendazol oder Thiabendazol 2. zyklische Amidine wie Pyrantel und Morantel 3. Imidazothiazol wie Levamisol 4. makrozyklische Laktone wie Ivermectin, Doramectin und Moxidectin 5. Cyclooctadepsipeptide wie PF1022A und Emodepsid BROWN et al. (1961) entwickelten Anfang der sechziger aus der Gruppe der Benzimidazole (BZ) das Thiabendazol (TBZ). TBZ war effektiver und nicht so toxisch wie die bisher erhältlichen Substanzen (Kupfersulfat, verschiedene Arsenik-Verbindungen, extrahierte pflanzliche Alkaloide, Wurmfarn oder Phenothiazin) (SCHOLTYSIK 2002). Nach der ersten Entwicklung folgten weitere substituierte BZ. Der Wirkungsmechanismus der BZ basiert auf der Hemmung der Polymerisation von Tubulinmolekülen zu Mikrotubuli durch Blockade des β-tubulins. Zusammen mit dem α-tubulin wird die röhrenartige Mikrotubulistruktur in den Zellen der Parasiten und Wirte gebildet. Fehlt das Mikrotubuli werden wichtige Zellstoffwechselvorgänge wie z.b. der intrazelluläre Transport oder die Zellteilung nicht stattfinden, und es kommt zum Tod des Organismus. BZ haben ein breites Wirkungsspektrum gegen nahezu alle Nematodenarten und teilweise auch gegen Leberegel (Triclabendazol) (UNGEMACH 2003). Die Imidazothiazole und Tetrahydropyrimidine wie Levamisol (LEV), Pyrantel und Morantel sind weitere Gruppen mit einer breiten anthelminthischen Wirkung. Sie verursachen eine antagonistische Wirkung auf die nikotinergen Acetylcholinrezeptoren (ACh-Rezeptoren) und induzieren beim Parasit eine Depolarisation somatischer Muskelzellen mit folgender spastischer Paralyse. Die therapeutische Breite ist bei LEV sehr eng, und schon bei der 39

40 Literaturübersicht doppelten Gabe der therapeutischen Dosis können beim Wirt Nebenwirkungen auftreten (SCHAEFFER u. HAINES 1989; ARENA et al. 1995; SHOOP et al. 1995). Bei den makrozyklischen Laktonen (ML) werden zwei Gruppen unterschieden, zum einen die Avermectine und zum anderen die Milbemycine. Anfang der siebziger Jahre wurden die Milbemycine als Milben- und Pilzmittel von SANKYO (1967) entdeckt. Mitte der Siebziger wurde die anthelminthische Wirkung festgestellt wurde als erster Vertreter Ivermectin (IVM) für die Veterinärmedizin zugelassen. Makrozyklische Laktone binden selektiv an glutamatkontrollierte Chloridkanäle, erhöhen den Einstrom von Cl - -Ionen in Nerven- und Muskelzellen, hemmen dadurch die Erregungsleitung und induzieren eine Paralyse und damit den Tod der Parasiten (UNGEMACH 2003). Closantel aus der Gruppe der Salicylsäureanilide wird bei Schafen gegen adulte und larvale Stadien von H. contortus eingesetzt. Die Wirksamkeit ist auf H. contortus beschränkt. Es verursacht eine Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung und hemmt dadurch die ATP- Synthese. Zu den Cyclooctadepsipeptiden zählen das PF1022A und das Emodepsid. SASAKI et al. (1992) isolierten erstmals 1992 das Fermentationsprodukt PF1022A des Pilzes Mycelia sterilia, seit 1993 ist das semisynthetische Emodepsid bekannt. Emodepsid hat eine α-latrotoxin-ähnliche Wirkung und führt bei empfindlichen Nematoden zu einer Paralyse. Es kommt zur Immobilisation des Parasiten und zu einer verminderten Eiablage (WILLSON et al. 2004). Es kann bei vielen Tierarten gegen eine Vielfalt von Nematoden eingesetzt werden (CONDER et al. 1995; HARDER u. SAMSON-HIMMELSTJERNA 2002; JESCHKE et al. 2005). Ferner ist eine Wirkung bei BZ-, LEV- und IVM-resistenten H. contortus- Populationen und bei einem IVM-resistenten C. oncophora-stamm beschrieben (SAMSON- HIMMELSTJERNA 2005). Alle diese Gruppen sind gut wirksam gegen adulte Stadien der Nematoden. Durch die eingeschränkte Wirksamkeit von zyklischen Amidinen und Imidazothiazolen gegenüber hypobiotischen Larven ist der Einsatz in der peripartalen Behandlung nicht angeraten. Eine Nahrungskarenz der Tiere von 24 Stunden vor der anthelminthischen Behandlung erhöht den Wirkstoffspiegel im Blut und die Kontaktzeit des Wirkstoffes mit dem Parasiten (ROMMEL 2000). 40

41 Literaturübersicht Tabelle 2.2: Mittel gegen Nematoden nach ROMMEL et al. (1988) und ABBOTT et al. (2004) Wirkstoffgruppe Wirkstoffe Hauptindikation Benzimidazole Albendazol, Fenbendazol, Flubendazol, Mebendazol, Oxfendazol Magen-Darm-, Lungen- und andere Nematoden und Pro-Benzimidazole Febantel, Netobimin Cestoden Imidazothiazole Levamisol Magen-Darmund Lungennematoden Makrozyklische Laktone: Avermectine Milbemycine Doramectin, Ivermectin Moxidectin Nematoden und Ektoparasiten Cyclooctadepsipeptide Emodepsid Nematoden PF1022A Piperazin Piperazin Darmnematoden Pyrimidine Pyrantel, Morantel Nematoden Salicylsäureanilide Closantel Haemonchus contortus Bei dem Einsatz von AH sind einige Grundsätze zur Vermeidung von Resistenzen und zur Ausbildung einer optimalen Wirksamkeit zu beachten. Die vorgeschriebene Dosis des Herstellers ist einzuhalten. Die Dosierung richtet sich nach dem schwersten Tier in der Herde und nicht nach einem Mittelwert. Der Therapieerfolg sollte durch parasitologische Kotuntersuchung kontrolliert werden, um eine Resistenz frühzeitig festzustellen. Die Selektion von therapieresistenten MDS sollte durch effektiven Einsatz des AH vermieden werden. Es sollten nur die Tiere behandelt werden, die klinische Symptome aufweisen und am anfälligsten sind. So wird der Selektionsdruck auf die Parasitenpopulation verringert. Die Kontamination der Weide sollte durch ein den Möglichkeiten angepasstes Weidemanagement reduziert werden (ABBOTT et al. 2004). 41

42 Literaturübersicht Beim Weidemanagement werden zwei Systeme am häufigsten eingesetzt, eine etwas abgewandelte Form des Weybridger dose and move -Systems und das Glasgower Modell (SCHNIEDER 2006b). Bei dem dose and move -System (s. Abb. 2.4) werden die Muttertiere peripartal vor dem Austrieb mit einem AH, welches auch gegen hypobiotische Stadien wirksam ist, behandelt. Je nach Alter und Gewicht sind die Lämmer nur geringfügig gefährdet, weil die Tiere vor Anstieg der Larvenanzahl auf der Weide geschlachtet werden. Ansonsten werden die Lämmer Mitte Sommer vor jedem Umtrieb auf eine saubere Fläche oder Aufstallung zur Mast bei positivem koproskopischen Befund einmalig therapiert. Auf der neuen Weide werden aufgrund der Therapie weniger MDS-Eier ausgeschieden, und die Anzahl der infektiösen L 3 ist geringer und zeitlich versetzt zur alten Weidefläche. Auf der alten Weide besteht ein früher eintretender, höherer Infektionsdruck durch die vorherige vermehrte Eiausscheidung der Tiere und die damit verbundene höhere Anzahl an infektiösen L 3. Stehen nur kontaminierte Flächen im Mittsommer zur Verfügung, werden die Infektionen mit bis zu drei Behandlungen in dreiwöchigen Abständen bekämpft. Das dose and move -System (s. Abb. 2.5) ist in der Zwischenzeit umstritten und diskutiert. COLES et al. (2004) beschrieben, dass durch dieses System die Larven auf die neue Weidefläche verbracht werden, die die AH- Therapie überstanden haben und somit eine Selektion stattfindet (MOLENTO et al. 2004). Ein besseres System stellten ABBOTT et al. (2004) vor. Dabei wird move after dose praktiziert, wobei die Tiere nach der Behandlung auf der kontaminierten Weide gelassen werden, bis eine leichte Reinfektion stattgefunden hat. Erst danach findet ein Umtrieb auf geringer bis gar nicht belastete Weiden statt. Somit werden die neuen Weiden nicht ausschließlich mit selektierten MDS kontaminiert und einer schnellen Resistenzbildung wird vorgebeugt (SCHNIEDER 2006b). Das Glasgower Modell (s. Abb. 2.6) wird bei kontaminierten Flächen im Frühjahr verwendet. Die Muttertiere werden peripartal behandelt. Die Lämmer werden drei, sechs und neun Wochen nach Austrieb einer anthelminthischen Therapie mit BZ oder LEV unterzogen sowie 42

43 Literaturübersicht spätestens beim Absetzen und dann zwei- bis dreimal bis zum Herbst. Eine Aufstallbehandlung aller Tiere wird bei beiden Modellen empfohlen. Für Wanderschafe wird ebenfalls eine Behandlung beim Aufstallen sowie zweimal im Jahr im Mai/ Juni und im August/ September empfohlen (SCHNIEDER 2006b). Abbildung 2.5: Weybridger Dose-and-Move-System (EMERY u. WAGLAND 1991) Abbildung 2.6: Glasgower Modell (BENITEZUSHER et al. 1977) Alternative Bekämpfungsmaßnahmen Durch die zunehmenden Resistenzprobleme wird vermehrt an metaphylaktischen Maßnahmen wie z.b. einer Impfung gearbeitet und geforscht. EMERY und WAGLAND (1991), WALLER (1997) und GELDHOF et al. (2007) beschrieben drei Hauptziele einer Impfung: 43

