FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE

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1 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE Literatur : Fluoreszenz Principles of Fluorescence Spectroscopy J.R. Lakowicz Kluwer Academic Press, 1999 Fluorescence Spectroscopy. New Methods and Applications O.S. Wolfbeis, Ed. 1993, Springer 57

2 Grundlagen Anregung Absorption Energieabgabe (Emission) Fluoreszenz 58

3 Jablonski Diagramm Energieterm-Schema A Anregung Lichtabsorption Energieniveauschema S 0 Grundzustand 2 e - mit entgegengesetztem Spin S 1 T 1 Singulett-Zustand angeregter Zustand mit entgegengesetztem Spin Triplett-Zustand angeregter Zustand mit paralleler Spin-Orientierung 59

4 Relaxationsprozesse IC IC internal conversion Energieabgabe durch Zusammenstoß mit Lösungsmittelmolekülen Stoßzahl mit H 2 O τ ~ s Schwingungsenergie an die Umgebung F Q Fluoreszenz Quencher auch zu höheren Wellenlängen - Rotshift τ ~ 10-8 s Energieübertragung auf Nachbarmoleküle ohne Aussendung von Licht X* + Q [XQ]* X* angeregter Fluorophor [XQ]* X + Q + hv 3 X=Q [XQ] Excimer [XQ]* X + Q + Wärme X#Q [XQ] Exciplex 60

5 Relaxationsprozesse ISC Chem ISC Interkombinationsübergang Intersystem Crossing durch Spinumkehr strahlungsloser Übrgang in Triplett-Zustand von dort langsamer Übergang in S 0 Phosphoreszenz P ( rotverschoben ) Chemische Reaktion z.b. Photosynthese oder Rhodopsin (Sehprozess - Isomerisierung von Retinal) 61

6 Messmethoden in der Fluoreszenzspektroskopie Fluoreszenzspektren Stoßprozesse Quenchen oder Excimerbildung Energietransfer Lösungsmittelrelaxation Chromophorrotation Statische Fluoreszenz Dynamische Fluoreszenz 62

7 Fluoreszenzparameter Emissionswellenlänge : λ em Fluoreszenzintensität : I Lebensdauer : τ [ns] Fluoreszenzanisotropie : r Quantenausbeute Q 63

8 Steady-State Messungen M1 Anregungsmonochromator M2 Emissionsmonochromator Emissionsspektren fix scanbar M1 M2 scanbar / variabel fix / konstant Anregungsspektren 64

9 Fluoreszierende Biomoleküle Aromatische Aminosäuren Phe, Tyr, Trp Proteine ( Absorption 280 nm, Emission nm) Pyridinnukleotide Flavine Vitamin A (Carotinoide) Porphyrine Chlorophyll Steroide (einige) Intrinsische Fluorophore NICHT - FLUORESZIERENDE BIOMOLEKÜLE Lipide, Phospholipide, Kohlenhydrate, Fettsäuren, Carbonsäuren, Nukleinsäuren, nicht aromatische Aminosäuren 65

10 Künstliche Fluorophore Extrinsische Fluoreszenzsonden 66

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13 Fluoreszenzmarker Labelling Proteinlabelling Kovalent gebunden an SH- Gruppe (Thiolgruppe) von Cysteinen Kovalent gebunden an Amidgruppe von Lysinen Geringe Konzentrationen : 10-8 M sehr empfindliche Methode 69

14 Fluoreszenzmarker Membran DPH bis-pyrene PC C12-fluorescein 70

15 Fluoreszenzspektren Stokes Shift λ E ABS > E FLU λ ABS < λ FLU Stokes-Shift Rotverschiebung des Fluoreszenzlichtes 71

16 Tryptophan-Fluoreszenz λ Emission unpolares Lösungsmittel Wasser ~325 nm ~350 nm Rot-Verschiebung im polaren Lösungsmittel Peptid + Lipid λ 340 nm Trp-Rest in Peptid λ 350 nm in unpolarerer Lipidumgebung Blau-Shift 72

17 Dynamische Fluoreszenzmessungen "Lifetime" Zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie schnelle Reaktionen und dynamische Bewegungen µs-ps Bereich. I = I 0 e -t/τ Pulsmethode single photon counting, gepulste Lichtquelle, I o Synchrotron Strahlungsquelle I o /e τ 73

18 Heterogene Fluoreszenz - Bestimmung von Proteindomänen Trp-Fluoreszenz (ersichtlich in welcher Umgebung) Trp im Inneren (unpolar) - eher im blauen Bereich τ 1 Trp außen (polar) - eher im roten Bereich τ 2 I Steady State Spektrum τ 1 τ 2 λ [nm] Trp Lebensdauer im Bereich von 3-6 ns 74

