The cellular life-death decision how mitochondrial membrane proteins can determine cell fate

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1 Entscheidung über Leben und Tod wie mitochondriale The cellular life-death decision how mitochondrial membrane proteins can determine cell fate García-Sáez, Ana J. Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme, Standort Stuttgart, Stuttgart Korrespondierender Autor Zusammenfassung Lebende Organismen haben eine sehr wirksame Methode, überflüssige oder potenziell gefährliche Zellen zu zerstören: den programmierten Zelltod. Wissenschaftler um Ana García-Sáez interessieren sich für die der Apoptose zugrunde liegenden Prozesse, insbesondere für ein Protein namens Bax, welches Poren in der äußeren Mitochondrienmembran öffnet und damit den programmierten Zelltod unabwendbar einleitet. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen bei der Entwicklung neuer Medikamente für die Bekämpfung von Krebs helfen, da Krebszellen meistens für diese Art des Zelltods desensibilisiert sind. Summary Living organisms have a very effective method for eliminating cells that are no longer needed: programmed death. Researchers in the group of Ana García Sáez work with a protein called Bax, a key regulator of apoptosis that creates pores with a flexible diameter inside the outer mitochondrial membrane. This step inevitably triggers the final death of the cell. These insights into the role of important key enzymes in setting off apoptosis could provide useful for developing drugs that can directly influence apoptosis. Schlüsselenzyme bei der Einleitung des programmierten Zelltods Der Prozess der Apoptose auch programmierter Zelltod genannt ist ein streng geregelter physiologischer Vorgang, bei dem einzelne Zellen planmäßig sterben. Dieser Vorgang spielt für eine Vielzahl von biologischen Prozessen eine wichtige Rolle, denn so werden überflüssige oder potenziell gefährliche Zellen, wie zum Beispiel Krebszellen oder von Viren befallene Zellen, schonend entfernt. Außerdem ist die Apoptose wichtig für eine korrekte Embryonalentwicklung und für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase, also für die Balance zwischen neu gebildeten und absterbenden Zellen in einem Organ. Dies gilt besonders für das Immunsystem. Immunzellen müssen dahingehend überprüft werden, ob sie nicht versehentlich körpereigene Moleküle anstatt Krankheitserreger erkennen. Zellen, die körpereigenes Material erkennen, müssen aussortiert werden, um dann mittels Apoptose entsorgt zu werden. Eine Störung der apoptotischen Prozesse hat weitreichende Konsequenzen für jeden Organismus. Krebszellen sind oft desensibilisiert gegenüber der 2014 Max-Planck-Gesellschaft 1/6

2 Apoptose und können daher ungehindert wachsen, sich vermehren und streuen. Im Gegensatz dazu ist aber auch eine erhöhte Zelltodaktivität schädlich, da dies zu unkontrolliertem Gewebesterben führen und beispielsweise nach einem Herzinfarkt die Herzfunktion beeinträchtigen kann. Registriert eine Zelle ein Todessignal, so wird zunächst die Berechtigung dieses Befehls überprüft. Diese Aufgabe übernehmen sogenannte Bcl-2-Proteine, die entscheiden, ob der Zelltod eingeleitet wird. Proteine der Bcl-2-Familie können miteinander wechselwirken und dadurch entweder fördernd oder hemmend auf die Apoptose wirken. Überwiegt die Anwesenheit von inhibierenden Familienmitgliedern (z. B. Bcl-2 oder Bcl-xL), bleibt die Funktionsfähigkeit der Mitochondrien erhalten und die Apoptose wird verhindert. Überwiegen Apoptose-fördernde Proteine (z. B. Bax oder Bak), kommt es zu einer Ausschüttung pro-apoptotischer Moleküle, wie etwa Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma [1] und der Zelltod wird unumkehrbar durchgeführt. Um zur Heilung von Krankheiten in die Apoptose eingreifen zu können, ist zunächst ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Abläufe nötig. Die Arbeitsgruppe um Ana García Sáez untersucht daher verschiedene Bcl-2-Proteine hinsichtlich ihrer Struktur, Funktion und Wechselwirkungen untereinander. Bax macht die Mitochondrienmembran während der Apoptose durchlässig A bb. 1: Schem atische Darstellung, wie Bax die Mitochondrienm em bran im Rahm en der Apoptose durchlässig m acht. Die m olekularen Details wie Struktur, Funktion und die Wechselwirkungen verschiedener Bcl-2-Proteine m iteinander sind noch nicht vollständig verstanden. Max-Planck-Institut für Intelligente System e / García-Sáez Das proapoptotische Bcl-2-Protein Bax nimmt eine Schlüsselfunktion während der Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran ein. In gesunden Zellen liegt Bax hauptsächlich als inaktives Monomer im Zytoplasma der Zelle vor, wobei einige Bax-Moleküle reversibel an die äußere Mitochondrienmembran gebunden sind. Sobald die Apoptose eingeleitet wird, verändert sich Bax. Die meisten Bax-Proteine wandern 2014 Max-Planck-Gesellschaft 2/6

3 zu den Mitochondrien und binden sich irreversibel an sie. Dabei bildet Bax Oligomere, die Poren in der äußeren Mitochondrienmembran eröffnen. So wird die Membran durchlässig für proapoptotische Proteine wie zum Beispiel Cytochrom c gemacht. Im Zytosol kann Cytochrom c mit anderen Proteinen einen Komplex bilden und so spezielle Proteasen aktivieren, was zum Abbau der Zelle und dem Zelltod führt. Die molekularen Details der dabei stattfindenden Prozesse sowie die Struktur des Membran-insertierten Bax- Proteins sind dabei nicht vollständig verstanden (siehe Abb. 1). Untersuchungen zum molekularen Mechanismus von Bax mithilfe quantitativer Mikroskopie Mithilfe verschiedener mikroskopischer Verfahren wurde die Struktur und Funktion von Bax untersucht, um zu verstehen, wie genau das Protein die äußere Mitochondrienmembran während der Apoptose durchlässig macht. Mitochondrien sind Organellen der Zelle, die von einer doppelten Membran umgebenen sind und Netzwerke innerhalb der Zelle bilden. Für ihre mikroskopischen Untersuchungen nutzen die Forscher spezielle künstliche Membranen. Diese sogenannten GUVs (giant unilamellar vesicles) sind von einer einzigen Membran umgeben, deren Zusammensetzung kontrolliert werden kann. Sie sind in etwa so groß wie eine Säugetierzelle und daher unter dem Lichtmikroskop gut zu erkennen (siehe Abb. 2). A bb. 2: Bax m acht Mem branen durchlässig. Die weißen Pfeile kennzeichnen künstliche Riesenvesikel (runde Kreise), in welche nach Einbau von Bax dunkelgrüne Um gebungsfarbe eingeström t ist. Max-Planck-Institut für Intelligente System e / Gallego Um eine statistisch haltbare Aussage zu treffen, analysierten die Forscher Hunderte von Vesikeln vor und nach Zugabe von Bax. Hierbei konnten sie die Porenentstehung direkt untersuchen. Mit ihrem Versuchsaufbau gelang es ihnen, die in der Membran stattfindenden Prozesse über die Bindungsaffinität der Proteine zur Membran, den Grad der Membrandurchlässigkeit sowie die Kinetik, Stabilität und Größe der aus Bax- Proteinoligomeren bestehenden Membranporen genau zu beschreiben [2, 3] Max-Planck-Gesellschaft 3/6

