Gläser als Fluoreszenzstandards für die Mikroskopie

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1 Gläser als Fluoreszenzstandards für die Mikroskopie D.Ehrt *, R. Atzrodt, W. Wintzer Otto-Schott-Institut, FSU Jena C. Rußmann, K-H. Geier, G. Nordt Carl Zeiss Jena U. Kolberg, M. Leister Schott Glas Mainz DGG-Glasforum Würzburg

2 Gliederung Fluoreszenz in der Analytik Vorteile von Gläsern Gläser mit grüner Fluoreszenzemission Gläser mit roter Fluoreszenzemission und langer Lebensdauer Anforderungen an Fluoreszenzstandards Glasentwicklung und Herstellung Test

3 Fluoreszenzanalyse Lumineszenzemission: Lichtaussendung elektronisch angeregter Atome und Moleküle 2-3 Größenordnungen empfindlicher als Absorptionsmessung Direkte Messung Fingerabdruck Schwierig, da keine Referenz und viele Konkurrenzreaktionen

4 Mögliche Relaxationskanäle

5 Vergleich Absorption und Emission Absorption relative Messung unabhängig von I 0 E λ = log (I 0 /I) λ = ε λ. c. d Lambert-Beer Fluoreszenzintensität F direkte Messung direkt proportional I 0 und Φ F = 2,3. Φ. F I. o ε. λ c. d Quantenausbeute

6 Anforderungen an Glas Emission und Anregung in definierten Spektralbereichen Lebensdauer der Emission Optisch homogen ( n < ) Reproduzierbar Chemisch-physikalische Eigenschaften (Beständigkeit, Strahlenresistenz, usw.) Bearbeitbarkeit

7 Standardglas mit grüner Emission Spektrale Augenempfindlichkeit: Nacht = schwarz-weiß Tag = Farbe Max. = grün ~550nm

8 Mögliche Fluorophore für grüne Emission in Gläsern Seltene Erden (f-f Übergänge) Tb 3+ (4f 8 ) Dy 3+ (4f 9) Ho 3+ (4f 10 ) Er 3+ (4f 11 ) Übergangsmetalle: Mn 2+ (3d 5 ) KZ 4

9 Mögliche Fluorophore für rote Emission in Gläsern Seltene Erden (f-f Übergänge) Sm 3+ (4f 5 ) Eu 3+ (4f 6 ) Übergangsmetalle: Mn 2+ (3d 5 ) in KZ 6

10 Einflussfaktoren Glasmatrix : Silicate, Borosilicate, Fluoride, Phosphate Konzentration der Fluorophore Schmelzbedingungen - Technologie Rohstoffe Redoxverhalten (Mn 2+ / Mn 3+ ) etc.

11 Optische Absorption Tb 3+ (4f 8 ) Wellenlänge (nm) E / d (cm -1 ) FP20 FP3 ~ 1%Tb 3+ sehr schwach farblos nm Einfluss Glasmatrix gering Wellenzahl (cm -1 )

12 Grüne Tb 3+ - Fluoreszenz Wellenlänge (nm) ~1% Tb Intensität a.u Excitation Em 543nm nm 369 Emission Ex 378nm nm FP20 FP3 d=4mm Matrixeinfluss gering /5 Wellenzahl (cm -1 )

13 Optische Absorption Dy 3+ (4f 9 ) Wellenlänge (nm) E / d (cm -1 ) FP20 FP3 1% Dy ~ nm Wellenzahl (cm -1 ) schwach Matrixeinfluss gering farblos

14 Grüne Dy 3+ - Fluoreszenz Em 574nm Wellenlänge (nm) Emission Ex 350nm ~1% Dy nm 574nm FP3 Intensität a.u d=2mm / Wellenzahl (cm -1 ) FP20 Matrix

15 Optische Absorption von Ho 3+ (4f 10 ) E/d (cm -1 ) FP10 / Ho Wellenlänge (nm) % ~ [Ho 3+ ] 0.0 0,1% Wellenzahl (cm -1 )

16 Grüne Ho 3+ - Fluoreszenz 1% Ho 3+ Excitation Emission nm FP 3 Intensität a.u /5 FP Wellenlänge (nm) Matrix

17 Grüne Ho 3+ - Fluoreszenz Excitation 1% Ho 3+ Emission 800 ZBLAN Fluoride Intensität a.u FP 0 FP 3 Oxide 0 3/ Wellenlänge (nm)

18 Optische Absorption Er 3+ (4f 11 ) Extinktion NBS1 / Er Wellenlänge (nm) nm 520nm * Er * Er 2 d=10mm nm ~ ~ [Er 3+ ] Wellenzahl (cm -1 )

19 Absorption Er 3+ - Matrixeinfluss gering Wellenlänge (nm) 0,1% Er 3+ Extinktion FP3 FP10 FP20 Al-Si-Sb OH nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm Wellenzahl (cm -1 ) 5000 d=10mm

20 3/3; FP = 5 mm; Al-Si-Sb = 10 mm nm nm nm nm nm nm nm Intensität Grüne Er 3+ - Fluoreszenz Excitation Matrix ~0,1 % Er 3+ FP 3 Al-Si-Sb FP 10 FP nm nm Wellenlänge (nm) Emission nm nm nm nm nm nm nm nm

21 Optische Absorption Silicatgläser + 0,5 % Mn Wellenlänge (nm) Extinktion Mn 2+ ~420nm Mn nm NCS NBS1 NBS1/Z Problem Mn 3+!!! ~355nm ~ d=10mm Wellenzahl (cm -1 )

22 Grüne Mn 2+ (3d 5 ) - Fluoreszenz in Silicaten KZ Anregung 420nm 430nm 525nm Emission NBS1 + Zucker Intensität a.u nm 370nm ~465 NBS1 NCS 0 0,5% Mn / Wellenzahl (cm -1 ) d=10mm

