4 Transkription, Translation und der genetische Code

Transkript

1 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 49 4 Transkription, Translation und der genetische ode Die in der Überschrift genannten Begriffe sind unter Molekularbiologen so etwas wie llerweltswörter: man muss sie kennen und problemlos benutzen können. Das soll mit diesem Kapitel erreicht werden. Zur Illustration beschreiben wir dabei im wesentlichen die Verhältnisse bei Bakterien oder genauer bei der Bakterienart Escherichia coli (E. coli). Dafür gibt es hauptsächlich zwei Gründe: Forschungsgeschichte. Die rt und Weise, wie genetische Information zur Synthese von Proteinen umgesetzt wird, konnte nach der Entdeckung der D-Doppelhelix innerhalb einer recht kurzen Zeitspanne von Jahren aufgeklärt werden zumindest in den Grundzügen. Das lag unter anderem daran, dass die beteiligten Forscher sich auf ntersuchungen an einem besonders einfachen biologischen System konzentrierten, nämlich auf ntersuchungen mit der harmlosen Bakterienart E. coli, die sich problemlos und ohne großen ufwand in Laboratorien kultivieren lässt (S. 88). Vorteile für eine einführende Beschreibung. bwohl Transkription und Translation im Prinzip bei allen Lebewesen gleich ablaufen, sind die Verhältnisse bei Bakterien doch erheblich einfacher als bei Eukaryoten. Dazu kommt noch, dass auch in der heutigen Zeit, in der sich viele Molekularbiologen bevorzugt für Eukaryoten interessieren, eine gründliche Kenntnis der Bakteriengenetik von utzen ist, denn Bakterien werden bei den meisten gentechnischen Verfahren eingesetzt (S. 300). In diesem Kapitel geht es im wesentlichen um die msetzung der genetischen Information. Das ist ein Prozess in zwei Schritten: 1. Transkription: Die ucleotid-folgen (Sequenzen) in den Genen der D werden umgeschrieben transkribiert und zwar in Form der ucleotid-folgen (Sequenzen) von R-Molekülen. der anders gesagt, Transkription ist die Synthese von R und zwar so, dass die entstandenen R-Sequenzen komplementär zu einem der beiden D-Stränge sind. 2. Translation: Die R-Sequenzen werden übersetzt translatiert und zwar in minosäure-sequenzen von Proteinen. Der genetische ode auf der R-Sequenz bestimmt die Reihenfolge der minosäuren im Protein. Transkription oder die Synthese von R Ribonucleinsäuren, abgekürzt R (ribonucleic acid), sind Ketten von ucleotiden, die durch Phosphodiester-Bindungen miteinander verknüpft sind (bb. 4.1), entsprechend den Bindungen zwischen den Deoxynucleotiden in D-Strängen (S. 11). ber wir registrieren wichtige nterschiede zwischen den Ribonucleotiden der R und den Deoxy- H -Ende P H P H P H H 4 ' 1' 2' H P H H H P H H 2 H H -Ende G H 2 bb. 4.1 ucleotide in der R. Ein ucleotid ist zusammengesetzt aus dem Fünf-Kohlenstoff-Zucker Ribose, einer Phosphatgruppe und einer von vier heterozyklischen Basen, nämlich denin (), Guanin (G), ytosin () und racil (). Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt.