44 Literaturübersicht Erstens soll die Weidekontamination verringert werden, um die Reinfektionsrate zu verkleinern. Zweitens soll ein ausreichender Schutz der empfänglichen Jungtiere gewährleistet sein. Drittens als wichtigster Punkt gilt, den Einsatz von AH zu minimieren. Um diese Ziele zu erreichen, nutzt man bei einer Impfung den natürlichen Aufbau einer Immunität bei Tieren, die über einen längeren Zeitraum Parasiten exponiert waren. Als Vakzinen werden Antigene virulenter Erreger, Totantigene auf nativer oder rekombinanter Basis oder Nukleinsäuren verwendet. Eine andere Variante der Immunisierung wurde mit röntgenattenuierten H. contortus- und T. colubriformis-larven beim Schaf durchgeführt (SMITH et al. 1980; ADAMS et al. 1988; NIEZEN et al. 1995; ECKERT 2005; BRUNET et al. 2008). Dabei wurde eine Reduktion der Infektion von über 80 % erzielt. Die gentechnologische Produktion protektiver Antigene ist problematisch (EMERY u. WAGLAND 1991) und Vakzinen daher bisher nicht realisiert. Die Herstellung von Vakzinen ist kosten- und zeitaufwändig. Hinzu kommt, dass ein Impferfolg erst bei Lämmern ab dem siebten Lebensmonat erreicht wurde. Vorrausetzung für einen Impferfolg ist die Empfänglichkeit des Tieres für den Erreger sowie keine vorherige parasitäre Exposition (ROMMEL 2000). Neben der Impfung werden nutritive Möglichkeiten erforscht. So wird dem Wirkstoff Tannin, der z.b. in Süßklee, Luzerne und Leguminosen enthalten ist, eine gewisse Wirkung zugesprochen, der die Wurmbürde verringert (GRAY 1987). Eine andere Alternative stellen nematophage Pilze dar. LARSEN (2006) beschrieb den Pilz Duddingtonia flagrans, dessen Sporen dem Futter zugesetzt werden, den GIT passieren und im Kot durch Ausbildung des Pilzmyceles die ausgeschiedenen Nematoden zerstört. Eine weitere Möglichkeit ist die Zucht von resistenten Schafrassen. ROMMEL et al. (2000) beschrieben die erfolgreiche Zucht von H. contortus unempfindlicheren Merinoschafen. Die selektive Zucht kann womöglich andere Parameter wie die Qualitätsmerkmale von Wolle und Fleisch in Mitleidenschaft ziehen. ABBOTT et al. (2004) beschrieben die Zucht von unterschiedlichen Schafrassen mit einer geringeren Eiausscheidung. Durch die minimierte Ausscheidung wird der Infektionsdruck gesenkt, und es findet eine verminderte Reinfektion statt. 44

45 Literaturübersicht 2.3 Anthelminthika Makrozyklische Laktone Allgemeines In den siebziger Jahren wurde die anthelminthische Wirkung der makrozyklischen Laktone (ML) erstmals festgestellt, 1981 wurde Ivermectin (IVM) für die therapeutische Verwendung in der Veterinärmedizin zugelassen. Makrozyklische Laktone haben ein breites Wirkungsspektrum, welches adulte und die meisten larvalen Stadien der Magen-Darm-Nematoden und Lungenwürmer umfasst. Die Effekte erstrecken sich bis auf verschiedene Ektoparasiten, so dass sie auch als Endectocide bezeichnet werden. Die ML werden aus zwei Hauptgruppen gebildet, aus den Avermectinen und den Milbemycinen. Avermectine sind natürliche Stoffwechselprodukte des Bodenorganismus Streptomyces avermitilis aus Japan. Die heutigen Präparate werden als mikrobielle Metaboliten in Fermentern gewonnen und partialsynthetisch präpariert. Es gibt vier chemisch sehr ähnliche Strukturen von Avermectin A1, A2, B1 und B2. Diese Analoga unterscheiden sich unter anderem in ihrer unterschiedlichen Wasserlöslichkeit. In der Veterinärmedizin sind aus der Gruppe der Avermectine Abamectin sowie die partialsynthetischen Verbindungen Ivermectin, Doramectin, Eprinomectin und Selamectin von Bedeutung (HUBERT et al. 1995; TAYLOR u. KENNY 1995). Neben den Avermectinen wurden 1983 von ONO et al. (1983) die Milbemycine entdeckt. Milbemycine sind Fermentationsprodukte des Strahlenpilzes Streptomyces cyanogriseus oder hygroscopius var. aureolacrimosus. Sie haben die gleichen strukturellen und chemischphysikalischen Eigenschaften, sowie das breite Wirkungsspektrum wie die Avermectine (STEEL 1993). Aufgrund der Unterschiede im pharmakokinetischen Verhalten besteht eine wesentlich längere antiparasitäre Wirkung (ALVINERIE et al. 1998). In der Tiermedizin sind Moxidectin, Milbemycin D und Milbemycinoxim von Bedeutung. 45

46 Literaturübersicht Im Folgenden wird aufgrund der Verwendung von IVM und MOX bei Schafen vorwiegend auf diese beiden Wirkstoffe aus dieser Gruppe eingegangen Chemische Eigenschaften Ivermectin (IVM) ist ein Derivat des halbsynthetisches Avermectin B1 und setzt sich aus 80 % 22,23-Dihydroavermectin B1a und 20 % 22,23-Dihydroavermectin B1b zusammen. Es ist ein weißes, stark lipophiles und hydrophobes Pulver mit sehr begrenzter Wasserlöslichkeit. In den meisten organischen Lösungsmitteln ist es gut löslich. Die Stabilität ist bei Raumtemperatur in nicht-sauren Lösungen vorhanden. Bei Beleuchtung mit UV-Licht zerfällt IVM. In Abbildung 2.7 sind einige Avermectine dargestellt. Moxidetin ist ein halbsynthetisches Milbemycin und wird durch natürliche Fermentation und chemische Synthese gebildet. Aus der natürlich produzierten Substanz Nemadectin wird durch chemische Modifikation MOX hergestellt (LANUSSE et al. 1997) und stellt das 23-(O-methyloxim)-Derivat dar. Durch eine ungesättigte Seitenkette an Position C25 und der fehlenden Disaccharid-Gruppe an Position C13 des Makrolidringes unterscheidet es sich von IVM, dadurch resultieren Unterschiede im physikalischen und pharmakokinetischen Verhalten (MCKELLAR u. BENCHAOUI 1996). MOX ist stärker lipophil als IVM und gut in organischen Lösungsmitteln löslich. Die Löslichkeit in Wasser ist nur gering, allerdings höher als die des IVM (SHOOP et al. 1995). Die molare Masse beträgt 639,82 g. In Abbildung 2.8 sind das chemische Grundgerüst der Milbemycine und die verschiedenen Reste zur Wirkstoffidentifikation dargestellt. 46

47 Literaturübersicht Avermectin B1a: R=CH3 Avermectin B1b: R=H Abbildung 2.7: Chemische Struktur von wichtigen Avermectinen Abbildung 2.8: Chemische Struktur von wichtigen Milbemycinen 47

48 Literaturübersicht Wirk- und Resistenzmechanismus Der Wirkungsmechanismus der ML ist noch nicht genau geklärt (UNGEMACH 2003; WOLSTENHOLME u. ROGERS 2005). Es wurde festgestellt, dass eine Erhöhung der Membranpermeabilität gegenüber Chloridionen an den Nerven- und pharyngealen Muskelzellen des Parasiten stattfindet (ARENA et al. 1995). Die ML binden hochaffin an Glutamat-gesteuerte Chloridkanäle (GluCl-Kanäle), die in großer Anzahl an der Pharynxpumpe und den somatischen Muskelzellen gelegen sind. Die GluCl-Kanäle öffnen sich langsam, meist irreversibel und erhöhen den Einstrom von Chloridionen in die Zellen. Es kommt zu einer Hyperpolarisation und herabgesetzten Erregbarkeit der Zellen (AVERY u. HORVITZ 1990). Die Folge ist eine schlaffe Paralyse der Pharynxpumpe und der Muskelzellen (GEARY et al. 1993; KOTZE 1998). Als erstes stellt sich die Pumpaktivität am Pharynx ein, da die Pharynxmuskulatur am empfindlichsten gegenüber ML ist (BROWNLEE et al. 1997; MARTIN 1997; UNGEMACH 2003). Erst bei viel höherer Dosierung sind Auswirkungen auf die somatische Muskulatur der Larvenstadien zu erkennen (GEARY et al. 1993; LANUSSE et al. 1997). Es wird vermutet, dass die Avermectine hauptsächlich die Nahrungsaufnahme verhindern und dadurch der Parasit verhungert (SANGSTER u. GILL 1999). Bei Überdosierung wird die inhibitorische Wirkung des Neurotransmitters GABA potenziert. Die GABA-Rezeptoren liegen an inhibitorischen Chloridkanälen von neuromuskulären Nervenzellen der Invertebraten und Neuronen des zentralen Nervensystems von Vertebraten (MCKELLAR u. BENCHAOUI 1996). MOX wurde eingesetzt bei IVMresistenten H. contortus-infizierten Tieren und konnte zum Teil noch eine effektive Wirkung vorweisen. Später fand man heraus, dass die Wirksamkeit von der verabreichten Dosierung beeinflusst wird und IVM und MOX die gleichen Wirkungsmechanismen besitzen (CONDER et al. 1993; RANJAN et al. 2002). Makrozyklische Laktone wirken nur auf Nematoden, da Trematoden und Cestoden keine GluCl-Rezeptoren besitzen und somit eine natürliche Resistenz gegenüber ML haben. Der Resistenzmechanismus von ML ist bis heute nur wenig untersucht. Unklar ist die Ursache einer Veränderung in den parasitären GluCl-Kanälen, den Hauptangriffspunkten (MARTIN, et al. 1997). Die GluCl-Kanäle bestehen aus fünf Untereinheiten. Es handelt sich dabei um 48

