FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE

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1 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE Literatur : Fluoreszenz Principles of Fluorescence Spectroscopy J.R. Lakowicz Kluwer Academic Press, 1999 Fluorescence Spectroscopy. New Methods and Applications O.S. Wolfbeis, Ed. 1993, Springer 1

2 Grundlagen Anregung Absorption Energieabgabe (Emission) Fluoreszenz 2

3 Jablonski Diagramm Energieterm-Schema Anregung Energieniveauschema A Lichtabsorption S 0 Grundzustand 2 e - mit entgegengesetztem Spin S 1 T 1 Singulett-Zustand angeregter Zustand mit entgegengesetztem Spin Triplett-Zustand angeregter Zustand mit paralleler Spin-Orientierung 3

4 Relaxationsprozesse IC IC internal conversion Energieabgabe durch Zusammenstoß mit Lösungsmittelmolekülen Stoßzahl mit H 2 O τ ~ s Schwingungsenergie an die Umgebung F Q Fluoreszenz Quencher auch zu höheren Wellenlängen - Rotshift τ ~ 10-8 s Energieübertragung auf Nachbarmoleküle ohne Aussendung von Licht X* + Q [XQ]* X* angeregter Fluorophor [XQ]* X + Q + hv 3 X=Q [XQ] Excimer [XQ]* X + Q + Wärme X#Q [XQ] Exciplex 4

5 Relaxationsprozesse ISC Chem ISC Interkombinationsübergang Intersystem Crossing durch Spinumkehr strahlungsloser Übrgang in Triplett-Zustand von dort langsamer Übergang in S 0 Phosphoreszenz P ( rotverschoben ) Chemische Reaktion z.b. Photosynthese oder Rhodopsin (Sehprozess - Isomerisierung von Retinal) 5

6 Messmethoden in der Fluoreszenzspektroskopie Fluoreszenzspektren Stoßprozesse Quenchen oder Excimerbildung Energietransfer Lösungsmittelrelaxation Chromophorrotation Statische Fluoreszenz Dynamische Fluoreszenz 6

7 Fluoreszenzparameter Emissionswellenlänge : λ em Fluoreszenzintensität : I Lebensdauer : τ [ns] Fluoreszenzanisotropie : r Quantenausbeute Q 7

8 Steady-State State Messungen M1 Anregungsmonochromator fix M2 Emissionsmonochromator scanbar Emissionsspektren M1 M2 scanbar / variabel fix / konstant Anregungsspektren 8

9 Fluoreszierende Biomoleküle Aromatische Aminosäuren Phe, Tyr, Trp Proteine ( Absorption 280 nm, Emission nm) Pyridinnukleotide Flavine Vitamin A (Carotinoide) Porphyrine Chlorophyll Steroide (einige) Intrinsische Fluorophore NICHT - FLUORESZIERENDE BIOMOLEKÜLE Lipide, Phospholipide, Kohlenhydrate, Fettsäuren, Carbonsäuren, Nukleinsäuren, nicht aromatische Aminosäuren 9

10 Künstliche Fluorophore Extrinsische Fluoreszenzsonden 10

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13 Fluoreszenzmarker Labelling Proteinlabelling Kovalent gebunden an SH- Gruppe (Thiolgruppe) von Cysteinen Kovalent gebunden an Amidgruppe von Lysinen Geringe Konzentrationen : 10-8 M sehr empfindliche Methode 13

14 Fluoreszenzmarker Membran DPH bis-pyrene PC C12-fluorescein 14

15 Fluoreszenzspektren Stokes Shift Δλ E > E ABS FLU λ ABS < λ FLU Stokes-Shift Shift Rotverschiebung des Fluoreszenzlichtes 15

16 Tryptophan-Fluoreszenz λ Emission unpolares Lösungsmittel ~325 nm Wasser ~350 nm Rot-Verschiebung im polaren Lösungsmittel Peptid + Lipid λ 340 nm Trp-Rest in Peptid λ 350 nm in unpolarerer Lipidumgebung Blau-Shift 16

17 Dynamische Fluoreszenzmessungen "Lifetime" Zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie schnelle Reaktionen und dynamische Bewegungen µs-ps Bereich. I = I 0 e -t/τ Pulsmethode single photon counting, gepulste Lichtquelle, I o Synchrotron Strahlungsquelle I o /e τ 17

