Transport von Calcium über das isolierte Pansenepithel des Rindes

Transkript

1 Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover Transport von Calcium über das isolierte Pansenepithel des Rindes INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Gundula Elisabeth Ricken aus Celle Hannover

2 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. B. Schröder 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder 2. Gutachter: Jun. Prof. Dr. M. Pröpsting Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2005 gefördert durch Mittel der H. Wilhelm Schaumann Stiftung 2

3 Für Lotte und Bruno, die mir diesen Weg zeigten, für meine Eltern, die mir ermöglichten, ihn zu gehen, und für Markus und Wolf, ohne die ich dieses Ziel nicht erreicht hätte. 3

4 4

5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literaturübersicht Lokalisation der gastrointestinalen Calciumabsorption beim Wiederkäuer Versuche mit Schafen und Ziegen Versuche mit Rindern Mechanismen der gastrointestinalen Calciumabsorption Parazellulärer Calciumtransport Transzellulärer Calciumtransport Prophylaxe der hypocalcämischen Gebärparese Hypocalcämische Gebärparese (Milchfieber) Calciumarme Fütterung ante partum Supplementierung mit Vitamin D Anionenreiche Rationen in der Trockenstehzeit (DCAD-Konzept) Calciumsupplementierung im peripartalen Zeitraum Material und Methoden Tiere Ussing-Kammer-Technik Präparation der Pansenepithelien Inkubation in Ussing-Kammern Pufferlösungen Chemikalien Ermittlung der Ca 2+ -Fluxraten Elektrische Messungen

6 Inhaltsverzeichnis 3.3 Durchführung der einzelnen Versuchsreihen Versuchsreihe Versuchsreihe Versuchsreihe 3a Versuchsreihe 3b Versuchsreihe Statistische Auswertung Ergebnisse Versuchsreihe Elektrophysiologische Parameter Einfluss kurzkettiger Fettsäuren auf die Ca 2+ -Resorption;...45 Ermittlung unidirektionaler Ca 2+ -Fluxraten und Ca 2+ -Nettofluxraten Versuchsreihe Versuchsreihe Einfluss unterschiedlicher Anionen auf die Resorption von Calcium über das Pansenepithel des Rindes Einfluss von Chlorid und Propionat auf Resorption und Sekretion von Calcium über das Pansenepithel Einfluss von Chlorid und Propionat in unterschiedlichen Konzentrationen auf die Resorption von Calcium über das Pansenepithel des Rindes Versuchsreihe Diskussion Beurteilung der Ussing-Kammer-Methode Aktiver Calciumtransport über das Pansenepithel des Rindes Einfluss von SCFA auf die Calciumresorption im Pansen

7 Inhaltsverzeichnis Einfluss von Chlorid auf die Calciumresorption im Pansen Vergleichbarkeit von an Rindern und Schafen bezüglich des ruminalen Calciumtransportes gewonnenen Ergebnissen Passiver Calciumtransport über das Pansenepithel des Rindes Entwicklung eines Konzeptes zur Calciumhomöostase des Wiederkäuers unter besonderer Berücksichtigung des Rindes Schlussfolgerungen und Konsequenzen bezüglich zukünftiger Untersuchungen Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang

8 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ANOVA Varianzanalyse (Analysis of Variances) BCS Body Condition Score Bq Becquerel C Grad Celsius CaBP calcium binding protein Ca 2+ Cl - cpm d DCAD Fa. FAL GIT G t h I I sc I c J J ms J net J sm KH meq min Mw N n n.s. p ionisiertes Calcium Chlorid Impulse pro Minute (counts per minute) Tag Dietary Cation Anion Difference Firma Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Gastrointestinaltrakt Gewebeleitfähigkeit Stunde Strom Kurzschlussstrom Klemmstrom unidirektionale Fluxrate Fluxrate von mucosal nach serosal Nettofluxrate Fluxrate von serosal nach mucosal Kohlenhydrate Milliequivalent Minute(n) arithmetischer Mittelwert Normalität Anzahl nicht signifikant Irrtumswahrscheinlichkeit 8

9 Abkürzungsverzeichnis p.a. PTH PD m PD t p.p. R SCFA SEM Tab. TMR vs µci µeq pro Analysi Parathormon transmurale Potenzialdifferenz transepitheliale Potenzialdifferenz post partum Widerstand kurzkettige Fettsäuren (Short Chain Fatty Acids) Standardfehler des Mittelwertes Tabelle Totale Mischration (total mixed ration) versus Mikrocurie Mikroequivalent 9

10 Abkürzungsverzeichnis 10

11 Einleitung 1 Einleitung Eine der häufigsten und von den ökonomischen Auswirkungen her bedeutendsten Erkrankungen der Milchkuh ist das so genannte Milchfieber, das auch als hypocalcämische Gebärparese bekannt ist. Ihre Ursache hat diese Stoffwechselerkrankung in einer durch das Einsetzen der Laktation bedingten Störung der Calciumhomöostase im peripartalen Zeitraum. Durch diverse Fütterungs- und Behandlungsstrategien wurde in der Vergangenheit bis in die Gegenwart versucht, den Calciumhaushalt der Kuh während dieser kritischen Phase auszugleichen, um das Erkrankungsrisiko des Tieres zu minimieren und dabei möglichst auch das Auftreten einer subklinischen Hypocalcämie zu verhindern. Die Zielsetzung besteht hierbei darin, die Calciumresorption im Gastrointestinaltrakt bzw. die Calciumverfügbarkeit aus dem Knochen zu erhöhen und somit die Calciumverluste durch die Milchbildung zu kompensieren. Vor dem Hintergrund der beschriebenen Milchfieberproblematik wurden zahlreiche Studien zu Lokalisation, Mechanismen und Regulation der Calcium-Resorption beim Wiederkäuer durchgeführt, aus denen aber bislang keine klaren Funktionskonzepte abgeleitet werden konnten. Ein Grund dafür ist darin zu sehen, dass die Ergebnisse der Untersuchungen teilweise überaus stark differieren. Weiterhin fanden diese Studien aus Gründen der Praktikabilität häufig unter Verwendung des kleinen Wiederkäuers (Schaf und Ziege) statt. Eine deckungsgleiche Übertragbarkeit auf das Rind sollte aufgrund der schon zwischen Schaf und Ziege bezüglich der Calciumresorption gefundenen Unterschiede jedoch nicht per se angenommen werden. Unklar ist somit nach wie vor, welche quantitative und qualitative Rolle das Vormagensystem des Rindes in Bezug auf die Resorption von alimentär zugeführtem Calcium spielt. 1

12 Einleitung In der vorliegenden Arbeit sollte auf Pansenepithelebene anhand einer In-vitro- Methode zunächst untersucht werden, ob dieses Organ eine relevante Lokalisation für die Calciumresorption darstellt. Anschließend war es das Ziel, zu prüfen, inwieweit sich der ruminale Calciumtransport unter Verwendung solcher Anionen, wie sie in handelsüblichen Calciumpräparaten zur Gebärpareseprophylaxe enthalten sind, beeinflussen lässt. 2