49 Literaturübersicht Proteine mit vier Transmembranregionen mit jeweils einem langen N-terminalen und einem kurzen C-terminalen, extrazellulären Abschnitt (MACDONALD u. OLSEN 1994). Untersuchungen ergaben, dass bei IVM-resistenten C. oncophora statt Phenyalanin Leucin im Codon 256 vorhanden ist (NJUE et al. 2004). Die Veränderungen in der Aminosäuresequenz verursachen nicht nur ein schlechteres Bindungsverhalten der ML, sondern auch ein verändertes Verhalten der Chloridionenkanäle (SAMSON-HIMMELSTJERNA 2004). Die Empfindlichkeit gegenüber ML nimmt ab (WOLSTENHOLME u. ROGERS 2005). Wahrscheinlich sind p-glykoproteine (P-gp) an der Entstehung von Resistenzen beteiligt (KERBOEUF et al. 2003). P-gp sind membranständige Transportproteine für xenobiotische Komponenten. Diese Proteine binden die ML und transportieren sie aus der Zelle. Genetische Studien lassen vermuten, dass P-gps eine Rolle bei der IVM-Resistenz von H. contortus spielen (SANGSTER u. GILL 1999). Die Aktivität von P-gp kann pharmakologisch beeinflusst werden durch einen Kalziumkanalblocker oder durch immunsupressive Substanzen. Zurzeit kann noch nicht mit Bestimmtheit gesagt werden, ob P-gp-Inhibitoren praktisch von Bedeutung werden (SAMSON-HIMMELSTJERNA u. BLACKHALL 2005) Pharmakokinetik Die Aufnahme, Verteilung und Persistenz der ML im Parasiten wird durch ihre Lipophilie bestimmt. ML sind stark lipophile Substanzen, die oral, parenteral oder topisch verabreicht werden. Nach der Aufnahme bestehen ein großes Verteilungsvolumen und eine Anreicherung hoher Konzentrationen hauptsächlich im Fettgewebe und in der Leber (ALVINERIE et al. 1998). So ist die MOX-Konzentration im Fettgewebe 28 Tage nach der Behandlung neunfach höher als im Plasma. Aus den Geweben findet eine langsamere Freisetzung statt und ermöglicht so eine therapeutische Dosis im Plasma über einen längeren Zeitraum. Da MOX deutlich lipophiler als die anderen MLs ist, findet eine noch stärkere Akkumulation im Fettgewebe statt und somit eine Verlängerung der Persistenzzeit (LIFSCHITZ et al. 1999; SCHOLTYSIK 2002). OOSTHUIZEN et al. (1993) und ALVINERIE et al. (1998) führten Untersuchungen zur subkutanen (s.c.) und oralen Verabreichung von MOX bei Schafen durch. Eine Stunde nach Applikation wurde im Plasma MOX nachgewiesen. Die Absorption findet bei oraler Gabe schneller statt als bei s.c.-injektion, jedoch ist bei s.c.-injektion die 49

50 Literaturübersicht Persistenzzeit im Körper wesentlich länger und somit die antiparasitäre Effizienz erhöht. Bei oraler Gabe werden höhere Maximalkonzentrationen in kürzerer Zeit im Plasma festgestellt. Die Bioverfügbarkeit liegt bei 40 %, der maximale Plasmaspiegel wird nach sechs bis acht Stunden erreicht. Bei IVM liegt die Bioverfügbarkeit bei intraruminaler Gabe gerade mal bei 25 %, wobei bei intraabomasaler Gabe 100 % erreicht werden, der maximale Plasmaspiegel wird erst nach ca. vier Tagen erreicht. Die Bioverfügbarkeit wird außerdem durch die Futterart und die Futtermenge besonders bei IVM beeinflusst. Durch die starke Bindung von lipophilen IVM an Futterpartikel wird empfohlen, weniger Futter für eine längere Ingestapassage zu geben. Die Empfehlung ist eine Nahrungskarenz von 24 Stunden vor und 12 Stunden nach Verabreichung der ML. Die Plasmahalbwertszeit von MOX liegt bei 81 Stunden und erklärt somit die lange Persistenz (SHOOP et al. 1995). Maximale Konzentrationen in allen Geweben, im Kot und in der Galle werden bereits innerhalb des ersten Tages nach Applikation erreicht (UNGEMACH 2003). MOX wird in die C und C 14 -Monohydroxymethyl-Derivate metabolisiert. Ein deutlicher Unterschied zwischen MOX und IVM ist die verlängerte Eliminationsphase von MOX (STEEL 1993; LANUSSE et al. 1997). Über die Fäzes werden nahezu 90 % des MOX in den ersten acht Tagen ausgeschieden (UNGEMACH 2003). IVM wird bis zu 50 % unverändert über die Galle oder direkt über das Blut mit dem Kot in den ersten vier Tagen nach Gabe ausgeschieden. Nur etwa 2 % werden über den Urin und bei laktierenden Tieren ca. 5 % über die Milch ausgeschieden (UNGEMACH 2003). Bei MOX bleiben die Wirkstoffkonzentrationen über 75 Tage über der Nachweisgrenze, bei IVM nur 40 Tage. Makrozyklische Laktone zeichnen sich durch eine sehr gute Verträglichkeit bei Wiederkäuern aus. Als Nebenwirkungen werden im therapeutischen Dosisbereich Irritationen beim pour on- Verfahren beobachtet. Zentralnervöse Störungen treten erst nach mehr als 30facher Menge (Rind) der therapeutischen Dosierung auf und äußern sich durch Somnolenz, Ataxie, Tremor, Salivation und Mydriasis (LACEY 1990a). Es besteht bei bestimmten Tierarten und rassen eine Unverträglichkeit. Eine Rassedisposition besteht bei Schäferhunden wie z.b. Collie, Australien Shepherd, Bobtail, etc. (NOLI 2005), ferner sollte MOX nicht bei Fohlen unter vier Monaten angewendet werden. 50

51 Literaturübersicht Benzimidazole Allgemeines Die Benzimidazole gehören zu den wichtigsten AH. Anfang der sechziger Jahre wurde das TBZ zum therapeutischen Einsatz auf den Markt gebracht. TBZ hat keine volle Wirksamkeit gegen alle Nematoden, das Wirkungsspektrum ist eingeschränkt. Durch Änderung der chemischen Struktur wurde die Resorption der BZ herabgesetzt und somit eine verlängerte Kontaktzeit mit dem Parasiten induziert. Therapeutische Bedeutung bekamen 5-Carbamatsubstituierte BZ wie z.b. Cambendazol. Neuere BZ wie Mebendazol, Fenbendazol, Oxfendazol und Flubendazol sind auch gegen Cestoden wirksam, Albendazol ist in höheren Dosierungen wirksam gegen die adulten Stadien von F. hepatica und D. dendriticum. Probenzimidazole wie Fenbantel sind Vorstufen der BZ, aus denen durch Biotransformation wirksame BZ entstehen (LANUSSE u. PRICHARD 1993) Chemische Eigenschaften Bei den chemischen Eigenschaften der BZ werden zwei Vertreter aus der Gruppe besprochen. Mebendazol (s. Abb. 2.9) ist ein weißes bis hellgelbes Pulver mit sehr geringer Löslichkeit in Wasser und den meisten organischen und anorganischen Lösungsmitteln. Thiabendazol (s. Abb. 2.10) ist ein weißes, geruch- und geschmackloses, lipophiles Pulver, welches schlecht löslich in Wasser und besser löslich in Alkohol ist. Abhängig von dem ph- Wert bestehen unterschiedliche Löslichkeiten. Die molare Masse beträgt 201,2 g/mol. Es wird oral verabreicht. 51

52 Literaturübersicht Abbildung 2.9: Chemische Struktur von Benzimidazolcarbamaten und Benzimidazolen Wirk- und Resistenzmechanismus Kennzeichnend für die BZ sind ihr breites Wirkungsspektrum, eine große therapeutische Breite und somit gute Verträglichkeit für den Patienten. BZ wirken selektiv auf die Tubuline im Parasiten und Wirtsorganismus und binden mit einer hohen Affinität an dem β-tubulin der Parasiten (LACEY 1990a; ROOS 1990; MARTIN 1997). Durch die Bindung von BZ an das β-tubulin wird die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli gehemmt. Mikrotubuli sind röhrenartige Strukturen, die sich aus α-tubulin und β-tubulin zusammensetzen. Sie sind am Aufbau des Zytoskeletts, des mitotischen Spindelapparates und von Zellfortsätzen beteiligt. Der intrazellulären Transport, Pinozytose und Exozytose, wird maßgeblich von ihnen reguliert. Zwischen dem Tubulin und Mikrotubuli besteht ein dynamisches Gleichgewicht, welches durch Regulatorproteine und Kofaktoren kontrolliert wird (UNGEMACH 2003). 52

53 Literaturübersicht Durch sogenannte Mikrotubulininhibitoren wird der Aufbau gehemmt, wobei gleichzeitig der Abbau von Mikrotubuli weiterläuft (LANUSSE u. PRICHARD 1993). Als Folge kommt es durch verringerte Glucoseaufnahme und verringerter mitochondrialer Aktivität zur verminderten Synthese von endogenem Glykogen und schließlich zur ATP-Verarmung. Die Wirkung tritt nur langsam ein und erfordert eine lange Kontaktzeit der BZ, die entweder durch eine Langzeitformulierung oder wiederholte Dosierung erreicht wird. Nach Erschöpfen der Energiereserven kommt es zum Absterben des Parasiten und zur Expulsion nach zwei bis drei Tagen (UNGEMACH 2003). Neben der Wirkung auf adulte Parasiten besitzen BZ auch eine ovizide und larvizide Wirkung. Diese beruht auf der Hemmung der Spindelbildung und Störung des Metabolismus während der Embryogenese. Der Resistenzmechanismus gegen BZ beruht auf einer molekularen Veränderung der β- Tubulin-Gens der Nematoden (ENOS u. COLES 1990; ROOS 1990; SAMSON- HIMMELSTJERNA 2004). Die Veränderungen am β-tubulin verändern die Anbindungsstelle und verhindern die Anbindungsfähigkeit der BZ an die Tubuline. Die Änderung der Aminosäuresequenz im Codon 200 des β-tubulin Isotyp-I-Gens, verursacht durch eine Punktmutation, induziert einen Austausch von Phenylalanin zu Tyrosin (KWA et al. 1994). Es ist bekannt, dass nicht nur das Codon 200, sondern auch andere Codons an der Resistenzsituation von BZ beteiligt sind (KWA et al. 1993; SAMSON-HIMMELSTJERNA 2004). Die Elimination von BZ aus den Zellen der Parasiten und somit die Entstehung einer Resistenz kann auch über die P-gp stattfinden. Dieses sind Transporterproteine, die BZ an sich binden und aus der Zelle transportieren (KERBOEUF et al. 2003) Pharmakokinetik Benzmidazole sind langsam wirksame AH, die oral oder direkt intraruminal verabreicht werden. Die Bioverfügbarkeit und anthelminthische Wirkung der BZ hängen von der Persistenz der Wirkstoffspiegel im GIT oder Plasma des Wirtes ab (PRICHARD et al. 1981). Thiabendazol ist relativ gut wasserlöslich und wird umfangreich enteral resorbiert und eliminiert. Die Kontaktzeit mit dem Parasiten ist ziemlich kurz. Somit ist die Wirksamkeit von TBZ von der erreichten Konzentration im Blutplasma abhängig. Viele der neueren BZ 53