19 Fluoreszenzlöschung "Quenching" Löschermoleküle Quencher in der Lösung diffundierende Fremdmoleküle O 2, I -, NO, BrO 4-, Schweratome, Olefine, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Acrylamid hν F F* +Q +Q Dynamisches Quenchen [FQ] hν [FQ]* FQ + Wärme F + Q + Wärme Statisches Quenchen 75

20 Statisches Quenching : F + Q [FQ] im Grundzustand [FQ] hν [FQ]* fluoresziert nicht Intensität beeinflußt (da Konz. von F kleiner) FQ + Wärme Dynamisches Quenching : Löschung durch Stoß Kollisionslöschen F* + Q [FQ]* Wechselwirkung von Q mit angeregtem Fluorophor F + Q + Wärme Intensität und Lebensdauer beinflußt 76

21 Stern-Volmer Kinetik : τ 0 / τ = 1 + k Q τ 0 c Q τ 0 τ = Lebensdauer des angeregten Zustand ohne Quencher = Lebensdauer des angeregten Zustand mit Quencher k Q = Quenchkonstante c Q = Quencherkonzentration Löschung der Trp-Fluoreszenz: z.b. mit O 2 oder I -, Acrylamid Trp exponiert zugänglich für O 2 und I - Trp im Protein verborgen nur mehr für O 2 zugänglich Fluktuationen und Flexibilität von Protein Selbstquenchen : z.b. Calcein oder Carboxyfluorescin 77

22 Fluoreszenzanisotropie Fluoreszenzdepolarisation Absorption I II - I P = III + I linear polar. Licht Polarisation I II Polarisator I I II - I A = III + 2 I I F,ges = I II + 2 I Anisotropie Bestimmung der Rotationsbewegung von Chromophoren, Orientierung und Viskosität 78

23 Fluoreszenzdepolarisation Isotroper Rotator in Lösung τ F = Lebenszeit Fluorophor Perrin Gleichung : A(t) = A 0. e -t/τ rot = A 0. e -6D rot. t D rot = Rotationsdiffusionskoeffizient τ rot = 1/ 6 D rot Rotationskorrelationszeit Stoke sche Gesetz : D rot = RT/ η. V ~ r s 3 r s = Stoke scher Radius t = 0 A = A 0 t A 0 durch Rotation isotrop verteilt 79

24 Gehinderter Rotator in Lösung in Membranen - Rotationsbewegung in einem Kegel τ rot = A 0 - A / 6D w. A 0 D w = "wobbling" Diffusionskoeffizient A = statischer od struktureller Anisotropiebeitrag (Grenzanisotropie) A / A 0 Maß für die Orientierungsordnung des Fluorophors S = ( A / A 0 ) 1/2 Ordnungsparameter 0 < S < 1 Nanosekunden-Fluoreszenzpolarisation Laserpuls ( kleiner 10-9 s) Fluoreszenzanisotropie als Funktion der Zeit messen A(t). Dynamische Messung der Anisotropie 80

25 Fluoreszenzanisotropie kleine Anisotropie hohe Anisotropie A = 0.4 A = 1 max. Anisotropie Maß für die Beweglichkeit schnelle Bewegung langsame Bewegung zufallsorientierte Probe orientierte Probe, feste Phase Photoselektion : Bevorzung der Absorption in bestimmten Orientierungen Bestimmung der Fluidität und Viskosität von Membranen Protein schnelle Bewegung in Lösung geringe Anisotropie Protein aggregiert hohe Anisotropie Bindung von Protein an Membran hohe Anisotropie 81

26 Resonanzenergietransfer hν ENERGIEDONOR hν ENERGIEAKZEPTOR hν Anregung Energietransfer Fluoreszenz Donor - Akzeptor Å Distanz abhängig Intensität des Fluoreszenzsignals nimmt mit r 6 ab. Emissionsband vom Donor überlappt Anregungsband vom Akzeptor teilweise Dipolorientierung von Donor und Akzeptor ungefähr parallel Förster Energietransfer Fluoreszenz-Donor-Akzeptor fluorescence resonance energy transfer (FRET) 82

27 Fluoreszenzlicht rotverschoben α Naphtyl Dansyl Poly-L-Prolinkette n bestimmt den Abstand % Energietransfer = f(r 6 ) 83

