Die Erkrankung der Karpfen (Cyprinus carpio) mit dem Cypriniden Herpesvirus 3 (CyHV-3) ein Update

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1 Aus der klinischen Abteilung für Fischmedizin¹, Department für Nutztiere und öffentliches Gesundheitswesen, der Veterinärmedizinischen Universität Wien und dem Friedrich-Loeffler-Institut², Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel-Riems, Deutschland Die Erkrankung der Karpfen (Cyprinus carpio) mit dem Cypriniden Herpesvirus 3 (CyHV-3) ein Update J. KATTLUN 1, M. GOTESMAN 1, S.M. BERGMANN 2 und M. EL-MATBOULI 1 * eingelangt 25. September 2012 angenommen 23. Oktober 2012 Schlüsselwörter: Koi, Karpfen, Herpesvirus, Infektion, KHVD, CyHV-3. Zusammenfassung Karpfen und Koi (Cyprinus carpio) werden weltweit intensiv gezüchtet, einerseits als Nutzfi sche und andererseits als Zierfi sche für einen wachsenden Liebhaberkreis. Seit den späten 90er Jahren des letzten Jahrhunderts wird diese Spezies von einem neuartigen Virus bedroht, welches mittlerweile als Herpesvirus klassifiziert wurde und jährlich massive Verluste in beiden Wirtschaftszweigen verursacht: Das Cyprinide Herpesvirus 3 (CyHV-3), auch bezeichnet als Koi Herpesvirus (KHV). Dieser Artikel gibt eine Übersicht über Wissen und Wissenslücken die Erkrankung und den Erreger selbst betreffend und beschreibt, welche Umstände dazu führen, dass auch 14 Jahre nach seiner Entdeckung CyHV-3 noch immer ein schwerwiegendes Problem in der Karpfen- Aquakultur und in Koihaltungen darstellt. Keywords: Koi, carp, Herpesvirus, infection, KHVD, CyHV-3. Abstract Infection of carp (Cyprinus carpio) with Cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3) an update Common carp and koi (Cyprinus carpio) are bred intensively worldwide, both as farm animals and as pet fish with an ever growing circle of enthusiasts. Since the late 90s of the last century, the species has been threatened by a novel virus, recently classified as a herpesvirus. The virus, now known as Cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3) or Koi Herpesvirus (KHV), causes massive losses in both industrial branches each year. This review aims to provide a general overview of current knowledge concerning the disease and the pathogen, as well as describing why, 14 years since its discovery, CyHV-3 still poses a serious problem in both carp and koi aquacultures. Abkürzungen: CCB = Common Carp Brain Zellen; CyHV = Cyprinides Herpesvirus; K0 = Karpfen-Brut und -Jungfische < 1 Jahr; K1 = einjährige Karpfen; KF -1 = Koi Fin 1 Zellen; KHV = Koi Herpesvirus; KHVD = Koi Herpesvirus Disease/Erkrankung; KHV-I, KHV-J, KHV-U = von AOKI et al. (2007) verwendete CyHV-3-Isolate aus Israel (I), Japan (J) und den USA (U); LAMP = loop-mediated isothermal amplification ; MHC = major histocompatibility complex; ORF = open reading frame; p.i. = post infectionem Einleitung Die Aquakultur ist nach wie vor der am stärksten wachsende Industriezweig innerhalb der tierischen Lebensmittelproduktion, nicht zuletzt durch die weiter ansteigende Weltbevölkerung und den damit verbundenen Bedarf an tierischen Proteinen (FAO, 2010). Seit 1970 stieg die Produktion auf diesem Sektor um durchschnittlich 6,6 % pro Jahr. Damit übertrifft sie die Gesamtproduktion in der Fischerei und die Nutztierproduktion auf dem Festland (FAO, 2010). Bereits 46 % der globalen Versorgung mit Fischen kamen 2008 aus der Aquakultur. Mehr als die Hälfte davon sind ausschließlich Süßwasserfische. Die Familie der Karpfenartigen (Cyprinidae) spielt hierbei eine herausragende Rolle: Sie machen mit 20,4 Millionen Tonnen 71 % der gesamten Produktion an Süßwasserfischen aus. Im globalen Maßstab sind die Haupterzeugerländer des Karpfens (Cyprinus carpio) China, Indonesien und Myanmar, wo die intensive Karpfenproduktion auch viele Arbeitsplätze schafft. Die europäische Produktion macht zwar nur 2 % der global produzierten Karpfen aus, jedoch gibt es in einigen Ländern eine traditionelle Karpfenteich-Kultur, darunter Tschechien, Polen, Ungarn und Deutschland als Haupterzeuger (EUROPÄISCHE KOMMISSION 2012); auch in Österreich werden Karpfen als Nutztiere gehalten, darunter insbesondere im Waldviertel als größte Karpfenzuchtregion. Dieser insgesamt nicht unwesentliche Produktionszweig wird seit den späten 90er Jahren des letzten Jahrhunderts von einem neuartigen Virus bedroht: Das Cyprinide Herpesvirus 3 72

2 (CyHV-3), oder auch Koi Herpesvirus (KHV), benannt nach dem Wirt seiner ersten Isolation, verursacht massive Schäden in der Produktion von Karpfen weltweit. Wie der zweite Name andeutet, sind neben den Nutzkarpfen auch die bunten Varianten des Karpfens, die Koi, betroffen. Heute geht man davon aus, dass gerade der unkontrollierte Transport dieser farbigen Karpfen auf dem Weg von Züchtern zu Händlern und zu Hobbyhaltern und weiter zu verschiedenen internationalen Ausstellungen die rasche Verbreitung des Virus über den Globus begünstigt hat (HEDRICK et al., 2000; POKOROVA et al., 2005). Dieser Artikel soll eine Übersicht über den aktuellen Wissensstand zur Erkrankung und zum Erreger, dem Cypriniden Herpesvirus 3, geben. Der Erreger Vorkommen Ausbrüche der Koi-Herpesvirus-Infektion (KHVD) ereigneten sich zum ersten Mal 1997 und 1998 in Deutschland (BRETZINGER et al., 1999). Gleichzeitig wurde das Virus 1998 auch in den USA und Israel entdeckt (HEDRICK et al., 2000; RONEN et al., 2003). In Großbritannien gab es ebenfalls 1998 schon Ausbrüche, möglicherweise auch schon im Jahr 1996 (WALSTER, 1999). Durch intensiven weltweiten Handel mit Karpfen und Koi, meist ohne veterinärmedizinische Aufsicht, ist das Virus heute über den ganzen Globus verbreitet (POKOROVA et al., 2005). KHVD wird heute in vielen Ländern Europas angetroffen, in Deutschland, England und Wales, Frankreich, Italien, den Niederlanden, Belgien, Dänemark, der Schweiz, Österreich, Polen und Luxemburg (HAENEN et al., 2004; BERGMANN et al., 2006). Auch Tschechien ist seit 2007 nicht mehr ausgenommen (POKOROVA et al., 2007), sowie Slowenien seit 2008 (TOPLAK et al., 2011). In Asien sind Israel, China, Taiwan, Indonesien, Südkorea, Japan und Vietnam betroffen (PERELBERG et al., 2003; CHENG et al., 2011; DONG et al., 2011; GOMEZ et al., 2011; für Vietnam: unsere unveröffentlichten Daten). In Nordamerika hat sich das Virus von den Vereinigten Staaten nach Kanada ausgebreitet (HEDRICK et al., 2000; GRIMMETT et al., 2006; GARVER et al., 2010). Bereits von gab es Ausbrüche von CyHV-3 in Südafrika (HAENEN et al., 2004). Nur in Nordafrika, Südamerika und Australien wurde bis jetzt noch kein CyHV-3 nachgewiesen. Das Virus hat einen schwerwiegenden Einfluss auf die Karpfenwirtschaft in Europa, Israel, Japan und Indonesien (PERELBERG et al., 2003; SANO et al., 2004, 2005; HUTORAN et al., 2005; SUNARTO et al., 2005). Nicht nur in Koi-Zuchtbetrieben und Nutzkarpfenteichen, auch in Flüssen und Seen trägt das Virus zum Massensterben von Wildpopulationen bei, so geschehen in Japan, Deutschland, England, den Niederlanden und den USA (BRETZINGER et al., 1999; CRANE et al., 2004; GRIMMETT et al., 2006; HAENEN et al., 2004; UCHII et al., 2009; HONJO et al., 2009; MINAMOTO et al., 2012). Taxonomie CyHV-3 gehört zur erst kürzlich gegründeten Familie der Alloherpesviridae et al., 2009). Durch phylogenetische Analyse verschiedener Gene konnte diese Familie eindeutig von den Herpesviridae unterschieden werden, es wird jedoch angenommen, dass beide Familien einen gemeinsamen Vorfahren haben. Die Alloherpesviridae unterteilen sich in zwei Kladen: Die erste Klade besteht aus Herpesviren der Karpfenartigen und Aale. Die zweite Klade setzt sich zusammen aus Herpesviren der Lachse, Welse, Störe und verschiedener Amphibien et al., 2009) (siehe Tab. 1). Beide Kladen unterscheiden sich besonders durch die unterschiedliche Genomgröße: kb in der ersten und kb in der zweiten Klade. Die nächsten Verwandten von CyHV-3 sind das Cyprinide Herpesvirus 1 (CyHV-1), der Erreger der Karpfenpocken, und das Cyprinide Herpesvirus 2 (CyHV-2), ein Virus, dass bei Goldfi schen eine hämatopoetische Nekrose verursacht et al., 2009). Hervorzuheben ist, dass CyHV-3 mit 295 kb das größte Genom aller Herpesviren besitzt (AOKI et al., 2007). Morphologie CyHV-3 besitzt einen für Herpesviren charakteristischen Aufbau: Das Genom, ein einzelner linearer DNA-Doppelstrang, ist umhüllt von einem Kapsid in Form eines Ikosaeders. Dieses wird von dem sogenannten Tegument umgeben, einer proteinreichen Matrix. Nach außen ist das Virus durch eine glykoproteinhaltige Lipidhülle geschützt, die im Golgi-Apparat der Wirtszelle gebildet wird (Abb. 1; MIYAZAKI et al., 2008; METTENLEITNER et al., 2009). Ein umhülltes Viruspartikel misst im Durchmesser nm (HEDRICK et al., 2000; CHENG et al., 2011). Aufbau des Genoms und genetische Diversität AOKI et al. (2007) gelang die komplette Sequenzierung des CyHV-3-Genoms von drei unabhängigen Abb. 1: Schematische Darstellung eines Herpesvirus 73

3 Tab. 1. : Familie der Alloherpesviridae nach VAN BEURDEN und ENGELSMA (2012) Wissenschaftlicher Name Abk. Gebräuchlicher Name Wirt Referenz Klade 1* Cyprinid Herpesvirus 1 CyHV-1 Karpfenpocken Karpfen (Cyprinus carpio) Cyprinid Herpesvirus 2 CyHV-2 Hämatopoetische Nekrose des Goldfisches *siehe WALTZEK et al. (2009) Goldfisch (Carassius auratus auratus) Cyprinid Herpesvirus 3 CyHV-3 Koi Herpesvirus Karpfen (Cyprinus carpio) Anguillid Herpesvirus 1 AngHV-1 Aal Herpesvirus Europäischer Aal (Anguilla anguilla) Japanischer Aal (Anguilla japonica) Klade 2* Ranid Herpesvirus 1 RaHV-1 Lucké Tumor Herpesvirus Leopardfrosch (Rana pipiens) Ranid Herpesvirus 2 RaHV-2 Frosch Virus 4 Leopardfrosch (R. pipiens) Acipenserid Herpesvirus 1 AciHV-1 Weißer Stör Herpesvirus 1 Versch. Stör-Arten (Acipenser spp.) Acipenserid Herpesvirus 2 AciHV-2 Weißer Stör Herpesvirus 2 Weißer Stör (Acipenser transmontanus) Ictalurid Herpesvirus 1 IcHV-1 Channel catfish virus Getüpfelter Gabelwels Channel catfish (Ictalurus punctatus) Ictalurid Herpesvirus 2 IcHV-2 Ictalurus melas Herpesvirus Schwarzer Zwergwels (Ameiurus melas) Getüpfelter Gabelwels (Ictalurus punctatus) Salmonid herpesvirus 1 SalHV-1 Herpesvirus salmonis Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) Salmonid herpesvirus 2 SalHV-2 Coho salmon (Silberlachs) Herpesvirus Salmonid herpesvirus 3 SalHV-3 Epizootic epitheliotrophic disease virus Versch. Lachs-Arten (Oncorhynchus spp.) Amerikanischer Seesaibling (Salvelinus namaycush) et al., 2005) et al., 2005) et al., 2005) et al., 2005) (DAVISON et al., 2006) (DAVISON et al., 2006) (KUROBE et al., 2008) (KUROBE et al., 2008) (DAVISON, 1992) (DOSZPOLY et al., 2008) et al., 2009) et al., 2009) et al., 2009) Isolaten aus Israel (KHV-I), Japan (KHV-J) und den USA (KHV-U). Daraus ging hervor, dass das 295 kb umfassende Genom aus einem zentralen Teil besteht, der von zwei 22 kb großen terminal repeat regions flankiert wird. Es wurden 156 für Proteine kodierende Gene identifiziert, wovon acht open reading frames (ORFs) in der terminal repeat region liegen und daher als zwei Kopien vorliegen. Alle drei Isolate sind trotz ihrer unterschiedlichen geografischen Herkunft genetisch zueinander sehr ähnlich. Dennoch ist es gelungen, neun unterschiedliche Genotypen anhand von molekularen Markern zu identifizieren. Diese wiederum können in eine europäische (sieben Genotypen) und eine asiatische Gruppe (zwei Genotypen) unterteilt werden, wobei KHV-J zur asiatischen Linie gehört, und KHV-I und KHV-U beide zur europäischen Linie zugeordnet werden können. Daraus folgt, dass möglicherweise asiatische und europäische CyHV-3 unabhängig voneinander in die jeweilige Region gelangt sind (KURITA et al., 2009). Bezüglich der Epidemiologie und Diversität verschiedener CyHV-3 Isolate liegen bereits einige Arbeiten vor: So konnten beispielsweise MAREK et al. (2010) durch Vergleich verschiedener Isolate aus österreichischen KHVD Ausbrüchen bei Koi-Karpfen zeigen, dass alle Proben in der ORF40 Region identisch zueinander waren, sowie zu 100 % identisch mit dem Isolat aus Japan (KHV-J). Daher wurde angenommen, dass die Ausbrüche in Österreich durch asiatische CyHV-3 verursacht worden waren. In einer anderen Studie konnten mit Hilfe eines duplex PCR Assays eine Mehrzahl niederländischer Isolate 74

4 ebenfalls der asiatischen Linie zugeordnet werden; französische Isolate gehörten hingegen hauptsächlich der europäischen Linie (KHV-I/KHV-U) an (BIGARRE et al., 2009). Ein CyHV-3-Isolat aus Großbritannien wurde durch beide Studien als KHV-I zugehörig identifiziert. Damit sind in Europa beide genetischen CyHV-Linien anzutreffen. Zu erwähnen ist, dass auch eine Mischform beider Linien in europäischen Isolaten entdeckt wurde (BIGARRÉ et al., 2009). Auch eine Studie von AVARRE et al. (2011) beschäftigt sich mit der Identifizierung verschiedener CyHV-3 Genotypen, hier durch Analyse von multiplen short tandem repeats. Unter den Viren der Familie Alloherpesviridae, deren Genom schon sequenziert wurde, weist das Anguillide Herpesvirus 1 die meisten Übereinstimmungen mit CyHV-3 auf (VAN BEURDEN et al., 2010). Vierzig konservierte Gene wurden in beiden Viren gefunden (VAN BEURDEN et al., 2010). Möglicherweise wird jedoch die noch ausstehende Sequenzierung von CyHV-1 und CyHV-2 weitere Homologien hervorbringen, da bereits im Vergleich einzelner Gene ein hohes Maß an Übereinstimmungen zwischen den drei cypriniden Herpesviren gefunden werden konnte et al., 2005). Interessanterweise beherbergt CyHV-3 auch Gene, die verschiedenen Genen der Familien der Poxviridae, Iridoviridae und anderen großen DNA-Viren sehr ähnlich sind (HUTORAN et al., 2005; ILOUZE et al., 2006; AOKI et al., 2007; WALTZEK et al., 2005). Zwei dieser Gene, Thymidylat-Monophosphat-Kinase und B22R, sind zuvor noch in keinem Mitglied der Herpesviridae beschrieben worden. Durch Vergleich mit Genomen anderer Viren konnten für eine größere Anzahl von ORFs Vorhersagen bezüglich der Funktion der durch sie kodierten Proteine gemacht werden: so zum Beispiel für eine Reihe möglicher Membranproteine (AOKI et al., 2007). Doch die Mehrheit der ORFs im CyHV- 3-Genom lässt keinen Schluss auf deren Funktion zu. Proteom Bis zu diesem Zeitpunkt liegen nur wenige Arbeiten über Proteine von CyHV-3 vor. Wie schon erwähnt machen AOKI et al. (2007) in ihrer Arbeit eine Vorhersage zu einer Anzahl möglicher Membranproteine. Vor kurzem konnten durch Analyse mit Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie-Kopplung (liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC/MS) 40 Proteine dargestellt werden, die in reifen Virionen vorkommen (MICHEL et al., 2010), darunter drei Kapsid-, 13 Membran- und zwei Tegumentproteine. Zweiundzwanzig Proteine konnten keiner Funktion zugeordnet werden. Außerdem konnten bis zu 18 Proteine identifiziert werden, deren Ursprung in einem Wirt von CyHV-3 zu finden ist (MICHEL et al., 2010). Eingehender wurde bisher nur das von ORF81 kodierte Protein untersucht, ein Membranprotein, welches auch mit Hilfe von Antikörpern in verschiedenen Geweben infizierter Karpfen dargestellt werden konnte (ROSENKRANZ et al., 2008). Die Erkrankung Wirtsspektrum Von einer klinischen KHVD sind nur Karpfen und Koi (Cyprinus carpio) betroffen (BRETZINGER et al., 1999; WALSTER, 1999; PERELBERG et al., 2003). Einige Studien haben sich damit befasst, andere Fischarten zu identifizieren, die symptomlose Träger (sog. Carrier) von CyHV-3 sind und das Virus auf naive Karpfen oder Koi übertragen können. Versuche durch Zusammensetzen von vorher dem Virus exponierten Fischen mit naiven Karpfen