Fische und Stress Tierschutzaspekte auf molekularbiologischer Ebene. Dr. med. vet. Henrike Seibel

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1 Fische und Stress Tierschutzaspekte auf molekularbiologischer Ebene Dr. med. vet. Henrike Seibel

2 Hintergrund Tierschutzaspekt immer mehr im Fokus der Öffentlichkeit Zunehmende Intensivierung der Fischproduktion In wie weit sind Haltungsbedingungen tiergerecht? Art. 20a Grundgesetz: der Staat hat in Verantwortung für die künftigen Generationen die natürliche Lebensgrundlage und die Tiere zu schützen 2 Tierschutzgesetz: Tier muss angemessen ernährt, gepflegt und verhaltensgerecht untergebracht sein und Schmerzen oder vermeidbare Leiden oder Schäden müssen vermieden werden 2

3 Hintergrund Drittmittelprojekt, finanziert von der Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung, Bundesprogramm Ökologischer Landbau und andere Formen nachhaltiger Landwirtschaft (BÖLN) Etablierung von Stressparametern auf mrna Basis aus Vollblut Bei der Regenbogenforelle 3

4 Definition von Stress unspezifische Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung. (Selye, 1973) Zustand, in dem die körpereigene Homöostase bedroht ist, bzw. angenommen wird, dass sie bedroht ist. (Chrousos, 1998) Äußere Anforderungsbedingung, in deren Folge es zur Auslösung einer Stressreaktion kommt Stressor z.b. Organismus Reaktion 4

5 Stressreaktion alle Prozesse, die im Organismus als Antwort auf einen Stressor in Gang gesetzt werden. Änderungen im/von Verhalten Gen- Expression Stoffwechsel Energiehaushalt Immunsystem Hormonhaushalt Nervensystem 5

6 Stressreaktion Dauer Intensitiät 1. Reaktion Neuroendokrine Ebene (Alarmreaktion) Ausschüttung von Stresshormonen z.b. plötzliche Verhaltensänderungen Bild: GMA akut Min.-Std. 2. Reaktion Physiologische Veränderungen (Resistenz) z.b. Erythrozyten oder Blutglukosespiegel Sauerstoffaufnahme über Kiemen (Ventilation ) 3. Reaktion Gesamtkörpereinfluss (Erschöpfung) z.b. Wachstum oder Reproduktion Krankheitsanfälligkeit ; Immunsuppression chronisch Tage-Wochen-Monate 6

7 Fütterungsversuch mit Sojabohnenmehl (SBM) Austausch von Fischmehl (50% in Basaldiät) durch Sojabohnenmehl um: 0 % 33 % 66 % 100 % Kein Stress Milder Stress Moderater Stress Hochgradiger Stress Antinutritive Inhaltsstoffe wie Saponine, Lectine, Phytinsäuren Verkürzung der Darmzotten Durchlässigkeit der Darmschranke Entzündungserscheinungen Bild: GMA 7

8 Untersuchte Parameter Hämatologische Parameter: Hämatokrit Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche) Wachstums- und Konditionsparameter z.b. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme, Mortalität, Gesundheitsstatus) Wasserparameter (O 2, NO kiel.de/de/fischtage/fischtag , ph, NH 4, Temp.), täglich bestimmt andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut) Büsumer Fischtag 2016 Parameter auf molekularbiologischer Basis 8

9 Cortisol [ng/ml] Cortisol und Kondition Durchfall Durchfall n = 6 nach 4 Wochen Durchfall V0 CD SBM33 SBM66 SBM100 nach 8 Wochen V0 Initialbeprobung CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 33,66,100 Austauschraten Stress konnte mit suboptimaler Futterformulierung erzeugt werden CD SBM33 SBM66 SBM100 K 0,89 ± 0,24 0,95 ± 0,29 0,94 ± 0,22 0,88 ± 0,20 SGR [%*d -1 ] 1,00 ± 0,12 0,87 ± 0,34 0,86 ± 0,1 0,44 ± 0,21 K = Fulton scher Konditionsfaktor; SGR = spezifische Wachstumsrate 9

10 Untersuchte Parameter Hämatologische Parameter: Hämatokrit Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche) Wachstums- und Konditionsparameter z.b. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme, Mortalität, Gesundheitsstatus) Wasserparameter (O 2, NO 2, ph, NH 4, Temp.), täglich bestimmt andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut) Parameter auf molekularbiologischer Basis 10