2 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 50 4 Transkription, Translation und der genetische ode G G G G G G G G G GGG GG GGG G GGGGG GG GG G GGG GG G G GG G GGGG GGGG G G GG G G GGGG G GGGG GG GG GGGGGG GG G GG G GGG GG G G G G GG G G G G G G G GGG GGG bb. 4.2 Ringförmige R. Struktur des Potato spindle tuber viroid (PSTV). Beachte, dass das Molekül aufgrund zahlreicher Basenpaarungen die Form eines Stäbchens einnimmt [nach 9]. Viroide infizieren Kartoffeln, Zitruspflanzen, Kokospalmen u. a. Sie verursachen oft Wachstumshemmung mit Verkrümmung und Vergilbung der Blätter. ribonucleotiden der D: R enthält Ribose als Fünf-Kohlenstoff-Zucker sowie racil anstelle von Thymin (s. bb. 2.1). Durch die rt der Verknüpfung über Phosphatbrücken zwischen der 5 -H-Gruppe in der Ribose eines ucleotids und der 3 -H-Gruppe in der Ribose des benachbarten ucleotids erhält ein R-Molekül eine definierte Richtung mit einem freien 5 -Ende und einem freien 3 -Ende (bb. 4.1). Man kann die natürlich vorkommenden R-rten der Zelle (Tab. 4.1) als unterschiedlich lange, unverzweigte und einzelsträngige Ketten von Ribonucleotiden ansehen. Diese Beschreibung ist jedoch nicht umfassend, denn Rs neigen zur usbildung von Doppelstrang- Formen. Diese treten v. a. innerhalb einer R-Kette auf, sofern bschnitte mit komplementären Ribonucleotid-Folgen in einem Molekül vorkommen. Später werden wir viele teilweise komplexe Sekundärstruktur-Formen von R-Molekülen kennenlernen. Wir werden auch sehen, dass die Fähigkeit von R-Molekülen zur Schleifenbildung nicht selten wichtige strukturelle und genetische Konsequenzen hat. Es gibt R-Moleküle ohne freie Enden: sie sind ringförmig geschlossen, wie die sogenannten Viroide, die zu den Erregern von wichtigen Pflanzenkrankheiten in tropischen und subtropischen Ländern gehören (bb. 4.2). uch aus der menschlichen Pathologie kennt man ringförmige R, nämlich als Genom des Hepatitis-Delta-Virus, das zusammen mit dem Hepatitis-B-Virus schwere Entzündungen der Leber verursacht. Die ringförmige R des Hepatitis-Delta-Virus besteht aus etwa 1700 ucleotiden. Tab. 4.1 transfer-r (tr) ribosomale R (rr) messenger R (mr) Einige wichtige R-rten in der Zelle Größe (ungefähre ngaben) Funktion ucleotide Übertragung von minosäuren zum Proteinsynthese- pparat drei rten (bei Bakterien) aus etwa 120, 1540 bzw ucleotiden sehr verschieden (von einigen hundert bis zu mehreren tausend ucleotiden) Struktur-und Funktionselemente von Ribosomen die Boten-(messenger)-Rs enthalten bschriften der Gene und programmieren den Proteinsynthese-pparat Zellen enthalten zusätzlich noch viele andere rten von R. Darüber berichten wir im passenden Zusammenhang in späteren Kapiteln. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt.

3 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart Transkription oder die Synthese von R 51 R-Polymerase Die Transkription von Genen, also die Synthese aller R-rten der Tab. 4.1, erfolgt durch Enzyme mit der Bezeichnung R-Polymerase, oder genauer: D-abhängige R-Polymerase. Die genauere Bezeichnung ist nützlich, wenn das zelluläre Transkriptionsenzym von den R-Polymerasen mancher Viren unterschieden werden soll. Denn eine lange Reihe wichtiger Viren, etwa Poliovirus, Hepatitis--Virus oder Influenza-Virus, enthalten R als genetisches Material. Diese Viren benötigen für die Vermehrung ihrer R jeweils eigene R-Polymerasen, die entsprechend ihrer Funktion als R-abhängige R-Polymerasen bezeichnet werden (S. 450). Hier geht es um die R-Polymerase von Bakterien, aber die R- Polymerasen von Eukaryoten führen ähnliche Grundreaktionen bei der R-Synthese aus. Von eukaryotischen R-Polymerasen wird später die Rede sein (S. 337). Hier wollen wir betonen, dass in Bakterien eine einzige rt von R-Polymerase genügt, um alle rten von R (Tab. 4.1) herzustellen. Biochemiker können die Wirkungsweise von R-Polymerasen im Reagenzglas (in vitro) untersuchen, wenn folgende Voraussetzungen gegeben sind (bb. 4.3): Das erste Erfordernis ist das Vorhandensein von D, deren ucleotid-folge durch das Enzym kopiert wird. Dann müssen genügende Mengen der R-Vorläufer angeboten werden: die Ribonucleosid-Triphosphate TP, GTP, TP