Identifikation eines Modifikatorlocus für die Modulation des gp130-vermittelten STAT-Signalweges

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1 Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie I Abteilung Neuroanatomie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Identifikation eines Modifikatorlocus für die Modulation des gp130-vermittelten STAT-Signalweges INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2007 von Lutz Mittler geboren in Karlsruhe

2 Dekan Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Gutacher PD Dr. rer. nat. Matthias Kirsch 2. Gutachter A/Prof. Dr. sc. nat. ETH Matthias Ernst, Ph. D. Jahr der Promotion 2008

3 ÜBER DIE WISSENSCHAFT Eine Hauptursache der Armut in den Wissenschaften ist meist eingebildeter Reichtum. Es ist nicht ihr Ziel, der unendlichen Weisheit eine Tür zu öffnen, sondern eine Grenze zu setzen dem unendlichen Irrtum. Aus: Das Leben des Galilei ( ) von Bertolt Brecht ( ) Für meine Eltern und Brüder

4 Seite 1 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG ZYTOKINE UND IHRE REZEPTOREN Zytokine der IL-6-Familie Zytokinrezeptoren Signaltransduktion DAS GP130 STAT/ STAT -MAUSMODELL Die gp130 STAT -Mutation Phänotypen Signaltransduktion in der gp130 STAT -Maus Hintergrund-abhängiger Phänotyp Arbeitshypothese: Modifikatorlocus MATERIAL UND METHODEN MATERIAL Versuchstiere Mikrosatellitenmarker Oligonukleotide Enzyme Antikörper und Antisera Geräte und Filme Kits Fragmentlängenstandards Datenbanken Software METHODEN Mauszucht DNA-Methoden Trait Linkeage-Analyse mit Mikrosatellitenmarkern Bioinformatische Methoden Westernblot-Analyse von Lebergewebe ERGEBNISSE TRAIT-LINKEAGE-ANALYSE MIT MIKROSATELLITENMARKERN PCR mit Mikrosatellitenmarkern Haplotypen-Kartierung Kopplungsanalyse GENSEQUENZIERUNG Sequenzierung von SOCS Sequenzierung der Bindestellen von D17Mit Sequenzierung von Ctf Sequenzierung von Il

5 Seite 2 Inhaltsverzeichnis Sequenzierung von pkpna KREUZUNGSEXPERIMENT BALB/C STAT/WT C57BL/6J STAT/WT WESTERNBLOT-ANALYSEN Vergleichsanalyse von Lebergewebe 129T1/Sv-Ter wt/wt C57BL/6J wt/wt DISKUSSION AUSGANGSLAGE MIKROSATELLITENMARKER-ANALYSE Methode der Mikrosatellitenmarker-Analyse Intervall zwischen benachbarten Mikrosatellitenmarkern Grenzen der Mikrosatellitenmarker-Analyse Ausschluss des Chromosoms Y bei der Mikrosatellitenmarker-Analyse UNTERSUCHUNG DER ZUR VERFÜGUNG STEHENDEN GENOME Untersuchung des Hintergrundes C57BL/6J versus Balb/C Selektion geeigneter Versuchstiere und Genome Auswahl von Tieren zur Generierung zusätzlicher informativer Genome DIE KANDIDATENLOCI Kandidatenlocus um den Mikrosatellitenmarker D17Mit Kandidatenlocus um den Mikrosatellitenmarker D7Mit Kandidatenlocus um die Mikrosatellitenmarker D13Mit37 bis D13Mit LOD-SCORES UND KOPPLUNGSGRAPHEN POTENTIELLE KANDIDATENGENE Weitere Methoden zur Identifizierung von Kandidatengenen Il ErbB2ip AUSBLICK ZUSAMMENFASSUNG ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS LITERATURVERZEICHNIS ANHANG PROGRAMMCODES ZUR BERECHNUNG DES LOD-SCORES Programmcode func.r Programmcode analysis_me23.r

6 Seite 3 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Zytokine und ihre Rezeptoren Zytokine sind Proteine, die eine Vielzahl unterschiedlicher Aufgaben wahrnehmen. Sie fungieren sowohl als Akutphase-Mediatoren als auch als Regulatorproteine. Im Rahmen von Entzündungsreaktionen oder Immunantworten dienen sie der Kommunikation zwischen den beteiligten Zellen. Ihre Wirkung kann dabei sowohl auto- als auch parakrin sein. In verschiedensten Geweben nahezu im gesamten Körper vorkommend, können Zytokine sehr rasch synthetisiert und freigesetzt werden. Unter anderem steuern Zytokine bedeutende Zellfunktionen wie Proliferation, Differenzierung und Überleben. Sie binden an eine extrazelluläre Domäne spezifischer Rezeptoren der Zielzelle und lösen so eine intrazelluläre Signalkaskade aus (siehe dazu auch Kapitel und 1.1.3). Die Klonierung und biologische Analyse von Zytokinen brachten ein grundlegendes Verständnis deren Pleiotropie und Redundanz: Obwohl ein bestimmtes Zytokin in verschiedenen Zellen an den gleichen Rezeptorkomplex bindet, ruft ein und das gleiche Zytokin in verschiedenen Zelltypen sehr unterschiedliche und spezifische Antworten hervor. Sogar in der gleichen Zellart kann die Antwort auf ein bestimmtes Zytokin variieren, abhängig von der Lokalisation der Zelle und den Bedingungen in ihrem Mikroumfeld. Die molekulare Grundlage dieser Eigenschaften wird den Zytokinrezeptorkomplexen zugeschrieben. Sie enthalten zum einen eine signaltransduzierende Rezeptoruntereinheit, die von allen Mitgliedern einer Zytokinfamilie benutzt wird. Zum anderen enthalten sie Untereinheiten, die spezifisch für die Bindung von meist jeweils einem einzigen Zytokin sind [94] Zytokine der IL-6-Familie Die Familie der phylogenetisch verwandten Long-type-I -Zytokine, welche allesamt die gemeinsame Rezeptor-Untereinheit gp130 nutzen, umfasst LIF (Leucemia Inhibitory Factor), IL-6 (Interleukin 6), IL-11 (Interleukin 11),

7 Seite 4 Einleitung OsM (Oncostatin M), CT-1 (Cardiotrophin 1), CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor), CLC (Cardiotrophin-Like Cytokine) [22], Neurotrophin 1/B-Zell stimulierender Faktor 3 (NNT-1/BSF-3), Neuropoetin (NP) [43; 127; 215], IL-27 (Interleukin 27) [127], und IL-31 (Interleukin 31) [127]. Der Rezeptor des letztgenannten IL-31 enthält jedoch nicht gp130 selbst, sondern eine dem gp130 ähnliche, so genannte gp130-like (GPL) Rezeptor-Untereinheit [45]. Durch das Studium von transgenen- und Knock-out-Mäusen für verschiedene Elemente der gp130-signalkaskade konnte gezeigt werden, dass alle diese, auch IL-6-type -Zytokine genannten Proteine verschiedene wichtige Rollen bei der Regulation von komplexen zellulären Prozessen wie Proliferation und Differenzierung spielen [77]. Damit sind einzelne Familienmitglieder entscheidend an der Embryonalentwicklung und an den verschiedensten physiologischen Prozessen wie Hämatopoese, Entzündungsreaktionen, Entwicklung des Nervensystems, dem Überleben sowie an myokardialer und hypophysärer Proliferation beteiligt. Gp130-Zytokine spielen ferner bei der Zelltransformation und der Pathophysiologie vieler Tumoren eine wichtige Rolle [32]. Auch gibt es Evidenz dafür, dass diese Zytokine eine wichtige Rolle bei der Implantation beim Menschen spielen [174]. Die Zytokine der IL-6-Familie nutzen das Membranglykoprotein gp130 als Signalüberträger mittels des Jak/STAT Signalweges. Sie teilen sich gp130 als funktionelle Rezeptoruntereinheit und weisen daher nicht nur eine gewisse funktionelle Redundanz auf, sondern zeigen auch ähnliche biologische Effekte [22; 32; 76; 174]. Die beiden Zytokine IL-6 und IL-11 beispielsweise überschneiden sich in vielen Signaltransduktionsmechanismen. Dennoch weisen beide Zytokine auch Unterschiede in ihrer Wirkung auf: Im Gegensatz zur Behandlung von Patienten mit IL-6 führt rekombinantes humanens IL- 11 (rhil-11) nicht zum Anstieg der Körpertemperatur, was signifikante Unterschiede in der in-vivo-funktion dieser beiden Moleküle vermuten lässt. Diese sind durch die unterschiedlichen Expressionsmuster von IL-6R und IL-11R verursacht. Aktuelle Studien zeigen, dass IL-11 eine potente anti-inflammatorische Aktivität in einer Reihe präklinischer Tiermodelle