18 Heterogene Fluoreszenz - Bestimmung von Proteindomänen Trp-Fluoreszenz (ersichtlich in welcher Umgebung) Trp im Inneren (unpolar) - eher im blauen Bereich τ 1 Trp außen (polar) - eher im roten Bereich τ 2 I Steady State Spektrum τ 1 τ 2 λ [nm] Trp Lebensdauer im Bereich von 3-6 ns 18

19 Fluoreszenzlöschung schung "Quenching" Löschermoleküle Quencher in der Lösung diffundierende Fremdmoleküle O 2, I -, NO, BrO 4-, Schweratome, Olefine, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Acrylamid hν F F* +Q +Q Dynamisches Quenchen [FQ] hν [FQ]* FQ + Wärme F + Q + Wärme Statisches Quenchen 19

20 Statisches Quenching : F + Q [FQ] im Grundzustand hν [FQ] [FQ]* fluoresziert nicht Intensität beeinflußt (da Konz. von F kleiner) FQ + Wärme Dynamisches Quenching : Löschung durch Stoß Kollisionslöschen F* + Q [FQ]* Wechselwirkung von Q mit angeregtem Fluorophor F + Q + Wärme Intensität und Lebensdauer beinflußt 20

21 Stern-Volmer Kinetik : τ 0 / τ = 1 + k Q τ 0 c Q τ 0 = Lebensdauer des angeregten Zustand ohne Quencher τ = Lebensdauer des angeregten Zustand mit Quencher k Q = Quenchkonstante c Q = Quencherkonzentration Löschung der Trp-Fluoreszenz: z.b. mit O 2 oder I -, Acrylamid Trp exponiert zugänglich für O 2 und I - Trp im Protein verborgen nur mehr für O 2 zugänglich Fluktuationen und Flexibilität von Protein Selbstquenchen : z.b. Calcein oder Carboxyfluorescin 21

22 Fluoreszenzanisotropie Fluoreszenzdepolarisation Absorption I II - I P = III + I linear polar. Licht Polarisation I II Polarisator I I II - I A = III + 2 I I F,ges = I II + 2 I Anisotropie Bestimmung der Rotationsbewegung von Chromophoren, Orientierung und Viskosität 22

23 Fluoreszenzdepolarisation Isotroper Rotator in LösungL τ F = Lebenszeit Fluorophor Perrin Gleichung : A(t) = A 0. e -t/τ rot = A 0. e -6D rot. t D rot = Rotationsdiffusionskoeffizient τ rot = 1/ 6 D rot Rotationskorrelationszeit Stoke sche Gesetz : D rot = RT/ η. V ~ r s 3 r s = Stoke scher Radius t = 0 A = A 0 t A 0 durch Rotation isotrop verteilt 23

24 Gehinderter Rotator in LösungL in Membranen - Rotationsbewegung in einem Kegel τ rot = A 0 - A / 6D w. A 0 D w = "wobbling" Diffusionskoeffizient A = statischer od struktureller Anisotropiebeitrag (Grenzanisotropie) A / A 0 Maß für die Orientierungsordnung des Fluorophors S = ( A / A 0 ) 1/2 Ordnungsparameter 0 < S < 1 Nanosekunden-Fluoreszenzpolarisation Laserpuls ( kleiner 10-9 s) Fluoreszenzanisotropie als Funktion der Zeit messen A(t). Dynamische Messung der Anisotropie 24

25 Fluoreszenzanisotropie kleine Anisotropie hohe Anisotropie Maß für r die Beweglichkeit schnelle Bewegung langsame Bewegung A = 0.4 zufallsorientierte Probe A = 1 max. Anisotropie orientierte Probe, feste Phase Photoselektion : Bevorzung der Absorption in bestimmten Orientierungen Bestimmung der Fluidität t und Viskosität t von Membranen Protein schnelle Bewegung in Lösung geringe Anisotropie Protein aggregiert hohe Anisotropie Bindung von Protein an Membran hohe Anisotropie 25

26 hν Resonanzenergietransfer hν ENERGIEDONOR ENERGIEAKZEPTOR hν Anregung Energietransfer Fluoreszenz Donor - Akzeptor Å Distanz abhängig Intensität des Fluoreszenzsignals nimmt mit r 6 ab. Emissionsband vom Donor überlappt Anregungsband vom Akzeptor teilweise Dipolorientierung von Donor und Akzeptor ungefähr parallel Förster Energietransfer Fluoreszenz-Donor-Akzeptor fluorescence resonance energy transfer (FRET) 26