ergaben, dass Goldfisch (Carassius auratus auratus) (MEYER, 2008; SADLER et al., 2008; BERGMANN et al., 2010a; EL-MATBOULI et al., 2010), Graskarpfen (Ctenopharyngodon idella), Silberkarpfen (Hypophthalmichthys molitrix) und Schleie (Tinca tinca) als Carrier in Frage kommen (MEYER, 2008). Nach der experimentellen Infektion konnte aus denselben Fischen CyHV-3-DNA mittels PCR nachgewiesen werden (MEYER, 2008). Weitere Studien konnten aus anderen Arten nach natürlicher Infektion Virus-DNA durch verschiedene PCR-Methoden nachweisen: so zum Beispiel in Goldfischen (EL-MATBOULI et al., 2007b; SADLER et al., 2008; BERGMANN et al., 2009), Karauschen (Carassius carassius) (HAENEN und HEDRICK, 2006), Graskarpfen (Ctenopharyngodon idella), Orfen (Leuciscus idus) und verschiedenen Antennen-Harnischwelsen (Ancistrus spp.) (BERGMANN et al., 2009); letztere gehören nicht der Familie der Karpfenartigen an. Auch Gewebeproben vom Russischen Stör (Acipenser gueldenstaedtii) und Atlantischen Stör (A. oxyrinchus), ebenfalls keine Karpfenverwandten, wurden positiv auf CyHV-3 getestet (KEMPTER et al., 2009). Es ist also zu befürchten, dass noch weitere Carrier entdeckt werden, die das Virus übertragen können und bis jetzt von CyHV-3 verschonte Karpfenbestände bedrohen. Hybride aus Koi/Goldfi sch und Koi/Karausche erkranken ebenfalls an der KHVD (BERGMANN et al., 2010b) und stellen somit keine Alternative zur Karpfen-Aquakultur dar. Was die Empfänglichkeit verschiedener Altersklassen von Karpfen betrifft, scheinen junge Fische (K0: ein bis drei Monate alt, 2,5 6 g Körpergewicht) empfindlicher gegenüber dem Virus zu sein als erwachsene Exemplare (K1: 1 Jahr, ca. 230 g) (PERELBERG et al., 2003). Larven (drei Tage nach Schlupf) waren in einer anderen Studie nicht empfänglich für CyHV-3, jedoch erkrankten die Tiere klinisch nach erneuter Virusexposition im Alter von zwei Monaten (ITO et al., 2007). Übertragung Das Virus wird über das Wasser übertragen, in das es durch Kot und Urin von mit CyHV-3 infizierten Tieren gelangt. Seine Infektiosität hält dabei mindestens 24 Stunden im Wasser an (PERELBERG et al., 2003; 75

5 DISHON et al., 2005; SHIMIZU et al., 2006). Schon zwei Tage nach Infektion (post infectionem, p.i.) und bereits vor dem Auftreten klinischer Symptome konnte eine Virusexkretion über den Urin nachgewiesen werden (NEGENBORN, 2009). Daher ist die gemeinsame Haltung von kranken mit naiven Fischen ausreichend für eine Übertragung (RONEN et al., 2003). Zuerst wurde angenommen, dass CyHV-3 über die Kiemen in den Fischkörper gelangt (GILAD et al., 2004; PIKARSKY et al., 2004; DISHON et al., 2005; MIYAZAKI et al., 2008). Neusten Untersuchungen zufolge werden die Fische jedoch auch über die Haut infiziert (COSTES et al., 2009). Außerdem sind epidermale Abschürfungen sowie Wundheilungsbereiche gute Pforten für das Virus (RAJ et al., 2011). Auch eine Fütterung mit virushaltigem Material stellt eine Infektionsquelle dar, da CyHV-3 gut über die pharyngeale Mukosa aufgenommen werden und sich im Darm vermehren kann (FOURNIER et al., 2012), unter Umständen wird es auch über die Darmmukosa aufgenommen (HEDRICK et al., 2000; PERELBERG et al., 2003). Die Ausbreitung von Teich zu Teich könnte durch Vögel durch Kontaktübertragung ermöglicht werden, für die moribunde Karpfen an der Wasseroberfläche eine leichte Beute darstellen (ILOUZE et al., 2011). Allerdings spielt hier wahrscheinlich die Einschleppung von Virus über symptomlose Carrierfische eine größere Rolle. Temperatursensitivität, Carrier und Latenz Ausbrüche der KHVD ereignen sich in Europa im Sommer, wenn die Temperatur in offenen Teichen zwischen 18 und 28 C liegt (GILAD et al., 2003; PERELBERG et al., 2003). Auch experimentell wurden bei diesen Temperaturen hohe Mortalitäten (75 95 %) beobachtet, nachdem man die Fische durch Virus oder mit infizierten Karpfen exponierte (GILAD et al., 2002, 2003; HEDRICK et al., 2000; HUTORAN et al., 2005; PERELBERG et al., 2005, 2003). Unterhalb dieses Temperaturoptimums bleibt eine klinische Erkrankung der Fische aus: So überlebten Karpfen zum Beispiel eine Infektion bei 13 C ohne jegliche klinische Zeichen (GILAD et al., 2003), jedoch konnten geringe Mengen viraler DNA auch noch nach 64 Tagen p.i. in den Fischen nachgewiesen werden (GILAD et al., 2004). Wurde die Wassertemperatur von 13 auf 23 C angehoben, erkrankten die Tiere. Insgesamt hatte die Wassertemperatur einen stärkeren Einfluss auf den Krankheitsverlauf als die Viruskonzentration im Wasser (GILAD et al., 2003). Bei 30 C findet zwar ebenso eine Infektion statt, aber auch hier erkranken die Fische nicht klinisch (RONEN et al., 2003). Es konnte allerdings ein erhöhter Antikörpertiter gegen CyHV-3 bei diesen Tieren festgestellt werden, weshalb man in der Folge hier von natürlich resistenten Karpfen sprach (RONEN et al., 2003). Dasselbe Phänomen der Temperatursensitivität des Virus konnte auch in vitro dargestellt werden (DISHON et al., 2007): Mit CyHV-3 infizierte Zellkulturen zeigten einen cytopathischen Effekt, der nach Änderung der Inkubationstemperatur von 22 auf 30 C verschwand und bei neuerlicher Temperaturänderung zu 22 C wieder zu erkennen war. Ebenso konnte ein