8 Seite 5 Einleitung für Krankheiten aufweist. rhil-11 reduziert dabei die Produktion proinflammatorischer Zytokine wie TNF und IL-12 durch aktivierte Makrophagen [211]. NNT-1/BSF-3 ist ein weiteres, relativ neu entdecktes Mitglied der gp130-zytokin-familie [127]. NNT-1/BSF-3 ist ein Ligand des trimeren CNTFR-Komplexes und aktiviert Jak- STAT-, MAPK- und PI3/Akt-Signalwege in verschiedenen Zellsystemen. Bislang sind für NNT-1/BSF-3 neurotrophe und B-Zell stimulierende Effekte, sowie die neuroimmunoendokrine Modulation kortikotropher Funktionen bekannt. Die zelluläre Sekretion von NNT- 1/BSF-3 erfordert die Bildung eines heterodimeren Komplexes mit anderen Faktoren, zum Beispiel CLF-1 oder scntfr [215]. CT-1 wurde bei der Suche nach Faktoren, welche Hypertrophie von Kardiomyozyten induzieren, identifiziert. Das Expressionsmuster von CT-1 und seine Effekte in hämatopoetischen, neuronalen und Entwicklungsuntersuchungen zeigen, dass CT-1 zusätzlich zu seinen Effekten in der Herzentwicklung und -hypertrophie auch eine wichtige Rolle in weiteren Organsystemen spielt [150]. Für CLC wurden recht außergewöhnliche Mechanismen in Bezug auf Sekretion und Rezeptor-Rekrutierung beschrieben. So konnte gezeigt werden, dass Koexpression von entweder CLF-1 oder CNTFR Voraussetzung für die Sekretion von CLC ist [46; 155; 186]. Abbildung 1: Tetrahelikale hil-6-struktur [12-14; 151; 165; Abbildung 2: hil-6 (Aufsicht) [11; 22-24; 57; 216]

9 Seite 6 Einleitung Abbildung 3: OsM [12-14; 42; 151; Abbildung 4: Struktur von CNTF (4 Moleküle) [12-14; 115; 151; 163] Die Mitglieder der IL-6-Zytokin-Familie weisen strukturell vier lange -Helices auf, welche mit A, B, C und D benannt werden (siehe hierzu Beispiele in den Abbildungen 1 bis 4). Während IL-6 (Abbildungen 1 und 2) und vermutlich auch IL-11 ausschließlich gestreckte Helices enthalten, findet sich bei OsM (Abbildung 3) und CNTF (Abbildung 4) ein Knick in der A-Helix [24; 42] Zytokinrezeptoren Viele Rezeptoren für lösliche Faktoren, die eine Funktion im Immun- oder hämatopoetischen System erfüllen, gehören zur Familie der Zytokinrezeptoren. Sie sind mit Januskinasen und oft zusätzlich auch noch mit anderen Tyrosinkinasen assoziiert, welche durch Ligandeninduzierte Dimerisierung ihrer Rezeptorkomponenten aktiviert werden. Die Aktivierung dieser Januskinasen verbindet die Rezeptoren an der Zelloberfläche funktionell mit den Genen im Zellkern [203]. Funktionelle Zytokinrezeptoren sind transmembrane Proteinkomplexe, welche bei Bindung eines Liganden ein Signal ins Innere der jeweiligen Zelle übertragen. Üblicherweise weisen diese Moleküle ein hydrophobes Segment von etwa Aminosäuren Länge auf. Dieses Segment durchspannt die Membran in Form einer Helix, was die topographische Aufteilung der Rezeptoren in einen extra- und einen intrazellulären Anteil erlaubt. Durch Ausnutzung zweier verschiedener Epitope überspannen die Zytokine zwei Rezeptorketten, was wiederum zu einer engen Annäherung des interzellulären Teils und damit zur Auslösung der Signalkaskade führt. Der Dimerisationsvorgang wird für das entscheidende Ereignis gehalten,

10 Seite 7 Einleitung durch welches das Signal von der extra- auf die intrazelluläre Seite der Zellmembran übertragen wird [65]. Zytokinrezeptoren werden normalerweise nur in vergleichsweise geringer Zahl exprimiert und benötigen die Kooperation einer oder mehrerer Untereinheiten, um eine hohe Affinität zum Zytokin und damit eine zuverlässige Signaltransduktion zu gewährleisten. Die Zytokinrezeptoren konnten, in Abhängigkeit von ihrer Struktur und ihrer Aminosäure-Sequenz, in verschiedene Superfamilien eingeordnet werden. Die größte Gruppe bilden dabei die so genannten Typ-I-Zytokinrezeptoren [22]. Die überwiegende Mehrheit der Zytokinsignale wird von gemeinsam genutzten Rezeptoruntereinheiten vermittelt. Diese Einheiten bilden die zentrale signaltransduzierende Komponente in Komplexen höherer Ordnung. Solche Rezeptorkomplexe nehmen eine duale Aufgabe wahr: Sie erkennen die Zytokine und formieren multimere Signaleinheiten. Bislang existieren von den bekannten gemeinsamen Rezeptoreinheiten lediglich für gp130 detaillierte Informationen zu Struktur und Funktion [21] Typ-I-Zytokinrezeptoren und gp130 Auch Rezeptoren für Zytokine der IL-6-Familie können in nicht-transduzierende -Rezeptor- Untereinheiten (IL-6R, IL-11R und CNTFR ) und signaltransduzierende Rezeptor- - Untereinheiten (gp130, LIFR, OsMR ) unterteilt werden. Letztgenannte binden Januskinasen und werden nach Stimulation durch den Zytokinliganden an verschiedenen Tyrosinresten phosphoryliert [76]. Abbildung 5 zeigt die Rezeptorkomplexe für die einzelnen Zytokine der IL-6-Familie. In der Abbildung wird deutlich, dass alle Rezeptorkomplexe gp130 enthalten. Eine 1995 von Kanji Yoshida (Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, Osaka, Japan) hergestellte gp130 -/- -Maus erwies sich als nicht lebensfähig. Diese Tiere starben zwischen Tag 12,5 p.c. und dem errechneten Geburtstermin. Bei gp130 -/- -Embryonen findet sich eine stark verminderte Anzahl pluripotenter hämatopoietischer Vorläuferzellen in der Leber sowie differenzierter Zelllinien wie z.b. T-Zellen im Thymus. Ferner findet man bei diesen Embryonen ein ventrikulär hypoplastisches Myocard [222]. Dies muss als weiteres Indiz für die große Bedeutung dieser Rezeptor-Untereinheit gewertet werden.