28 E trans = 100% r E trans = 0% Anwendung : Lokalisation und Abstandsbestimmung von Bindungsstellen an Proteinen Nachweis lateraler Assoziationen von Membrankomponenten Beweglichkeit von Makromolekülen in Lösung Membranfusion 84

29 Excimerfluoreszenz Fluoreszenzverschiebung k E Pyren* + Pyren [ Pyren ] 2 * angeregt nicht angeregt Dimer = Excimer ("excited dimer") Reaktionen: Fluoreszenz [ Pyren ] 2 * k E 2Pyren + Strahlung Strahlungsloser Übergang [ Pyren ] 2 * 2Pyren + Wärme Dissoziation [ Pyren ] 2 * Pyren* + Pyren 85

30 Stern-Volmer Gleichung Q F,M max Q F,M = 1 + k E τ 0 c M Q F,M max maximale Fluoreszenzquantenausbeute des Monomers τ 0 k E c M Lebensdauer des angeregten Monomers Löschkonstante durch Excimerbildung Konzentration von Monomeren Anwendungen : Dynamik Laterale Diffusionskoeffizienten D Flip-Flop Mechanismen in Membranen 86

31 Fluoreszenz Photobleichverfahren Fluorescence revovery after photobleaching FRAP Spot oder Bereich im Layer beleuchten (Lichtpuls) Bleichen von Fluorophor Fluoreszenzintensität sinkt Diffusion von ungebleichten Fluorophoren Fluoreszentintensität steigt Bestimmung der lateralen Diffusion 87

32 Fluoreszenzmikroskopie Zellen, Proteine, Antikörper,DNA Molecular Probes Inc. 88

33 Schema: blau angeregt grün emittiert Fluoreszenz Images : grüne Fluoreszenz angeregt bei 488nm rote Fluoreszenz angeregt bei 586nm Lampen : Xenon, Xenon/Hg Laser : Ar, Kr, He-Ne... 89

34 Fluoreszenzmikroskop 90

35 Konvokale Laserscanning Mikroskopie 91

36 "Z-Serie" Vergleich: Für Präparate bis 50µm, 0.5-1µm dünne Schichten darstellbar 92

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40 Dynamik in lebenden Zellen 96

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42 Fluoreszenz-Korrelations Spektrosopie (FCS) Einzelmoleküle beobachten! Diffusionsvorgänge und molekulare Wechselwirkungen Interaktion mit Zellen 98

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44 Diffusionskonstanten : proportional dem hydrodynamischen Radius und dem Molekulargewicht eines Moleküls 100

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48 Fluoreszenz " Dyes" Proteinbindungsstelle (an SH oder NH 2 ) chemisch reaktive Gruppe Lokalisation von Proteinen Auflösung ~ 0.2 µm (200nm) 104

49 Green Fluorescent Protein (GFP) GFP absorbiert im UV (blau) und fluoresziert gelb-grün in der Zelle GFP in tobacco cells 105

50 Fluoreszenzfarbstoffe für Proteine Fluoreszenz Label Excitation Emission FITC PE APC PerCP Cascade Blue Coumerin-phalloidin Texas Red Tetramethylrhodamine-amines CY3 (indotrimethinecyanines) CY5 (indopentamethinecyanines)

51 Fluoreszenzfarbstoffe für Membranen oder Zellen Probe Site Excitation Emission BODIPY Golgi NBD Golgi DPH Lipid TMA-DPH Lipid Rhodamine 123 Mitochondria DiO Lipid dii-cn-(5) Lipid dio-cn-(3) Lipid BODIPY - borate-dipyrromethene complexes DPH diphenylhexatriene NBD - nitrobenzoxadiazole TMA - trimethylammonium 107

52 Zell-Fusion fluoreszenzmarkierte Antikörper an Membranproteine Fluorescein grün Rhodamin rot 108

53 Immunofluoreszenz Enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) Bestimmung von Proteinen (SDS-Elektrophorese) von Gel auf Polymerschicht übertragen (Blotting) Antikörper-Antigen Komplex 109

54 Auflösungsvermögen von Mikroskopen Menschliches Auge 10 mm Organismen 1 mm 100 µm Eukaryontische Zellen Lichtmikroskopie 0.2 µm 10 µm 1µm Bakterien Zellorganellen Optisches Nahfeld Rasterelektronen mikroskopie Transmissions Elektronenmikroskopie Rastersonden mikroskopie 100 nm 10 nm 1 nm 0.1 nm Viren Makromoleküle Organische Moleküle Atome 110