27 Fluoreszenzlicht rotverschoben α Naphtyl Dansyl Poly-L-Prolinkette n bestimmt den Abstand % Energietransfer = f(r 6 ) 27

28 E trans = 100% r E trans = 0% Anwendung : Lokalisation und Abstandsbestimmung von Bindungsstellen an Proteinen Nachweis lateraler Assoziationen von Membrankomponenten Beweglichkeit von Makromolekülen in Lösung Membranfusion 28

29 Excimerfluoreszenz Fluoreszenzverschiebung k E Pyren* + Pyren [ Pyren ] 2 * angeregt nicht angeregt Dimer = Excimer ("excited dimer") Reaktionen: Fluoreszenz [ Pyren ] 2 * k E 2Pyren + Strahlung Strahlungsloser Übergang [ Pyren ] 2 * 2Pyren + Wärme Dissoziation [ Pyren ] 2 * Pyren* + Pyren 29

30 Stern-Volmer Gleichung Q F,M max Q F,M = 1 + k E τ 0 c M Q F,M max maximale Fluoreszenzquantenausbeute des Monomers τ 0 k E c M Lebensdauer des angeregten Monomers Löschkonstante durch Excimerbildung Konzentration von Monomeren Anwendungen : Dynamik Laterale Diffusionskoeffizienten D Flip-Flop Mechanismen in Membranen 30

31 Fluoreszenz Photobleichverfahren Fluorescence revovery after photobleaching FRAP Spot oder Bereich im Layer beleuchten (Lichtpuls) Bleichen von Fluorophor Fluoreszenzintensität sinkt Diffusion von ungebleichten Fluorophoren Fluoreszentintensität steigt Bestimmung der lateralen Diffusion 31

32 Fluoreszenzmikroskopie Zellen, Proteine, Antikörper,DNA Molecular Probes Inc. 32

33 Schema: blau angeregt grün emittiert Fluoreszenz Images : grüne Fluoreszenz angeregt bei 488nm rote Fluoreszenz angeregt bei 586nm Lampen : Xenon, Xenon/Hg Laser : Ar, Kr, He-Ne... 33

34 Fluoreszenzmikroskop 34

35 Konvokale Laserscanning Mikroskopie 35

36 "Z-Serie" Vergleich: Für Präparate bis 50µm, 0.5-1µm dünne Schichten darstellbar 36

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40 Dynamik in lebenden Zellen 40

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42 Fluoreszenz-Korrelations Spektrosopie (FCS) Einzelmoleküle beobachten! Diffusionsvorgänge und molekulare Wechselwirkungen Interaktion mit Zellen 42

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44 Diffusionskonstanten : proportional dem hydrodynamischen Radius und dem Molekulargewicht eines Moleküls 44

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48 Fluoreszenz " Dyes" Proteinbindungsstelle (an SH oder NH 2 ) chemisch reaktive Gruppe Lokalisation von Proteinen Auflösung ~ 0.2 µm (200nm) 48

49 Green Fluorescent Protein (GFP) GFP absorbiert im UV (blau) und fluoresziert gelb-grün in der Zelle GFP in tobacco cells 49

50 Fluoreszenzfarbstoffe für f r Proteine Fluoreszenz Label Excitation Emission FITC PE APC PerCP Cascade Blue Coumerin-phalloidin Texas Red Tetramethylrhodamine-amines CY3 (indotrimethinecyanines) CY5 (indopentamethinecyanines)

51 Fluoreszenzfarbstoffe für f r Membranen oder Zellen Probe Site Excitation Emission BODIPY Golgi NBD Golgi DPH Lipid TMA-DPH Lipid Rhodamine 123 Mitochondria DiO Lipid dii-cn-(5) Lipid dio-cn-(3) Lipid BODIPY - borate-dipyrromethene complexes NBD - nitrobenzoxadiazole DPH diphenylhexatriene TMA - trimethylammonium 51

52 Zell-Fusion fluoreszenzmarkierte Antikörper an Membranproteine Fluorescein grün Rhodamin rot 52

53 Immunofluoreszenz Enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) Bestimmung von Proteinen (SDS-Elektrophorese) von Gel auf Polymerschicht übertragen (Blotting) Antikörper rper-antigen Komplex 53