11 Seite 8 Einleitung Diejenigen Rezeptorkomplexe, welche als Liganden Zytokine der Interleukin-6-Familie binden, besitzen eine gp130-untereinheit und gehören zur so genannten Gruppe-1 -Zytokinrezeptor-Superfamilie. Die Mitglieder dieser Superfamilie weisen untereinander strukturelle Ähnlichkeiten auf [81; 84]. Abbildung 6 zeigt die Struktur von gp130. Abbildung 5: Rezeptorkomplexe von Zytokinen der IL-6 Familie. Aus [76]. Das Glykoprotein gp130 fungiert als ( -)Rezeptor-Untereinheit von Typ-I-Zytokinrezeptoren, welche für Liganden aus der IL-6-Familie spezifisch sind. In einer Vielzahl unterschiedlichster Zellen (zum Beispiel Hepatozyten, Kardiomyozyten, Neurone, Erythroblasten) ist gp130 so an der Signaltransduktion zytokinvermittelter, zelltyp-spezifischer Aktivitäten beteiligt [58]. Abbildung 6: Die Struktur von gp130 [12-14; 36; 151; 162]

12 Seite 9 Einleitung Da gp130 ubiquitär exprimiert wird, scheinen Zeit und Ort von gp130-vermittelten Zellfunktionen in vivo durch die räumlich und zeitlich regulierte Expression von den zytokinbindenden - Rezeptoruntereinheiten bzw. der Zytokine selbst reguliert zu werden [32]. IL-6, IL-11 und CNTF binden zunächst spezifisch an ihre jeweilige -Rezeptor-Untereinheit. Nur der Komplex aus Zytokin und zugehörigem -Rezeptor ist im Fall dieser Zytokine in der Lage, an die signaltransduzierende Untereinheit zu binden. Auch für CT-1 wurde die Existenz einer spezifischen -Untereinheit postuliert [166]. Da jedoch bislang kein entsprechendes Rezeptorprotein kloniert werden konnte, gilt dessen Existenz weiterhin als fraglich [76]. LIF und OsM hingegen binden direkt an ihren signaltransduzierenden Rezeptor, ohne dass hierzu eine -Untereinheit erforderlich ist [77; 186]. Alle Zytokine der IL-6-Familie verfügen über eine Site II -Sequenz, welche mit der CBM- Sequenz (cytokine binding module) von gp130 interagiert. Der jeweils zweite Signalrezeptor, also entweder das zweite gp130 oder LIFR bzw. OsMR bindet an die so genannte Site III - Sequenz [77]. Site III wird von der Immunglobulin-ähnlichen (Ig-like) Domäne von gp130, LIFR beziehungsweise OsMR erkannt [73; 103; 147; 208]. Folglich sind auch im gp130-homodimer zwei verschiedene Epitope an der Ligandenerkennung beteiligt [153]. Bei Beteiligung eines -Rezeptors am Gesamtkomplex bindet dieser mit seinem CBM an die Site I - Sequenz des entsprechenden Zytokins [77]. Die beschriebenen Erkenntnisse wurden größtenteils innerhalb der letzten zehn Jahre erlangt und warfen eine Reihe neuer Fragen auf. Wissenschaftler beschäftigen sich seither mit der Aufklärung der Signalwege oben genannter Zytokine und Zytokinrezeptoren sowie mit ihrer Wirkung in verschiedenen Zelltypen und Geweben. Einen wesentlichen Fokus stellt dabei nach wie vor die gp130-untereinheit dar. Zunächst wurde die Rolle von gp130 für die Signaltransduktion an Hand von verschiedenen Zelllinien in vitro, wie zum Beispiel an embryonalen Stammzellen, Hepatozyten und Makrophagen erforscht [51; 83; 211]. Bereits die Untersuchungen an diesen Zelllinien zeigten, dass nach Rezeptor-Liganden-Interaktion intrazellulär zumindest zwei unabhängige Signalwege aktiviert werden, was in vitro die pleiotrope Aktivität zumindest teilweise erklären konnte [60].

13 Seite 10 Einleitung Lösliche Zytokinrezeptoren Einige Rezeptorelemente für Zytokine der IL-6-Familie existieren auch in löslicher, also nicht-membranständiger Form. Der Komplex aus einem Zytokin und seiner -Rezeptor-Untereinheiten agiert dabei wiederum als Zytokin an Zellen, welche für diesen Komplex spezifische Rezeptoren exprimieren [84]. Die löslichen Formen entstehen in vivo durch limitierte Proteolyse, das so genannte shedding von membranständigen Rezeptoren oder durch alternatives Spleißen der entsprechenden mrna [77]. Forscher arbeiten seit längerem an der Identifizierung und der Aufklärung der regulatorischen Eigenschaften dieser löslichen Zytokinrezeptoren. Sie binden ihre Liganden mit gleicher Affinität wie die membranständigen Rezeptoren und verlängern dadurch effektiv die Halbwertzeit der Zytokine, welche sie binden [96]. Bislang wurden lösliche Formen von CNTFR (scntfr ), IL-11R (sil-11r ), IL-6R (sil-6r ) und gp130 (sgp130) beschrieben [76; 108]. Alle löslichen -Rezeptor-Untereinheiten fungieren als Agonist an Zellen, in welchen die entsprechende membranassoziierte - Untereinheit nicht exprimiert ist. Diese Eigenschaft wird Transsignaling genannt. Dagegen fungiert sgp130 als spezifischer Transsignaling-Antagonist [126] Signaltransduktion Die Bindung eines Liganden an einen gp130-haltigen Rezeptor führt zur Aktivierung multipler intrazellulärer Signaltransduktionsmechanismen wie zum Beispiel der STAT-, Ras- MAPK- und PI-3-Kinase-Wege, deren Aktivierung von bestimmten Bereichen des gp130 reguliert wird [85]. Obgleich alle IL-6-type Zytokine die gleichen Signalwege aktivieren, zeigt ein Vergleich ihrer physiologischen Eigenschaften, dass sie vielfältige und komplexe biologische Antworten hervorrufen [77].

14 Seite 11 Einleitung Nach der Bindung des Liganden kommt es zur Assemblierung der Rezeptor-Komplexe, insbesondere zur Dimerisierung von zwei -Untereinheiten. Dies wiederum führt zur Aktivierung von rezeptorassoziierten Kinasen der Janus-Familie und zur Rekrutierung und Phosphorylierung von Proteinen mit SH2-Domänen wie z.b. zwei Transkriptionsfaktoren der STAT-Familie. Phosphoryliertes STAT1 und/oder STAT3 dimerisieren und translozieren in den Nukleus. Dort binden sie an spezifische DNA-Sequenzen in Zielgenen, was wiederum zur Transkription dieser Gene führt. Die wichtigen Player im gp130-signalweg sind neben den Zytokinen und den Rezeptorkomponenten, ferner die Januskinasen Jak1, Jak2 und Tyk2, die Signaltransduktoren und Transkriptionsaktivatoren STAT1 und STAT3 sowie die Tyrosinphosphatase SHP2 (SH2 domain-containing tyrosine phosphatase) [76]. Neben einer Aktivierung des Jak-STAT-Signalweges kann ein Zytokinrezeptorkomplex gleichzeitig auch noch mehrere weitere Signaltransduktionswege aktivieren. Je nach Zelltyp haben die unterschiedlichen, von ein und demselben Zytokinrezeptorkomplex aktivierten Signalwege ergänzende oder auch gegensätzliche Wirkungen auf die Zielzelle. Diese gegensätzlichen Wirkungen von einem einzelnen Zytokin sind so abgestimmt, dass sie eine einheitliche biologische Antwort in der entsprechenden Zielzellart auslösen [94]. An der Terminierung der IL-6-type -Zytokin-Signale sind im einzelnen Tyrosinphosphatasen, Proteasomen, Jak-Kinase-Inhibitoren SOCS (suppressor of cytokine signaling), PIAS (protein inhibitors of activated STATs), und die Internalisierung des Zytokinrezeptors durch gp130 beteiligt (siehe Details in Abschnitt ) Ligand-Rezeptor-Interaktion und Dimerisierung Nach der zunächst niedrig-affinen, extrazellulären Bindung der Zytokine IL-6 und IL-11 an die membranständige (und für das jeweilige Zytokin spezifische) -Untereinheit geht diese mit der transmembranen -Untereinheit gp130 eine koordinative Bindung ein. Die dadurch in der -Untereinheit verursachte Konformationsänderung überführt die bis zu diesem Zeitpunkt niedrig-affine Ligand-Rezeptor-Bindung in eine hoch-affine Bindung. Zwei solcher, aus je einer - und einer -Untereinheit bestehenden Komplexe lagern sich im Folgenden zu einem Tetramer zusammen. Diese Dimerisierung wiederum ist Voraussetzung für die bei Januskina-