54 Literaturübersicht sind schwerer wasserlöslich und lipophiler. Diese Modifikationen in der Struktur begünstigen eine längere Kontaktzeit mit dem Parasiten, aber auch einen langsameren Anstieg des Wirkstoffes im Plasma (LANUSSE u. PRICHARD 1993). Die bessere Wirksamkeit der BZ bei Wiederkäuern und Pferd liegt an der längeren Verweildauer im Pansen oder Caecum. Trotz der schlechten Resorption bestehen ein hohes Verteilungsvolumen und damit eine vergrößerte Resorptionsfläche, so dass noch therapeutische Konzentrationen in der Lunge erreicht werden. Durch den enteroenteralen Kreislauf der ebenfalls schwerer löslichen Metaboliten wird die Kontaktzeit der Parasiten in der histotrope Phasen in der Darmwand mit BZ verlängert. Die Ausscheidung erfolgt billiär, was die fasziolizide Wirkung von Albendazol bedingt. Durch diese kinetischen Eigenschaften sind die BZ nicht nur gegen adulte und zahlreiche larvale Stadien der Magen-Darm-Nematoden, sondern auch in der neuen Generation zuverlässig gegen inhibierte und histotrope Larvenstadien und extraintestinalen Helminthosen wirksam (UNGEMACH 2003). Thiabendazol wird zu 88 % aus dem Pansen resorbiert und innerhalb von 48 Stunden eliminiert. Nach vier Stunden werden im Plasma und im Abomasum Maximalwerte erreicht, die bereits nach 24 Stunden wieder sinken. Die Metabolisierung findet über eine Hydroxylierung, sowie eine Glukuronidierung in der Leber und Sulfatbildung statt. TBZ wird zu 90 % in konjugierter Form über die Niere, zu 5 % über die Fäzes und weniger als 1 % unverändert renal eliminiert (SCHOLTYSIK 2002; UNGEMACH 2003). Durch die schnelle Eliminierung aus dem Körper ist die Rückstandsbildung in den Geweben und die Ausscheidung über die Milch sehr gering (GUERRERO 1980; PRICHARD 1988). BZ sind nur geringgradig toxisch und allgemein sehr gut verträglich. Selbst die Gabe der acht- bis zehnfachen therapeutischen Dosis wird auch bei mehrmaliger Gabe ohne Nebenwirkungen vertragen. Bei den älteren BZ wie TBZ können eher Nebenwirkungen wie Benommenheit, Inappetenz, Erbrechen und vereinzelt Durchfall auftreten. Schon bei geringer Dosierung besteht eine embryotoxische Wirkung. Die Anwendung von BZ in Dauertherapie kann bei Zuchtböcken Störungen der Fertilität induzieren (UNGEMACH 2003). 54

55 Literaturübersicht Levamisol Allgemeines Levamisol gehört neben Tetramisol zur Gruppe der Imidazothiazole. Auch bei dieser Gruppe besteht ein breites Wirkungsspektrum. Tetramisol ist ein Racemat aus den beiden D- und L-Isomeren Dexamisol und LEV, welches zuerst als AH eingesetzt wurde. Man stellte jedoch fest, dass nur das linksdrehende LEV anthelminthisch wirksam ist. Durch den fehlenden Effekt von Tetramisol wurde es durch LEV auf dem Markt ersetzt. Aus diesem Grunde wird in diesem Kapitel nur auf LEV als Hauptvertreter der Gruppe eingegangen. Levamisol hat eine gute Wasserlöslichkeit und kann infolgedessen oral als Drench, sowie als Injektionslösung intramuskulär als auch s.c. oder in alkoholischem Lösungsmittel als Aufgusspräparat pour on verwendet werden. Es dient zur Bekämpfung von intestinalen und extraintestinalen Nematoden bei Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Geflügel und Tauben. Inhibierte Larvenstadien von Ostertagia spp. werden nur selten erreicht, eine ovizide Wirkung fehlt (MARTIN et al. 1997) Chemische Eigenschaften Das linksdrehende Isomer des Tetramisols LEV (Abb. 2.11) gibt es in Form von zwei Salzen, dem Levamisolhydrochlorid und dem Levamisolphosphat. Die Phosphatverbindung wird als Injektionslösung, die Hydrochloridverbindung für alle anderen Darreichungsformen verwendet. Beide Salze sind gut wasserlöslich. Sie sind von weißer bis blass cremefarbener Farbe, nahezu geruchlos und von kristalliner bzw. pulvriger Konsistenz. Die molare Masse liegt bei 204,75 g/mol, die Wasserlöslickeit bei 1 g LEV in 2 ml Wasser. Sie sind relativ stabil in sauren, wässrigen Lösungen. Es entstehen wasserunlösliche Metaboliten durch Hydrolyse im alkalischen Milieu (GUERRERO 1980; LANUSSE u. PRICHARD 1993). 55

56 Literaturübersicht Abbildung 2.11: Chemische Struktur von Levamisol Wirk- und Resistenzmechanismus Levamisol ist ein schnell wirkendes AH. Der Wirkungsmechanismus ist direkt cholinerg, der bei höherer Dosierung durch eine Hemmung der Acetylcholinesterase verstärkt wird. Die Bindungsstelle befindet sich an den nikotinergen ACh-Rezeptoren der somatischen Muskulatur (UNGEMACH 2003). Die Folge sind ein Depolarisationsblock in den Ganglien und eine daraus resultierende spastische Paralyse. Die nikotinartige Wirkung von LEV auf den Parasiten ist von der Höhe des Plasmaspiegels abhängig. Ob der Effekt reversibel oder irreversibel ist, hängt von der Parasitenspezies, dem Lebenszyklusstand und der Konzentration ab (GALTIER 1981). Levamisol wird auch immunstimulierende Eigenschaften zugesprochen. Dieser Effekt wird zur Wiederherstellung insbesondere einer ausreichenden T-Zellpopulation ausgenutzt (BOGAN et al. 1982). Der häufige Einsatz von LEV führte zu einer signifikanten Resistenzentwicklung. Der Resistenzmechanismus ist noch nicht genau geklärt (WOLSTENHOLME et al. 2004). Eine Resistenz gegenüber LEV induziert gleichzeitig eine Kreuzresistenz gegen andere nikotinerge Agonisten wie Pyrantel und Morantel (SANGSTER et al. 1998). Der Mechanismus beinhaltet eine verringerte Bindungsfähigkeit von LEV an ACh-Rezeptoren durch eine veränderte Rezeptorenstruktur (LEWIS et al. 1980). Die herabgesetzte Empfindlichkeit oder Resistenz des Parasiten gegenüber LEV wird mit einer Abnahme der Anzahl oder Empfänglichkeit der ACh-Rezeptoren in Verbindung gebracht (SANGSTER et al. 1988). Eingehende Untersuchungen an C. elegans ergaben eine mutiple genetische Resistenzbildung durch Veränderungen am ACh-Rezeptor (FLEMING et al. 1997). Wahrscheinlich wird die 56

57 Literaturübersicht Resistenz durch Änderung einer β-untereinheit hervorgerufen, wodurch die Ausbildung von bestimmten Subtypen des Rezeptors reduziert wird (ROBERTSON et al. 1999). Bei T. colubriformis ist die Resistenz an ein einzelnes, geschlechtsgebundenes Gen gekoppelt, bei H. contortus sind wahrscheinlich mehrere Gene beteiligt (SANGSTER u. DOBSON 2002). Andere Mechanismen und Unterschiede in den Arten sind noch unbekannt Pharmakokinetik Das kurz und schnell wirkende AH wird sowohl intestinal als auch parenteral gut resorbiert. Das Verteilungsvolumen ist sehr hoch, so werden hohe Konzentrationen im Bronchialschleim als auch in der Tränenflüssigkeit gefunden. Maximale Plasmakonzentrationen werden spätestens innerhalb einer Stunde unabhängig der Applikationsform beim Schaf erreicht (UNGEMACH 2003). Die höchsten intestinalen Konzentrationen werden beim Schaf nach oraler Applikation festgestellt. Die Metabolisierung findet in der Leber statt. Die Ausscheidung erfolgt über die Niere. Bereits 24 Stunden nach Applikation können bis zu 90 % der Dosis im Harn gemessen werden. Bei topischer Applikation können klimatische Einflussfaktoren die Wirksamkeit von LEV herabsetzen. LEV ist nur mäßig verträglich. Die therapeutische Breite ist sehr gering und bereits bei doppelter therapeutische Dosis können muscarin- und nicotinartige Nebenwirkungen auftreten. Es wirkt an der Injektionsstelle lokal reizend, und auch als Aufgusspräparat kann es Hautirritationen und Haarausfall verursachen (SCHOLTYSIK 2002). 57

58 Literaturübersicht Anthelminthikaresistenz Formen der Resistenz Eine Resistenz entwickelt sich als ein angeborener oder natürlicher Schutzmechanismus des Parasiten. PRICHARD et al. (1980) beschrieben mehrere Formen und unterschieden zwischen Resistenz, Nebenresistenz, Mehrfachresistenz und Toleranz. Resistenz ist definiert als Toleranz gegenüber der therapeutischen Konzentration eines Wirkstoffes von mehr Individuen einer Population als in einer sensiblen Population der gleichen Spezies. SANGSTER und GILL (1999) definierten AH-Resistenz in einer ursprünglich sensiblen Population als die Veränderung der Anzahl resistenter Allele durch Selektion. Eine Nebenresistenz ist definiert als die Resistenz eines Wirkstoffes durch die Resistenzbildung gegen einen anderen Wirkstoff mit dem gleichen Wirkmechanismus oder aus der gleichen Wirkstoffgruppe. So besteht eine Nebenresistenz zwischen IVM und MOX (CONDER et al. 1993). Nebenresistenz wird auch als Kreuzresistenz bezeichnet. Bei Mehrfachresistenzen bestehen bei einer Nematodenpopulation zwei oder mehr Resistenzen gegen unterschiedliche AH-Klassen durch unabhängige Selektion oder als Ergebnis von Kreuzresistenzen. Die Toleranz einer Nematodenart ist eine bereits vorhandene Eigenschaft ohne vorhergehenden Kontakt zu dem Wirkstoff und stellt eine grundsätzliche Unempfindlichkeit dar. Aus diesem Grunde sind neue Antiparasitika gegen einige Nematodenlarven gut wirksam, während sie andere wenig bis gar nicht beeinflussen (ECKERT 2005). Bisher sind drei unterschiedliche Mechanismen der Resistenz bekannt, die eine verminderte Wirksamkeit bis hin zum Fehlen der Wirksamkeit eines Wirkstoffes verursachen können. Eine Möglichkeit ist die Änderung der Bindungsstelle des Wirkstoffes (ROOS 1990). Eine andere Variante ist die Erhöhung der Eliminierungsrate des Wirkstoffes durch Membrantransporter aus der Zelle (KERBOEUF et al. 2003). Der dritte Mechanismus ist eine Erhöhung der Enzymaktivität und damit eine Steigerung des Entgiftungsprozesses. 58