und TP. Schließlich müssen Temperatur (30 37 ), ph-wert und Ionenmengen stimmen. nersetzlich sind Magnesium-Salze in geeigneten Konzentrationen. wachsende R-Kette G G T G G T T G T G G G T G T T T G pp pp TP TP pp GTP TP pp TP TP T G T T G G G bb. 4.3 R-Synthese im Schema. ben, der D-Doppelstrang (rot) wird im Bereich der R- Polymerase entwunden: Damit stehen die Deoxynucleotide eines D-Stranges für Basenpaarungen mit den hereinkommenden Ribonucleotiden zur Verfügung. Die Ribonucleotide werden an das 3 -H-Ende (Dreieck) der wachsenden R-Kette (grün) geknüpft. Die endständigen Phosphat-Reste der Ribonucleotide werden als Pyrophosphat (PP) freigesetzt. Mitte, ovale Formen kennzeichnen die R-Polymerase, die sich in Richtung des waagerechten Pfeils entlang des D-Stranges bewegt. Dabei erfolgen komplizierte Drehungen von D und R (Drehpfeile; dunkle Dreiecke). Das offene Dreieck zeigt auf das 3 -H-Ende der wachsenden R-Kette. nten, damit nicht der Eindruck bleibt, dass das Schema in der Mitte dieser bbildung die Form der R-Polymerase wiedergibt, wird hier ein Bild gezeigt, das auf Röntgenstruktur-nalysen zurückgeht: eine breite Klammer aus den großen ntereinheiten b und b, die die D (roter Schlauch) umschließt [30]. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt.

4 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 52 4 Transkription, Translation und der genetische ode nter diesen Bedingungen kopiert die R-Polymerase die ucleotid- Folge des D-Matrizenstranges nach den Regeln der Basenpaarung. Dort, wo in der D ein Guanin-Baustein steht, wird in der R ein ytosin-ucleotid eingebaut, und umgekehrt. Gegenüber einem Thymin- in der D gelangt ein denin-ucleotid in die R, und gegenüber einem denin- ein racil-ucleotid. racil nimmt also in der R die Stelle des Thymins ein. Die R-Polymerase knüpft ein ucleotid nach dem anderen an das 3 -H-Ende einer wachsenden R-Kette. Dabei werden die endständigen Pyrophosphate von den Ribonucleosid-Triphosphaten abgespalten und Phosphodiester-Bindungen gebildet. lle zellulären R-Polymerasen sind aus mehreren ntereinheiten aufgebaut: bakterielle R-Polymerasen bestehen aus fünf bis sechs ntereinheiten (Tab. 4.2) und eukaryotische R-Polymerasen aus mehr als einem Dutzend ntereinheiten (S. 337). Der ufbau aus mehreren ntereinheiten ist keine notwendige Voraussetzung für die Synthese von R. Zum Beispiel sind die R-Polymerasen der Bakteriophagen T 3 und T7 monomere Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 100 kda. Dies gilt auch für die R-Polymerase in Mitochondrien. ber diese R-Polymerasen sind hoch spezialisiert: Sie erkennen nur die Genanfänge der zugehörigen Genome. Der komplexe ufbau zellulärer R-Polymerasen hängt mit den vielfältigen Regulationen zusammen, die erforderlich sind, damit die einzelnen Gene einer Zelle spezifisch und genau nach den Bedürfnissen im Zuge der Reaktionen auf mweltbedingungen aktiviert werden können. Zurück zur bakteriellen R-Polymerase (Tab. 4.2). Für eine einfache R-Synthese von der rt der bb. 4.3 genügt ein Komplex aus je einer b-ntereinheit und einer b -ntereinheit sowie zwei a-ntereinheiten, das so genannte Minimal- oder ore-enzym. Doch für eine korrekte und effiziente Transkription bakterieller Gene ist ein Holo-Enzym notwendig, das außer den ntereinheiten des Minimal-Enzyms noch eine Sigma(s)-ntereinheit besitzt. Die b -ntereinheit und die b-ntereinheit bilden eine gemeinsame Struktur zur Bindung der D-Matrize und der wachsenden R-Kette. Tab. 4.2 ntereinheit R-Polymerase von E. coli Zahl der ntereinheiten/enzym minosäuren Mol. Gew. [kda] Gen-ame im E. coli-genom Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt. b rpo b rpob a rpo w (omega) rpoz 70 s (sigma) rpod Die Größe einer ntereinheit wird auf zweierlei Weise notiert, nämlich durch ngabe der Zahl der minosäuren, aus denen das Protein aufgebaut ist, und durch das Molekulargewicht, ausgedrückt in kda (Definition auf S. 43). E. coli-zellen haben mehrere Sigma-ntereinheiten, je eine für die Transkription verschiedener Gen-Gruppen (s. S.104). Die Tabelle enthält als Beispiel die häufigste Sigma-ntereinheit aufgrund ihres Molekulargewichtes als Sigma-70 oder 70 s bezeichnet.