13 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Lokalisation der gastrointestinalen Calciumabsorption beim Wiederkäuer Versuche mit Schafen und Ziegen Der Beitrag unterschiedlicher Abschnitte des Gastrointestinaltraktes zur Calciumresorption beim Schaf war Gegenstand diverser Untersuchungen, insbesondere unter dem Aspekt der Milchfieberproblematik. Bezüglich des Calciumtransportes über das Vormagenepithel differieren die Ergebnisse dabei erheblich. PHILLIPSON und STORRY (1965) kamen bei ihren Versuchen am gewaschenen Reticulorumen anästhesierter Schafe zu dem Ergebnis, dass das Pansenepithel für Calcium nahezu undurchlässig ist, denn selbst bei einer Calciumkonzentration, bei der unter Berücksichtigung der transmuralen Potenzialdifferenz theoretisch eine Nettoaufnahme hätte auftreten müssen, fand keine Resorption von Calcium statt. In einer Reihe anderer In-vivo-Experimente stellte sich heraus, dass in Vormägen und Labmagen zum Teil eine Sekretion von Calcium auftrat (PFEFFER et al. 1970; GREENE et al. 1983a; WYLIE et al. 1985), teilweise jedoch auch ein beträchtlicher Anteil der täglichen Calciumaufnahme erfolgte (GRACE et al. 1974; DILLON u. SCOTT 1979; RAYSSIGUER u. PONCET 1980; BEN-GHEDALIA et al. 1982; RAHNEMA u. FONTENOT 1983; BREVES et al. 1985). Aufgrund dieser Ergebnisse, die auf eine wichtige Rolle des präintestinalen Bereiches schließen ließen, wurden beim Schaf, im Gegensatz zum Rind, auch Invitro-Experimente zu dieser Fragestellung durchgeführt. Hierbei wurde mittels der Ussing-Kammer-Technik der Transport von Calcium über die isolierte Pansenschleimhaut charakterisiert. In Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten wurde dabei eine Nettoresorption von Calcium festgestellt, was als sicherer Hinweis für das Vorliegen 3

14 Literaturübersicht aktiver Mechanismen für den Transport von Calcium zu werten ist. Eine Blockierung der Na + /K + -ATPase mit Ouabain führte zum Verschwinden der Ca 2+ -Resorption, was darauf hinweist, dass dieser Calciumtransport einerseits Na + -abhängig und andererseits energieaufwändig ist (BREVES u. HÖLLER 1988; GERDES 1988). Die Anwesenheit von SCFA im mucosalen Puffer hatte einen stimulierenden Effekt auf die Ca Nettofluxe, deren Höhe dann bei ca nmol cm -2 h lag (SCHRÖDER et al. 1997; WADHWA u. CARE 2000; SCHRÖDER et al. 2001); die größte Wirkung hatte ein Gemisch aus Acetat, Propionat und Butyrat im physiologischen Verhältnis von 12:5:3 (SCHRÖDER et al. 1999). UPPAL et al. (2003) konnten zeigen, dass ein Ansteigen der SCFA-Konzentration praktisch einen linearen Anstieg der Ca 2+ -Nettofluxe bewirkte, bei mit Kraftfutter gefütterten Tieren waren die J net signifikant höher als bei Tieren, die nur Heu erhalten hatten. Auch am Pansenepithel der Ziege konnten BREVES et al. (1989) eine aktive Ca 2+ -Resorption (J net 10,9 nmol cm -2 h -1 ) feststellen. Damit lag sie in der gleichen Größenordnung wie bei SCHRÖDER et al. (1997), die am isolierten Pansenepithel wachsender Ziegen eine Calcium-Nettoresorption von 16,5 nmol cm -2 h -1 feststellten; bei Calcium-depletierten Tieren waren es sogar 25,1 nmol cm -2 h Versuche mit Rindern Die relativ wenigen Studien, die sich mit der Lokalisation der Ca-Resorption im GIT des Rindes beschäftigten, kamen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Die Anzahl der Versuchstiere war aus Gründen der Praktikabilität in der Regel nur gering und die Tiere unterschieden sich in Geschlecht, Rasse, Alter, Fütterung und ggf. Laktations- und Trächtigkeitsstadium. Allen Versuchsansätzen war gemein, dass die Rinder chirurgisch mit Kanülen und/oder Fisteln in diversen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes versehen 4

15 Literaturübersicht wurden. Die Erfassung der segmentalen Calciumflüsse erfolgte mittels Markertechnik (meist Cr 2 O 3 ). Je nach Lokalisation der Kanülen konnten so nicht nur die Ca 2+ -Gesamtresorption, sondern auch Sekretion und/oder Resorption im präintestinalen Bereich, im Dünnund im Dickdarm unterschieden werden. Eine Zusammenfassung von neun Studien, die zwischen 1972 und 1997 publiziert wurden, gibt Tab. 1. In den Studien von KEMP et al. (1973) und VAN T KLOOSTER (1976) ergab sich eine Ca 2+ -Sekretion im präintestinalen Bereich, die durch Nettoresorption im Dünndarm mehr als kompensiert wurde. Auffällig war, dass diese Resorption mit 32,4 g d -1 bei einem Tier in laktationsbedingt negativer Calciumbilanz im Vergleich zu nichtlaktierenden Tieren deutlich höher lag (VAN T KLOOSTER 1976). Diese Ergebnisse legten zunächst nahe, dass beim Rind, genau wie beim Monogastrier, eine Nettoresorption von Calcium im Duodenum und Jejunum stattfindet. In der Folge kamen aber verschiedene Autoren zu anderen Ergebnissen, denn mit Ausnahme zweier weiterer Studien, in denen überwiegend eine Ca 2+ -Sekretion in die Mägen verzeichnet wurde (GOETSCH u. OWENS 1985; ZINN u. SHEN 1996), ergab sich zum Teil eine deutliche Ca 2+ -Nettoresorption aus dem präintestinalen Kompartiment. So beobachteten GREENE et al. (1983b) in einer Untersuchung, die primär den Einfluss des Kaliumgehaltes im Futter auf die Magnesiumresorption zum Gegenstand hatte, dass bei jungen Bullen (Angus x Simmentaler) eine Nettoresorption von Calcium aus den Mägen und dem Dickdarm erfolgte; im Dünndarm hingegen wurde Calcium sezerniert. Bei der Überprüfung des Effektes von Monensin auf die Mg 2+ - und Ca 2+ -Resorption war das Vormagen/Labmagen-Kompartiment sogar der ausschließliche Abschnitt des Gastrointestinaltraktes für Ca 2+ -Nettoresorption (GREENE et al. 1988). KHORASANI und ARMSTRONG (1992) untersuchten den Einfluss verschieden hoher Konzentrationen von Calcium im Futter auf dessen Nettobewegungen im Magen-Darm-Trakt von vier Jersey-Rindern. Der Hauptresorptionsort für Calcium 5

16 Literaturübersicht befand sich hierbei wiederum in den Vormägen und dem Labmagen, im Dünn- und Dickdarm wurde hingegen nur wenig Calcium resorbiert oder sezerniert. RAHNEMA et al. (1994) stellten bei ihren Untersuchungen an fünf laktierenden Holstein-Kühen, deren Ration unterschiedliche Mengen an Fett enthielt, fest, dass die Nettoresorption von Calcium von der Menge des täglich aufgenommenen Calciums abhängig war und dass bis auf eine Ausnahme stets eine überwiegend präintestinale Resorption von Calcium erfolgte. KHORASANI et al. (1997) überprüften an acht laktierenden Holstein-Friesian-Kühen den Einfluss verschiedener Silagen auf den Resorptionsort von Calcium und einiger weiterer Mengenelemente. Dabei stellten sie fest, dass die Ca 2+ -Verdaulichkeit nicht von der Art der Fütterung beeinflusst wurde, dass aber mit Erhöhung der täglich aufgenommenen Calciummenge die präintestinale Ca 2+ -Resorption anstieg. Bei einer Aufnahme von 115 g Calcium pro Tag wurden 9 g in die Vormägen und den Labmagen sezerniert, bei 231 g Calcium pro Tag wurden jedoch 49,8 g resorbiert. JESCHKE et al. (2002) konnten ebenfalls zeigen, dass bei frisch laktierenden Kühen die präduodenale Resorption von Calcium mit steigender täglicher Calciumaufnahme ansteigt. Erhielten die Tiere ca. 60 g Calcium am Tag, erfolgte in drei von vier Fällen eine Sekretion von bis zu 19,2 g d -1 in die Mägen, bei einer täglichen Versorgung mit ca. 150 g Calcium wurden präduodenal bis zu 46 g d -1 resorbiert. Zusammenfassend ergibt sich somit berechtigter Grund zu der Annahme, dass auch beim Rind, genau wie beim Schaf, durch Resorption im präintestinalen Bereich des Magen-Darm-Traktes bei ausreichend hoher Ca 2+ -Absorption ein relevanter Anteil des täglichen Calciumbedarfes gedeckt werden kann. 6