59 Literaturübersicht Andere Einflüsse auf die Wirksamkeit von AH können eine Toleranz verursachen, die von der Resistenz abzugrenzen ist (CONDER u. CAMPBELL 1995). Ursachen für eine Toleranz können mangelnde Wirkstoffkonzentrationen, geschlechtsspezifische Unterschiede, verschiedene Sensibilität der einzelnen Entwicklungsstadien, geographische Unterschiede der Parasiten oder speziesabhängige Eigenschaften in verschiedenen Wirtstieren sein (SANGSTER u. GILL 1999) Häufigkeit und Verbreitung der Anthelminthikaresistenz Anthelminthikaresistenzen (AR) sind ein weit verbreitetes Phänomen. Die fortschreitende Entwicklung stellt ein großes Problem nicht nur in Hinblick auf Mensch und Wirtschaft, sondern vor allem für das Tier dar. Die Resistenzen sind tierartübergreifend und wurden sowohl bei Schafen (JACKSON u. COOP 2000; KAPLAN 2004) als auch in der Rinder- und Pferdehaltung (KELLY u. HALL 1979; MCKELLAR u. JACKSON 2004) beschrieben. Bei den Nematodenarten kleiner Wiederkäuer werden Resistenzen einzeln in allen AH-Gruppen beschrieben. Berichte aus Südafrika (VAN WYK et al. 1999) und Großbritannien (YUE et al. 2003) zeigen die Tendenz zu Multiresistenzen. KAPLAN et al. (2004) beschrieben die Problematik von Multiresistenzen auch im Südosten der USA. In Tabelle 2.3 sind einige Beispiele für Resistenzen aus den verschiedenen Ländern der Welt zusammengefasst Entstehung von Resistenzen Die Eigenschaft der AR wird in jeder Wurmpopulation genetisch vererbt. Durch eine anthelminthische Behandlung werden die sensiblen Parasiten eliminiert. Die Parasiten mit der angeborenen Toleranz verweilen im Wirt und pflanzen sich fort. Die erhöhte Toleranz wird vererbt, folglich steigt das Resistenzlevel der Population. Bei Erhöhung des Resistenzlevels werden die Behandlungsintervalle mit AH immer kürzer, um den gleichen anthelminthischen Effekt erzielen zu können. Durch weitere Behandlungen wird der Selektionsdruck gesteigert, und es entsteht eine Resistenz. Daraus resultiert, dass der Wirkstoff nicht mehr zur Therapie 59

60 Literaturübersicht eingesetzt werden kann. Die Geschwindigkeit einer Resistenzentwicklung ist erhöht, wenn die Resistenz nur an ein Gen gekoppelt ist und dominant vererbt wird. Weitere Einflüsse auf die Selektion sind der Zeitpunkt der Behandlung, die chemische Struktur, Wirksamkeit und Wirkungsdauer des AH, die Reproduktionsrate und Lebensdauer der Nematoden, die Überlebensstrategien in der Umwelt, die Neuinfektionsrate und das Weidemanagement (ECKERT 2005). Tabelle 2.3: Übersicht von Anthelminthikaresistenzen und die betroffenen Nematodenarten in einigen Ländern Land Nematodenart Anthelminthikum Referenz Australien Haem., Tricho., Ost. spp LEV (BARTON 1983) Schafnematoden TBZ, LEV (ANDERSON et al. 1988) Brasilien Tela. cirumcincta TBZ, IVM, LEV (AMARANTE et al. 1997) Dänemark O. circumcincta LEV (BJORN et al. 1991) Deutschland Magen-Darm-Nematoden TBZ, BZ, IVM, LEV (BAUER et al. 1988) (HERTZBERG u. BAUER 2000) Großbritannien Tela. sp. Multiresistenzen (YUE et al. 2003) Kenia H. c., Tricho. spp. BZ (MAINGI 1998) Neuseeland Tricho. spp. Ziege IVM (POMROY et al. 1992) Niederlande H. c. BZ (BOERSEMA 1982) Slowakei Ost., Tricho. spp. BZ, LEV (CORBA et al. 2002) Südafrika H.c. IVM, BZ (VAN WYK et al. 1999) BZ = Benzimidazole; IVM = Ivermectin; LEV = Levamisol; TBZ = Thiabendazol Haem. = Haemonchus; H.c. = Haemonchus contortus; Ost./O. = Ostertagia; Tricho. = Trichostrongylus; Tela. = Teladorsagia; spp. = Subspezies 60

61 Literaturübersicht Resistenzdetektion Zur Bestimmung von Resistenzen stehen in vivo- und mehrere in vitro-methoden zur Verfügung. Als in vivo-methoden gelten die Verfahren, die zunächst am lebenden Tier durchgeführt werden und oft in der Schlachtung der Tiere enden. Die Tiere werden innerhalb eines Tierversuches mit Nematodenlarven infiziert oder haben natürlich alimentär Larven aufgenommen. Nach Abschluss der Präpatenz werden die MDS-Eier aus dem Kot gewonnen, oder das Tier wird zur Gewinnung der Adulten geschlachtet. Dieses Verfahren ist kostenintensiv und zeitaufwendig, hat aber eine gute Genauigkeit in der Aussagekraft. Eine mögliche Alternative zum Tierversuch ist der Eizahlreduktionstest (EZRT). Bei diesem Test werden die ausgeschiedenen Nematodeneier im Kot gezählt und analysiert. Man geht davon aus, dass eine Korrelation zwischen der Eiausscheidung und der Wurmbürde besteht. Die Bestimmung der Eizahl pro Gramm (EpG) Kot wird vor und nach der Behandlung durchgeführt, so wird die Basis für eine Kalkulation des Behandlungseffekts gegeben. Allerdings ist der Test nicht sehr sensitiv und schwach in der Detektion niedriger Resistenzlevel (MARTIN et al. 1989). Eine verminderte Eiausscheidung mit z.b. IVM während der Therapie wird nicht berücksichtigt. Die Sensitivität der Population kann durch die vermeintlich verminderte Eiausscheidung nicht genau bestimmt werden (LEJAMBRE et al. 1995; MCKENNA 1997). Die in vitro-methoden sind kostengünstiger, weniger zeitintensiv und einfacher durchzuführen. Allgemein wird in allen Testverfahren eine isolierte Nematodenpopulation in einer Wirkstoffverdünnungsreihe inkubiert und später je nach Testverfahren einer Entwicklungsbestimmung oder Vitalitätsmessung unterzogen, um die Dosis- Wirkungsbeziehung zu ermitteln. LE JAMBRE (1976) beschrieb erstmals den Larvenschlupfhemmtest (LSHT) für BZ und LEV. Der Test stellte sich als ungeeignet für nicht ovizide Wirkstoffe und -gruppen wie Closantel und Avermectine heraus, da die Entwicklung vom Ei zur Larve gehemmt wird. Ein anderes in vitro-verfahren ist der Larvenentwicklungshemmtest (LEHT). Der Test ist auch für nicht ovizide AH geeignet und wird häufig verwendet. LACEY et al. (1990b) 61

62 Literaturübersicht modifizierten den LEHT, der als DrenchRite Assay (GILL et al. 1995) kommerziell erhältlich ist. Für den LSHT und den LEHT werden aus dem Kot die MDS-Eier isoliert. Demgegenüber stehen die in vitro-methoden, bei denen die Motilität der L 3 gemessen wird. Diese Tests wurden zur Bestimmung von Resistenzen bei BZ und ML entwickelt. Die Larven werden in Anwesenheit einer Wirkstoffverdünnungsreihe inkubiert, um danach die Motilität zu messen (MARTIN u. LEJAMBRE 1979; SUTHERLAND 1990). Die Auswertung erfolgt mittels elektronischer Detektoren, anhand der Migration durch Siebe (SANGSTER et al. 1988) oder durch Beobachtung (GILL et al. 1991). Um die Resistenzen bei adulten Nematoden zu detektieren, können das Micromotility meter (MMT) und der Muscle transducer (MT) verwendet werden (DEMELER 2005). Beim MMT wird die Bewegung von adulten Nematoden, die in einer Wirkstoffverdünnung inkubiert wurden, anhand eines Flüssigkeitsspiegels in einem Glasröhrchen gemessen. Der MT wird zur Messung von Kontraktionen der somatischen Muskulatur eingesetzt. Ein adultes Weibchen wird am Kopf mit einem dünnen Faden fixiert und mit dem Transducer verbunden. Die Fixation am Schwanz findet über eine Nadel statt. Nach Entnahme der inneren Organe wird der Wirkstoff appliziert, und die Kontraktionen werden über den Faden an den Transducer übertragen (SANGSTER et al. 1991). Molekularbiologische Tests eröffneten neue Möglichkeiten zur Detektion von Resistenzen. Die Verfahren gelten als sehr sensitiv. Voraussetzung für die Tests ist das Wissen über die genetische Basis der Resistenzmechanismen der Parasiten. Bei BZ ist der wichtigste Resistenzmechanismus bekannt. Trichostrongyliden von Wiederkäuern und Pferden werden anhand einer Polymerasenkettenreaktion-Analyse (PCR-Analyse) untersucht. Die BZ- Resistenz basiert hauptsächlich auf einem Polymorphismus im Codon 200 des β-tubulin- Gens, dem Wechsel von Phenylalanin zu Tyrosin (KWA et al. 1994; HUMBERT et al. 2001; SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. 2002). Eine weitere Ursache wird in einem Polymorphismus des β-tubulin von Codon 167 und 198 vermutet (PRICHARD u. TAIT 2001). SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. (2003) entwickelten eine andere Methode basierend auf der real-time PCR. Untersuchungen mit der Pyrosequencing TM -Technik sind innerhalb einer Stunde durchführbar und haben den Vorteil gegenüber Mutationen tolerant zu sein (LOTSCH et al. 2003; SAMSON-HIMMELSTJERNA u. BLACKHALL 2005). 62