15 Seite 12 Einleitung sen bekannte, wechselseitige Phosphorylierung der beiden -Untereinheiten [52] (siehe Kapitel ). Abbildung 5 verdeutlicht, dass die Zytokine LIF, CT-1, CNTF, OsM und CLC sich von IL-6 und IL-11 dadurch unterscheiden, dass LIF, CT-1 und OsM direkt an den LIF-Rezeptor binden können. Der LIFR ist ebenfalls ein transmembranes Protein, welches sowohl eine liganden-bindende (der -Untereinheit entsprechende) als auch eine zur wechselseitigen Phosphorylierung mit einer gp130- -Untereinheit befähigte (der -Untereinheit entsprechende) Domäne besitzt (LIFR ). Der LIFR bildet folglich nach Ligandenbindung ein Heterodimer mit gp130. OsM kann neben dem LIFR auch an den Oncostatin-M-Rezeptor (OsMR ) binden. Der OsMR ist ähnlich aufgebaut wie der LIFR und bildet ebenfalls ein Heterodimer mit gp130, bindet jedoch ausschließlich und spezifisch OsM. CLC und CNTF schließlich binden zwar an spezifische -Untereinheiten, diese jedoch verursachen die Ausbildung eines LIFR gp130-heterodimers [51; 52; 76; 77]. Zusätzlich wurde mehrfach auch über die Beteiligung von nicht verwandten Rezeptoren an der Signaltransduktion von Zytokinen der IL-6-Familie berichtet. So führt zum Beispiel die Stimulation von Fibrosarkomzellen mit OsM zu einer ausgeprägten Phosphorylierung der IFN (Interferon) Rezeptorkette 1 [200] und in murinen embryonalen Fibroblasten (MEF-Zellen), welchen der IFN -IFN -Signalkomplex fehlt, finden sich signifikant reduzierte IL-6-Signale [121]. Ferner konnte gezeigt werden, dass ErbB2 in Prostata-Karzinomzellen IL-6-abhängig mit gp130 komplexiert [158] Jak-Aktivierung Wichtige Mediatoren für die meisten Zytokinsignale sind die Januskinasen und STAT-Proteine (signal transducer and activator of transcription). Selektiver Gebrauch von Mitgliedern der Jak- und der STAT-Familie von einem bestimmten Zytokinrezeptor sind unter anderem verantwortlich für die Spezifität der Zytokinreaktionen [94]. Zytokine der IL-6-Familie induzieren sehr schnell Tyrosinkinase-Aktivität in Molekülen der Jak-Familie. Die signaltransduzierenden -Untereinheiten gp130, LIFR und OsMR binden an Jak1, Jak2 und Tyk2 [79; 113; 160; 194]. Jak1 spielt eine besonders wichtige Rolle, da die

16 Seite 13 Einleitung Abbildung 7: Moleküle der gp130-signalkaskade. Aus [76] Bedeutung sind [67]. Transduktion von IL-6-Signalen in Zellen ohne Jak1 stark beeinträchtigt ist [66; 111; 167]. Die Wechselwirkung zwischen gp130 und Jak1 ist sehr fest und dauerhaft [76]. Januskinasen binden im membrannahen Bereich der Zytokinrezeptoren, welcher konservierte, so genannte Box1 - und Box2 -Motive enthält [67; 68; 128; 160]. Auch der Bereich zwischen dem Box1 - und dem Box2 - Motiv von gp130 spielt eine wichtige Rolle für die Assoziation mit Jaks [68]. Da bei stellt gp130 jedoch nicht nur die Bin dungs stelle für Januskinasen zur Verfügung, es wurden auch noch weitere Reste des gp130 identifiziert, welche für die Jak-Aktivierung von entscheidender Die verschiedenen Domänen der Januskinasen sind in Abbildung 7 zu sehen. Der C- terminalen Tyrosin-Kinase-Domäne ist eine Pseudokinase-Domäne vorangestellt, die zwar selbst keine katalytische Aktivität besitzt, jedoch die Aktivität der Kinase-Domäne reguliert [146]. Januskinasen enthalten ferner eine SH2 (Src homology 2) Domäne. Der N-terminale Bereich von Januskinasen enthält eine so genannte FERM (fourpoint-one, ezrin, radixin and moesin) Domäne, welche für die Rezeptor-Bindung benötigt wird. FERM- Domänen bestehen aus drei Subdomänen: F1, F2 und F3. Zusammen bilden diese drei Subdomänen eine kompakte, kleeblattförmige Struktur [72; 74; 149]. Von besonderer Wichtigkeit ist die F1-Subdomäne von Jak1 für die Wechselwirkung mit gp130 [69]. Cdk9 (cyclin-dependent kinase 9) bindet ebenfalls an gp130, und die Bindung war verstärkt unter IL-6-Stimulation von HEK 293 Zellen, die gp130 und Cdk9 überexprimieren [54]. PKC (protein kinase C ), eine Kinase, die an der Serin-Phosphorylierung von STAT3 beteiligt ist, konnte nach IL- 6-Stimulation komplexiert mit gp130 nachgewiesen werden. PKC verbessert die Bindung von STAT3 an den Rezeptor. Hieran ist möglicherweise die Phosphorylierung am Thr 890 des gp130 beteiligt [145]. Abgesehen von ihrer Bedeutung für die Signaltransduktion sind Janus-

17 Seite 14 Einleitung kinasen auch wichtig für die Oberflächenexpression von mindestens einigen Zytokinrezeptoren. Koexpression von Jak1, Jak2 und Tyk2 begünstigt die Oberflächenexpression von OsMR stark [76] STAT-Aktivierung Die Transkriptionsfaktorfamilie der STAT-Proteine umfasst in Mammalia sieben Mitglieder: STAT1, -2, -3, -4, -5a, -5b und -6 [77]. In einer Reihe von Studien konnte die zentrale Rolle der STAT-Proteine im Signalweg der Zytokine der IL-6-Familie gezeigt werden. Alle Zytokine der IL-6-Familie sind potente STAT3-Aktivatoren und, in geringerem Ausmaß, STAT1-Aktivatoren über die ihnen gemeinsame Rezeptor-Untereinheit gp130 [76]. Auch LIFR und OsMR aktivieren STAT3, STAT1 und STAT5. OsMR stellt dabei als Besonderheit den wirkungsvollsten Aktivator von STAT5 dar [104]. Die Struktur von STAT-Proteinen umfasst vom N- bis zum C-Terminus eine Oligomerisationsdomäne, die so genannte Coiled-coil -Domäne, die DNA-bindende Domäne, die Linker -Domäne, die SH2-Domäne und die Transaktivierungsdomäne (siehe dazu auch Abbildung 7). Alternativ wird für die Coiled-coil -Domäne, die DNA-bindende Domäne und die Linker -Domäne die Nomenklatur 4-helix bundle, -barrel und Connector -Domäne verwendet. Die Erkenntnisse über die funktionelle Struktur der STAT-Proteine leiten sich aus der teilweisen Aufklärung der Kirstallstrukturen von STAT4 sowie von STAT1 und STAT3 ab [10; 35; 214]. Die Aktivierung von Mitgliedern der STAT-Familie erfordert die transiente Assoziation der STAT-Proteine mit Zytokinrezeptoren [57; 64]. Die klassische Sichtweise bevorzugt die Rekrutierung von monomeren STAT-Proteinen an die aktivierten Rezeptoren. Jedoch konnte gezeigt werden, dass präassoziierte oligomere STAT-Komplexe mit hohem Molekulargewicht bereits vor der Stimulation vorliegen [71; 138; 144; 196]. Die Rekrutierung von STAT-Proteinen durch aktivierte Rezeptoren wird von deren SH2- Domäne vermittelt und setzt die Phosphorylierung von Rezeptor-Tyrosin-Motiven voraus [64; 75; 78; 195]. Während murines STAT3 an Phospho-(p)YXXQ-Motive (Y 767 RHQ, Y 814 FKQ, Y 905 LPQ und Y 915 MPQ in gp130; Y 981 QPQ, Y 1001 KPQ und Y 1028 RPQ im LIFR)

