Neue Wege in der Stressdiagnostik bei Fischen

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1 Neue Wege in der Stressdiagnostik bei Fischen Dr. med. vet. Henrike Seibel Büsumer Fischtag 09. Juni 16 1

2 Gliederung Was ist Stress? Was macht Stress? Versuchsdesign Erste Fazit Ausblick 2

3 Hintergrund Hohe animal welfare Standards gefordert Spezies spezifisches Verhalten muss ausgelebt werden können Krankheits- und Stressprophylaxe ist wichtige Grundlage Stressresistente Spezies werden gefordert Etablierung von Stressparametern auf mrna Basis aus Vollblut Einleitung 3

4 Einleitung Foto: Alwaysimages.de 4

5 Definition von Stress unspezifische Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung (Selye, 1973) Physiologische Stress Antwort Stressoren Reaktion Einleitung 5

6 Stressantwort Weites Spektrum von physiologischen Mechanismen Änderungen im/von Energiehaushalt Verhaltens weisen Endokrinen System Einleitung Metabolismus Gen & Protein Expression Immunsystem Nervensystem 6

7 Einfluss auf das Immunsystem Dauer Intensitiät modifiziert Seibel Metabolische Veränderungen (z.b. Glucose & Lactat, Glycogen) Zell Veränderungen ( HSP Produktion) Gestörte Osmoregulation Veränderungen im Blutbild (Hct, Leukocrit, Hämoglobin) Veränderungen im Immunsystem Einleitung Thymus, Milz oder andere lymphatische Strukturen schrumpfen Anzahl weißer Blutkörperchen sinkt Blutungen oder Ulzerationen können im Verdauungstrakt vermehrt auftreten Dhabhar et al. (1995) J. Immunol. 154 (10) ; Dhabhar (2002) Brain Behav. Immun. 16 (6) Lokale Immunität steigt durch Auswanderung von Lymphozyten in die Haut und andere Körperregionen Dhabhar (2000) Ann. Ny Acad Sci

8 Fütterungsversuch mit Sojabohnenmehl Austausch von Fischmehl (50% in Basaldiät) durch Sojabohnenmehl um: 0 % 33 % 66 % 100 % Kein Stress Milder Stress Moderater Stress Hochgradiger Stress Energie restriktives Futtermittel Pellets Isonitrogenes Futtermittel Material & Methoden Welche Parameter eignen sich zur adäquaten Untersuchung von Stress? 8

9 Untersuchte Parameter Parameter auf molekularbiologischer Basis; mrna Expression von: β-actin, elongation factor 1-α (EF-1-α) und RPS5 als interne Standards Th1 Zytokine wie Interleukin (IL)-2 or IL-12 Th2 Zytokine wie IL-4, IL-10 Tumor necrosis factor α (TNFα) and Interferon γ (IFNγ) Heat-shock protein 70 (HSP70) und andere Hämatologische Parameter: Hämatokrit Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche) Material & Methoden Wachstums- und Konditionsparameter (z. B. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme, Mortalität, Gesundheitsstatus) Wasserparameter (O 2, NO 2, ph, NH 4, Temp.), täglich bestimmt und andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut) 9

10 Erste Fütterungsversuch Foto: Seibel Foto: Seibel Spezifische Stressvermeidungsstrategien durchgeführt 10

11 35 Cortisol Fütterungsversuch n = 6 Cortisol [ng/ml] Vzwi nach 4 Wochen Vend nach 8 Wochen V0 Initialbeprobung CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 33,66,100 Austauschraten 0 V0 CD SBM33 SBM66 SBM100 Große individuelle Unterschiede Zeitpunkt der Bestimmung wichtig! Quantitative Bestimmung des freien Cortisols im Blutplasma mittels kompetitiver ELISA; Cortisol Saliva; IBL International GmbH (nach Schlachter 2011) 11

12 abnehmende Effizienz Ressourcen werden knapp initiale Aktivierung des Immunsystems z.b. mehr Antikörper, mehr Lymphozyten Immunsuppression Distress und Maladaptation Zeit Minuten Tage Wochen Monate 12

13 Cortisol und Kondition Fütterungsversuch Durchfall Durchfall n = 6 Vzwi nach 4 Wochen Cortisol [ng/ml] Durchfall Vend nach 8 Wochen V0 Initialbeprobung CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 5 33,66,100 Austauschraten 0 Stress konnte mit suboptimaler Futterformulierung erzeugt werden CD SBM33 SBM66 SBM100 K 0,89 ± 0,24 0,95 ± 0,29 0,94 ± 0,22 0,88 ± 0,20 DFI [%*d 1 ] 2,43 ± 0,13 a 2,7 ± 0,13 a,b 2,69 ± 0,07 a,b 2,32 ± 0,21 b SGR [%*d 1 ] 1,00 ± 0,12 0,87 ± 0,34 0,86 ± 0,1 0,44 ± 0,21 K = Fulton scher Konditionsfaktor; DFI = tägl. Futteraufnahme; SGR = spezifische Wachstumsrate; Signifikante Untersuchiede zwischen den Gruppen sind durch Index-Buchstaben gekennzeichnet (p 0,05) 13