17 Literaturübersicht Tab. 1: Calciumbewegungen (g d -1 ) im Gastrointestinaltrakt von Rindern (negative Werte bedeuten Nettosekretion) alimentäre Ca 2+ - Aufnahme 31,6 60,1 69,6 72,9 14,3 14,7 15,2 14,4 23,0 27,7 32,8 34,7 24,9 25,1 25,2 33,6 37,1 48,2 51,4 51,7 170,0 189,5 189,8 199,5 199,7 17,6 17,8 18,0 28,8 28,9 39,5 39,9 40,3 115,0 118,0 150,0 231,0 Vormägen/ Labmagen Dünn-/ Dickdarm ,4-9,5-7,0-3,5 2,2 4,0 2,8-2,5-8,3-3,2 5,8 3,1 1,2 1,9 1,1 1,6 5,4 14,5 20,9 19,8 14,6-13,3 6,8 13,8 15,9-5,9-5,5-5,0-0,9-5,2 3,3-0,7-4,6-9,0 6,5 19,1 49,8 5,8 15,8 31,5 7,1 0,5-0,9 0,9 13,8 26,7 26,8-3,7-1,8-0,2 2,6 1,6 0,4 0,0 1,9-1,2-4,3-1,8 27,9 6,6-13,1 6,6 12,9 12,2 11,6 12,7 14,7 13,7 15,1 16,6 36,8 28,6 28,0 24,6 Faeces Bilanz Autor 30,2 53,8 45,1 69,3 3,1 4,6 4,1 30,4 33,3 23,9 20,7 22,6 31,6 33,0 31,8 31,7 36,2 157,2 174,9 176,5 198,7 177,2 10,6 11,0 11,5 17,0 19,5 22,6 25,4 28,3 78,6 83,6 107,4 156,5 1,1 5,8-6,3 3,2 2,7 3,0 3,7 11,3 18,4 23,6 2,4 1,4 0,2 3,5 2,1 1,0 4,4 17,4 18,2 13,8 12,8 14,6 13,9 0,7 22,6 7,0 6,8 6,6 11,8 9,5 17,0 14,5 12,0 36,4 34,4 42,6 74,5 Kemp et al. (1973) van t Klooster (1976) Greene et al (1983b) 1 Goetsch u. Owens (1985) 2 Greene et al. (1988) 3 Khorasani, Armstrong (1992) Rahnema et al. (1994) 4 Zinn u. Shen (1996) 5 Khorasani et al. (1997) 6 1 Die Ration der Tiere enthielt verschieden hohe Kaliummengen. 2 Die Ration der Tiere bestand zu 88% aus Konzentrat; ein Experiment wurde als offensichtlicher Ausreißer nicht berücksichtigt. 3 Die Ration der Tiere enthielt Monensin. 4,5 Rationen mit hohem Fettgehalt 6 Es wurden verschiedene Silagen verfüttert. 7

18 Literaturübersicht 2.2 Mechanismen der gastrointestinalen Calciumabsorption Calcium (Ca) liegt im Magen-Darm-Trakt in verschiedenen Formen vor: an Protein gebunden, als undissoziiertes Salz oder als ionisiertes Calcium (Ca 2+ ). Nach allgemeiner Auffassung wird vor allen Dingen das ionisierte Calcium vom Körper aufgenommen. Der Anteil an ionisiertem Calcium unterscheidet sich in den verschiedenen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes ganz beträchtlich. In der Pansenflüssigkeit liegt er bei ca. 50% (HOHLS 1990), im Labmagen liegt praktisch das gesamte vorhandene Calcium in gelöster Form vor, und im Dünndarm nimmt der ionisierte Anteil mit zunehmender Alkalisierung der Ingesta kontinuierlich ab (STORRY 1961a). Das momentan vorhandene Wissen über die Mechanismen des gastrointestinalen Calciumtransports basiert überwiegend auf Untersuchungen am Dünndarm von Nichtwiederkäuern. Die Absorption von Calcium kann danach sowohl parazellulär als auch transzellulär erfolgen Parazellulärer Calciumtransport Bei Vorhandensein eines ausreichend großen chemischen Gradienten kann Calcium prinzipiell in allen Abschnitten des Magen-Darm-Traktes parazellulär ins Blut übertreten und muss auf diesem Wege die Tight Junctions zwischen den Zellen überwinden; diese Art des Calciumtransportes per Diffusion ist in physiologischen Bereichen nicht sättigbar. Die transmurale Potenzialdifferenz (PD m ) spielt dabei eine wichtige Rolle. Da das Blut gegenüber dem Lumen des Gastrointestinaltraktes positiv geladen ist, stellt die PD m ein Hindernis für das doppelt positiv geladene Calciumion dar, das nur durch eine entsprechend höhere Calciumkonzentration im Lumen gegenüber dem Blut überwunden werden kann. Im Pansen liegt die transmurale Potenzialdifferenz bei ca. 30 mv; d.h., eine passive Resorption könnte theoretisch auf der Grundlage der 8

19 Literaturübersicht Nernst-Gleichung ab einer Ca 2+ -Konzentration von 10 mmol l -1 erfolgen, wenn für das Blut eine Konzentration von 1 mmol l -1 ionisiertes Calcium angenommen wird (DOBSON u. PHILLIPSON 1958; HÖLLER et al. 1988). Eine weitere Möglichkeit, Calcium auf passivem Wege ins Blut aufzunehmen, stellt das so genannte Solvent drag -Phänomen dar. Hierbei verursacht der durch den aktiven Transport anderer Ionen erzeugte osmotische Gradient zwischen Lumen und Interzellularraum ein parazelluläres Nachströmen des Lösungsmittels (hier Wasser), mit dem auch die darin gelösten Ca 2+ -Ionen ins Blut transportiert werden (KARBACH 1992). Insbesondere in Darmabschnitten mit relativ undichten Interzellularräumen ( leaky Epithelien) kann der Solvent drag eine quantitativ relevante Rolle spielen. SCHARRER und WOLFFRAM (1987) postulierten, dass er vor allem im Dünndarm und im proximalen Colon von Bedeutung ist. Früher war die allgemeine Meinung die, dass der passive Calciumtransport keiner direkten Regulation unterliegt. Neuere Forschungen haben jedoch gezeigt, dass prinzipiell auch die parazelluläre Diffusion bestimmter Ionen durch veränderten Aufbau der Tight Junctions beeinflusst werden kann. So ist es zum Beispiel denkbar, dass Calcitriol durch eine Veränderung im Aufbau der Tight Junctions indirekt Einfluss auf den Transport von Calcium über bestimmte Epithelien nimmt. Diese Theorie wurde aufgestellt von CHIRAYATH et al. (1998), die bei ihren Versuchen an Caco-2-Kulturen feststellten, dass die Zellkulturen nach Behandlung mit 1,25(OH) 2 D 3 signifikant mehr Calcium transportierten als unbehandelte Kontrollkulturen. Hierbei war die über das Epithel beförderte Mannitmenge ebenfalls erhöht, was als sicherer Hinweis dafür gilt, dass der Transport parazellulär erfolgte. Auch KUTUZOVA und DELUCA (2004) konnten zeigen, dass im Dünndarm von Ratten nach intravenöser Calcitriolapplikation neben einer Hochregulierung von Genen, die für Ca 2+ -transportierende Proteine codieren, auch die Permeabilität der Tight Junctions und somit der parazelluläre Ca 2+ -Transport verändert war. 9