18 Seite 15 Einleitung bindet [60; 102; 195; 209], assoziiert murines STAT1 lediglich mit der Konsensussequenz pyxpq (Y 905 LPQ und Y 915 MPQ in gp130) [60]. Obgleich mehrere gp130-motive eine STAT3-Aktivierung vermitteln, unterscheiden sie sich hinsichtlich ihrer Potenz, STAT-Faktoren und Akutphaseprotein-Promoter zu aktivieren [182]. Neben der Tyrosinphosphorylierung wurden weitere posttranslationale Mechanismen beschrieben, welche die STAT-Funktion beeinflussen. Serin-Phosphorylierung wurde für STAT1, -3, -5a und -5b beschrieben. Als Ort der Serin-Phosphorylierung in STAT1 und STAT3 wurde Ser 727 identifiziert. Die involvierte(n) Serinkinase(n) sind bislang unbekannt [1; 95; 110; 131; 184; 212]. Zwei pstat-proteine sind in der Lage, ein Dimer auszubilden. In der Signalantwort auf eine Stimulation mit Zytokinen kumuliert phosphoryliertes, zytoplasmatisches STAT3 schnell im Nukleus. Auf Grund ihrer Größe von 90 kda, die weit über der Ausschlussgrenze der Kernporen liegt, müssen STAT-Proteine aktiv in den Zellkern transportiert werden. Die durch ein extrazelluläres IFN-Signal verursachte Translokation von STAT1 benötigt NPI-1/Importin- 5, welches wiederum die Translokation durch einen Ran-abhängigen Mechanismus vermittelt [185]. Der nukleäre Import und die nukleäre Akkumulation werden durch die STAT-Dimerisierung auf Grund von Tyrosinphosphorylierung getriggert. Nach der Bindung des Rezeptors folgt die Phosphorylierung der STAT-Faktoren an einem einzigen Tyrosinrest (Tyr 701 in STAT1 beziehungsweise Tyr 705 in STAT3) [97; 191]. Dies führt zur Bildung von STAT-Dimeren, welche durch deren SHP2-Domäne vermittelt wird [190]. Die Phosphotyrosin-Motive von STAT1 und STAT3 (py 701 IKT in STAT1 und py 705 LKT in STAT3) stimmen nicht mit den STAT3-Konsensussequenzen überein, die aus den Bindestellen von gp130 und LIFR abgeleitet wurden [60; 102; 195; 209]. Eine Konformationsänderung der SH2-Domäne könnte diese duale Spezifität erklären [70]. Obwohl Tyrosinphosphorylierung selbst dabei keine zwingende Voraussetzung für die Translokation von STAT darstellt, ist die Dimerisierung unerlässlich: Künstlich dimerisierte, nichtphosphorylierte STAT-Proteine akkumulieren ebenfalls im Nukleus [28; 119]. STAT3 ist während des gerichteten Transportes durch das Zytosol mit Endozytosevesikeln assoziiert [15]. Für die STAT1-Antwort auf ein IFN -Signal konnte jedoch gezeigt werden, dass die Translokation in den Nukleus keine Zytoskelettstrukturen wie Aktinfilamente oder Mikro-

19 Seite 16 Einleitung tubuli erfordert [109]. Auch kumuliert pstat1 nach Mikroinjektion schnell und augenscheinlich ohne Beteiligung von endozytotischen Vesikeln im Nukleus [76]. In der Literatur finden sich einige Hinweise für einen ständigen nukleo-zytoplasmatischen Transport von STAT-Proteinen, der unabhängig von extrazellulärer Stimulation und Phosphorylierung stattfindet [76; 117; 118; 224]. Auch der Fund von unphosphoryliertem STAT im Nukleus [118] könnte darauf hindeuten, dass STAT eine Rolle als Transkriptions-Koaktivator spielt [33; 101]. Nukleo-zytoplasmatisches Pendeln von STAT-Proteinen kann auch noch nach Stimulation und nukleärer STAT-Akkumulation nachgewiesen werden [6]. Export von STAT1 aus dem Nukleus erfolgt mittels des nukleären Exportrezeptors CRM-1, welcher ebenfalls Ran-abhängig arbeitet [11; 116]. STAT3 ist essentiell für gp130-vermitteltes zelluläres Überleben und Zellzyklus-Transitionssignale von der G 1 - bis zur S-Phase. Sowohl c-myc als auch pim wurden als Zielgene von STAT3 identifiziert und spielen bei einem STAT3-Mangel in Bezug auf zelluläres Überleben und Zellzyklus-Übergänge eine entscheidende Rolle. STAT3 ist ebenso nötig für den gp130- vermittelten Erhalt des pluripotenten Zustandes von proliferierenden embryonalen Stammzellen als auch für die gp130-induzierte Makrophagendifferenzierung von M1-Zellen. Studien mit gewebespezifischen STAT3 ko -Mäusen haben gezeigt, dass STAT3 die Zellbewegung, wie zum Beispiel Leukozyten-, Keratinozyten- und die epidermale Zellmigration reguliert. STAT3 scheint auch an der B-Zell-Differenzierung zu antikörperproduzierenden Plasmazellen beteiligt Abbildung 8: DNA-pSTAT3-Komplex [12; 20; 22-24; 58] zu sein. Da die IL-6/gp130/STAT3 Signalkaskade sowohl in B-Zell-Wachstum als auch an deren Differenzierung zu Plasmazellen beteiligt ist, scheint es sehr wahrscheinlich, dass diese Kaskade auch eine Rolle bei der Entstehung des Plasmozytoms spielt [83]. Ein weiterer posttranslationaler Mechanismus spielt eine entscheidende Rolle für die STAT- Funktion: Arg 31 von STAT1 wird spezifisch von PRMT-1 (Protein Arginine Methyltransferase-1) methyliert [2; 157].

20 Seite 17 Einleitung Der MAP-Kinase-Weg Dimerisierung von Rezeptor- -Untereinheiten führt nicht nur zur Aktivierung des Jak-STAT- Signalweges, sondern auch zur Induktion der MAPK-Kaskade. Erste Untersuchungen der gp130- und LIFR-vermittelten Aktivierung von MAP-Kinasen lieferten die SHP2-Bindungsstelle Tyr 759 von gp130 [195] und Tyr 974 des LIFR. Diese ist von entscheidender Wichtigkeit für die Aktivierung der MAPK-Kaskade [181]. SHP2 wird schnell von tyrosinphosphoryliertem gp130 rekrutiert und Jak1-abhängig phosphoryliert [180]. Gab1 ist ein weiteres Protein, welches an der Aktivierung der Ras-Raf-MAPK-Kaskade beteiligt ist. Gab1 ist ein Gerüstprotein, welches über eine PH-Domäne an die Plasmamembran binden kann. Ferner besitzt Gab1 Bindestellen für Grb2, SHP2, PI3K, Crk, PLC und den c- Met-Rezeptor [89; 111; 179]. Nach IL-6-Stimulation wird Gab1 tyrosinphosphoryliert und interagiert anschließend mit SHP2 und PI3K (siehe unten). IL-6-induzierte Assoziation von Gab1 mit SHP2 führt zur Aktivierung von Erk2 [204]. Zytokine der IL-6-Familie aktivieren nicht nur Erk1/2, eine MAPK, welche das Überleben von Zellen regelt, sondern auch stressaktivierte Mitglieder der MAPK-Familie: p38 und JNK [18; 217; 223] (siehe auch Abbildung 9). Die Signaltransduktionswege, welche zu deren Aktivierung führen, sind bis heute weitestgehend unverstanden. Im Gegensatz zu gp130 und dem LIFR, rekrutiert der OsMR kein SHP2. Dennoch ist der OsMR in der Lage, den Ras-Raf-MAPK Signalweg zu aktivieren. OsMR rekrutiert Shc (SH2- and collagen-homology-domain-containing protein, siehe Abbildung 9) über sein Tyr 861 in der zytoplasmatischen Region [80]. Der OsMR benutzt, im Gegensatz zu gp130 und dem LIFR, den Shc-Grb2-SOS-Weg zur Aktivierung von MAP-Kinasen [80]. Abbildung 9 zeigt den Transduktionsmechanismus.