55 Rasterelektronenmikroskopie (REM) scanning electron microscopy (SEM) Vakuum Anode Magnetische Linsen Ablenkspulen (x, y) Objektiv* Kathode Wehnelt-Zylinder Kondensor* Bildschirm Probe Detektoren für: Sekundärelektronen (SE) Rückstreuelektronen (RE) Oberfläche mit Elektronenstrahl abrastern Ausbeute der Sekundärelektronen in Abhängigkeit zur Neigungsfläche der abgebildeten Probe 111

56 Rasterelektronenmikroskopie (REM) Relativ dicke Proben : Biologische Probe mit Metall bedampfen (haltbar und leitend machen) Plastische, dreidimensionale Darstellung von Oberflächen. Auflösung ca. 3 nm. Haar Fliegenauge 112

57 Rastersondenmikroskopien : Allgemein Bild nicht optisch oder elektronisch abgebildet - sondern Bild wird durch eine Sonde erzeugt Probenoberfläche wird mit der Sonde abgerastert Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe wird detektiert und das Bild rekonstruiert. Wechselwirkung entspricht einer Kraft : elektrisch, mechanisch, magnetisch oder mit einer Lichtwelle Rastertunnelmikroskopie (RTM), scanning tunneling microscopy (STM) Rasterkraftmikroskopie (RKM), atomic force microscopy (AFM) Magnetkraftmikroskopie (MKM), magnetic force microscopy (MFM) Optische Rasterfeldmikroskopie, scannning near-field electron microscopy (SNOM) 113

58 Rastertunnel-Mikroskopie (RTM) scanning tunneling microscopy (STM) Abbildung der Oberfläche der Probe (nur für elektrisch leitende Oberflächen) Tunneleffekt Quantenmechanischer Effekt Elektronen haben Welleneigenschaften und können sich mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit durch eine Potentialbarriere durchtunneln. < 1 V Leitende Oberflächen : Abstand zwischen Probe und Sonde verringern (1 nm) - Tunnelstrom kann fließen abhängig vom Abstand Probe-Spitze 114

59 Entwicklung des Rastertunnelmikroskops Ende 1981 zu sehen. Damit gelang es erstmals Atome abzubilden. Gerd Binning und Heinrich Rohrer vom IBM-Forschungslabor in Rüschlikon wurden dafür 1986 mit dem Nobelpreis für Physik ausgezeichnet. Gerd Binning Heinrich Rohrer Eisen auf Kupfer - Corral 115

60 Rastertunnel-Mikroskop 116

61 Rasterkraft-Mikroskopie (RKM) atomic force microscopy (AFM) Detektor Laser Hebelarm und atomare Spitze Probe auf Piezo-Steuerquarz (x, y, z) 117

62 AFM Cantilever Spitze Tip < 20 nm, Silizium Feder mit geringer Federkonstante : ~0.1N/m Signal ist die Auslenkung der Feder Probe muss nicht elektrisch leitend sein! 118

63 AFM : Methode 119

64 Der Laserstrahl wird auf die Rückseite des Cantilevers fokussiert und der reflektierte Strahl mit einem Photodetektor erfasst. Jeder Verbiegung des Cantilvevers wird am Bildschirm ein Helligkeitswert zugeordnet. Ein Höhenprofil - Topographiebild - wird erstellt. Gescannt wird mit konstanter Geschwindigkeit in der x,y Ebene. 120

65 AFM - Modus Kontaktmodus : Abrastern der Oberfläche Nicht-Kontaktmodus : Spitze im Abstand von 2-20 nm von der Probe Van der Waals Wechselwirkung Tapping Mode (MAC) Verformung der Probe durch permanente Krafteinwirkung möglich Oszillierendes Magnetfeld bewirkt Bewegung des magnetisierten Cantilever Oszillationsfrequenz : khz Durch van der Waals-Wechselwirkungskräfte mit der Probe kommt es zu einer Änderung der Oszillationsfrequenz und Amplitude. 121

66 AFM Oberflächen Graphit Mica Al-Silizium Mineral planare Oberflächen hydrophil neg. geladen in H 2 O Mica-Oberfläche 1µm 2. Rauhigkeit weniger 6Å 122

67 AFM Aufnahmen Proteinmoleküle auf Mica 123

68 AFM Bindung von Proteinen an Membranen Protein Lipid bilayer aminopropyltriethoxy silane Mica 124

69 AFM Aufnahmen 125

70 Moleküle bewegen - mit AFM Cantilever schreiben 126

71 Rastersondenmikroskope im Vergleich 127

72 Rastersondenmikroskope im Vergleich 128