20 Literaturübersicht Transzellulärer Calciumtransport Die primär durch Vitamin D regulierte aktive Ca 2+ -Resorption ist beim Monogastrier mehr oder weniger auf das Duodenum und das vordere Jejunum beschränkt (HOENDEROP et al. 2005). Beim Wiederkäuer gilt es, zumindest für das Schaf und die Ziege, auf Basis der Ergebnisse mehrerer In-vitro-Studien mittlerweile als gesichert, dass auch im Reticulorumen aktive Calcium-Transportprozesse ablaufen (HÖLLER et al. 1988; SCHRÖDER et al. 1997). Der transzelluläre Transport von Calcium erfolgt dabei in mindestens drei Schritten: 1. Aufnahme in die Zelle über die apikale Membran, 2. Transport durch das Cytoplasma und 3. Ausschleusung ins Blut über die basolaterale Membran. Aufnahme in die Zelle Da das Zellinnere gegenüber dem Extrazellularraum eine Potenzialdifferenz von 30 mv (innen negativ) aufweist und die cytosolische [Ca 2+ ] hier mit 1 µmol l -1 sehr gering ist, bewegt sich das zweifach positiv geladene Ca 2+ -Ion bei seinem Eintritt in die Zelle sowohl entlang eines elektrischen als auch eines chemischen Gradienten (BRONNER 1987). Beim Monogastrier erfolgt die Aufnahme in die Zelle über spezielle Ca 2+ -Kanäle, wobei in diesem Zusammenhang Transportproteine aus der TRP-Kanalfamilie (TRPV5 und TRPV6) nachgewiesen wurden (HOENDEROP et al. 2005). Ob diese Kanäle auch im Vormagensystem des Wiederkäuers am Calciumtransport beteiligt sind, ist nicht bekannt (Abb. 1). SCHRÖDER et al. (1997) sowie WADHWA und CARE (2000) war es möglich, im In-vitro-Versuch durch eine Zugabe des cardiomyocytären L-Typ-Ca 2+ -Kanalblockers Verapamil zur mucosalen Pufferlösung den Ca 2+ -Nettoflux über das Pansenepithel des Schafes signifikant zu reduzieren, aber bei SCHRÖDER et al.(1999) trat dieser Effekt nicht auf. Wenn Effekte von Verapamil auftreten, müssen sie vorsichtig interpretiert werden, da die Substanz eventuell keinen spezifischen Effekt auf TRPV-Kanäle ausübt (HOENDEROP et al. 10

21 Literaturübersicht 2005). Dass teilweise doch eine Hemmung des Calciumtransportes auftritt, liegt möglicherweise daran, dass Verapamil über die Blockierung von K + -Kanälen das apikale Membranpotenzial der Zelle depolarisiert (LEONHARD-MAREK u. MARTENS 1996). Ein solcher Mechanismus würde ebenfalls für eine elektrogene Ca 2+ -Aufnahme über die apikale Zellmembran sprechen. Eine weitere Möglichkeit, Calcium in die Zelle aufzunehmen, bestünde in der Exprimierung eines Calcium-Protonen-Austauschers, wie er von LUTZ und SCHARRER (1991) für das Colon der Ratte postuliert wurde. Hierbei geht man von der Vorstellung aus, dass in die Pansenepithelzelle aufgenommene kurzkettige Fettsäuren (SCFA) im Zellinneren dissoziieren, woraufhin die frei werdenden Protonen für den Antrieb eines Ca 2+ /H + -Austauschers zur Verfügung stehen (Abb. 1). apikal basolateral Ca [H]SCFA TRPV? SCFA - + H + Ca 2+ NCX Na + Ca 2+ + H Ca 2+ PMCA Ca 2+ Ca 2+ Abb. 1: Postulierte Mechanismen des aktiven Calciumtransportes über das Pansenepithel des Wiederkäuers (modifiziert nach Breves et al. 1999). TRPV: epithelialer Ca 2+ -Kanal, [H]SCFA: undissoziierte kurzkettige Fettsäuren, NCX: Na + /Ca 2+ -Austauscher, PMCA: Ca 2+ -ATPase. 11

22 Literaturübersicht Untermauert wird diese Hypothese durch die Tatsache, dass in mehreren Studien Ca 2+ -Nettofluxraten nur in Anwesenheit von SCFA im mucosalen Puffer ermittelt werden konnten (RITTMANN 1996; VÖSSING 1997; SCHRÖDER et al. 2001). Transport durch das Cytosol Da Calcium innerhalb der Zelle verschiedene Signalfunktionen hat, ist es für die Epithelzelle wichtig, einen unkontrollierten Anstieg des freien Calciums im Cytosol zu verhindern. Es werden zwei Hypothesen diskutiert, wie dies bewirkt werden könnte. Die erste Annahme geht davon aus, dass das Calcium beim Transport durch das Cytosol an besondere Transportproteine gebunden wird. Bei diesen handelt es sich beim Säugetier in der Regel um Calbindin-D 9k oder in Ausnahmefällen um Calbindin D 28k (Maus), deren Synthese durch Calcitriol reguliert wird. Die Expression von Calbindin D 9k -mrna konnte von YAMAGISHI et al. (2002) beim Rind nur im vorderen Teil des Dünndarmes per Northern Blot nachgewiesen werden. Interessanterweise gab es bei den untersuchten Tieren keinerlei Beziehung zwischen deren Alter (0,4 bis 83,4 Monate) und der Menge der duodenalen Calbindin D 9k -mrna; auch zwischen mrna und der Konzentration von Calcitriol im Plasma bestand keine Korrelation. Pansenepithel wurde weder von diesen noch von anderen Autoren auf das Vorliegen von Calbindin D 9k untersucht. Als zweite Möglichkeit wird ein als Transcaltachia bezeichneter Vorgang diskutiert, bei dem Calcium per Endozytose in die Zelle aufgenommen wird. Der Transport durch die Zelle erfolgt dann in den Vesikeln, und an der basolateralen Membran wird das Calcium durch Exozytose wieder freigesetzt (HOENDEROP et al. 2005). 12