21 Seite 18 Einleitung Abbildung 9: Aktivierung der MAPK-Kaskade über den OsMR. Aus [76] Die PI3K-Signalkaskade Die Zytokine der IL-6-Familie können noch eine weitere Signalkaskade aktivieren: Die PI3K- Kaskade. PI3K ist ein Enzym, welches die Phosphorylierung von Phosphatidylinositol 3 an der 3 -OH-Position des Inositolrings katalysiert. Dies wiederum hat zur Folge, dass die Serin/Threonin-Kinase B/Akt an die Plasmamembran rekrutiert wird. Dort wird sie mittels Phosphorylierung durch PDK1 (phosphoinositide-dependent kinase-1) aktiviert. IL-6-induzierte Aktivierung des PI3K/Akt Signalweges spielt wahrscheinlich für den Schutz der Zelle vor A- poptose und für die gesteigerte Proliferation von multiplen Myelomzellen eine Rolle [82; 92; 188]. Nach Stimulation durch IL-6 interagiert Gab1 (siehe oben) mit PI3K [204]. Gleichermaßen bindet PI3K nach OsM-Stimulation an IRS-1 (insulin receptor substrate-1) [29]. Dies lässt vermuten, dass sowohl IRS-1 als auch Gab1 Schnittstellen zwischen gp130 und der PI3K-Aktivierung darstellen [76].

22 Seite 19 Einleitung Inhibitorische Elemente und Terminierung des Signals Um Überstimulierung zu verhindern, hat die Natur fein abgestimmte Mechanismen zur Terminierung von Zytokinsignalen eingerichtet. Die im Folgenden einzeln besprochenen Mechanismen zur Inhibition der Signalübertragung von Zytokinen der IL-6-Familie sind in Abbildung 11 dargestellt. Die Bindung von IL-6-Familie-Zytokinen an ihre Rezeptoren führt zur unmittelbaren Internalisierung der Liganden. Bislang wurden keine Internalisierungssignale in den -Rezeptoren identifiziert. Folglich wird der Internalisierungsprozess den signaltransduzierenden Untereinheiten zugeschrieben [77]. Die Internalisierung von gp130 scheint von der Bindung eines Liganden unabhängig zu sein [206] und wird durch Phosphorylierung am Ser 782 moduliert [61]. Phosphorylierung einzelner Komponenten der Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle bei der Transduktion von IL-6-Zytokin-Signalen. Das impliziert, dass neben Kinasen auch Phosphatasen an der Signaltransmission beteiligt sind. Die erste Phosphatase, die im Zusammenhang mit IL-6-Signalen beschrieben wurde, war SHP2. SHP2 bindet an das zytoplasmatische Tyr 759 von aktiviertem gp130 [23; 195]. Die Kristallstruktur von SHP2 hat gezeigt, dass die N-terminale SH2-Domäne bei Abwesenheit eines tyrosinphosphorylierten Bindungspartners das aktive Zentrum bedeckt und damit die enzymatische Aktivität inhibiert [88]. Die Bindung von SH2-Domänen an Phosphotyrosin-Motive von Rezeptoren führt zur Entfaltung des Proteins, was wiederum zur Aktivierung dessen enzymatischer Aktivität führt [106; 156; 201]. SHP2 wird auch durch Phosphorylierung der Tyrosinreste 542 beziehungsweise 580 im C-terminalen Anteil des Enzyms aktiviert. Anschließend interagieren diese Phosphotyrosinreste mit den N- und C-terminalen SH2-Domänen. Dabei wird die PTP-Domäne aus der N-terminalen SH2-Domäne-vermittelten Hemmung befreit [112] (siehe Abbildung 10).

23 Seite 20 Einleitung Abbildung 10: Regulation von SHP2. Aus [76]. Die Tyrosinkinase SHP2 nimmt wahrscheinlich auch negativ-regulatorische Funktionen im Jak/STAT-Signalweg wahr [107]. SOCS-Protein IL-6 IL-11 LIF OsM CIS SOCS1 SOCS2 SOCS3 Tabelle 1: Induktion von SOCS-Proteinen durch Zytokine [17; 114; 132; 197] SOCS- und CIS-Proteine (cytokineinducible SH2 proteins) werden auch als SSI-Proteine (STAT-induced STAT inhibitors) bezeichnet. Die acht Mitglieder dieser Familie (CIS und SOCS1 SOCS7) enthalten eine zentrale SH2-Domäne, sowie eine C-terminale Domäne, welche SOCS box genannt wird (siehe dazu auch Abbildung 7). Die Expression von SOCS-Proteinen wird durch Zytokine der IL-6-Familie schnell hochreguliert. Die regulatorischen Zusammenhänge der wichtigsten SSI-Proteine sind in Tabelle 1 dargestellt. SOCS-Proteine agieren als klassische Feedbackinhibitoren: Sie werden durch den Jak/STAT- Signalweg direkt induziert und hemmen anschließend die STAT-vermittelte Signaltransduk-

24 Seite 21 Einleitung tion. Dabei ist SOCS3 dasjenige Familienmitglied, welches im gp130-jak-stat-signalweg von entscheidender Bedeutung ist. Der primäre Wirkmechanismus von SOCS3 besteht in einer Hemmung der Tyrosinkinase-Aktivität von Jak-Proteinen. Dabei bindet SOCS3 an das Phosphotyrosin-Motiv 759 von gp130 [140; 183], welches gleichzeitig auch die Bindungsstelle für SHP2 darstellt. Die Affinität der Bindung von SOCS3 an gp130-peptide ist sogar geringfügig höher als die von SHP2 [40]. Obwohl SOCS3 und SHP2 von der gleichen Bindungsstelle im nativen gp130 rekrutiert wird, bedienen sie sich zweier völlig unterschiedlicher Modi zur negativen Regulation der gp130 Aktivität: Zum einen mittels Feedbackhemmung durch SOCS3 und/oder zum anderen durch die Dephosphorylierung von Januskinasen, Rezeptoren und STAT-Proteinen [107]. Der genaue Mechanismus der SOCS3-Wirkung ist dabei nicht ganz klar. Es wurde berichtet, dass SOCS3 mit seiner SH2-Domäne an den so genannten activation loop von Jak2 bindet [175; 176]. Als wichtigste Funktion von STAT3 kann die Vermittlung der proteasomalen Degradierung des gp130-komplexes angesehen werden. Neben seiner Wirkung an SHP2 ist SOCS3 auch an der ptyr 759 -vermittelten Hemmung beteiligt. SOCS1 und SOCS3 unterscheiden sich bezüglich ihrer inhibitorischen Funktion durch die Tatsache, dass SOCS1 die Jak-Aktivität effizienter zu blockieren vermag als SOCS3 [141]. Neben SOCS3 ist auch die Gruppe der PIAS-Proteine an der Regulierung der pstatvermittelten Transkriptionsaktivität beteiligt. PIAS-Proteine können durch unterschiedliche Mechanismen Einfluss auf die Transkriptionsaktivität nehmen. Die DNA-bindende Sequenz von STAT und anderen Transkriptionsfaktoren können durch PIAS-Proteine gebunden und Protein HWZ (h) SOCS1 1,5 SOCS2 1 SOCS3 1,6 IL-6R 2 3 gp130 2,5 Jak1 3,2 Jak2 1,9 Tyk2 2 STAT3 8,5 STAT3 4,5 STAT1 16 SHP Tabelle 2: Halbwertzeiten [192] damit blockiert werden. Weitere Regelmechanismen sind die Rekrutierung transkriptioneller Korepressoren sowie die Begünstigung einer Sumoylierung beteiligter Proteine [189]. Ein weiterer wichtiger Mechanismus zur Modulation der Zytokinaktivität ist die Regulierung der Halbwertzeit der mrna des entsprechenden Zytokins, beziehungsweise die der Zytokine selbst und Komponenten der Signalkaskade. Die mrna der Zytokine ist auf Grund von AU-reichen Sequenzen in ihrer nicht-translatierten 3 -Region generell kurzlebig. Die bei Stress aktivierte p38-mapk spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der mrna vieler Zytokine, so auch bei IL-6. p38-mapk aktiviert MK2