5 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart Transkription oder die Synthese von R 53 Die Struktur trägt das aktive Zentrum, wo neue ucleotide an das 3 -H-Ende der R angeheftet werden. Die a-ntereinheiten übernehmen zwei Funktionen: Die aminoterminale Domäne trägt zum Zusammenbau und zur Stabilität des Gesamt-Enzyms bei; die carboxyterminale Domäne hilft bei der Bindung an die Promotor-D und beteiligt sich an der Wechselwirkung mit Regulatoren der Transkription (s. S.120). Die kleinste ntereinheit (omega) hat eine Funktion bei der Stabilisierung und ufrechterhaltung der dreidimensionalen Gesamtstruktur der R-Polymerase. Die Sigma-ntereinheit hat, wie gesagt, eine spezielle ufgabe bei der Erkennung von Startstellen der Transkription vor Bakteriengenen. Gen-nfang: Der Promotor Wie wird die R-Polymerase an den Gen-nfang geleitet? Wie unterscheidet sie den Strang, der transkribiert werden soll, vom komplementären Strang? Die R-Synthese sollte nicht irgendwo auf der D beginnen, sondern genau vor einem Gen. Es sollte auch nicht irgendein Strang transkribiert werden, sondern nur der Strang, dessen Transkript die genetische Information trägt, der codogene oder Sinnstrang. Die R-Polymerase (Holo-Enzym) bindet bevorzugt an Stellen auf der D, die vor einem Gen-nfang liegen. Eine solche Erkennungsund Bindestelle nennt man Promotor (promoter). Man kennt die ucleotid-sequenzen der über tausend verschiedenen Promotoren im Genom von E. coli. Beim Vergleich dieser Sequenzen fallen einige Regelmäßigkeiten auf (bb. 4.4): 1. In dem Bereich, der etwa 10 Basenpaare stromaufwärts vor dem Start der R-Synthese liegt, kommt oft eine Sequenz von ucleotiden vor, die eine mehr oder weniger große ¾hnlichkeit mit der Folge 5 -TTT-3 hat. Diese Sequenz wird gelegentlich nach ihrem Erstbeschreiber als Pribnow-Box, meist als TT-Box oder einfach als 10-Region bezeichnet (wobei als +1 das ucleotid am Startpunkt der R-Synthese angegeben wird). 2. In dem Bereich, der etwa 35 ucleotide stromaufwärts vom Start liegt (in der 35-Region), gibt es innerhalb eines T-reichen bschnitts eine zweite Folge von oft vorkommenden ucleotiden, im Idealfall 5 -TTG Ein drittes Erkennungselement in vielen bakteriellen Promotoren liegt direkt aufwärts der 35-Region. Daher die Bezeichnung als P-Element (upstream). Es enthält viele T-Basenpaare und ist eine Stelle, wo die a-ntereinheit der R-Polymerase an den Promotor gelangt. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt. 35 T T T G G T G T 17 ± 1 bp 10 T T T T T T 5 7 bp +1 T G T entwunden im offenen 9 Promotor-Komplex +3 bb. 4.4 Ein Musterpromotor des E. coli-genoms. Der bstand zwischen dem Transkriptionsstart und dem ersten ucleotid der 10-Region beträgt 5 7 Basenpaare (bp); der bschnitt zwischen der 10-Region und 35-Region 17 1 bp. Der untere der beiden D-Stränge ist der transkribierte oder codogene Strang, der obere der nichttranskribierte Strang [nach 8].