Ab- und Anschalten der Genomtranskription des Virus durch nicht permissive Temperatur (30 C) bzw. permissive Temperaturen (22 C) demonstriert werden. Auch nach 30 Tagen bei 30 C war infektiöses Virus in der Kultur nachweisbar (DISHON et al., 2007). Neben der möglichen Überdauerung von ungünstigen Umweltbedingungen in Fischkot am Teichgrund (DISHON et al., 2005) scheint daher auch eine Persistenz im Wirt selber zu existieren. So konnte in einer wilden Karpfenpopulation virale DNA mindestens zwei Jahre nach dem ersten Ausbruch einer KHVD im See Biwa (Japan) nachgewiesen werden (UCHII et al., 2009). Es gibt bereits einige Studien, die zeigen, dass Karpfen nach einer überstandenen KHVD latente Carrier des Virus bleiben. Hierbei scheint die Reaktivierung des Virus temperaturabhängig zu sein (ST. HILAIRE et al., 2005) und sie kann durch Stress hervorgerufen werden (MEYER, 2008; BERGMANN u. KEMPTER, 2011; EIDE et al., 2011). Möglicherweise kann dieser Mechanismus als Latenz aufgefasst werden, welches ein spezielles Charakteristikum aller Herpesviren ist (DAVISON, 2002). DISHON et al. (2007) äußerten auch den interessanten Gedanken, dass die genetische Eigenschaft der Viren wechselwarmer Wirbeltiere, in Wirtszellen bei nicht permissiven Temperaturen persistieren zu können, möglicherweise zur Evolution der Latenz bei Herpesviren gleichwarmer Wirbeltiere geführt hat. Bei CyHV-3 verwandten aquatischen Viren konnte Latenz bereits nachgewiesen werden: So zum Beispiel in Karpfen nach CyHV-1-Infektion (SANO et al., 1993b) und bei Aalen nach AngHV-1-Infektion (VAN NIEUWSTADT et al., 2001; RIJSEWIJK et al., 2005). In beiden Fällen konnte das Virus in kranialen Nervenzellen und Spinalnerven durch in situ Hybridisierung nachgewiesen werden (MORITA u. SANO, 1990; SANO et al., 1993a,b). Nervenzellen als Aufenthaltsort während der Latenzphase sind ebenfalls charakteristisch für Herpesviren (DAVISON, 2002). Hinweise, dass dies auch für CyHV-3 zutrifft, existieren bereits: YUASA und SANO (2009) wiesen das CyHV-3 Genom noch ein Jahr nach der Infektion in Proben vom Gehirn überlebender Fische nach. Dort war es auch länger nachzuweisen als in den Nieren der Tiere. BERGMANN et al. (2009, 2010a) beschrieb infizierte Leukozyten zwei Jahre nach der eigentlichen Infektion im Karpfen und im Goldfi sch. Er stellte die Hypothese einer lymphotropen Latenz des Virus, vor allem in polymorphkernigen Granulozyten, auf. Die Frage nach der Latenz von CyHV-3 zu klären, würde nicht nur zur phylogenetischen Einordnung des Virus beitragen, sondern auch dazu, seine epidemiologisches Verhalten besser zu verstehen (ILOUZE et al., 2011). 76

6 Erregerreplikation Nach einer ersten Replikation am Eintrittsort (COSTES et al., 2009) breitet sich das Virus vermutlich sehr rasch im Fisch aus. Schon 24 Stunden nach der Infektion konnte virale DNA aus unterschiedlichsten Geweben isoliert werden, darunter Kiemen, Leber, Darm, Milz, Niere und Gehirn (GILAD et al., 2004). Diese Gewebe sind Orte der späteren viralen Replikation, was auch an den dort auftretenden pathologischen Veränderungen erkenntlich ist. Auch im von der Fischhaut produzierten Schleim konnte Virus nach dieser kurzen Zeit nachgewiesen werden (GILAD et al., 2004). Erregervermehrung in Organen wie Haut, Kiemen, Nieren und Magen-Darm-Trakt bilden eine ideale Quelle, um infektiöses Material ins umgebende Wasser abzugeben. PIKARSKY et al. (2004) konnten das Virus mittels Immunhistochemie in Leukozyten in der Niere lokalisieren. Aufgrund der schnellen und systemischen Verbreitung des Virus im Fischkörper wurde die Hypothese geäußert, dass CyHV-3 durch infizierte Blutzellen in die anderen Gewebe gelangt (PIKARSKY et al., 2004; BERGMANN et al., 2009; EIDE et al., 2011; FOURNIER et al., 2012). Klinik Die Mortalität beginnt bei permissiven Temperaturen (18 28 C) meist fünf bis zehn Tage nach Virusexposition und erreicht unter kontrollierten Laborbedingungen innerhalb von zwei bis drei Wochen 90 % (HEDRICK et al., 2000; PERELBERG et al., 2003). Bei latent infizierten Tieren kann die klinische Erkrankung durch Stressoren wie Transport, Abfischen und bakterielle oder parasitäre Sekundärinfektionen ausgelöst werden (MEYER, 2008). Klinische Anzeichen treten schon zwei bis drei Tage p.i. auf, können aber stark variieren: Anorexie und Lethargie sind die ersten unspezifischen Symptome, die Fische liegen am Grund des Teichs mit gefalteter Rückenflosse. Kiemennekrose (Abb. 2 und 3) ist das hauptsächliche Krankheitszeichen, welches schon nach drei Tagen p.i. auftreten kann, meist begleitet von einem erhöhten Parasiten-, Bakterien- und Pilzbefall (ARIAV et al., 1999; HEDRICK et al., 2000). Aufgrund von fortschreitendem Sauerstoffmangel sammeln sich die Fische an der Wasseroberfläche. Die Haut zeigt blasse und unregelmäßige Flecken, sie verliert an Glanz und zeigt eine Überproduktion von Schleim. Blutungen treten an der Flossenbasis auf (Abb. 2) (BRETZINGER et al., 1999; WALSTER, 1999; HEDRICK et al., 2000; HAENEN et al., 2004; PERELBERG et al., 2003, 2005). In späteren Stadien nimmt die Schleimproduktion stetig ab, sodass die Haut eine sandpapierartige Textur bekommt. Es können bilateraler Enophthalmus (Abb. 2) sowie seltener Exophthalmus auftreten und neurologische Ausfälle, wie Desorientierung, sporadische Hyperaktivität und Gleichgewichtsverlust (WALSTER et al., 1999; HEDRICK et al., 2000; GILAD et al., 2003; HUTORAN et al., 2005). Abb. 2: Äußere Symptome einer CyHV-3 Erkrankung beim Karpfen. Gut zu erkennen die hochgradige Kiemennekrose nach Entfernung des Kiemendeckels, Enophthalmus und Hämorrhagien an der Brustflossenbasis Pathologisch-anatomische Befunde Makroskopische Befunde wie oben beschrieben sind in vielen Fällen kaum vorhanden (HEDRICK et al., 2000). Jedoch können histopathologische Veränderungen durch eine CyHV-3-Infektion in unterschiedlichem Ausmaß in Kiemen, Haut, Niere, Leber, Milz, Magen-Darm-Trakt und Gehirn festgestellt werden. In den meisten Organen können ausgeprägte pathologisch-anatomische Veränderungen von unspezifi - schen Entzündungsreaktionen bis hin zur Degeneration von Zellverbänden und Nekrosen des Gewebes beobachtet werden (PIKARSKY et al., 2004). Am deutlichsten sind diese in den Kiemen, wo Läsionen schon zwei Tage p.i. auftreten: Ausbildung von Hyperplasien, Hypertrophien und Nekrosen der Epithelzellen, sowie Entzündung der Kiemenfilamente mit Verschmelzungen der Kiemensekundärlamellen (HEDRICK et al., 2000; PERELBERG et al., 2003; PIKARSKY et al., 2004; MIYAZAKI et al., 2008). Neben den Kiemen sind die Nieren der Fische schwer betroffen, weshalb CyHV-3 kurz nach seiner Entdeckung auch Carp interstitial nephritis and gill necrosis virus genannt wurde (RONEN et al., 2003). Es kommt in der Niere schon sehr früh (zwei Tage p.i.) zu peritubulärer Infiltration von Entzündungszellen, welche mit der Zeit zunimmt und zusammen mit Blutstauung in den Gefäßen zur Degeneration von Nephronen und hämatopoetischen Zellen führt (PIKARSKY et al., 2004). Bei Fischen mit neurologischen Anzeichen der Erkrankung werden angestaute Kapillaren und Ödeme im Nervengewebe vorgefunden (MIYAZAKI et al., 2008), sowie Entzündung der Meningen (PIKARSKY et al., 2004). Die Veränderungen in der Haut bestehen aus einer Ablösung des Epithels von der Basalmembran und fokaler Zellnekrose (BRETZINGER et al., 1999), was sich bis in die Maulhöhle fortsetzt (HEDRICK et al., 2000). Die für Herpesviren typischen 77

7 Abb. 3: Äußere Symptome einer CyHV-3 Erkrankung beim Koi. Hochgradige Kiemennekrose Einschlusskörperchen im Zellkern können in Kiemenepithelzellen, Splenozyten, Hepatozyten und auch im Maulhöhlen- und Magenepithel gefunden werden (Abb. 4) (HEDRICK et al., 2000; MIYAZAKI et al., 2008; EL-DIN et al., 2011). Ammonium- und Nitritkonzentrationen, zu einer ähnlichen Symptomatik führen (ARIAV et al., 1999). Auch parasitäre und bakterielle Ursachen müssen ausgeschlossen werden, doch zeigen diese selten solch einen akuten Verlauf. Eine sichere Diagnose am lebenden Karpfen ist umstritten. Zwar kann unter Narkose Gewebe aus Kiemen und Flossen entnommen werden, aber es können gerade Carrier dadurch übersehen werden (PIKARSKY et al., 2004). Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass eine Diagnose am lebenden Karpfen mittels Kiemenabstrich möglich ist, wenn man die Tiere vorher einem Stressor, zum Beispiel durch Abfi - schen, aussetzt (BERGMANN u. KEMPTER, 2011). Der CyHV-3-Nachweis ist auch in separierten Leukozyten nach Blutabnahme von Einzeltieren möglich. Zur Untersuchung auf CyHV-3 werden allerdings meist Organpoolproben (Niere, Milz, Kieme, Gehirn, Leber) von einzelnen getöteten oder frisch verendeten Fischen herangezogen (BERGMANN et al., 2009). Der direkte Erregernachweis erfolgt durch Virusisolierung aus infizierten Fischen in Zellkultur. Mit dieser Methode wurde CyHV-3 auch zum ersten Mal überhaupt nachgewiesen (HEDRICK et al., 2000). Das Virus wächst in Zellkultur auf Common Carp Brain Zellen (CCB cells; Abb. 4: Histologisches Präparat von Lebergewebe eines an CyHV- 3 erkrankten Karpfens mit eosinophilen viralen Einschlusskörperchen (Pfeile). Hämatoxilin/Eosin-Färbung; 400fache Vergrößerung Diagnose Eine Verdachtsdiagnose auf CyHV-3 ergibt sich aus den klinischen Zeichen der Erkrankung. Bei Massensterben in Koi- und Karpfenbeständen bei Temperaturen zwischen 18 und 28 C sollte immer auch an CyHV-3 gedacht werden. Als Differentialdiagnose kommt bei den viralen Erkrankungen die Frühlingsvirämie der Karpfen (Spring Viremia of Carp, SVC), verursacht durch ein Rhabdovirus, in Frage. Auch bei dieser Erkrankung kommt es innerhalb kürzester Zeit zu akuten Mortalitäten im Karpfenteich. Jedoch kann auch eine mangelhafte Wasserqualität, wie hohe Abb. 5: Elektronenmikroskopische Aufnahme von intranuklearen Viruspartikeln im respiratorischen Epithel eines Koi fache Vergrößerung NEUKIRCH et al., 1999) und Koi Fin Zellen (KF-1 cells; HEDRICK et al., 2000) bei Temperaturen zwischen 20 und 25 C. Ein zytopathischer Effekt kann meist innerhalb von 5 10 Tagen festgestellt werden. Auch mit histopathologischen Methoden oder der Elektronenmikroskopie (Abb. 4 und 5) kann das Virus im Gewebe dargestellt werden. Da ein direkter Nachweis jedoch recht aufwendig ist, wurden eine Reihe molekularbiologischer Methoden zum indirekten Erregernachweis entwickelt: Diese reichen von der Detektion verschiedener Gene der CyHV-3-DNA mittels PCR bis zu Protokollen für real-time und nested PCR. Laut der amtlichen Methodensammlung des deutschen Referenzlabors im 78