11 DNA mrna Bild: Seibel Ausschüttung von Botenstoffen 11

12 DNA mrna Minimal-invasive Methode zur validen Stressdiagnostik Bild: Seibel EDTA Vollblut 12

13 Molekularbiologie Fluidigm Biomark HD-System Auszug C3aR C5aR CCL4-1 C3a Rezeptor C5a Rezeptor C-C motif Ligand 4 Chemokin CD41 Cluster of differentiation 41 ENPP3 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 3 FGL2 Fibinogen like protein 2 Forellenspezifisches CC- Chemokin CC-Chemokin FTH Ferritin Heavy Chain Gen G-CSFR Granulozyten-Koloniestimulierende Faktor Rezeptor HP Haptoglobin HSP30 Heat Shock Protein 30 HSP47b Heat Shock Protein 47b HSP90AA1a Heat Shock Protein 90AA Untereinheit 1a HSP90AA1b Heat Shock Protein 90AA Untereinheit 1b IgM Immunglobulin M IL1b Interleukin 1 beta IL4 Interleukin 4 IL6 Interleukin 6 CXCL8 MPO MX1 NCCRP1 CXC-Motiv-Chemokine Ligand 8, entspricht IL8 Myeloperoxidase Myxovirus 1 Gen Non-specific cytotoxic cell receptor protein 1 NOS2 PPARG PSMB7 SAA Stickstoffmonoxid-Synthase Peroxisom-Proliferatoraktivierte Rezeptoren gamma Proteasome subunit beta type- 7 precursor Serum amyloid A SOD1 Superoxid Dismutase 1 TCRB T cell receptor beta chain Gen TLR20 Toll like Rezeptor 20 TLR22a Toll like Rezeptor 22a TLR3 Toll like Rezeptor 3 TLR5 Toll like Rezeptor 5 TLR9 Toll like Rezeptor 9 TNFa Tumor Nekrose Faktor alpha TNFb UCP2 Tumor Nekrose Faktor beta Mitochondrial uncoupling protein 2 13

14 Allgemeine Ergebnisse Die mrna einiger Gene wurde z.z. der Blutabnahme nicht expremiert (CXCL12, HSP47α, IFNγ1, IL10, TCBP1) Unterschiedlich hohe mrna Expression z.b. UCP2 zwischen 15 bis 100 Kopien / µg RNA TLR20 bis Kopien /µg RNA in der SBM100- Gruppe Teilweise deutliche individuelle Unterschiede zwischen Fischen 14

15 Kopien / µg RNA mrna Expression der Myeloperoxidase (MPO) p=0.029 CD SBM33 SBM66 SBM100 n = 6 Maximum Median Minimum Wichtiges Enzym der neutrophilen Granulozyten H 2 O 2 Starkes Oxidationsmittel bakterizid nach 4 Wochen nach 8 Wochen Regulation und Termination von Entzündungsprozessen Zeit 15

16 Kopien / µg RNA mrna Expression des Uncoupling Protein (UCP) N = 6 CD SBM33 SBM66 SBM100 n = 6 Maximum Median Minimum p=0.016 p=0.014 Besonders von Makrophagen expremiert Kontrolliert die Aktivierung von Immunzellen Hemmt die Produktion von reaktiven O 2 -Spezies nach 4 Wochen Zeit nach 8 Wochen 16

17 Kopien / µg RNA mrna Expression des Serum Amyloid A (SAA) p=0.079 N = 6 CD SBM33 SBM66 SBM100 n = 6 Maximum Median Minimum Unspezifische Immunreaktion bei akuter Entzündung, auch durch Nahrungsallergene ausgelöst (Mensch) nach 4 Wochen Zeit nach 8 Wochen Während Akuter-Phase- Reaktion ausgeschüttet Rekrutiert Immunzellen Wichtiger Teil des angeborenen Immunsystems 17

18 Kopien / µg RNA mrna Expression der Stickstoffmonoxid- Synthase (NOS2) p=0.031 CD SBM33 SBM66 SBM100 n = 6 Maximum Median Minimum Bildet Stickoxid (NO) Produziert von verschiedenen Immunzellen Potenter Immuneffektor mit antimikrobieller Aktivität Zu viel führt zu cytotoxischen Effekten wie Gewebe- oder Zellzerstörung nach bakteriellen Infektionen hochreguliert nach 4 Wochen Zeit nach 8 Wochen 18

19 Fazit Signifikant erhöhte mrna Expression in der SBM100-Gruppe im vgl. zur SBM33-Gruppe z.b. bei NOS2, SAA, UCP und MPO nach 8 Wochen NOS2, SAA, UCP und MPO können bei Forellen auch über Blut nachgewiesen werden Eignung als chronische Futterstress-Anzeiger gegeben Eignung als allgemeiner Stressparameter wird gerade noch validiert Die hier vorgestellten Gene stehen mit, durch Sojabohnenmehl bedingter, Unverträglichkeit und Entzündungen im Darm im Zusammenhang Verschiedene weitere interessante Gene noch in Auswertung Bspw. wird IgM mit steigender Sojabohnenmehlmenge herunterreguliert Könnte ein Hinweis auf Immunsuppression sein 19

20 Ausblick Evaluierung der relevanten Stressparameter auf molekularbiologischer Ebene in einem Fütterungsversuch auf Haltungsbedingten Stress Haltungsversuch nach Öko Richtlinien mit Forellen aus Starnberg und Wielenbach in initial niedriger (2,5 kg/m 3 ) und hoher (10 kg/m 3 ) Besatzdichte Ist eine der Forellenherkünfte für die niedrige/hohe Besatzdichte besser geeignet? 20

21 Vielen Dank Carsten Schulz für das Ermöglichen des Projektes; Helmut Wedekind, Marcus Zielasko und Kay Lübke (LfL Starnberg) für die gute Kooperation und Zusammenarbeit; Alexander Rebl, Tom Goldammer und Team (FBN Dummerstorf) für Unterstützung beim Primerdesign und Austestung geeigneter Gene; Kati Schlachter für die Beste Unterstützung bei den Laborarbeiten; Stephanie Michl und Frederick Kaiser für statistische Unterstützung; Jonas Müller für die Arbeit im Rahmen seiner Bachelorarbeit; Laura Schynawa für die Arbeit im Rahmen ihrer Masterarbeit; Michael Schlachter, Claudia Torno, Markus Griese und allen Kollegen an der GMA für Unterstützung und Inspiration 21