6 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 54 4 Transkription, Translation und der genetische ode GG GG T T T T T T T GT T GGT G T T GT T GT GT GGT T GT GG G GT T T T GG G T T G T T GT GGGG T G T GT GT G GGGG T T T T G T T T GT T GT GT GT T T T GT GT T GGT G pppgggggggggg F Met Thr Met D R Protein bb. 4.5 Die ucleotid-sequenz am nfang der lac-genfolge von E. coli. Beachte die bweichungen an der Transkriptionsstartstelle, an der 10- und an der 35-Region von der Konsensus-Sequenz. Der nfang der mr ist angegeben. us deren Sequenz kann man auf den transkribierten Sinnstrang der D schließen. In einem anderen Zusammenhang werden wir der Sequenz noch einmal begegnen und dabei auf einige weitere Strukturmerkmale eingehen [nach 7]. Diese Beziehungen sind in der bb. 4.4 zusammengefasst. Die dort gezeigten Verhältnisse treffen für einen Musterpromotor zu. Man spricht von einer Konsensus-Sequenz, weil die meisten natürlich vorkommenden Promotoren im Genom von E. coli in mehreren Positionen mit dieser Mustersequenz übereinstimmen. In Wirklichkeit gleicht so gut wie kein Promotor der Idealstruktur der Konsensus-Sequenz. ls Beispiel zeigt die bb. 4.5 die Promotor- Sequenz eines speziellen Gens, und man erkennt an mehreren Stellen in der 10- und in der 35-Region bweichungen von der Sequenz des Musterpromotors. Die 10-Region und die 35-Region sind die Grundelemente eines Promotors von E. coli und verwandten Bakterien. ls eine rt Faustregel kann gelten, dass je näher die Sequenz der Grundelemente mit der Konsensus-Sequenz verwandt ist, desto höher ist die ffinität der R-Polymerase zum Promotor. ber D-bschnitte stromaufwärts und stromabwärts davon beeinflussen die Wechselwirkung mit der R-Polymerase und damit die Effizienz der Transkription, besonders von Genen, die unter dem Einfluss von Regulationsmechanismen stehen (s. Kap. 5). Zusammengenommen hat das zur Konsequenz, dass manche Gene (Transkriptionsabschnitte) mehr als tausendmal und andere weniger als einmal während einer Bakterien-Generation transkribiert werden. Ereignisse am Promotor Wie findet die R-Polymerase einen Promotor? Der erste Schritt ist die schwache Bindung der R-Polymerase an irgendeine Stelle auf der Bakterien-D. Von dort gleitet sie an der D entlang: Sie löst und bindet sich im Wechsel, bis sie auf eine Promotor-Sequenz trifft, an der sie mit hoher ffinität haften bleibt. Die s-ntereinheit hat dabei wichtige Funktionen, denn erstens, verringert sie drastisch die Wechselwirkung der R-Polymerase mit unspezifischer D, und zweitens, erkennt sie im Verbund des Holo- Enzyms die D-Sequenzen sowohl in der 10-Region als auch in der 35-Region und vermittelt die spezifische Bindung der R-Polymerase an den Promotor. Die einfache Bindung an den Promotor ist nur der erste Schritt, der als Bildung des geschlossenen Promotor-Komplexes bezeichnet wird. Geschlossen, weil in diesem Stadium die D noch als Doppelhelix erhalten bleibt. Dann erfolgt in einem zweiten Schritt die Bildung des offenen Promotor-Komplexes : Der D-Doppelstrang wird in einem bschnitt von ungefähr 12 Basenpaaren um den Startpunkt der Transkription herum entwunden. Dabei ändert sich die rt der D-Bindung: Im geschlossenen Promotor-Komplex befindet sich der D- bschnitt zwischen den Basenpaaren 55 und 5 in engem Kontakt mit dem Enzym; im offenen Promotor-Komplex ist der enzymgebundene D-bschnitt länger: Er schließt nun die Basenpaare von 55 bis +20 ein. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt.