23 Literaturübersicht Ausschleusung über die basolaterale Membran Da das Calcium beim Übertritt ins Blut entgegen einem elektrochemischen Gradienten transportiert werden muss, ist dieser Schritt energieaufwändig und bedarf besonderer Transportsysteme (Abb. 1). Beim Monogastrier wurden bisher eine ATP-abhängige Ca 2+ -Pumpe (PMCA1b) und ein 3Na + /Ca 2+ -Austauscher (NCX1) nachgewiesen (HOENDEROP et al. 2005). Auch im Pansenepithel des Wiederkäuers wurde eine Ca 2+ -ATPase nachgewiesen (HEGNER und TELLHELM 1974). Der Ca 2+ -Pumpen-Inhibitor Vanadat hatte in Invitro-Untersuchungen von SCHRÖDER et al. (1999) am Pansenepithel des Schafes keine hemmende Wirkung auf die Calciumresorption. Dies lässt vermuten, dass die im Reticulorumen vorhandene Ca 2+ -ATPase Vanadat-insensitiv ist oder nur eine untergeordnete Rolle für den Calciumtransport über die basolaterale Membran spielt. 2.3 Prophylaxe der hypocalcämischen Gebärparese Hypocalcämische Gebärparese (Milchfieber) Die Aufrechterhaltung der extrazellulären Calciumkonzentration ist für den Säugerorganismus aufgrund der vielen Funktionen, die Calcium im Körper innehat, von existentieller Bedeutung. In Anbetracht der Tatsache, dass die Calciumzufuhr über die Nahrung beträchtlichen Schwankungen unterliegen kann, ist es für das Tier notwendig, sowohl die Resorption als auch die Exkretion dieses wichtigen Mengenelementes effektiv regulieren zu können. Mit einsetzender Galaktopoese erhöht sich der Calciumbedarf des Organismus drastisch, was eine außergewöhnliche Beanspruchung für die Regulationsmechanismen des Calciumhaushaltes darstellt. 13

24 Literaturübersicht Während der Trockenstehzeit muss der Stoffwechsel der Milchkuh nur etwa vier bis fünf Gramm Calcium pro Tag für die Mineralisierung des fetalen Skelettes zur Verfügung stellen. Mit dem Einsetzen der Laktation nimmt der Calciumbedarf des Tieres innerhalb von ein bis zwei Tagen um ein Mehrfaches zu. Allein die Produktion von 10 l Kolostrum entzieht dem Organismus ca. 20 g Calcium. In Anbetracht der Tatsache, dass die im Körper verfügbare Menge an freiem Calcium nur etwa g beträgt (GOFF et al. 1991), wird deutlich, dass die Calciumregulationsmechanismen der Kuh extrem beansprucht werden, was dazu führt, dass bei den meisten Kühen der Calciumspiegel im Blut nach dem Kalben für h p.p. schon physiologisch vorübergehend erniedrigt ist (HOVE 1986; TVEIT et al. 1991; HORST et al. 1994; GOFF u. HORST 1997). Wenn die Adaptation des Stoffwechsels an die veränderten Bedürfnisse zu langsam verläuft, kommt es erst zu einer subklinischen Hypocalcämie und später zum so genannten Milchfieber. Die Inzidenz dieser Erkrankung wird angegeben mit 5-10% aller adulten Milchkühe (MARTIG 2002); das klinische Bild ist schon seit langer Zeit bekannt, erstmals erwähnt wurde es im Jahre 1793 von Eberhardt (HORST et al. 1997). Betroffene Tiere haben eine herabgesetzte Körpertemperatur, sie leiden an eingetrübtem Bewusstsein und einer progressiven schlaffen Lähmung der Muskulatur, die letztlich mit dem Festliegen des Tieres endet. Erfolgt keine rechtzeitige Behandlung, versterben 60-70% der betroffenen Tiere (WEIGHTON 1958). Trotz intensiver Forschung auf diesem Gebiet ist die genaue Ätiologie der hypocalcämischen Gebärparese nach wie vor nicht endgültig geklärt. Erwiesen ist, dass besonders ältere Tiere betroffen sind; das Erkrankungsrisiko steigt mit der Anzahl der Laktationen kontinuierlich an (CURTIS et al. 1984). Färsen erkranken selten; bei ihnen liegt die Milchfieberinzidenz lediglich bei 0,5% (FLEISCHER et al. 2001). Ein Zusammenhang mit einer hohen Milchleistung wurde häufig vermutet. FLEISCHER et al. (2001) konnten jedoch zeigen, dass eine Korrelation zwischen Milchleistung und Milchfieber nicht mehr nachweisbar ist, wenn man die praktisch nie 14

25 Literaturübersicht betroffenen Erstkalbskühe, deren Leistung niedriger liegt als die pluriparer Tiere, nicht mit in die Analysen einbezieht. Auch eine Störung des Hormonhaushaltes scheint nicht die Ursache für diese Krankheit zu sein: Die Calcitoninsekretion ist bei betroffenen Tieren eher niedriger als bei gesunden Tieren (MAYER et al. 1975), die hypocalcämischen Tiere leiden weder an einer insuffizienten PTH-Sekretion noch an einer ungenügenden Calcitriolsynthese (HORST et al. 1978). Es gibt allerdings Tiere, die nicht auf die Standardtherapie ansprechen, bei denen die Synthese von ausreichend Calcitriol erst mit einer Verzögerung von h eintritt (GOFF et al. 1989). Es ist also zu schlussfolgern, dass bei Kühen, die an Milchfieber erkranken, Knochen und Gastrointestinaltrakt ungenügend auf die hormonellen Stimuli reagieren, was zu einer Verzögerung der Calciumresorption aus dem Magen-Darm-Trakt bzw. dem Skelett führt. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die Anzahl der Vitamin D-Rezeptoren zum Zeitpunkt der Geburt absinkt. Dieses Phänomen tritt jedoch bei allen Kühen auf; es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen gesunden Tieren und solchen, die an Milchfieber erkranken. Es trifft aber zu, dass die Anzahl der Vitamin D-Rezeptoren mit zunehmendem Alter geringer wird (GOFF et al. 1991). Eine andere Theorie besagt, dass, bedingt durch eine alkalotische Stoffwechsellage, Niere und Knochen nicht adäquat auf PTH reagieren (s ). Neueste Forschungsergebnisse lassen weiterhin die Frage aufkommen, welche Rolle der Milchdrüse in der Ätiologie des Milchfiebers zukommt. PRAPONG et al. (2005) konnten anhand molekularbiologischer Untersuchungen zeigen, dass im Milchdrüsenepithel erkrankter Tiere die präpartale Expression einer sekretorisch tätigen Ca 2+ -ATPase gegenüber gesunden Tieren signifikant gesteigert war. Da bis in die zwanziger Jahre des vergangenen Jahrhunderts unbekannt war, dass Milchfieber durch ein Absinken der Calciumkonzentration im Blut verursacht wird, wurde mit diversen, heute eigenartig anmutenden Therapiemethoden versucht, eine Heilung herbeizuführen. Dazu gehörten beispielsweise das Einreiben der Beine des Tieres mit Alkohol und Cayennepfeffer, das Übergießen des Kopfes mit kaltem 15

26 Literaturübersicht Wasser oder auch ein täglicher Aderlass von 4-5 Litern Blut über 8-10 Tage (HORST et al. 1997). Mittlerweile ist die hypocalcämische Gebärparese durch die intravenöse Infusion calciumhaltiger Lösungen (8-10 g Calcium) relativ leicht therapierbar; Tiere, die klinisch an Milchfieber erkrankt waren, geben jedoch anschließend weniger Milch und sind generell anfälliger gegenüber anderen metabolischen und infektiösen Erkrankungen wie Wehenschwäche, Nachgeburtsverhaltung, Mastitis, Ketose und Labmagenverlagerung (CURTIS et al. 1983; RISCO et al. 1984; VAN DORP et al. 1999). Teilweise kommt es auch zu Rezidiven, bei denen die Behandlung mehrfach wiederholt werden muss und bei denen die Prognose für das Tier generell vorsichtig zu stellen ist. Die effektive Milchfieberprophylaxe hat aus diesen Gründen im Management der modernen Milchviehhaltung einen hohen Stellenwert. Neben diversen, weniger spezifischen Prophylaxemaßnahmen, wie Kontrolle der peripartalen KH- und Magnesiumaufnahme, Kontrolle der Körperkondition mittels BCS, Verkürzung der Trockenstehzeit, Verfütterung calciumbindender Substanzen (Zeolith), präpartales Anmelken bzw. unvollständiges Ausmelken nach der Abkalbung, gibt es dabei vier Konzepte, die auf breiter Basis Verwendung und in der Literatur Beachtung finden (THILSING-HANSEN et al. 2002; GOFF 2004): - calciumarme Fütterung ante partum - Supplementierung mit Vitamin D - anionenreiche Rationen in der Trockenstehzeit (DCAD-Konzept) - Calciumsupplementierung im peripartalen Zeitraum. Diese Konzepte werden im Folgenden näher erläutert. 16