14 Fütterungsversuch [%] 40 Hämatokrit V0 Vzwi Vend n = 6 V0 Initialbeprobung Vzwi nach 4 Wochen Vend nach 8 Wochen CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 33,66,100 Austauschraten CD SBM33 SBM66 SBM100 Gewicht [g] 400 Vend R² = 0, ,00 20,00 40,00 60,00 Hämatokrit [%] Durchschnittlich % bei Forellen (nach Literatur normal ) Signifikant positive Korrelation zwischen Körpermasse und Hämatokrit Zusammenhang mit Stress höchste Cortisol Werte bei Vzwi Cortisol Erythropoese, Erythrodepletion 14

15 Differenzialblutbild Fütterungsversuch V0 Initialbeprobung Vzwi nach 4 Wochen Vend nach 8 Wochen CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 33,66,100 Austauschraten n = 6 auffällig: eosinophile Granulozyten nach 4 Wochen Versuchslaufzeit 15

16 [%] Lymphozyten CD SBM33 SBM66 SBM100 Fütterungsversuch V0 Initialbeprobung Vzwi nach 4 Wochen Vend nach 8 Wochen CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 33,66,100 Austauschraten n = V0 1 Vzwi 2 Vend Cortisol [ng/ml] V0 CD SBM33 SBM66 SBM100 Cortisol Lymphozytopenie Zusammenhang mit erhöhten Cortisolwerten höchste bei Vzwi 16

17 HSI, SSI & Histologie Fütterungsversuch 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 n = 12 CD SBM33 SBM66 SBM100 Melanomakrophagen aus: A Colour Atlas of Salmonid Diseases, ed. Bruno et al., 2 nd edition V0 Initialbeprobung Vzwi nach 4 Wochen Vend nach 8 Wochen CD Kontrolldiät SBM Sojabohnenmehl 33,66,100 Austauschraten Hepatosomatischer Index Splenosomatischer Index bei Stress bei Infektionskrankheiten 17

18 Untersuchte Parameter Parameter auf molekularbiologischer Basis; mrna Expression von: β-actin, elongation factor 1-α (EF-1-α) und RPS5 als interne Standards Th1 Zytokine wie Interleukin (IL)-2 or IL-12 Th2 Zytokine wie IL-4, IL-10 Tumor necrosis factor α (TNFα) and Interferon γ (IFNγ) Heat-shock protein 70 (HSP70) und andere Hämatologische Parameter: Hämatokrit Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche) Material & Methoden Wachstums- und Konditionsparameter (z. B. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme, Mortalität, Gesundheitsstatus) Wasserparameter (O 2, NO 2, ph, NH 4, Temp.), täglich bestimmt und andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut) 18

19 Fazit I Allgemein: Untersuchung unter Laborbedinungen Spiegelfolien Regelmäßige Überwachung von Gesundheitsparametern Standardisierte Beprobung Allgemeine Stressvermeidung Cortisol nach 4 Wochen, gegen Ende des Versuchs Hohe Standardabweichungen Zeitpunkt der Beprobung bedeutsam Aussage, ob Stress vorliegt, nur in Kombination mit anderen Parametern sinnvoll als valider Stressparameter fraglich Hämatokrit abhängig von Körpergewicht, große indiv. Unterschiede als valider Stressparameter eher nicht geeignet 19

20 Fazit II Prozentualer Anteil an Lymphozyten bei Stress Laborbedingungen!! Ausschluss anderer Erkrankungen als valider Stressparameter im Labor geeignet, für das Freiland fraglich HSI und SSI verändern sich nicht als valider Stressparameter nicht geeignet 20

21 Molekularbiologische Parameter 21

22 Molekularbiologie Lymphozyten EDTA Vollblut Mono zyten Minimal-invasive Methode zur validen Stressdiagnostik Feinabstimmung der Methode und Primeretablierung Material & Methoden Totale RNA Isolation Reverse Transkription der mrna in cdna Mol. Biol. Methoden etabliert qpcr Labor neu eingerichtet 22

23 Molekularbiologie mrna Isolation aus Fischblut nicht trivial Problem Ursache Lösung Hohe gdna Konzentration Kernhaltige Erys zu viel DNA/RNA für kommerzielle Kits Blut verklumpt schnell Spezielle Zusammenstellung des RNA Iso. Kits insg. 3 versch. gdna Verdauungen Bisher publizierte Primer binden gdna falsch pos. Exon-Exon span Primer etabliert 23

24 Molekularbiologie Exon-Exon überspannende neu designte Primer * für Regenbogenforelle Primersequenz Primerkonzentration Standardreihen Referenz Gene Th 1 Zellmarker EF1 α βactin RPS5 TGF β IL-1 β TNF α Proben aus Fütterungsversuch mrna isoliert und in cdna umgeschrieben * besonderen Dank an Dr. A. Rebl, Leibniz-Institut für Nutztierbiologie, Abt. Fischgenetik 24

25 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit! BÖLN für die Finanzierung; Prof. Dr. Carsten Schulz für s Ermöglichen des Projektes; Dr. Helmut Wedekind und Marcus Zielasko für die gute Kooperation im Rahmen des Herkunftsversuchs; Kati Schlachter für verlässliche Unterstützung bei den Laborarbeiten; Laura Schynawa für die Arbeit im Rahmen ihrer Masterarbeit; Dr. Jens Tetens (CAU) and Alexander Rebl (FBN Dummerstorf) für die Unterstützung beim Finden der richtigen Primer; Michael Schlachter, Claudia Grimm, Markus Griese und allen anderen Kollegen an der GMA für Unterstützung und Inspiration 25