7 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart Transkription oder die Synthese von R 55 ore + s Holo-Enzym bp bb. 4.6 Ereignisse am Promotor. Das Bild betont die Veränderungen in der Konformation der R-Polymerase und in der rt der Enzym-D- Wechselwirkungen, wie im Text beschrieben. RP = R-Polymerase-Promotor-Komplex, geschlossen; RP = R-Polymerase-Promotor-Komplex, offen. Beachte, dass die D beim Übergang vom geschlossenen in den offenen Promotor-Komplex in eine rt Rinne oder Kanal des Enzms zu liegen kommt, ein Grund für die Stabilität der Bindung. s-ntereinheit RP RP Elongationskomplex s Die bb. 4.6 vermittelt eine Vorstellung von der ¾nderung der Enzym-D-Wechselwirkung und zeigt zugleich auch, dass der Übergang vom geschlossenen zum offenen Promotor-Komplex mit einer ¾nderung der Konformation der R-Polymerase einhergeht: Das Enzym bildet eine rt Rinne, die die D einschließt. Das ist der Grund, warum offene Promotor-Komplexe im Reagenzglas über Stunden bis Tage stabil bleiben können. Die Situation ändert sich mit der Zugabe von Ribonucleosid-Triphosphaten: Die R-Synthese beginnt, meist mit einem TP oder seltener mit einem GTP. ft wird zuerst nur ein kurzes R-Stück von bis zu zehn Ribonucleotiden gebildet, ohne dass die R-Polymerase ihre Position verändert. Eine solche abgebrochene R-Synthese kann sich mehrfach wiederholen, abhängig von der rt des Promotors und den Versuchsbedingungen. Erst wenn die R-Stücke Längen von 12 oder mehr ucleotiden erreichen, geht die Initiationsphase in die Elongationsphase der Transkription über. Dabei fällt die s-ntereinheit ab, und das Minimal- oder ore-enzym begibt sich auf den Weg entlang der D-Sequenz des Transkriptionsabschnittes. Die Rate, mit der die R-Polymerase den Promotor verlässt (promoter clearance), ist ein wichtiger Teilschritt der Initiation, denn nur ein frei gewordener Promotor kann wieder eine neue R-Polymerase aufnehmen. Wenn ein starker Promotor rasch frei wird, können viele R- Polymerasen einander auf dem Fuß folgen und gleichzeitig die Transkription der D durchführen (bb. 4.7). Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt.

8 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 56 4 Transkription, Translation und der genetische ode bb. 4.7 Schema der Transkription. Die Transkription beginnt mit dem offenen Promotor-Komplex. Das Holo-Enzym führt die Entwindung eines engen Bereiches um den Startpunkt der Transkription (+1) herbei. ach wenigen Polymerisationsschritten verlässt der s-faktor (Halbkreis) das ore- Enzym, das nun seinen Weg entlang des transkribierten D-Stranges fortsetzt. Der freigewordene Promotor wird wieder besetzt. Gleichzeitig sind mehrere R-Polymerasen mit der Transkription beschäftigt. Beachte, dass die R-Polymerasen auf ihrem Weg eine umschriebene Region entwundener D gleichsam wie eine Bugwelle mit sich führen wachsende R-Ketten Eine Schätzung ergibt, dass unter optimalen Lebensumständen etwa die Hälfte der mehr als 3000 R-Polymerase-Moleküle einer E. coli- Zelle mit R-Synthesen beschäftigt ist. Ein Viertel aller R-Polymerase-Moleküle sitzt am Promotor, der Rest ist unspezifisch an D gebunden (auf der Suche nach einem Promotor?). ur wenige R- Polymerase-Moleküle, vielleicht ein Prozent, befinden sich frei und ungebunden in der Zelle. Elongation der R-Kette D Das Prinzip der Kettenverlängerung ist die ständige Wiederholung einer Reaktionsfolge aus: Bindung des passenden ucleosid-triphosphates (TP), Ersatz des Pyrophosphates im TP durch das 3 -H-Ende der R, Freisetzen des Pyrophosphates, Bewegung des Enzyms relativ zum D-Matrizenstrang. Die Deoxynucleotide im Matrizen-D-Strang müssen für die npassung der komplementären Ribonucleotide zugänglich sein. Deswegen wird ein D-bschnitt von Basenpaaren im Bereich der R- Polymerase entwunden. Einige ucleotide am 3 -Ende der wachsenden R-Kette bleiben mit dem D-Matrizenstrang über Wasserstoffbrücken verbunden. Fachleute sind sich über die Längen dieser R-D- Hybrid -Bereiche nicht einig: manche finden Hinweise, die für einen sehr kurzen bschnitt von 2 4 Hybrid-Basenpaaren sprechen, andere meinen, dass die R-D-Hybrid-Bereiche bis zu 8 Basenpaare umfassen. Vermutlich sind die jeweils gewählten Versuchsbedingungen für die nterschiede verantwortlich. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt. Wenn E. coli-zellen sich unter optimalen Bedingungen vermehren, verläuft die Transkription mit einer Geschwindigkeit von Polymerisationsschritten pro Sekunde. Das Kennzeichen ist: stabile Bindung des Dreierkomplexes aus Enzym, D und R bei gleichzeitigem Gleiten entlang des Matrizenstranges.