27 Literaturübersicht Calciumarme Fütterung ante partum Eine der ältesten Methoden, die Milchfieberinzidenz zu senken, besteht darin, in den letzten vier bis sechs Wochen ante partum den Calciumgehalt in der Ration der trockenstehenden Kuh zu vermindern, um die endogenen Ca 2+ -Mobilisationsmechanismen des Tieres schon vor der Abkalbung zu sensibilisieren und den Organismus zu veranlassen, seinen Calciumbedarf über aktive Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt und Mobilisation aus dem Knochen zu decken. Hierbei ist es nötig, den Calciumgehalt im Futter auf weniger als 0,5% der aufgenommenen Trockenmasse zu senken (WESTERHUIS 1975). Auf diese Weise gelang es z.b. GOINGS et al. (1974), bei 12 Jerseykühen das Auftreten von Milchfieber dadurch zu verhindern, dass die Tiere ante partum eine Ration mit lediglich 8 g Calcium pro Tag erhielten. GREEN et al. (1981) konnten zeigen, dass Kühe, die vor der Abkalbung mindestens 14 Tage lang eine calciumarme Diät erhalten hatten, peripartal tendenziell höhere Plasmacalciumspiegel aufwiesen als calciumreich ernährte Kontrolltiere. Parallel dazu war auch der Hydroxyprolinspiegel im Harn tendenziell erhöht, was auf verbesserte Calciummobilisation aus dem Knochen schließen ließ. Im Allgemeinen gilt, dass der Calciumgehalt im Futter 20 g pro Tag nicht übersteigen sollte (HORST et al. 1997; MARTIG 2002). Sofort nach der Abkalbung sollte die Calciumversorgung des Tieres erhöht werden, was durch die einmalige Applikation einer Ca 2+ -haltigen Lösung o.ä. erreicht werden kann; nachfolgend sollte der Anteil des Calciums an der Trockensubstanz größer als 1% sein (WESTERHUIS 1975). Das Problem bei dieser Art der Milchfieberprophylaxe besteht darin, dass es bedingt durch die fehlende Verfügbarkeit geeigneter Futtermittel oft nicht möglich ist, den Calciumanteil des Futters auf das nötige Maß zu reduzieren. Ein Versuch, diese Problem zu lösen, besteht darin, dem Futter Ca 2+ -bindende Substanzen wie Zeolith zuzufügen. Die entstehenden Ca 2+ -Komplexe können vom 17

28 Literaturübersicht Körper nicht mehr resorbiert werden, was faktisch einer Verringerung des Calciumgehaltes der Ration entspricht (THILSING-HANSEN et al. 2003) Supplementierung mit Vitamin D Nachdem die Schlüsselrolle, die Vitamin D in der Regulation des Calciumhaushaltes zukommt, bekannt geworden war, lag es nahe herauszufinden, inwiefern es in der Milchfieberprophylaxe eingesetzt werden kann. Es wurde sowohl die Wirkung von Vitamin D 3 als auch die diverser Derivate in zahlreichen Studien überprüft; dabei war die Applikation von Vitamin D nur erfolgreich, wenn es innerhalb einer eng begrenzten Zeitspanne vor dem Abkalben verabreicht wurde, und selbst dann führte die Supplementierung mit Vitamin D nicht immer zum Erfolg. JÖNSSON und PEHRSON (1970) konnten mit einer intramuskulären Injektion von 10 Mio. IE Vitamin D 3 ca. eine Woche vor der Abkalbung keine signifikante Reduktion der Erkrankungshäufigkeit erreichen. JULIEN et al. (1977) gelang es hingegen, durch diese Methode bei Kühen, die in der vorangegangenen Laktation schon einmal erkrankt gewesen waren, die Milchfieberinzidenz deutlich zu senken. Die Supplementierung mit Mio. IE Vitamin D über das Futter während der letzten Tage vor und der ersten Tage nach dem Kalben (HIBBS u. POUNDEN 1955) brachte zwar zufriedenstellende Ergebnisse, fand aber keinen Eingang in die Praxis, wohl auch, weil die therapeutische Breite von Vitamin D unabhängig von der Applikationsart gering ist. Während relativ niedrige, nicht toxische Dosen ineffektiv waren (HIBBS u. POUNDEN 1955), kam es bei höheren Dosen und wiederholter Anwendung zu schweren Nebenwirkungen, die nicht selten zum Tod der Tiere führten (LITTLEDIKE u. HORST 1982). Weitere Substanzen, die ebenfalls auf ihre Tauglichkeit in puncto Milchfieberprophylaxe überprüft wurden, sind einerseits die beiden biologisch aktiven Formen des Vitamins D 3, 25-OHD 3 und 1,25-Dihydroxyvitamin D 3, und andererseits 18

29 Literaturübersicht künstlich hergestellte Calcitriolanaloga (1a-Hydroxyvitamin D 3, 24F-1,25- Dihydroxyvitamin D 3 ). Diese Stoffe haben gegenüber Vitamin D eine geringere Halbwertszeit und sind weniger toxisch, wie von HORST et al. (2003) in einer Übersichtsarbeit dargestellt wurde. Ihre Wirksamkeit ist dabei als gut zu bezeichnen; SACHS et al. (1987) beispielsweise injizierten Kühen sieben bis acht Tage vor dem Partus einmalig 700 µg 1a-Hydroxy-Vitamin D3 und konnten dadurch das Auftreten einer Hypocalcämie zum Abkalbezeitpunkt verhindern. Der Vorteil dieser Prophylaxemaßnahme liegt prinzipiell in ihrer leichten Durchführbarkeit, der Nachteil darin, dass die Kuh wirklich in dem Zeitraum kalben muß, in dem pharmakologisch wirksame Gewebespiegel des jeweiligen Präparates vorliegen. Aufgrund der Gefahr von Nebenwirkungen (Gewebecalcifikationen, Inappetenz, Atemnot, Siechtum, Tod) darf die Injektion nicht ohne Weiteres wiederholt oder die Dosis unreflektiert erhöht werden Anionenreiche Rationen in der Trockenstehzeit (DCAD-Konzept) Zu Beginn der 70er Jahre des vergangenen Jahrhunderts gelang es ENDER et al. (1971) zum ersten Mal, einerseits durch das Verfüttern alkalischer, d.h. natriumund kaliumreicher, Rationen, Milchfieber zu induzieren, und andererseits, das Auftreten der hypocalcämischen Gebärparese dadurch zu verhindern, dass die Tiere in den letzten Wochen vor der Abkalbung ein stark saures Futter erhielten. Damit gelten sie als die Begründer des sogenannten DCAD-Konzeptes (Dietary Cation Anion Difference), dessen Prinzip darin besteht, mit diätetischen Mitteln eine milde, in der Regel kompensierte metabolische Acidose zu induzieren, indem das Verhältnis bestimmter Kationen zu bestimmten Anionen in der Ration verändert wird. Die praktische Durchführung des DCAD-Konzeptes erfolgt so, dass zuerst die quantitativen Anteile ausgewählter Ionen an der Futterration analytisch bestimmt werden. Aus den ermittelten Werten lässt sich anhand verschiedener Formeln der 19