4 Als zweite Untersuchungsmethode nutzen die Wissenschaftler die sogenannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS). Diese Methode erlaubt es, einzelne Moleküle unter die Lupe zu nehmen, die zuvor chemisch verändert wurden, so dass sie bei Lichteinfall farbig leuchten (fluoreszieren). Mittels FCS können Forscher beobachten, inwieweit verschiedene markierte Moleküle miteinander in Kontakt treten. Dazu beleuchten die Wissenschaftler beispielsweise einen winzigen Bereich auf der Zelloberfläche mit einem Laserstrahl. Wenn das zu untersuchende Molekül in den Lichtstrahl tritt, kann man mit einem Messgerät das Fluoreszenzsignal des Moleküls messen. Kleine Moleküle durchqueren den Laserstrahl schnell, während größere Moleküle länger brauchen. Anhand der Fluoreszenz und der Molekülgeschwindigkeit konnten die Forscher einerseits die Menge der gebildeten Bax-Komplexe innerhalb der Membran im Verhältnis zur Porenaktivität analysieren (siehe Abb. 3). Andererseits konnten sie den Einfluss der Membran auf die Bildung von Bcl-2-Proteinkomplexen aufdecken [2, 4]. A bb. 3: Die Verlagerung von Bax (grün) in Mitochondrien (lila) während der Apoptose. Während Bax nach 40 Minuten noch im gesam ten Zellplasm a verteilt vorliegt, ist es nach 80 Minuten gänzlich an die Mitochondrienm em bran gewandert. Max-Planck-Institut für Intelligente System e / Bleicken Bax bildet stabile Poren unterschiedlicher Größe Eines der Rätsel in der Apoptoseforschung ist die Frage, wie genau Bax die Membrandurchlässigkeit in Mitochondrien vermittelt. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht gelungen, durch Apoptose entstandene Löcher in der Mitochondrienmembran sichtbar zu machen. Die Annahme, Bax sei direkt für den Aufbau solcher Poren verantwortlich, basiert auf der Beobachtung, dass das Protein eine porenbildende Funktion in künstlichen Membranen einnimmt. Allerdings gibt es auch antiapoptotische Bcl-2-Proteine, die eigentlich der Apoptose entgegensteuern, aber bekanntermaßen Poren in künstlichen Membranen bilden. Dieses Rätsel konnte durch Untersuchungen an einzelnen Vesikeln 2013 gelöst werden [2]. Die Forscher konnten zeigen, dass Bax Poren in Liposomenmembranen einführt, die den Durchfluss von Cytochrom c durch die Membran erlauben. Diese Poren sind größer und langlebiger als solche Poren, die durch den Bax-Antagonisten Bcl-xL gebildet werden. Bax beeinflusst die Mitochondrienmembran also stärker als BclxL, welches nur vorübergehend auf die Membranstruktur wirkt. Da die äußere Mitochondrienmembran auch sonst für kleinere Moleküle durchlässig ist, ist der Einfluss von Bcl-xL auf die normale Membranfunktion vernachlässigbar. Die Forscher haben auf Basis ihrer Messergebnisse unterschiedliche Modelle erstellt, die ein mögliches Aussehen der Membranporen beschreiben, welche während der Apoptose die Ausschüttung von Cytochrom c vermitteln. Eines dieser Modelle besagt, dass sowohl Proteine als auch Lipide am Kanalaufbau beteiligt sind. Dies würde bedeuten, dass Bax-Poren durch die Eigenschaften der am Membranaufbau beteiligten Lipide beeinflusst werden. Gleichzeitig würde es den dynamischen Auf- und Abbau der Poren sowie ihre nicht klar erkennbare Form erklären. Laut diesem Modell könnten Bax-Membrankanäle unterschiedlich groß sein [3]. Zur 2014 Max-Planck-Gesellschaft 4/6

5 Überprüfung dieser Aussage untersuchten die Forscher einzelne GUVs, zu denen Sie immer größere Mengen Bax zugaben. Sie beobachteten, dass bei geringen Bax-Mengen nur kleinere Proteine auch ins Innere der Liposomen aufgenommen wurden. Mit steigender Bax-Menge gelangten jedoch auch die größeren, andersfarbig markierten Proteine ins Innere der GUVs. Daraus lässt sich schließen, dass eine zunehmende Menge an Bax-Proteinen sich an vorhandenen Bax-Kanälen anlagert, sich integriert und die Poren vergrößert. Ein solcher Mechanismus würde den Zellen auf elegante Art und Weise erlauben, die Durchlässigkeit der Mitochondrienmembran für apoptotische Proteine räumlich und zeitlich