8 Friedrich-Loeffler-Institut (FLI, 2011), wird empfohlen, mg Organmaterial aus einer Poolprobe oder 1x10 7 Leukozyten/ml von einem Fisch zum Genomnachweis zu verwenden. Die sensitivsten Methoden zum Nachweis von CyHV-3 sind: 1. die real-time PCR nach GILAD et al. (2004); 2. die PCR nach GILAD et al. (2002); 3. nested PCR (BERGMANN et al., 2006) mit den Primerpaaren KHV-1Fn-1Rn nach GILAD et al. (2002) und 4. die one-tube semi-nested PCR nach BERGMANN et al. (2010c). Laut FLI sind neue in Europa auftretende CyHV-3 nicht mit der PCR nach BERCOVIER et al. (2005) detektierbar, teilweise gilt dies auch für PCRs nach GILAD et al. (2002) und BERGMANN et al. (2006) (FLI, 2011). Auch Protokolle für eine Virusdetektion mittels loop-mediated isothermal amplification (LAMP) wurden entwickelt, die im Gegensatz zu PCR basierten Methoden deutlich schneller durchzuführen sind und ohne spezialisierte Geräte auskommen (GUNIMALADEVI et al., 2004; SOLIMAN u. EL-MATBOULI, 2005, 2010). Außerdem wird der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mittels monoklonaler Antikörper bei der Detektion von Antikörpern in Blut von Fischen oder die in situ Hybridisierung zum Nachweis von infizierten Zellen im Gewebeverband (RONEN et al., 2003; PIKARSKY et al., 2004; ST.HILAIRE et al., 2009) erfolgreich angewendet. Es wurde außerdem ein ELISA für den Nachweis von Virus in Fischkot entwickelt (DISHON et al., 2005). ADKINSON et al. (2005) beschrieben einen ELISA, der Antikörper gegen KHV noch bis zu einem Jahr nach einer Infektion nachweist. Der ELISA erlaubt als serologisches Verfahren bei Einzelindividuen, aber auch im Rahmen von Bestandsuntersuchungen, den Nachweis von Serumantikörpern, um eine vorausgegangene Konfrontation mit dem Virus zu belegen und eventuelle Carrierfische ohne direkten Erregernachweis aufzudecken. Das Verfahren kann somit im Zusammenhang mit dem Tierhandel helfen, die potentielle Gefahr, die von Antikörper-positiven Fischen als mögliche Virusträger ausgeht, zu minimieren. Allerdings kann man mit indirekten Nachweisverfahren keine Aussage über das Vorliegen von infektiösen Virionen im untersuchten Tier treffen, was in der Praxis häufi g zu Schwierigkeiten bei der Interpretation eines Testergebnisses führt. Nimmt man aber die lebenslange Latenz des Erregers zur Hypothese, so ist jedes Antikörper-positive Tier auch ein Virusträger. Bekämpfung, Immunisierung und Prävention Die Europäische Union listet CyHV-3 als anzeigepflichtige Erkrankung (Richtlinie des Rates 2006/88/ EG vom 24. Oktober 2006), die World Organization for Animal Health (OIE) tut dies seit Januar Dies bedeutet, dass u.a. in Österreich der Verdacht einer KHVD angezeigt und untersucht werden muss. Wird CyHV-3 nachgewiesen, wird der Betrieb gesperrt bis zur Ausmästung bzw. Tötung der Fische mit nachfolgender Desinfektion. Detaillierte Maßnahmen im Falle eines KHVD-Ausbruchs sind dem Leitfaden zur Bekämpfung der Koi Herpesvirus-Infektion (KHV-I) in der Republik Österreich, Stand: Dezember 2010; BMG 74700/0079-II/B/11/2011, zu entnehmen (BUNDESMINISTERIUM FÜR GESUNDHEIT, 2010). Es gibt keine Therapie gegen die KHVD. Antivirale Mittel gegen CyHV-3 sind bis dato nicht erhältlich. Die Züchtung von gegen KHVD resistenten Karpfen, wie dies beispielsweise mit Forellen bei der Whirling Disease gelungen ist (HEDRICK et al., 2003; EL-MATBOULI et al., 2009), wäre eine gute Möglichkeit zur Prävention. Ansätze dafür wurden bereits von SHAPIRA et al. (2005) demonstriert durch Kreuzung von empfänglichen Nutzkarpfen mit gegenüber der KHVD resistenteren Wildkarpfen. Ähnliche Studien führten DIXON et al. (2009) und PIA CKOVÁ et al. (2012) durch, die beide die bessere Resistenz von verschiedenen Wildkarpfen-Linien bestätigen konnten. Eine mögliche Vererbung dieser Resistenz an die nächste Generation wurde von ØDEGÅRD et al. (2010) untersucht. Ebenfalls in diesem Zusammenhang wurden verschiedene Genotypen von MHC Klasse II B Genen identifiziert, die einen signifikanten Effekt auf die Mortalität von verschiedenen Karpfen-Kreuzungen nach experimenteller Infektion hatten (RAKUS et al., 2009). Eine andere Arbeit beschäftigte sich mit dem Zusammenhang von verschiedenen single nucleotide polymorphisms (SNP) bei Karpfen auf deren Resistenz gegen KHVD (KONGCHUM et al., 2011). Es ist allerdings zu beachten, dass beim Koi eine Selektion auf Resistenz mit der Selektion auf Farbvarianten konkurrieren würde, sodass diese Vorgehensweise bei diesen Zierfischen ungeeignet erscheint (ILOUZE et al., 2011). Eine sinnvolle Alternative ist die Entwicklung einer prophylaktischen Impfung. Bis jetzt sind allerdings nur wenige Studien zu diesem Thema veröffentlicht. Studien in Israel haben gezeigt, dass die Fische eine natürliche Resistenz erwerben können, wenn sie dem Virus bei einer hohen Wassertemperatur (30 C) ausgesetzt werden (RONEN et al., 2003). Jedoch ist anzunehmen, dass diese Tiere Träger des virulenten Virus bleiben, das dann naive Fische infizieren kann. Daher ist von der Durchführung einer solchen Immunisierung abzusehen. Außerdem wurde eine Impfung mit attenuiertem Virus entwickelt, die von PERELBERG et al. (2005) weiter entwickelt wurde und jetzt auf dem israelischen Markt durch KoVax Ltd. (Jerusalem, Israel) vertrieben wird. Bei einer Lebendvakzine besteht allerdings immer die Gefahr der Rekonversion zum virulenten Phänotyp. In Japan wiederum haben YASUMOTO et al. (2006) ein Liposomen-Vakzin aus inaktiviertem Virus entwickelt, welches jedoch nicht auf dem Markt verfügbar ist. COSTES et al. (2008) haben ein künstliches bakterielles Chromosom (bacterial artificial chromosome, BAC) entwickelt, welches das CyHV-3-Genom enthält. Damit kann durch Insertion und Deletion verschiedener Gene ein 79