30 Literaturübersicht DCAD-Wert der Ration, das heißt die Differenz zwischen den alkalogenen Kationen und acidogenen Anionen, berechnen. Obwohl gemäß neueren Forschungsergebnissen Chlorid eine um 60% stärkere acidifizierende Aktivität hat als Sulfat (GOFF et al. 2004), findet in den meisten Fällen hierbei die Formel nach BEEDE (1992) und OETZEL (1993) Verwendung: DCAD (meq/kgts)=(meq Na + /kgts + meq K + /kgts) (meq Cl - /kgts + meq SO 4 2- /kgts). Für eine optimale prophylaktische Wirkung wird ein DCAD-Wert von 150 meq/kg TS (Milliäquivalent) bis 100 meq/kg TS angestrebt (BEEDE 1992, FÜRLL et al. 1996). Liegt der DCAD-Wert der Ration zu hoch, muss er durch die Zugabe von verschiedenen anionischen Salzen auf den gewünschten Wert gesenkt werden. Diese Verbindungen zeichnen sich dadurch aus, dass ihre Anionen (so genannte Strong Ions ) besser vom Körper resorbiert werden als ihre Kationen. Im Blut wird die Anwesenheit der Anionen durch vermehrte Präsenz von H + -Ionen ausgeglichen; d.h., der ph-wert des Blutes sinkt, es kommt zu einer metabolischen Acidose, die in der Regel kompensiert wird (GOFF u. HORST 2003). Infolgedessen sinkt auch der ph-wert im Urin ab. Da der Urin-pH-Wert negativ mit dem Calciumgehalt im Blut korreliert ist, lässt sich seine Messung in der Praxis dazu nutzen, um das Risiko einer Kuh, an Milchfieber zu erkranken, einzuschätzen (SEIFI et al. 2004). Als anionische Salze finden bei der Umsetzung des DCAD-Konzeptes vor allem Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Magnesiumchlorid und Magnesiumsulfat Verwendung. Aufgrund des schlechten Geschmackes dieser Substanzen ist es empfehlenswert, die Ration an die trockenstehenden Kühe als TMR (Total Mixed Ration) zu verfüttern (BEEDE 1992, FÜRLL et al. 1996), was sich aber aus arbeitstechnischen Gründen nur in relativ großen Betrieben verwirklichen lässt. Mit Ausnahme weniger anders lautender Berichte, die keine positiven Auswirkungen einer anionenreichen Fütterung ante partum feststellen konnten (SEYMOUR et al. 1992), konnte die Wirksamkeit dieser Methode in zahlreichen Studien belegt werden (ENDER et al. 1971; DISHINGTON 1975; BLOCK 1984, GAYNOR et al. 1989; 20

31 Literaturübersicht FÜRLL et al. 1996, OETZEL et al. 1988, JOYCE et al. 1997), über das Wirkprinzip besteht allerdings Uneinigkeit. Bedingt durch den oft sehr hohen Kalium- und Natriumgehalt der verwendeten Futtermittel wird eine metabolische Alkalose verursacht. Diese bewirkt möglicherweise eine verminderte Ansprechbarkeit der PTH-Rezeptoren in Niere und Knochen (GOFF et al. 1991), wodurch es zu einer Verzögerung in der Bildung von Calcitriol kommt. Das Tier ist nicht in der Lage, den Calciumverlust über aktive Resorption rechtzeitig auszugleichen, und der Spiegel des im Blut vorhandenen Calciums sinkt unter den Referenzwert von 2,1-2,7 mmol/l ab (MARTIG 2002). Für diese Theorie spricht, dass Kühe, die an Milchfieber erkranken, genauso hohe PTH-Spiegel im Blut aufweisen wie nicht betroffene Tiere (HORST et al. 1978). Logische Schlussfolgerung aus dem eben Geschilderten ist, dass eine acidotische Stoffwechselsituation die Fähigkeit des Organismus, auf Calciumverluste zu reagieren, verbessern muss. Eine andere Theorie besagt, dass durch die Fütterung anionenreicher Diäten eine Stimulation der Calciummobilisierung aus dem Skelettsystem erfolgt. Die diesbezüglich in der Literatur gemachten Aussagen sind jedoch widersprüchlich. Eine erhöhte Hydroxyprolinkonzentration, die allgemein als Indikator für vermehrten Knochensubstanzabbau angesehen wird, konnte teilweise im Blut bzw. im Harn anionenreich gefütterter Kühe festgestellt werden (GOFF et al. 1991); dieser Effekt trat aber in anderen Studien nicht auf (VAN MOSEL 1994; JOYCE et al. 1997). Auch Untersuchungen der Knochenmorphologie führten zu unterschiedlichen Ergebnissen. Während ABU DAMIR et al. (1994) feststellten, dass in Knochenbiopsien von Kühen, die ante partum eine acidifizierende Diät erhalten hatten, signifikant mehr Knochensubstanz abgebaut worden war als bei alkalisch gefütterten Tieren, gab es bei VAN MOSEL (1994) keine Hinweise auf vermehrte Mobilisation von Knochensubstanz. SCHONEWILLE et al. (1994) machten in einer Calciumbilanzstudie die interessante Entdeckung, dass ein durch Chloridzusatz erreichter niedriger DCAD-Wert der Ration zu einer Erhöhung der intestinalen Calciumresorption und zu einer deutlichen 21

32 Literaturübersicht Steigerung der Calciumausscheidung über den Harn führt. Ein ähnlicher Effekt konnte bei Schafen beobachtet werden (BRAITHWAITE 1972) Calciumsupplementierung im peripartalen Zeitraum Eine weitere weit verbreitete Methode, der Entstehung von Milchfieber vorzubeugen, besteht darin, gefährdeten Kühen über einen Zeitraum von ca. 48 h rund um den Partus wiederholt große Mengen an Calcium oral zu verabreichen. Die erfolgreiche Anwendung der beschriebenen Prophylaxe-Methode setzt somit voraus, dass der Zeitpunkt der Abkalbung präzise vorausgesagt werden kann, was vom Tierhalter ein hohes Maß an Genauigkeit und persönlichem Engagement fordert. Üblicherweise erfolgt dann die erste Calciumgabe ca. 12 h vor dem erwarteten Geburtszeitpunkt, die zweite direkt nach dem Abkalben, die dritte und vierte ca. 12 h bzw. 24 h post partum. Die Menge des mit jeder Applikation zugeführten Calciums liegt bei je ca. 50 g (MARTIG 2002). Im Handel sind zu diesem Zwecke verschiedene Präparate erhältlich, wobei es sich zumeist um Boli, Emulsionen oder Gele mit Calcium in unterschiedlichen Formulierungen handelt, wobei die Verfügbarkeit zumindest von CaCl 2 sich zwischen den unterschiedlichen Darreichungsformen nicht wesentlich unterscheidet (OETZEL et al. 1998; FÜRLL u. OETZEL 2003). Calciumchlorid findet am häufigsten Verwendung, da es kostengünstig ist und auf sein Gewicht bezogen einen hohen Anteil an Calcium besitzt. Nach peroraler Applikation dieser Substanz kommt es zu einem schnellen Anstieg der Calciumkonzentration im Blut, ein Effekt, der nach Verabreichung von Calciumcarbonat oder Calciumborogluconat nicht eintritt (GLAWISCHNIG 1962). QUEEN et al. (1993) konnten ebenfalls zeigen, dass die Applikation von CaCl 2 innerhalb von fünf Minuten zu einem signifikanten Anstieg der Calciumkonzentration im Blut führte. 22