anzupassen. Strukturelle Organisation von Bax in der Membran Der genaue Funktionsmechanismus der Bax-Poren wird erst wirklich verständlich sein, wenn die dreidimensionale Struktur des Proteins in der Lipiddoppelschicht der Membran geklärt ist. Wichtige Informationen hierfür lieferten elektronenspinresonanz-spektroskopische Untersuchungen [5], mit denen die genauen Abstände zwischen den einzelnen Teilen im Bax-Protein gemessen werden können. Die Daten aus Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-Messungen wiederum zeigten, dass Bax in künstlichen Membranvesikeln Komplexe bilden kann [2]. Daraus kann geschlossen werden, dass der Prozess der Oligomerisierung in der Membran also die Aneinanderlagerung mehrerer strukturell gleicher Einheiten zu einem größeren Molekül einen wichtigen Schritt bei der Porenbildung einnimmt. Leider erschließt sich aus dieser Messung jedoch nicht, wie viele Bax-Moleküle jeweils eine Pore bilden. Hinweise dazu liefern molekulare Helligkeitsanalysen, basierend auf speziellen Mikroskopie- und Spektroskopie-Analysen. Aus der unterschiedlichen Helligkeit der einzelnen Bax-Proteine, die Teil der Membranpore sind, können Rückschlüsse auf die Anzahl und den Zusammenlagerungsprozess gezogen werden. Ergänzend nutzen die Forscher ein Rasterkraftmikroskop, welches die Membranoberfläche abtastet und so eine Art topographische Karte von der Membran mit Bax-Kanälen erstellen kann. Dabei arbeiteten die Wissenschaftler mit speziellen flachen Lipiddoppelschichten, die von der Zusammensetzung her der äußeren Mitochondrienmembran ähneln. Mit dieser Methode lassen sich Informationen über die mechanischen Eigenschaften der Membranen gewinnen. Vorher-Nachher-Untersuchungen zeigten, dass der Einbau von Bax die mechanischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht beeinflusst [6]. Langfristiges Ziel ist es, aus den vielen Puzzleteilen ein Gesamtbild zu erstellen, das erklärt wie Bcl-2-Proteine die Mitochondrienmembran während der Apoptose durchlässig machen. Hierzu fehlen noch mikroskopische Untersuchungen zum besseren Verständnis, wie die Aktivierung von Bax durch andere proapoptotische Proteine der Bcl-2-Familie genau erfolgt. Ziel ist es, das Gesamtnetzwerk der Protein-Wechselwirkungen zwischen sämtlichen Proteinen der Bcl-2-Familie im Zellinneren und in den Membranen zu bestimmen. Nur so kann ein mathematisches Modell erstellt werden, welches beschreibt, wie die Proteine der Bcl-2-Familie die Apoptose regulieren und wie Krebszellen es schaffen, diesem Selbstmordprogramm zu entwischen. Literaturhinweise [1] García-Sáez, A. J. The secrets of the Bcl-2 family Cell Death and Differentiation 19, (2012) 2014 Max-Planck-Gesellschaft 5/6

6 [2] Bleicken, S.; Wagner, C.; García-Sáez, A. J. Mechanistic differences in the membrane activity of Bax and Bcl-xL correlate with their opposing roles in apoptosis Biophysical Journal 104, (2013) [3] Bleicken, S.; Landeta, O.; Landajuela, A.; Basañez, G.; García-Sáez, A. J. Proapoptotic Bax and Bak proteins form stable protein-permeable pores of tunable size Journal of Biological Chemistry 288, (2013) [4] García-Sáez, A. J.; Ries, J.; Orzáez, M.; Pérez-Payà, E.; Schwille, P. Membrane promotes tbid interaction with BCL(XL) Nature Structural and Molecular Biology 16, (2009) [5] Bleicken, S.; Classen, M.; Padmavathi, P. V.; Ishikawa, T.; Zeth, K.; Steinhoff, H. J.; Bordignon, E. Molecular details of Bax activation, oligomerization, and membrane insertion Journal of Biological Chemistry 285, (2010) [6] Unsay, J. D.; Cosentino, K.; Subburaj, Y.; García-Sáez, A. J. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids 29, (2013) 2014 Max-Planck-Gesellschaft 6/6