63 Literaturübersicht 2.4 Wissenschaftliche Methoden Um die Tests international zu standardisieren, brachte die World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P) eine Zusammenfassung und genaue Anleitung der verschiedenen Methoden heraus (POWERS et al. 1982). Die Methoden werden regelmäßig kontrolliert, überarbeitet, ergänzt und neu publiziert (COLES et al. 1992; WOOD et al. 1995; COLES et al. 2006) In vivo-versuche Es sind zwei in vivo-methoden durchführbar, zum einen die post mortem Untersuchung nach der Behandlung mit AH und zum anderen die Bestimmung der EZR vor und nach der Behandlung mit AH als EZRT Eizahlreduktionstest Der Eizahlreduktionstest (EZRT) wurde von WHITLOCK et al. (1980) eingeführt. Es ist ein einfaches Verfahren ohne große Stresssituationen, welches sehr häufig eingesetzt wird. Der Test ist für Wiederkäuer, Schweine und Pferde, die Eier über den Kot ausscheiden, anwendbar und mit allen AH durchzuführen (COLES et al. 1992). Bei dem Test werden die EpG Kot vor und nach der anthelminthischen Behandlung ermittelt. Die Bestimmung der EpG erfolgt z.b. mittels eines Flotationsverfahrens mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (NaCl) in modifizierten McMaster-Kammern nach WETZEL (1951). Im Idealfall bleibt eine Tiergruppe als Kontrollgruppe unbehandelt, welches in der Praxis teils nicht praktikabel ist, um Schwankungen in der Eiausscheidung während der Versuchsperiode festzustellen. In jeder Versuchsgruppe sollten mindestens sieben bis zehn Tiere untersucht werden (PRESIDENTE 1985). Die Richtlinien beinhalten eine genaue Anleitung des EZRT für kleine Wiederkäuer. Die Wurmbürde der Tiere sollte ein EpG > 150 nicht unterschreiten, da sonst die Eizahl zu niedrig ist und eine genaue Resistenzbestimmung über den EZRT nicht mehr gegeben werden kann (JOHANSEN 1989; MARTIN et al. 1989). Die Tiere sollten acht 63

64 Literaturübersicht bis zwölf Wochen vor dem Test nicht anthelminthisch behandelt werden und die rektal entnommene Kotmenge mindestens 5 g betragen. Diese Richtlinien sind in der Praxis teils nur schwer einzuhalten, da sie vom Alter der Tiere (Lämmer) und dem Ausscheidungsintervall der Parasiten abhängt. Bei der oralen Therapie sollte die vom Hersteller empfohlene Dosierung eingehalten werden, bemessen entweder individuell nach jedem Tier oder nach dem schwersten Tier aus der Herde. Die zweite Probennahme findet Tage nach der Behandlung statt (COLES et al. 1992). Zur Berechnung der Eizahlreduktion (EZR) gibt es unterschiedliche Methoden. COLES et al. (1992) empfahlen in den Richtlinien die prozentuale Berechnung der EpG mit Einbeziehung der Kontrollgruppe. Dabei werden die arithmetischen Mittel der behandelten Gruppen und der unbehandelten Gruppe in Beziehung gesetzt. PRESIDENTE (1985) berechnete die EZR, indem er die Differenz von Tag 0 und 14 einer Gruppe ermittelte und die geometrischen Mittel der beiden Gruppen untereinander in Beziehung setzte. DASH et al. (1988) berechneten die EZR wie PRESIDENTE (1985) nur unter Verwendung des arithmetischen Mittels statt des geometrischen Mittels. KOCHAPAKDEE et al. (1995) bezogen in ihren prozentualen Berechnungen der EZR sowohl das arithmetische als auch das geometrische Mittel ein. Eine Resistenz liegt vor, wenn die EZR < 95 % ist und das untere 95 % Konfidenzintervall (uci) < 90 % ist. Nur beide Kriterien zusammen bestimmen eine Resistenz (COLES et al. 1992). Bei dem EZRT ist eine Differenzierung der einzelnen MDS schwierig bis gar nicht möglich, so wird eine Differenzierung der Larven aus dem Kot nach Ansetzen einer Larvenkultur mittels verschiedener Verfahren empfohlen (JOHANSEN 1989; TAYLOR et al. 2002). Die Ergebnisse des Testes liefern qualitative Aussagen über eine Resistenz. Die Sensitivität liegt zwischen 50 % und 75 %, liegt die Resistenzrate unter 25 % in einer Population, kann dies nicht mehr mit dem EZRT erfasst werden (MARTIN et al. 1989). In der Zwischenzeit wird öfter diskutiert, dass die Effizienz eines AH mit diesem Test nicht genau erfasst wird, da er intermittierende Ausscheidungsraten der Adulten z.b. durch Behandlung mit IVM nicht einbezieht und die Eiausscheidung mit der Wurmbürde nicht immer korreliert (TAYLOR et al. 2002). Die Ergebnisse bei einer H. contortus-infektion sind gut, da die Eiausscheidung 64

65 Literaturübersicht sehr hoch ist, die Korrelation bei T. colubriformis (SANGSTER et al. 1979) und T. circumcincta ist eher schlecht (MARTIN et al. 1985) Tierversuch Die Tiere werden mit einer für jede Parasitenart bestimmten Dosis an infektiösen Larven infiziert. Nach der Präpatenz werden die Versuchstiere entweder gar nicht oder mit unterschiedlichen Therapiedosen behandelt und ein EZRT wird durchgeführt. Die Tiere, die nicht behandelt werden, dienen der Passagierung der Nematodenpopulation. Zur Passagierung der Nematoden werden die Versuchstiere mit einem bestimmten Nematodenstamm infiziert. Nach der Präpatenz wird der Kot gesammelt, und es werden Larvenkulturen angesetzt. Aus diesen Kulturen werden die Larven gewonnen und bei der Passagierung für eine nächste Infektion asserviert. Zur Gewinnung der adulten Stadien werden die Tiere nach der Präpatenz der Nematoden getötet, der ganze Körper des Tieres oder die Zielorgane von den Parasiten schnellstmöglich entnommen und die Nematoden gewonnen. Der Tierversuch ist teuer, arbeits- und zeitintensiv In vitro-versuche Es werden zwei in vitro-verfahren beschrieben, zum einen der LSHT und zum anderen der LEHT Larvenschlupfhemmtest LE JAMBRE (1976) beschrieb erstmals den Larvenschlupfhemmtest (LSHT). Die isolierten Eier der zu untersuchenden MDS wurden in einer Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 26 C bis zum Beginn des Larvenschlupfes mit verschiedenen Konzentrationen der oviziden Testsubstanz inkubiert. Zeitgleich wurde eine Negativ- und Positivkontrolle durchgeführt. Waren alle Larven in den Negativkontrollen geschlüpft, wurde der Test durch Töten aller 65

66 Literaturübersicht Stadien gestoppt. Zur Auswertung wurde das Verhältnis der ungeschlüpften Eier zu den Larven in den einzelnen Vertiefungen mit den unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt. Auf der Basis dieses Testes wurden andere Ansätze aufgebaut. Zur Bestimmung der Resistenz von LEV und auch von anderen Wirkstoffen wie z.b. TBZ ist ein genauer Zeitplan aufgrund der Verwendung von frisch isolierten Eiern notwendig, (DOBSON et al. 1986). Durch die Verwendung von Nematodeneiern ist dieser Test zur Bestimmung eines Dosis- Wirkungsverlaufs bei nicht ovizider AH wie ML ungeeignet (COLES et al. 1988). Zur Detektion von BZ-Resistenzen bei H. contortus wurde der LSHT modifiziert (JOHANSEN 1989). Die Sensitivität des Tests liegt zwischen 50 % und 75 % (MARTIN et al. 1989). Zur Verhinderung der Embryonierung werden unembryonierte Nematodeneier sofort oder innerhalb von 24 Stunden unter aeroben Bedingungen aus dem Kot isoliert und für den Test verwendet. Unter anaeroben Bedingungen kann man die Proben bis zu sieben Tage lagern. Sind die Nematodeneier embryoniert, sinkt die Sensitivität gegenüber TBZ und anderen Wirkstoffgruppen (WHITLOCK et al. 1980; HUNT u. TAYLOR 1989). Mit Hilfe der Probitanalyse wird die effektive Konzentration 50 (EC 50 ) berechnet, bei der mindestens 50 % der Larven nicht geschlüpft sind. Anhand von Grenzwerten ist die AH- Resistenz definiert. Hierfür liegen verschiedenen Werte bei Schafnematoden vor. COLES et al. (1992) beschrieben hierfür einen Wert von 0,1 µg TBZ / ml, HUBERT u. KERBOEUF (1992) beschrieben einen Wert von 0,02 µg TBZ / ml und VARADY et al. (1995) beschrieben einen Wert von 0,02-0,03 µg TBZ / ml. Die unterschiedlich beschriebenen Grenzwerte lassen sich auf unterschiedliche Versuchsprotokolle zurückführen. Durch das Auftreten von Nebenresistenzen geht man davon aus, die Ergebnisse des LSHT mit TBZ auf andere BZ übertragen zu können (JOHANSEN 1989) Larvenentwicklungshemmtest Beim LEHT wird der Einfluss verschiedener AH-Konzentrationen auf die Entwicklung der Nematodeneier, sowie der L 1 und L 2 zur infektiösen L 3 gemessen. Bei diesem Verfahren können mehrer AH parallel untersucht werden (GILL et al. 1995; VARADY u. CORBA 1999). Nach fünf bis sieben Tagen Inkubation werden die Entwicklungsstadien in den verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen differenziert und ausgezählt. Eine Resistenz liegt 66

67 Literaturübersicht vor, wenn sich 50 % der Eier bzw. der Larven zur infektiösen dritten Larve weiterentwickelt haben (COLES et al. 1988). Ein großer Vorteil dieses Testes ist die Möglichkeit auch embryonierte Eier zu verwenden, was den Einsatz in der Praxis bei Felduntersuchungen erleichtert (CONDER u. CAMPBELL 1995; COLES et al. 2006). Im LEHT werden den L 1 hitzebehandelte Escherichia coli (E. coli) als Nahrungsquelle zugefügt, um eine Kultivierung bis zur L 3 zu erreichen (HUBERT u. KERBOEUF 1992). Eine andere Möglichkeit der Nahrungszufuhr für die Larven ist der Zusatz von Hefeextrakt (TAYLOR 1990). Eine weitere Modifikation des LEHT war die Durchführung auf einer Mikrotiterplatte basierend auf einer Agarmatrix, die mit Wirkstoff versehen ist und als Auflage den Nematodeneier dient (LACEY et al. 1990b). HUBERT und KERBOEUF (1992) setzten dem Test ein Gemisch aus Earle s balanced salts, Hefeextrakt und Bakterien zu. Mit Hilfe der Probitanalyse wird der EC 50 -Wert berechnet, bei dem mindestens 50 % der Eier und Larven sich nicht zu infektiösen dritten Larven entwickelt haben. Anhand von cut off- Werten ist die AH-Resistenz definiert. Hierfür beschrieben HUBERT u. KERBOEUF (1992), VARADY et al. (1999) und COLES et al. (2006) bei Schafnematoden einen Wert von 0,5 µg LEV / ml Molekularbiologische Verfahren Zu den molekularbiologischen Verfahren zählen unter anderem die PCR, der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, sequenzspezifische Primer und die real-time PCR. Für diese Untersuchungen wird genetisches Larvenmaterial der zu untersuchenden Feldstämme benötigt. Molekularbiologische Verfahren haben den Nachteil, dass für die Durchführung mehrere Schritte benötigt werden und sie sehr arbeitsaufwendig sind. Die Gefahr von Kontaminationen ist hoch, falsch positive als auch falsch negative Resultate sind denkbar. Eine Quantifizierung ist nur bedingt möglich. Mit der Echtzeit-PCR oder auch realtime PCR hat man ein Verfahren entwickelt, das diese Nachteile umgeht. 67