33 Literaturübersicht Als erstem gelang es HALLGREN (1965), in einer Studie die Milchfieberinzidenz durch die Eingabe einer CaCl 2 -Lösung von 62% auf 28% zu senken. RINGARP et al. (1967) hatten mit der Methode ebenfalls Erfolg; sie verabreichten das Calciumchlorid jedoch in einem Hydroxyethylzellulosegel, um das Auftreten von Aspirationspneumonien zu verhindern, zu denen es bei HALLGREN (1965) wiederholt gekommen war. Während in ihrer Studie das CaCl 2 noch über fünf bis zehn Tage eingegeben wurde, entwickelten JÖNSSON und PEHRSON (1970) das oben geschilderte Behandlungsprotokoll mit vier Applikationen rund um den Geburtszeitpunkt. Seitdem ist die gute Wirksamkeit dieser Methode zur Milchfieberprophylaxe in mehreren Studien belegt worden (SIMESEN u. HYLDGAARD-JENSEN 1971; GOFF et al. 1996; OETZEL 1996; PEHRSON et al. 1998). Allerdings ist CaCl 2 auch in Gelform stark schleimhautreizend, was dazu führen kann, dass die Tiere sich bei wiederholter Eingabe heftig wehren. Weiterhin wurde wiederholt nachgewiesen, dass es durch die Verabreichung zu starken Epithelreizungen bis hin zu Nekrosen im Vormagensystem kommen kann (PEHRSON u. JÖNSSON 1990; WENTINK u. VAN DEN INGH 1992). Besonders stark dürfte diese schädigende Wirkung bei verlangsamter Vormagenmotorik, wie sie bei Hypocalcämie häufig gegeben ist, in Erscheinung treten. Als Alternative zu Calciumchlorid findet Calciumpropionat Verwendung, dessen Wirksamkeit von GOFF et al. (1996) belegt werden konnte. Es wirkt nicht nur weniger reizend, sondern man verspricht sich davon zusätzlich eine Verbesserung der Energieversorgung des Tieres, denn Propionat ist eine glucoplastische Substanz. Ferner hat es nicht so starke Auswirkungen auf den Säure-Basen-Status des Tieres wie CaCl 2 (GOFF u. HORST 1993). Die Wirksamkeit von Calciumpropionat ist dabei durchaus mit der von Calciumchlorid vergleichbar (GOFF u. HORST 1994; PEHRSON et al. 1998). Als Calciumquellen in kommerziell erhältlichen Präparaten finden weiterhin Verwendung Calciumformiat und -acetat und, als Beimischung zu CaCl 2 (Bovikalc - Bolus), auch CaSO 4. 23

34 Literaturübersicht Bezüglich der Wirkungsweise dieser Methode der peripartalen Supplementierung mit diversen Calciumsalzen geht man davon aus, dass durch die Zufuhr großer Calciummengen und der daraus folgenden Erhöhung der Calciumkonzentration in den Ingesta der Blutspiegel durch passive Diffusion aus dem Intestinaltrakt erhöht wird (GOFF 2004). Interessant ist in diesem Zusammenhang jedoch die Tatsache, dass in der Mehrzahl der kommerziell erhältlichen Präparate CaCl 2 und damit Chlorid enthalten ist, eine Substanz, die in Form von Ammoniumchlorid oder Magnesiumchlorid auch in der Durchführung des DCAD-Konzeptes eine wichtige Rolle spielt. Damit liegt der Gedanke nahe, dass bei den diversen in der Milchfieberprophylaxe eingesetzten Calciumsalzen die enthaltenen Anionen per se eine stimulierende Wirkung auf den transepithelialen Calciumtransport haben. In der Tat existieren in der Literatur Hinweise darauf, dass Chlorid eine den Calciumhaushalt des Rindes positiv beeinflussende Wirkung hat, die nicht bedingt ist durch eine Veränderung des Säure-Basen-Haushaltes. ROCHE et al. (2002) konnten nämlich feststellen, dass Kühe, die ante partum MgSO 4 oder MgCl 2 erhalten hatten, signifikant seltener an klinischer Hypocalcämie erkrankten als solche, denen MgO verabreicht worden war, obwohl der DCAD-Wert in der Ration bei +140 bis +200 meq/kg TS gelegen hatte und damit weit von den empfohlenen 150 meq/kg TS entfernt war. Die Supplementierung von Schafen mit Ammoniumchlorid bewirkte eine verbesserte Calciumresorption aus dem Magen-Darm-Trakt (BRAITHWAITE 1972). Bei funktionellen Untersuchungen am Pansenepithel von Schafen konnte ebenfalls ein stimulierender Effekt von Chlorid auf die Calciumresorption festgestellt werden, wobei am Pansenepithel von anionenreich gefütterten Schafen eine höhere Calcium- Nettoresorption auftrat als bei Kontrolltieren (LEONHARD-MAREK et al. 2000). Funktionelle Untersuchungen auf Epithelebene zum Transport von Calcium im Reticulorumen des Rindes sind jedoch bis dato nicht durchgeführt worden. 24

35 Literaturübersicht Aus diesen Darstellungen bezüglich der Resorption von Calcium im Magen-Darm- Trakt des Rindes und der verschiedenen Methoden zur Milchfieberprophylaxe erschien es sinnvoll zu überprüfen, welche Rolle dem Pansen des Rindes in der Resorption von Calcium zukommt, auf welche Art dieser Transport erfolgt und welchen Einfluss die Anionen diverser Calciumsalze auf dort eventuell lokalisierte aktive Transportmechanismen haben. 25

36 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Tiere Bei den Rindern, von denen die Pansenepithelien gewonnen wurden, handelte es sich zum überwiegenden Teil um Tiere, die auf dem Schlachthof Hannover zu kommerziellen Zwecken geschlachtet wurden; lediglich zwei Rinder waren Versuchstiere der FAL Braunschweig, die primär für andere Versuchsvorhaben gehalten und geschlachtet wurden. Über die Haltung und Fütterung der Tiere war nichts Näheres bekannt. 3.2 Ussing-Kammer-Technik Präparation der Pansenepithelien Die Tiere wurden mit einem handelsüblichen Bolzenschussapparat betäubt und durch Entblutung per Halsschnitt getötet. Nach Entnahme des Magen-Darm-Konvolutes wurde mit einer Schere Gewebe aus dem ventralen Pansensack links kranial des kaudalen Pansenpfeilers gewonnen, mit 40 C warmem Puffer gespült und in 38 C warmer Pufferlösung aufbewahrt. Sowohl zum Spülen als auch zum Transport fand hierbei ein SCFA-Puffer Verwendung (Zusammensetzung siehe Tab. 2). Die Transportdauer zum Labor variierte zwischen 10 und 50 min. Nach Vorpräparation mit einer Schere wurde dort die Pansenschleimhaut manuell von der darunterliegenden Muskelschicht gestrippt, anhaftendes Bindegewebe wurde möglichst vollständig per Schere abpräpariert und das Epithel in die vorbereiteten Ussing-Kammern eingespannt. 26