25 Seite 22 Einleitung (MAPKAPK2, MAPK-activated protein kinase 2) [219]. In MK2-defizienten Makrophagen ist die Halbwertzeit der mrna von IL-6 um mehr als das Zehnfache verkürzt. Deletion des AU-reichen Anteils der mrna von TNF hebt den Effekt von MK-2 auf [139]. Andere Signalwege bewirken ebenfalls eine Stabilisierung der mrna von Zytokinen. So induziert der JNK-Signalweg eine Stabilisierung der kurzlebigen mrna von IL-2 [34]. PI3K-Aktivierung induziert eine Stabilisierung der mrna von IL-3 [120]. Die Verfügbarkeit von IL-6-Proteinen könnte auch durch Zytokinproteolyse reguliert sein. In entzündetem Gewebe induziert IL-6 die Freisetzung der Serinproteasen Elastase, Proteinase 3 und Cathepsin G aus neutrophilen Granulozyten, welche im Gegenzug eine Degradierung von IL-6 bewirken [8]. Wie aus der Zusammenfassung in Tabelle 2 ersichtlich ist, unterscheiden sich die Halbwertzeit der verschiedenen an der IL-6-Signalübertragung beteiligten Komponenten wesentlich voneinander [59; 192]. Während die Feedbackinhibitoren SOCS1, SOCS2 und SOCS3 sehr kurzlebig sind, haben STAT1, STAT3 und SHP2 geringe Umsatzraten. Die Halbwertzeit von STAT3, einer STAT3 -Spleißvariante, liegt fast 50% unter der von STAT3. Sowohl die Januskinasen Jak1, Jak2, Tyk2 als auch gp130 haben mittlere Halbwertzeiten. Diese unterschiedlichen Halbwertzeiten implizieren, dass Komponenten der Signalkaskade, welche für ihre Aktivierung posttranslational modifiziert werden müssen, langlebig sind, während die Aktivität von kurzlebigen Komponenten hauptsächlich auf der Transkriptionsebene reguliert wird. Schließlich kann IL-6-induzierte Signaltransduktion und transkriptionelle Aktivierung auf der Signaltransduktionsebene oberhalb der Gentranskription moduliert werden. So konnte zum Beispiel für LPS (Lipopolysaccharide) und das proinflammatorische Zytokin TNF gezeigt werden, dass sie die IL-6-vermittelte STAT3-Aktivierung in Makrophagen hemmen. Diese Hemmung wird sehr wahrscheinlich durch Induktion der de novo Synthese des Jak-Inhibitors SOCS3 verursacht [19]. Vermutlich existieren noch weitere Mechanismen zur Inhibition der IL-6-Signaltransduktion durch proinflammatorische Zytokine. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass IL-1, TNF- und LPS die IL-6-abhängige STAT-Aktivierung in Makrophagen durch von der de novo Proteinsynthese unabhängige Mechanismen hemmen [3; 142].

26 Seite 23 Einleitung Abbildung 11: Inhibitorische Mechanismen bei der Signalübertragung von Zytokinen der IL-6-Familie. Aus [76]. STAT-Bindestellen liegen oft in der unmittelbaren Nähe zu den Bindestellen anderer Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel der nuclear factor-il-6 [99], NF- B [178], das Aktivator-Protein 1 [91; 177; 202; 226] und der Glukokortikoidrezeptor [227]. Dies macht eine kooperative Wirkung dieser Transkriptionsfaktoren mit STAT-Proteinen bei der Genregulierung sehr wahrscheinlich. Bei Eukaryoten interagieren die meisten Transkriptionsfaktoren mit Histonacetyltransferasen (transkriptionelle Koaktivatoren), wie zum Beispiel CBP/p300, das als Koaktivator für STAT1, STAT2, STAT3 und STAT5 agiert [91; 148; 152; 225]. Die transkriptionelle Aktivität von STAT3 wird auch durch die Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren gesteigert. Beispiele hierfür sind der Forkhead -Transkriptionsfaktor FKHR und auch EZI (endothelial cell-derived zinc-finger protein). FKHR steigert spezifisch die Aktivität von STAT3-abhängigen Promotoren, wie zum Beispiel des 2 M-Promotors [100]. FKHR wird durch Akt/Proteinkinase B-vermittelte Serin-/Threoninphosphorylierung inaktiviert. Dies erklärt auch, dass die IL-6-vermittelte Synthese von Akutphaseproteinen durch Insulin und andere den PI3K/Akt- Signalweg aktivierende Wachstumsfaktoren vermindert wird [31; 216]. Das nukleäre Zinkfingerprotein EZI wurde zunächst als durch OsM induzierbares Genprodukt identifiziert, wird jedoch ubiquitär exprimiert [133]. Durch Koimmunoprezipitation konnte gezeigt werden, dass STAT3 und EZI physisch interagieren und man vermutet, dass EZI den nuklearen Export von STAT3 verhindert.

27 Seite 24 Einleitung 1.2 Das gp130 STAT/ STAT -Mausmodell Um STAT-abhängige, physiologische Reaktionen genauer zu untersuchen, haben Dr. M. Ernst und Kollegen eine Maus mit C-terminaler gp130 STAT knock-in -Mutation hergestellt, die im Folgenden genauer vorgestellt werden soll Die gp130 STAT -Mutation Bei dieser Mutation handelt es sich um eine Deletion aller STAT-Bindestellen des intrazellulären Anteils von gp130. Wie bereits im Abschnitt 1.1 dargestellt, ist der membranferne Anteil der -Kette erforderlich für die Bindung und Aktivierung von STAT1 und STAT3 durch mehrere YXXQ-Phosphotyrosinmotive: Y 765/812/904/914 XXQ beim murinen gp130 und Y 976/996/1023 XXQ beim murinen LIFR [195] (vergleiche Abschnitt ). Um die STAT-vermittelten biologischen Effekte auf Signale von Zytokinen der IL-6-Familie in vivo untersuchen zu können, wurde eine gp130- knock-in Maus mit einer C-terminalen Trunkierung des gp130 (gp130 STAT ) hergestellt. Diese weist eine Deletion aller STAT-Bindestellen auf und ist so angelegt, dass sie funktionell äquivalent zu Y F-Substitutionen in allen YXXQ-Motiven sein dürfte [53; 143; 221]. Abbildung 12 zeigt die Sequenz der Mutation sowie das Transkriptions- und das Translationsprodukt. Zur Inaktivierung der vier YXXQ STAT-Bindestellen von gp130 an den Positionen Y 765, Y 812, Y 904 und Y 914 wurde das Exon 18, welches für die Aminosäuren kodiert, durch eine Version, die auf der C-terminalen Seite von Aminosäure 768 trunkiert ist und die Y 765 F und Q 768 A Substitutionen enthält, ersetzt. Die Transkription der mutierten gp130 Allele führte zu einer dicistronischen gp130-neo-mrna, die 1,4 kb größer ist, als die gp130- Wildtyp-mRNA und für das trunkierte gp130 STAT -Protein kodiert [51]. Zur Herstellung der Mutation wurden zwei rekombinante ES-Zelllinien (129/X1SvJ) in C57BL/6J Blastozysten injiziert und die Keimbahnchimären mit C57BL/6J Weibchen verpaart. Homozygote Kolonien (gp130 STAT/ STAT ) wurden etabliert und weitergezüchtet, indem gp130 STAT/ STAT -Männchen mit gp130 STAT/wt Weibchen verpaart wurden.