68 Literaturübersicht Real-time PCR zur Larvendifferenzierung Die real-time PCR bildet ein geschlossenes System, kann in einem Schritt durchgeführt werden und bietet durch die Auswertung mittels spezieller Software die Möglichkeit, die Ausgangsmenge an DNA zu ermitteln. Die PCR basiert auf der Markierung der DNA mittels Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Sonden, die hochspezifisch an das amplifizierte DNA-Fragment binden. Durch die Bindung werden Fluoreszenzen freigesetzt, wobei die Intensität der Fluoreszenz in direktem Zusammenhang mit der vorliegenden Menge an DNA steht. Es werden mehrere Durchläufe bei unterschiedlichen Temperaturzyklen gemacht. Der Nachweis eines Gens ist umso einfacher, desto häufiger es im Genom des Parasiten vorhanden ist. Die entsprechenden Sequenzabschnitte der Gene von H. contortus, O. leptospicularis, T. colubriformis und C. curticei sind bekannt und werden tierartübergreifend zur Identifizierung von Nematodengattungen eingesetzt (SAMSON- HIMMELSTJERNA et al. 2003). Bei der real-time PCR wird während jedem Zyklus die Fluoreszenz der spezifischen Sonden und die Hintergrundfluoreszenz gemessen. Ein Vielfaches der Hintergrundfluoreszenz wird als Schwellenwert (c t -Wert), dem sog. Threshold, der Berechnung der Ziel-DNA-Menge zugrunde gelegt. Entscheidend ist, in welchem Zyklus der Probe dieser c t -Wert überschritten wird, um diesen c t -Wert mit den c t -Werten von Standardkonzentrationen zu vergleichen und die Ausgangskonzentration zu berechnen. Vorteil dieses Verfahren ist neben dem geringen Zeitaufwand ein hoher Probendurchsatz. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. zeigten 2002, dass eine Bestimmung der wichtigsten Trichostrongyliden der Wiederkäuer über gattungsspezifische Primer und Sonden mittels realtime PCR möglich ist Nachweis von Resistenzgenen gegen Anthelminthika in Nematoden Zur Bestimmung von Resistenzgenen wird die Pyrosequenzierung verwendet. Hierbei wird wie bei der Kettenabbruch-Synthese (SANGER et al. 1977) die Fähigkeit der Polymerase genutzt, DNA abzulesen. Die einsträngig vorliegende DNA wird mittels DNA-Polymerase kopiert. Bei der Pyrosequenzierung werden zu der DNA passende Nukleosidtriphosphate in die Lösung gegeben und von der Polymerase als Nukleotide an den neusynthetisierten DNA- 68

69 Literaturübersicht Strang angehängt. Unter Beteiligung von dem Enzym Luziferase entsteht bei Einbau eines passenden Nukleotids ein Lichtsignal, das an einem Detektor gemessen wird. Die Stärke des Lichtsignals ist proportional zu der Anzahl der angeknüpften Nukleotide. Besteht eine Mutation an der DNA und es ist kein passendes Nukleotid in der Lösung vorhanden, bleibt das Lichtsignal aus. Die Pyrosequenzierung wird zur Bestimmung von einfachen Genmutationen, sog. single nucleotide polymorphisms verwendet (RONAGHI 1999). LOTSCH et al. (2003) entwickelten eine Pyrosequenzierungsmethode, die drei Mutationen gleichzeitig bestimmt. Dabei werden Nukleosidtriphosphate in die Lösung gegeben, die nur zu bestimmten Mutationen auf der DNA passen. Wenn eine Mutation vorhanden ist, entsteht durch die Umsetzung von Luziferase ein Lichtsignal, welches in der Auswertung als Peak dargestellt wird. Auf diese Weise ist die Detektion von mehreren Mutationen an einem DNA- Strang möglich. 69

70 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1 Material Chemikalien Cydectin 0,1 % orale Lösung Amphotericin B, gelöst (A9528) Thiabendazol 99 % (T8904) Ivermectin (I8898) Levamisol (L9756) Dimethylsulfoxid (DMSO) 99,5 % (A994.2) Natriumhypochlorid 12 % Cl - Difco Bacto TM -Agar 2 % Earle s balanced salt solution 10x (E7510) Forte Dodge, Würselen Sigma, Steinheim Reinsubstanz Sigma, Steinheim Reinsubstanz Sigma, Steinheim Reinsubstanz Sigma, Steinheim Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Beton, Dickinson & Company, Detroit, Michigan, USA Sigma, Steinheim Puffer und Lösungen Ampuwa Hefeextrakt (2363.1) 1g Hefe auf 90ml 0,9 % NaCl Lugol sche Lösung (2 %) (L6146) 4 Teile KI, 2 Teile J, 94 Teile aqua dest (Ph. Helv. VII) Natriumchloridlösung, gesättigt Zuckerlösung, gesättigt Fresenius, Bad Homburg Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe 100 % NaCl in H 2 O 60 % Zucker in H 2 O E. coli-suspension /ml eigene Herstellung Enzyme Silverstar Polymerase Surestart TM Polymerase EuroGen Tech, Brüssel, Belgien Stratagene, La Jolla, USA 70

71 Material und Methoden Proteinase K Mackarey und Nagel, Düren Kits NucleonSpin Tissue Kit Brilliant QPCR Core Reagent Kit Mackarey und Nagel, Düren Stratagene, La Jolla, USA Im Anhang 10.1 befindet sich eine Auflistung Einwegartikel, Mehrwegartikel, technischen Geräte sowie der verwendeten Software. 3.2 Methoden Die Arbeit unterteilt sich in eine Datenerhebung mittels Fragebogen, einen Feldversuch mit MOX und in vitro-untersuchungen mit LEV und TBZ Auswahl der Betriebe Die Betriebe wurden nach ihrerer Bestandsgröße von den Tierärzten der Gesundheitsdienste ausgewählt und zur Teilnahme motiviert. Als Anforderung an die Betriebe war eine Mindestanzahl von 300 Muttertieren in der Herde gefordert, um Daten professioneller Schäfereien für die Studie zu erhalten. Es wurden fast ausschließlich Vollerwerbsbetriebe beprobt. An der Studie beteiligten sich Schafgesundheitsdienste aus sieben Bundesländern. Bei mindestens sieben, maximal dreizehn Betrieben in den Bundesländern wurden durch die Tierärzte der Schaf- und Ziegen-Gesundheitsdienste (SZGD) oder der Tiergesundheitsdienste (TGD) Kotproben genommen. Insgesamt wurden Proben von 1035 Lämmern aus 69 Betrieben untersucht. Die Lämmer gehörten verschiedenen Rassen an. 71

72 Material und Methoden Datenerfassung In den ausgewählten Betrieben, die sich an der Studie beteiligten, wurde eine Datenerhebung mittels Fragebogen (s. Anhang 10.2) durchgeführt. Die Erhebung der Daten fand durch die Tierärzte der SZGD / TGD statt. Im Rahmen dieser Befragung wurde nicht auf Einzeltiere (Böcke, Mastlämmer) eingegangen, welche außerhalb des Herdenverbands gehalten wurden. Der Fragebogen war in drei Bereiche gegliedert, wobei ein besonderes Augenmerk auf dem Entwurmungsmanagement lag. Der erste Teil befasste sich mit der Betriebsart. Im zweiten Teil wurde auf die Haltungsform eingegangen, um mögliche Einflüsse durch verschiedene Haltungsbedingungen zu evaluieren. Der dritte Teil befasste sich mit dem Entwurmungssystem. Dabei lag ein besonderes Augenmerk auf dem Management sowie auf den eingesetzten Anthelminthika (AH). Dies sollte Aufschluss über die Handhabung und Dosierung der Präparate geben. Zusätzlich wurde nach Ergebnissen früherer parasitologischer Untersuchungen oder bekannten Resistenzproblematiken gefragt Auswertung des Fragebogens Die Daten der ausgefüllten Fragebögen wurden tabellarisch eingegeben, um eine anschließende statistische Auswertung mittels SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) durchzuführen. Von allen Messwerten wurde eine deskriptive Statistik erstellt. Als Lagemaß wurde der arithmetische Mittelwert und als Streuungsmaß die Standardabweichung berechnet; zusätzlich wurden Minimum, Maximum zur Erstellung eines Betriebsvergleichs und die Anzahl der vorhandenen Antworten für die statistische Aussagekraft des Fragebogens ermittelt. Beim Wirkstoffvergleich von Levamsiol (LEV), Moxidectin (MOX) und Thiabendazol (TBZ) sowie bei den Messwerten, die in Zusammenhang mit den Testergebnissen standen, wurde zur Berechnung des p-werts aufgrund der kleinen Probengröße der exakte Fischer-Test verwendet. 72

73 Material und Methoden Eizahlreduktionstest Ziel des EZRT war es, in vivo in einem Feldversuch die Wirksamkeit von MOX zu untersuchen Probenentnahme Auf jedem Betrieb wurde bei der ersten Beprobung (= Tag 0) bei Lämmern eine Kotprobe rektal entnommen und anschließend die Tiere mit MOX 0,2 mg/kg KGW (Cydectin 0,1 % orale Lösung) behandelt. Diese Tiere wurden mit einer Ohrmarke und mittels Viehkennzeichnungsfarbe individuell markiert. Das Gewicht der Lämmer wurde entweder durch Wiegen ermittelt oder, falls eine Waage nicht zur Verfügung stand, von dem Halter und dem durchführenden Tierarzt geschätzt. Die vom Hersteller empfohlen Dosis von 0,2 ml pro kg KGW wurde dabei eingehalten. Die von Tierärzten der SZGD / TGD rektal entnommenen Proben wurden per Post ungekühlt in das Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gesendet. Von allen Tieren (Proben von Tag 0) wurde mittels McMaster-Verfahren die Eizahl pro Gramm Kot (EpG) ermittelt (s ). War bei mindestens fünf Tieren die EpG 100, wurde an Tag 14 eine Folgeuntersuchung bei den individuell gekennzeichneten Lämmern in diesem Betrieb durchgeführt. Hierfür wurden die Lämmer separiert, die Ohrmarken kontrolliert und den Lämmern mit einer EpG 100 die zweite Kotprobe rektal entnommen. Der Versand und die Kotuntersuchung wurden wie bei den ersten Probenahmen durchgeführt Kotuntersuchung In einem Zeitraum von maximal sieben Tagen ab dem Probenahmedatum (abhängig von der Transportzeit per Post) wurden eine koprologische Untersuchung zur Bestimmung der EpG mit einem modifizierten McMaster-Verfahren nach WETZEL (1951) durchgeführt. Hierzu wurde 4 g Kot in einem Mörser auf einer Waage abgewogen und mit 5-10 ml gesättigter 73