9 rekombinantes Virus hergestellt werden, was möglicherweise in der Zukunft zur Immunisierung von Karpfen verwendet werden kann. Die Impfung schützt den Karpfen allerdings auch nicht vor einer erneuten Infektion mit Wildtyp-KHV. Nach einer solchen Superinfektion wären die Tiere Träger beider Viren: des Impfvirus und des Wildtyp-Virus. Aufgrund des Mangels eines effektiven und sicheren Impfstoffs gegen das CyHV-3 auf dem Markt spielt daher die Prävention eine herausragende Rolle. Durch ihre Lipidhülle sind freie Herpesviren empfindlich gegenüber Desinfektionsmitteln und Einflüssen aus der Umwelt. NEUKIRCH (2003) konnte beispielsweise mit Chloroform CyHV-3 inaktivieren, ebenso durch Behandlung mit Temperaturen über 60 C oder Lagerung bei 35 C für zwei Tage. Auch eine ph-sensitivität konnte nachgewiesen werden: Bei einem ph- Wert <3 oder >11 war das Virus nicht mehr infektiös. KASAI et al. (2005) erzielten eine CyHV-3-Inaktivierung in Zellkultur durch UV-Bestrahlung, Hitzebehandlung über 50 C und Desinfektion mit Iodophoren, Benzalkoniumchlorid, Ethanol und Chlor. Grundsätzlich sollte auf eine gründliche Reinigung und Desinfektion von Gerätschaften unmittelbar nach Gebrauch geachtet werden. Dazu zählen vor allem Kescher, Becken, Schläuche und Eimer. Auch Stiefel und Oberbekleidung müssen desinfiziert werden. Bei Ausbruch einer KHVD ist dieses Vorgehen äußerst wichtig, um die Ausbreitung und Verschleppung des Virus über einen befallenen Betrieb hinaus zu vermeiden. Ein Besprühen oder Eintauchen mit handelsüblichen Desinfektionsmitteln ist hier angezeigt, dabei ist auf eine ausreichende Konzentration und Einwirkzeit sowie Materialverträglichkeit zu achten. Der gründlich abgefischte Teich muss bei einer nachgewiesenen KHVD ebenfalls desinfiziert werden. Dies geschieht meist durch Desinfektion mit Branntkalk (CaO); ist der Teich sehr groß, kann auch eine Trockenlegung bis zu zwei Monaten mit Desinfektion der Fischgrube ausreichend sein (BUNDESMINISTERIUM FÜR GESUNDHEIT, 2010). Ausblick CyHV-3 zeigt eine interessante Kombination epidemiologischer Eigenschaften: Auf der einen Seite breitet es sich schnell unter empfänglichen Tieren aus und erzeugt eine akute und meist tödliche Erkrankung im Wirt. Dieses Charakteristikum führt normalerweise zur schnellen Ausrottung des Virus aus der Population. CyHV-3 ist jedoch anscheinend in der Lage, entweder in einigen wenigen Überlebenden, symptomlosen Carriern anderer Spezies oder unter Umständen auch in der Umwelt zu überdauern, von wo es bei günstigen Wassertemperaturen (18 28 C) wieder aktiviert, vermehrt und ausgeschieden werden kann, um erneut für das Virus empfängliche Fische zu infizieren. Diese Reaktivierung ist typisch für Herpesviren, im Gegensatz zu der akuten Verlaufsform mit schneller Verbreitung. Diese Eigenschaften von CyHV-3 müssen bei dem Versuch einer Bekämpfung oder gar Eradikation in Betracht gezogen werden. Obwohl die Erkrankung nun seit mindestens zehn Jahren bekannt ist, und trotz intensiver Forschungsbemühungen in verschiedenen Arbeitsgruppen weltweit, ist bis heute außer in Israel keine effektive und sichere Impfung für Karpfen gegen CyHV-3 auf dem Markt. Aufgrund der erwähnten Schwierigkeiten (Persistenz, Carrierstatus anderer Fischarten und Latenz) das Virus einzudämmen oder dessen Verbreitung zu verhindern, bleibt wahrscheinlich langfristig die Entwicklung eines Impfstoffs die einzige Möglichkeit, die Erkrankung effektiv zu bekämpfen. Danksagung Die Arbeit wurde durch die Veterinärmedizinische Universität Wien (PP ) und durch das Vetmed Success Stipendium der Universität finanziell unterstützt. Die Autoren danken Herrn Patrick Schrabauer für technische Hilfe bei der Erstellung des Bildmaterials. Literatur ADKINSON, M., OREN, G., HENDRICK, R.P. (2005): An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the serum of koi Cyprinus carpio. Fish Pathol 40, AOKI, T., HIRONO, I., KUROKAWA, K., FUKUDA, H., NAHA- RY, R., ELDAR, A., DAVISON, A.J., WALTZEK, T.B., BERCOVIER, H., HEDRICK, R.P. (2007): Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide. J Virol 81, ARIAV, R., TINMAN, S., BEJERANO, I. (1998): First report of newly emerging viral disease of Cyprinus carpio species in Israel. In: EAFP Conference, Rhodes, September 1999, poster abstract. AVARRE, J.-C., MADEIRA, J.-P., SANTIKA, A., ZAINUN, Z., BAUD, M., CABON, J., CARUSO, D., CASTRIC, J., BIGARRÉ, L., ENGELSMA, M., MASKUR, M. 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