23 Rote Mn 2+ - Fluoreszenz in Phosphaten Excitation Wavelength (nm) Emission Intensity a.u C-T 1 407nm nm 605nm 1 2 langwellige Verschiebung mit steigender Mn 2+ - Konzentration KZ Wavenumber (cm -1 )

24 Rote Mn 2+ - Fluoreszenz in Fluoriden Excitation ~4% Mn Emission 600 FP nm Intensity a.u ~350 FP10 FP20 langwellige Verschiebung mit steigendem Phosphatzusatz /5 Wavelength (nm) d =10mm KZ 6

25 Lebensdauer der roten Mn 2+ - Fluoreszenz Ex 355nm-Laser normierte Intensität Zeit [µs] Em 615nm τ in ms- Bereich fällt mit steigender [Mn 2+ ]

26 Lebensdauer der roten Mn 2+ - Fluoreszenz Intensität a.e. 3.5x10 6 4% Mn Ex 355nm 3.0x x x x10 6 Em 665nm Matrix FP20 FP10 FP4 MP FPM 1.0x Zeit [µs]

27 Rote Fluoreszenz von Sm 3+ (4f 5 ) Excitation Wellenlänge (nm) Emission nm 595nm FP / 1% Sm 3+ Intensität nm ~700 Problem: schmale Banden verschiedene Übergänge /5 d=2mm Wellenzahl (cm -1 ) 15000

28 Rote Fluoreszenz von Eu 3+ (4f 6 ) Intensität Excitation Wellenlänge (nm) /3 320 d=10mm nm nm Wellenzahl (cm -1 ) Emission 610nm ~1% Eu 3+ Matrix FP10 NCS NBS1 Schmale Banden

29 Lebensdauer Sm 3+ und Eu 3+ normierte Intensität Energie- Transfer Zeit [µs] Ex 355nm Em 615nm NBS ~1% Eu NCS ~0,5% Eu NBS ~ 0,5% Eu FP ~ 1% Sm τ im ms- Bereich

30 Absolute Lebensdauer Sm 3+ und Eu Ex 355nm Em 615nm Nicht normiert auf Ausgangsintensität! Intensität a.e FP ~ 1% Sm NBS ~1% Eu NCS ~0,5% Eu NBS ~ 0,5% Eu Zeit [µs] τ im ms- Bereich

31 Glasentwicklung Gläser für grüne Fluoreszenzstandards durch Lampen- und Laser-Anregung Gläser für langlebige rote Fluoreszenzstandards durch Laser- und Lampen-Anregung

32 Technologieentwicklung Rohstoffe Schmelztechnologie Redoxverhalten Bearbeitung Prüfung OSI/Jena SCHOTT/Mainz Zeiss/Jena

33 Glaseinsatz Grüne Fluoreszenzstandards: 1. bisher ~300 kleine Platten (15 x 15 x 2 mm 3 ) für ZEISS-Mikroskope im OSI hergestellt, bearbeitet, geprüft und geliefert; 2. große Platten ( ~130 x 90 x 3 mm 3 ) für ZEISS Multimode Reader plate-vision als Labormuster im OSI und bei SCHOTT hergestellt, bei ZEISS bearbeitet und erfolgreich im Reader getestet;

34 Glaseinsatz Standards mit langlebiger roter Fluoreszenz 1. kleine Platten hergestellt und erfolgreich im ZEISS Reader getestet; 2. große Platten (~ 130 x 90 x 5 mm 3 ) als Muster hergestellt Test im Reader steht an.

35 Zeiss Jena: plate-vision mit Multimode Reader Screeningsystem für pharmazeutische Wirkstoffsuche (UHTS- Ultra High Throughout) 96fache Paralleldetektion von Fluoreszenz, Polarisation und Absorption in 96-, 384- und 1536-Well-Mikrotiter- Platten (MTP) > Proben/Tag Entwicklung von Carl Zeiss Jena mit Hoffmann-La Roche Basel

36 Zeiss Multimode Reader- plate-vision Optischer Aufbau MTP Multi-Titer-Platte Mini-Linsen-Array Standardglas Teleskop-Linsen

37 kalibrierte Messung der 96er Platte Signal-Fehler über 96 Kanäle = 3,2% 1. Test rfu R1 R4 R7 Eine leichte Inhomogenität in oder auf der Glasplatte betrifft nur ein well der 96er Platte, ist bei Messung als 1536er Platte nicht zu finden, z.b. kalibrierte Messung der nach der Kalibrierung gedrehten 96er Platte: -OF-Defekt (ra<0,3nm) -Staub -Blase -Schliere

38 Dank an alle Beteiligten FSU Otto-Schott-Institut Carl Zeiss Jena Schott Glas Mainz Entwicklungszeit < 1 Jahr! Grundlage langjährige Erfahrungen + optimale Kooperation!!!

39 Extinktion Absorption Mn 2+ (3d 5 ) Wellenlänge (nm) Mn 2+ ~420nm Mn 3+ NCS NBS1 BC BBC Silicate 0,5 % Mn d=10mm ~ NBS1/Z Wellenzahl (cm -1 )

40 E / d (cm -1 ) Absorption Mn 2+ (3d 5 ) 4 Mol % Mn Mn 2+ 6 (Mn 2+ + Mn 3+ ) FP Wellenlänge (nm) Phosphate MP MP/Z FP20 FP15 FP10 Fluoride

41 Einfluss von Verunreinigungen Intensity Wavelength (nm) nm 435nm 600 Excitation Emission Blaue Fluoreszenz durch Reste vom Waschmittel Weißmacher z.b. an OF von Displaygläsern nach Reinigung Wavenumber (cm -1 )