28 Seite 25 Einleitung Abbildung 12: Transkriptions- und Translationsprodukt der gp130 STAT -Mutation; nach [51] Phänotypen Bei Geburt wirken gp130 STAT/ STAT -Mäuse augenscheinlich gesund, zeigen jedoch im Vergleich zu gp130 wt/wt - und gp130 STAT/wt -Geschwistern sowohl ein um 20-30% vermindertes Körpergewicht (1,93 g ± 0,38 g versus 2,93 g ± 0,12 g) als auch eine verminderte Länge des Körperstamms. Beide Befunde persistierten bis ins Erwachsenenalter der Tiere. Die Durchschnittliche Lebenserwartung von gp130 STAT/ STAT -Mäusen ist im Vergleich zu der ihrer gp130 STAT/wt -Geschwister (15 ± 2 Monate für beide Geschlechter) reduziert (6 ± 1 Monat für Männchen, 8 ± 2 Monate für Weibchen). Die gp130 STAT/wt -Tiere unterschieden sich in keinem der untersuchten Merkmale von gp130 wt/wt -Tieren [51]. gp130 STAT -Mäuse gleichen phänotypisch Mausmutanten, die kein IL-6 (eingeschränkte humorale und muköse Akut-Phase-Reaktion) und kein LIF (Versagen der Blastozysten-Implantation) exprimieren können. Im Gegensatz zu Mäusen mit Nullmutationen von Liganden der gp130-signalkaskade, zeigten die gp130 STAT -Mäuse zusätzlich gastrointestinale Ulcera sowie eine schwere Gelenkerkrankung mit Anzeichen chronischer Synovitis, cartilaginärer Metaplasie und Degradierung des Gelenkknorpels. Mitotische Übererregbarkeit der Synovialzellen durch Zytokine der IL-6-Familie wurde durch verstärkte gp130-vermittelte SHP-2/Ras/ErkAktivierung auf Grund eingeschränkter STAT-vermittelter Induktion von SOCS-Proteinen (siehe Abschnitt ) erklärt [51].

29 Seite 26 Einleitung Ferner weisen die Tiere neben einem Ausfall der uterinen Implantation und der hepatischen Akutphasereaktion auch eine eingeschränkte humorale und muköse Immunabwehr auf [51]. Männchen Weibchen lebende Jungtiere Gt n Gt n wt/wt wt/ / wt/ 17 wt/ / 47 wt/ wt/ 15 / / 8 / 3 0 Tabelle 3: Genotypenverteilung bei lebenden Jungtieren; nach [51] Die Kreuzung von gp130 STAT/wt -Mäusen brachte homozygote Nachkommen hervor, wobei die Verteilung nahe an der nach Mendel zu erwartenden lag. Die nachfolgende Verpaarung von heterozygoten gp130 STAT/wt -Weibchen mit homozygoten gp130 STAT/ STAT -Männchen führte zu einem gegenüber dem Anteil an gp130 STAT/wt -Tieren signifikant verminderten gp130 STAT/ STAT -Anteil unter den Jungtieren (siehe Tabelle 3), obgleich die Jungtiere beider Genotypen während der Embryonalperiode (E18) noch zu gleichen Anteilen vorlagen [51]. Im Vergleich dazu sterben gp130 -/- -Mäuse, abhängig vom genetischen Hintergrund in utero oder kurz nach der Geburt an myokardialer Hypoplasie und verminderter Hämatopoese in der fetalen Leber [98; 222], während LIFR -/- - Mäuse perinatal auf Grund einer Degeneration von Motoneuronen starben [218] Signaltransduktion in der gp130 STAT -Maus Aus dem im Abschnitt und Berichteten ergibt sich für die gp130 STAT -Maus das in den Abbildung 13 und 14 vereinfacht dargestellte Signaltransduktionsmuster. Abbildung 13: Homodimerer Rezptor in der gp130 DSTAT -Maus Abbildung 14: Heterodimerer Rezeptor in der gp130 STAT -Maus Abbildung 13 zeigt den Signaltransduktionsmechanismus für den homodimeren gp130 STAT -Rezeptor. Dort ist die intrazelluläre STAT1- und STAT3-Phosphorylierung auf Grund der gp130 STAT - Mutation unmöglich. Aus dem Fehlen von pstat3 resultiert auch eine verminderte Hemmung der intrazellulären SHP2-Ras-Erk-Kaskade, welche von der Mutation im Übrigen nicht betroffen ist.

30 Seite 27 Einleitung Im Vergleich dazu zeigt Abbildung 14 die Situation bei Aktivierung des heterodimeren gp130 STAT -LIFR -Rezeptors. Hier ist über das YxxQ-Motiv im LIFR noch eine (im Vergleich zur Situation beim Wildtyp geringere) STAT-Aktivierung möglich. Die SHP2-Ras- Erk-Kaskade ist in diesem Fall in geringerem Ausmaß aktiviert als in der in Abbildung 14 dargestellten Situation [51] Hintergrund-abhängiger Phänotyp Die gp130 STAT -Mutation wurde zunächst aus formal-experimentellen Gründen in Mäusen verschiedener genetischer Hintergründe gezüchtet. Hierbei fiel auf, dass Tiere, welche für die Mutation homozygot waren (gp130 STAT/ STAT ) und den genetischen Hintergrund C57BL/6J oder den Hintergrund Balb/C hatten, innerhalb von 48 Stunden perinatal starben, während Tiere mit dem gemischten genetischen Hintergrund 129X1/SvJ-C57BL/6J lebensfähig sind und sich bis ins Erwachsenenalter entwickeln. Die Anzahl homozygoter Tiere je Wurf ist jedoch signifikant geringer, als es nach den Regeln von Gregor Mendel zu erwarten wäre [51]. Diese Beobachtungen waren der initiale Anlass für die vorliegende Arbeit Arbeitshypothese: Modifikatorlocus Das in Abschnitt Gesagte lässt vermuten, dass der genetische Hintergrund 129X1/SvJ einen Modifikatorlocus enthält, welcher für das perinatale Überleben der homozygoten Tiere verantwortlich ist. Es liegen direkte und indirekte experimentelle Beweise vor, die Anlass zur Annahme geben, dass diese Beobachtung durch einen Schwelleneffekt ( threshold regulation ) für den durch den mutanten heterodimeren LIFR/gp130 STAT -Rezeptor aktivierten STAT3-Signalweg erklärt werden kann, weil: a) gleichzeitiger Mangel an IL-6 und dem IL-11-Rezeptor das postnatale Überleben nicht beeinflusst [205]; b) Mäuse, mit einem Mangel an gp130 [222], LIFR [218], CNTFR [41] oder NR6 [4], eine perinatale Letalität innerhalb von 24 h nach der Geburt zeigen; c) eine Verminderung der Transkriptionsaktivität von STAT3 (durch Verwendung des S727A knock-in-allels) ebenfalls zu partieller perinataler Sterblichkeit führt [187].