9 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart Transkription oder die Synthese von R 57 Man fragt sich, wie diese beiden gegensätzlichen Bedingungen erfüllt werden können. Forschungen zeigen, dass dies durch mindestens drei Bindestellen auf dem Enzym gewährleistet wird: bschnitte des Enzyms umschließen die stromabwärts gelegene und noch nicht entwundene D wie eine Rinne; eine zweite Bindestelle umschließt den R- D-Hybrid-Bereich und eine dritte bildet eine rt Kanal, durch den die wachsende R das Enzym verlässt (bb. 4.8). Diese Eigenschaften ermöglichen der R-Polymerase im Prinzip eine gleichmäßige Bewegung entlang der D und eine rasche Wiederholung der Polymerisationsschritte. llerdings kommt es nicht selten zu Verzögerungen oder sogar zum nhalten der R-Polymerase. rsachen dafür können fehlerhaft eingebaute ucleotide sein, aber auch Besonderheiten der D-Sequenz oder D-gebundene Proteine, die der R-Polymerase sozusagen im Wege liegen. Das nhalten kann einige Sekunden bis länger als 30 Minuten dauern. Dabei erfolgt ein Zurückgleiten der R-Polymerase, wobei das 3 -Ende der wachsenden R-Kette freigesetzt wird. ls Reaktion darauf kann sich die R-Polymerase in die alte Position zurückbewegen oder das überstehende R-Ende abtrennen (bb. 4.9). In E. coli-zellen sind dafür zwei Proteine mit der Bezeichnung Gre und GreB notwendig. Sie fördern die Schneideaktivität der R-Polymerase. Somit gelangt das 3 -Ende der wachsenden R wieder in das aktive Zentrum, und die R-Polymerase kann die unterbrochene Synthese wieder aufnehmen. Termination Der Dreierkomplex aus Enzym, R und D bleibt bei Stops und Verzögerungen innerhalb eines Gens oder einer Transkriptionseinheit stabil. Der Komplex zerfällt erst am Ende des Gens und zwar an einer Stelle auf der D, die gewöhnlich als Terminator bezeichnet wird. Bei E. coli unterscheidet man zwei rten der Termination: Einfache (oder Rho-unabhängige) Termination. Sie wird im Wesentlichen durch die Sequenz von D und R bestimmt. Solche D- Sequenzen findet man bei etwa der Hälfte der Gene des E. coli-genoms. Sie bestehen aus Folgen von G-ucleotiden und einem Block D 12 14bp ~ 35 bp entwundene D ~ 8bp D-R-Hybrid R-Polymerase TP Bewegung R aktives Zentrum bb. 4.8 rganisation des Dreierkomplexes aus Enzym, D und R. Beschreibung im Text [nach 8]. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt. D R Elongation R-Polymerase gleitet zurück bspalten der überstehenden R bb. 4.9 nhalten und Verzögern. ormalerweise bewegt sich das Enzym bei der R-Synthese stromabwärts entlang der D (links). ber gelegentlich kommt es zu Verzögerungen und zum nhalten: Die R-Polymerase gleitet zurück (Mitte). Das hat zwei mögliche Konsequenzen: Die R-Polymerase gelangt wieder nach vorn und nimmt ihre alte Position ein (Pfeil von rechts nach links); oder das überstehende R-Ende wird abgespalten (durch die R-Polymerase selbst mit Hilfe der Proteine Gre und GreB) (rechts) [nach 25].

