Proteinstrukturaufklärung mit NMR

Transkript

1 Proteinstrukturaufklärung mit NMR Erlaubt die Strukturaufklärung von Proteinen in Lösung (nicht als Kristall) Kurt Wüthrich 1

2 Proteinstruktur 2

3 Proteinstruktur Primärstruktur Peptidbindung Bedingt durch die Mesomerie der Carbonsäureamid-Gruppe befinden sich das Cα-, CO-,Nund H-Atom nahezu in einer Ebene. Torsionswinkel Die Verdrehung dieser Ebene gegen die Ebene des darauf folgenden Restes wird durch zwei Torsionswinkel beschrieben 3

4 Proteinstruktur Sekundärstruktur: Häufig auftretende Strukturmotive α-helix β-faltblatt random coil 4

5 Proteinstruktur Tertiärstruktur: übergeordnete räumliche Anordnung der Polypeptidkette 5

6 Proteinstruktur 2D-NOESY eines115 kda Proteins 6

7 Proteinstruktur 7

8 Proteinstruktur Schematische Darstellung eines HNCA Experiments 8

9 Proteinstruktur Chemische Verschiebungen der Aminosäuren 9

10 Proteinstruktur NOEs Übereinandergelatertes NOESY (schwarz) und TOCSY (rot) 10

11 Proteinstruktur Erste Zuordnung der NOE Signale: Intensität Abstand in nm sehr stark 0.23 stark 0.28 mittel 0.31 mittel schwach 0.35 schwach

12 Proteinstruktur Charakteristische NOE für alpha-helix aus Struktur ableitbar 12

13 Proteinstruktur Charakteristische NOE für alpha-helix aus Struktur ableitbar 13

14 Proteinstruktur Wechselwirkungen im beta-faltblatt 14

15 Proteinstruktur 15

16 Lumineszenzspektroskopie Schwarze Strahler Radiolumineszenz Biolumineszenz Fluoreszenz Phosphoreszenz Chemolumineszenz 16

17 UV/Vis Spektroskopie 17

18 UV/Vis Spektroskopie 18

19 Jablonski Diagramm IC = internal conversion ISC = inter system crossing 19

20 Anregung 20

21 Anregung 21

22 UV-Spektrum I Gas Phasen Spektrum bei RT mit Schwingungssmodii II bei 77 K in Isopentan / Methylcyclohexan Matrix III In Cyclohexan bei RT IV In Wasser bei RT 22

23 UV-Spektrometer Q = Strahlungsquelle m = Monochromator Z = Beam splitter (rotierender Spiegel) Mk = Messküvette Vk = Küvette mit Lösungsmittel D = Photoelektronendetektor 23

24 UV-Spektrum isolierter Chromophore 24

25 UV-Spektrum konjugierter Chromophore 25

26 UV-Spektrum konjugierter Chromophore 26

27 UV-Spektrum konjugierter Chromophore Sterische Effekte 27

28 Fluoreszenzspektroskopie 28

29 Fluoreszenzspektroskopie Ionen Polarität Wasserstoffbrücken Quencher Fluoreszenz ph Druck Temperatur Viskosität 29

30 Fluoreszenzspektroskopie 30

31 Fluoreszenzspektroskopie 31

32 Fluoreszenzspektroskopie Spezifische Proteinmarkierung Quantum dots In vivo Markierung 32

33 Fluorometer 33

34 Konfocales Laserscanning Mikroskop 34

35 Fluoreszenzemission 35

36 Absorption s 36

37 Relaxation s s 37

38 Fluoreszenzemission Lebenszeit S s s 38

39 Fluoreszenzemission Stokes shift 39

40 Phosphoreszenzemission ISC s s Lebenszeit T s - 1 s 40

41 Lebenszeiten 41

42 Eigenschaften ausgewählter Aromaten 42

43 Fluoreszenzintensität 43

44 Substituenteneinfluss auf Fluoreszenz basisch sauer ph-abhängigkeit des UV-Spektrums von Anthracen-9- carboxylsäure 44

45 Chelatisierung und Fluoreszenz Spezifische Sensoren für Al (III) und Ga (III) R=Metall/n-BUSOX 45

46 Chelatisierung und Fluoreszenz Spezifische Sensoren für Al (III) und Ga (III) R=Metall/n-BUSOX Bryant et al. Progress in Organic Coatings, 57, Lack mit Fluoreszenzfarbstoff zur Früherkennung von Korrosion 46

47 Lösungsmittel Relaxation hohes Dipolmoment geringes Dipolmoment Rotverschiebung ausgeprägter, wenn Lösungsmittel hohe Polarität hat Viskositätsmessungen möglich 47

48 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan COO - - OOC COO - COO - CM O PDT O O COO - OH OH Chorismate Prephenate Phenylpyruvate Inhibition Inhibition Aminotransf. COO - NH 3 + CM Corismate Mutase Phenylalanine PDT Prephenate Dehydratase 48