74 Material und Methoden NaCl-Lösung zu einer homogenen Masse verrührt. Danach wurde die Kot-NaCl-Suspension druckvoll durch ein Sieb gespült und im Messbecher aufgefangen (Gesamtvolumen max. 60 ml). Diese die Eier enthaltende Suspension wurde mittels einer Pipette durchmischt, anschließend luftblasenfrei mit einer Pipette (0,5 ml) in die McMaster-Kammer (Ronnenberger Laborbedarf, Ronnenberg) überführt und für mindestens 15 Minuten in eine feuchte Kammer gelegt. Bei 100facher Vergrößerung im Mikroskop wurden alle vorkommenden Parasiteneier in den drei Zählfeldern differenziert und ausgezählt. Die Berechnung der EpG erfolgte nach folgender Formel: EpG = Gezählte Eier x angesetzte Suspensionsmenge [ml] Kotmenge [g] x Größe des Zählfeldes [cm 2 ] x Höhe der Kammer [cm] x Anzahl Zählfelder Daraus ergibt sich für eine Zählkammer mit drei Zählfeldern eine untere Nachweisgrenze von 33,3 Eiern pro gezählten Parasitenei (n). EpG = n x 33, Auswertung des Eizahlreduktionstestes Die Höhe der EpG-Befunde von Tag 0 und Tag 14 wurden auf Betriebsebene miteinander verglichen, und die Eizahlreduktion (EZR) wurde berechnet. Die Formel zur Berechnung (BAUER et al. 1986) der EZR lautet: EZR = (EpG Kot vor der Behandlung EpG Kot nach der Behandlung) x 100 EpG Kot vor der Behandlung Das auf der Bootstrapping-Methode basierende Programm Bootstreat ( wurde zur Berechnung der EZR und des 74

75 Material und Methoden 95 % Konfidenzintervalls (CI) verwendet. Dabei wurde die Methode von KOCHAPAKDEE et al. (1995) angewendet, in der sowohl das arithmetische als auch das geometrische Mittel in die Berechnung einbezogen werden. Eine Resistenz auf Betriebsebene wurde festgestellt, wenn die mittlere EZR < 95 % und die untere Grenze des 95 % Konfidenzintervalls (uci) < 90 % war Tierversuch Ziel des Tierversuchs war es, sensiblen Referenzwerten zu ermitteln, um sensible Bezugsdaten zur Berechnung der Ergebnisse der Feldpopulationen zu haben Versuchstiere Die Tierversuche zur Stammhaltung der Schafnematoden wurden unter dem Aktenzeichen /06A 395 beim Landesamt für Verbraucherschutz und Ernährungssicherheit (LAVES) geführt. Die Versuchstiere waren zwei männliche, weiße Merinolandschafe im Alter von drei Monaten und zwei männliche Schwarzkopfschafe im Alter von vier Monaten aus der Zucht der Klinik für kleine Klauentiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Lämmer waren in der Klinik geboren und wurden während der gesamten Aufzucht im Stall gehalten. Die Tiere waren in einer guten körperlichen Verfassung und koproskopisch frei von Magen-Darm-Parasiten. Die Tiere standen ab Versuchsbeginn paarweise in Stallhaltung mit betoniertem Auslauf. Das Futter bestand aus autoklaviertem Heu ad libitum und pelletiertem Fertigfutter. Wasser stand den Tieren ad libitium zur Verfügung. Nach Abschluss der Stammerhaltung wurden die Tiere entweder behandelt und zurück in die Klinik verbracht oder zur Gewinnung der adulten Parasiten getötet. 75

76 Material und Methoden Verwendete Parasitenpopulationen Haemonchus contortus: Die verwendete H. contortus-population (H.c. McMaster) war ein Isolat, welches aus dem Labor McMaster C.S.I.R.O Belmont/Victoria aus Australien stammt. Seit 1930 wurde dieses Isolat durch Passagen in Schafen erhalten. Der Stamm wurde keinen AH ausgesetzt und gilt als sensibel. Trichostrongylus colubriformis: T. colubrifomis Hannover wurde seit 2002 im Institut für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover passagiert und wurde ursprünglich von der Bayer AG zur Verfügung gestellt. Dieses Isolat wurde keiner anthelminthischen Behandlung ausgesetzt und gilt als sensibel gegenüber den hier beschriebenen AH. Feldpopulationen: Die aus den Feldversuchen gewonnenen Larvenpopulationen wurden mittels real-time PCR (s ) differenziert. Die Sensibilität der einzelnen Stämme gegenüber MOX, LEV und TBZ wurde in den beschriebenen Tests in vivo (s ) und in vitro (s TBZ und LEV) ermittelt Infektionsversuch Die zwei Merinolandschaflämmer wurden mit je infektiösen dritten Larven (L 3 ) von H.c. McMaster in Wasser und die Schwarzkopfschaflämmer mit infektiösen L 3 von T.c. Hannover in Wasser oral infiziert. Für die Infektion wurden die Tiere stehend fixiert und der Kopf mit einer Hand überstreckt. Die Spritze mit den infektiösen L 3 wurde seitlich in die Maulspalte bis über den Zungengrund eingeführt und dann entleert. Nach Ablauf der normalen Präpatenz von 21 Tagen wurde der Infektionserfolg wie unter beschrieben täglich kontrolliert. Bei einer EpG 100 wurde der Kot wie unter

77 Material und Methoden und beschrieben aufbereitet zur Bestimmung von Referenzwerten sensibler Magen- Darm-Strongyliden-Gattungen (MDS-Gattungen). Nach Abschluss des Infektionsversuches wurde zur Behandlung MOX (Cydectin 0,1 % orale Lösung) (Forte Dodge, Würselen) in einer Dosierung von 200 µg/kg KGW eingesetzt. Zur Gewinnung der adulten H. contortus McMaster wurde ein Merinolandschaflamm nach Abschluss der Stammhaltung mittels Bolzenschuss getötet und der Labmagen entnommen Gewinnung der Eier aus dem Kot Den Tieren wurde ein Kotsammelbeutel (Institut für Parasitologie, Hannover) angehängt, um den Kot direkt ohne Boden- oder Urinkontamination zu erhalten. Der Kot wurde in einem Gefäß mit Wasser vermischt und die Kotkugeln aufgebrochen. Im Labor wurde das Kot- Wasser-Gemisch durch ein Sieb (Omnilab, Hannover) mit einer Maschenweite von 100 µm gespült und das Filtrat in einem Eimer aufgefangen. Die erhaltene Suspension wurde dann durch ein Sieb (Omnilab, Hannover) mit einer Maschenweite von 25 µm gewaschen. Die im Sieb verbleibende Mischung wurde mit Wasser in ein Becherglas gespült, anschließend in Zentrifugenbehälter mit einem Fassungsvermögen von 250 ml überführt und 5 min bei 390 g (1500 U/min) zentrifugiert (Ultrazentrifuge Cyrofuge 5000, Heraeus, Osterode). Mittels einer Wasserstrahlpumpe wurde das Zentrifugat aus dem Zentrifugenbechern abgesaugt. Das Sediment wurde durch Auffüllen der Zentrifugenbehälter mit gesättigter Kochsalzlösung resuspendiert und anschließend für 2 min bei 173 g (1000 U/min) zentrifugiert. Die in der höheren Dichte der NaCl-Lösung flotierten Parasiteneier wurden mit dem Zentrifugat auf ein 25 µm Sieb gegeben und mit Leitungswasser gewaschen, von der Oberfläche des Siebes abgenommen und in ein 50 ml Reaktions-Gefäß (Sarstedt, Nümbrecht) überführt. Danach wurde diese Eisuspension aufgereinigt Aufreinigung der gewonnenen Eisuspension Die Aufreinigung erfolgte durch einen standardisierten Zuckergradienten, um die Kontamination mit Kotpartikeln und der damit verbundenen Pilz- und Bakterienbelastung 77

78 Material und Methoden möglichst gering zu halten. Dazu wurden Zuckerlösungen mit Konzentrationen von 10, 25 und 40 % hergestellt, die mit Lebensmittelfarbe unterschiedlich eingefärbt wurden. In 50 ml Spitzbodenröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) wurden zuerst 10 ml der 10 %igen Zuckerlösung (gelb gefärbt) gefüllt. Die 25 %ige (rot gefärbt) und 40 %ige (blau gefärbt) Zuckerlösungen wurden dann mittels Einmalpipette jeweils unter die niedriger konzentrierte Zuckerlösung verbracht, so dass eine Schichtung unterschiedlicher Zuckerkonzentrationen entstand (Abb. 3.1). Die Eisuspension wurde als oberste Schicht aufgetragen und alles für 5 min bei 129 g (1000 U/min) (Zentrifuge Megafuge 2.OR Sepatech, Hereaus, Osterode) zentrifugiert. Die Parasiteneier lagerten sich ihrem spezifischen Gewicht entsprechend zwischen der obersten und mittleren Bande ab und wurden mittels einer Pasteurpipette aus Glas abgenommen. Anschließend wurden die gereinigten und abgenommenen Parasiteneier nochmals durch ein Sieb (25 µm) mit Leitungswasser gewaschen (um die Eier vom Zucker zu säubern) und von der Sieboberfläche in ein Reaktions-Gefäß überführt. Dieser Vorgang wurde so oft wiederholt, bis die Suspension möglichst frei von Faseranteilen war. Die Eisuspension wurde auf Eier / 20 µl Wasser eingestellt. Dafür wurden mehrfach 10 µl der Eisuspension auf einem Objektträger ausgestrichen und die MDS-Eier bei 100facher Vergrößerung im Mikroskop (Zeiss, Jena) gezählt. Die Anzahl der Eier der einzelnen Ausstriche wurden addiert und durch die Anzahl der Ausstriche dividiert. Der so entstandene Mittelwert diente zur Einstellung der Suspension auf die gewünschte Konzentration. Abb. 3.1: Zuckergradient, unbenutzt 78