10 us Knippers, R.: Molekulare Genetik (ISB ) 2006 Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 58 4 Transkription, Translation und der genetische ode G G G G G G G G G GG- bb Haarnadelförmige Sekundärstruktur im 3 -icht-kodierungsbereich einer bakteriellen mr. Das hervorgehobene Triplett deutet das Ende des Kodierungsabschnittes an. bb Rho-Protein und Termination. Das Rho-Protein, ein Hexamer aus identischen ntereinheiten, bindet an einen Bereich der R. Es bewegt sich unter Spaltung von TP auf den Transkriptionskomplex (blau) zu und löst den Dreierkomplex auf [Einzelheiten in 4]. aus denin-bausteinen. ach der Transkription bildet sich in dem gerade synthetisierten R-Stück eine Doppelstrang-Struktur mit einem Stamm aus 4 10 G-Basenpaaren und einer Schleife von 3 8 ucleotiden gefolgt von mehreren racil-ucleotiden (bb. 4.10). Der R-Doppelstrang gelangt in den R-Kanal der R-Polymerase und verändert die Konformation des Enzyms mit der Folge, dass der Dreierkomplex Enzym-D-R auseinander fällt. Rho-abhängige Termination. Bei dem zweiten Typ von Termination findet man keine Besonderheiten der D-Sequenz oder der R- Struktur. ber Fachleute gehen davon aus, dass eine Voraussetzung für die Termination eine Verzögerung im Lauf der R-Polymerase ist. Das gibt dann dem Rho-Protein (oder Rho-Faktor) die Möglichkeit zur Bindung an das gerade synthetisierte R-Stück. Das Rho- Protein besteht aus sechs identischen ntereinheiten mit einer Molmasse von je etwa 50 kda. Die Bindung an R aktiviert eine TPspaltende Funktion (TPase), die dem Rho-Protein eine Bewegung in 5 -nach-3 -Richtung entlang des R-Fadens ermöglicht (bb. 4.11). Im Bereich der R-Polymerase setzt es die R frei, vermutlich über eine Trennung der Wasserstoffbrücken im R-D-Hybrid- Bereich. Stabile und nichtstabile R R-Polymerase synthetisiert alle rten der bakteriellen R (Tab. 4.1, S. 50) nach dem gleichen Reaktionsschema und mit ähnlicher Effizienz und Geschwindigkeit. Jedoch besteht der weit überwiegende Teil der R in einer Bakterienzelle aus rr und tr und nur 5 10 % sind mr. Diese Werte sind überraschend, wenn man berücksichtigt, dass unter guten Wachstumsbedingungen mehr als tausend proteinkodierende Gene ständig transkribiert werden und mr liefern, während höchstens nur sieben rr-gene und maximal etwas mehr als 80 tr-gene transkribiert werden. Man muss also den Schluss ziehen, dass mr bald nach ihrer Synthese wieder abgebaut wird und sich deswegen nicht in der Zelle anhäufen kann, während rr und tr für längere Zeit stabil bleiben. Tatsächlich liegt die Halbwertszeit des Überlebens durchschnittlicher bakterieller mr im Bereich von nur Sekunden. Ein Enzymapparat mit speziellen Ribonucleasen (Rasen) greift mr-moleküle an und hält ihre Mengen klein. Das bringt für die Bakterien den Vorteil größerer genetischer Flexibilität. Je nach Bedarf können neue mr-moleküle gebildet werden und ihre Wirkung in der Zelle entfalten, ohne dass ihr Effekt von den vorhandenen mrs überdeckt wird. Dagegen bleiben tr und rr stabil. Sie sind vor dem ngriff durch Ribonucleasen geschützt, einmal durch ihre ausgeprägte Sekundärstruktur, aber v. a. durch ihre Wechselwirkung mit Proteinen. m die Struktur der stabilen R und um die rt ihrer Wechselwirkungen wird es in den folgenden bschnitten gehen. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. rheberrechtlich geschützt. Transfer-R und die ktivierung von minosäuren Wie beschrieben, werden die Deoxynucleotid-Folgen von Genen mit Hilfe der R-Polymerase in eine Folge von Ribonucleotiden umgeschrieben und dem Proteinsynthese-pparat zur Verfügung gestellt.