49 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan Reaktion durch "P-protein" katalysiert CM PDT?? 386 Aminosäuren Dimere in der aktiven Form Oligomere in Gegenwart von Phenylalanin Aminosäuren Corismat Mutase 49

50 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan hν (295nm) hν ' CM Trp Trp PDT? Veränderung der Fluoreszenz in Gegenwart von Phe Zhang et al. J. Biol. Chem. 273, 1998,

51 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan hν (295nm) hν ' Trp CM PDT Keine Veränderung der Fluoreszenz in Gegenwart von Phe Zhang et al. J. Biol. Chem. 273, 1998,

52 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan hν (295nm) hν ' Trp PDT Trp R Veränderung der Fluoreszenz in Gegenwart von Phe Zhang et al. J. Biol. Chem. 273, 1998,

53 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan hν (295nm) hν ' Trp R Veränderung der Fluoreszenz in Gegenwart von Phe Zhang et al. J. Biol. Chem. 273, 1998,

54 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan hν (295nm) hν ' Trp R 10 I II III rel. intensity nm Zhang et al. J. Biol. Chem. 273, 1998, 6248 Emissionswellenlänge abhängig von der chemischen Umgebung von Tryptophan Tryptophan wird während Interaktion mit Phe exponiert Hydrophobe Oberfläche vergrössert Hydrophobe Interaktionen 54

55 Intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan R PDT CM CM PDT R Phe R PDT PDT CM R CM R PDT CM CM PDT R Hydrophobe Interaktionen vermitteln die Inaktivierung durch Oligomerisierung Zhang et al. J. Biol. Chem. 273, 1998,

56 Sensoren zur ph Bestimmung Photonic crystal fibres (Lichtdurchlässige Kapillaren mit definierten Mikrostrukturen) Galian et al. J. Mater. Chem. 16, 2006,

57 Sensoren zur ph Bestimmung Kapillarkräfte saugen Coumarin 6 Lösungen an Grün: unprotonierter Farbstoff (Anregung 440 nm) Rot: protonierter Farbstoff (Anregung 499 nm) Kapillare in EtOH Lösung von Coumarin 6 Kapillare mit Coumarin 6 nach Säurezugabe Galian et al. J. Mater. Chem. 16, 2006,

58 Alexa Fluor Familie 58

59 Alexa Fluor Familie Immunolabeling: Farbstoffe können auf spezifische Antikörper aufgebracht werden und dann mit z.b. Proteinen der Zelle Reagieren 59

60 Alexa Fluor Familie Immunolabeling: Farbstoffe können auf spezifische Antikörper aufgebracht werden und dann mit z.b. Proteinen der Zelle Reagieren 60

61 Rhodamin Fluoreszenz 61

62 Rhodamin Fluoreszenz Laser verschiedener Wellenlängen 62

63 Rhodamin Fluoreszenz Funktionelle oder strukturelle Untereinheiten können simultan visualisiert werden 63

64 Fluoreszenztracer 100 micron/sec Fluss um einen 25 micron Goldstab in einem elektrischen Feld im polymeren Mikrokanal Aufspürung von Verschmutzungsquellen Effizienz von Mischkammer Fluss zwischen Sedimentschichten 64

65 Fluorescein Fluoreszenz 65

66 Fluoresceindiacetat (LIVE/DEAD assay) Rattenzellen mit Fluoresceindiacetat und nicht membrangängigem EtHD1 (rot) gefärbt Lungengewebe 66

67 Schicksal angeregter Zustände Bernard Valeur "Molecular Fluorescence" Wiley-VCH

68 Statisches Quenching a a b b R R R O + verwundungsaktivierte Phospholipase A 2 COOH O 2, Lipoxygenase, Lyase 3 C10-Fragment O CH 2 OR OCH O CH 2 O P CH 2 OR + HCOH O CH 2 O P O - O + N(CH 3 ) 3 O - O + N(CH 3 ) 3 R = Acyl, Stearyl, etc. R = C 4 H 9, C 4 H 7 Phospholipase spaltet Bindung und entlässt fluoreszente Fettsäure 68

69 Statisches Quenching a b 69

70 Kationen Sensor Calixaren basierte photoinduced electron transfer (PET) sensoren Aoki et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1992,

71 Molecular Beacons Wechselwirkungen im Hairpin kleiner als mit komplementärer DNA Sequenzspezifische Detektion von DNA 71

72 Excimer Bildung Pyrenfluoreszenz (A 10-2 M, G 10-4 M) 72

73 Excimer Bildung Z.B. Bei Virus / Gast Fusion 73

74 FRET 74

75 Quantitative in vivo FRET cgmp Indikatorprobe 75

76 Real Time PCR Quantifizierung von DNA mit FRET Quantifizierung von DNA mit Quenching 76