Biofilme für die Prozessintensivierung

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1 Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Zwischenbilanz am 22. März 2017 in Erlangen Biofilme für die Prozessintensivierung Prof. Dr. Ruth Freitag Patrick Kaiser Prof. Dr. Andreas Greiner Steffen Reich Universität Bayreuth Lehrstuhl für Bioprozesstechnik Lehrstuhl für Makromolekulare Chemie II

2 Warum Biofilme? Bindung Langsamer Aufbau des Biofilms Wachstum Schutz der MO kompl. Synthesen Kommunikation Versch. MO Ablösung Freisetzung von MO und extrazelluläre Substanzen Entwicklung biomimetischer Biofilm 2

3 Arbeitsplan Arbeitspakete AP1: Konzept artifizieller Biofilm Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 Q10 Q11 Q12 Herstellung Bakterien/Hydrogelmikropartikel X X Produktion von Biokompositvliese X X X Erzeugung von Bakterienkonsortien in Vliese X X X AP2: Mikrobielle Brennstoffzelle Auswahl geeigneter Organismus X X Funktionalisierung der extrazellulären Matrix X X X Betreiben der MBZ mit Biofilmen X X X Charakterisierung/ Optimierung Prozess/Reaktor Skalierung und Optimierung der MBZ AP3: Biosynthese X X Definition geeigneter Mikroorganismen X X Herstellung der Biokomposite X X Prozess X X 3

4 Künstliche Biofilme Prozessierung Sprühtrocknung (Mikrokapseln) Bakterienkultur im Schüttelkolben Suspension der Bakterien in einer wässrigen Polymerlösung Nassspinnen (Fasern) PPX Beschichten der Biokomposite mit Poly(p-xylylen) (PPX) Elektrospinnen (Vliese) 4

5 Verkapselung durch Sprühtrocknung diverse Polymere Verkapselung von Bakterien: M. luteus und E. coli DH12α Verwendung von: Polyvinylalkohol (PVA) Polyvinylpyrrolidon(PVP) Hydroxypropylcellulose(HPC) Gelatine SEM-Bild von HPC Partikel 2500 x SEM-Bild von PVP Partikel 2500 x SEM-Bild von Gelatine Partikel 2500 x 5

6 Verkapselung von M. luteus Struktur der Kapseln Mikroskopie-Bild von sprühgetrockneten PVA/M.luteus Kapseln Raman-Bild von sprühgetrockneten PVA (blau)/m.luteus(rot) Kapseln Mittels Raman-Mikroskopie konnten Bakterien innerhalb sprühgetrockneter PVA Kapseln nachgewiesen werden 6

7 Verkapselung M. luteus in PVA Molmasseneffekt auf Kapselgröße g/mol SEM-Bild von PVA Partikel 500 x g/mol g/mol SEM-Bild von PVA Partikel 500 x Molekulargewicht (g/mol) Partikelgröße (µm) SEM-Bild von PVA Partikel 500 x ,68 ±0,81 2,54 ± 1,13 8,37 ± 4,90 7

8 Verkapselte Bakterien Fitnesstest Anzahl 20 SEM-Bild von PVA/M. luteus Partikel 500x Durchmesser [µm] Partikelgrößenverteilung von PVA/M. luteus Partikel Polymer M. luteus E. coli PVA Lebend Tot (150 C) PVP Lebend Lebend (120 C) HPC Lebend Lebend (120 C) Gelatine Lebend Lebend (120 C) M. luteusin PVA nach ca. 12 Monaten Lagerung bei 4 C immer noch lebensfähig. 8

9 Verarbeitung der Biokompositkapseln Elektrospinnen der suspendierten Kapseln aus organischen Lösungsmittel Elektrospinnen der sprühgetrockneten Partikel (PVA) in hydrophoben Polymeren Verwendung von: Polyvinylacetatlösung in Dichlormethan (PVAc) Polyvinylbutyrallösung in Dichlormethan (PVB) PVAc PVB SEM-Bild von PVA/M.luteus Partikel in PVAc-Vliesen 2500 x SEM-Bild von PVA/M.luteus Partikel in PVB-Vliesen 2500 x Fitnesstests stehen noch aus. 9

10 Nassgesponnene Biokomposit-Fasern Herstellung der Fasern Anlage konzipiert für kontinuierliche Produktion von Bakterien PVA-Fasern als Monofilamente Aceton Koagulationsbad Durchmesser der Fasern liegt bei 100 µm (±25 µm) Länge der Fasern liegt aktuell bei 125 m durch Austausch des Reservoirs über mehrere hundert Meter möglich SEM-Bild von PPX-beschichtete Faser, 900x Spinnanlage (Labormaßstab) zur Produktion von Fasern Fasern auf Träger, 35m 10

11 Nassspinnen von Biokomposit-Fasern (S. oneidensis in PVA)* Metabolische Aktivität Aceton hat nur Einfluss auf Bakterien in den äußeren Schichten Lebend/Tot Färbung mit SYTO-9 und Propidiumiodid Nach 7 Tage Kultur in Nährmedium, Rück-Besiedlung durch lebende Bakterien S. oneidensis ist in den Fasern metabolisch aktiv 60 Erneuerung des Nährmediums L-Milchsäure (mg) Lebend/Tot Färbung der Fasern vor (a) und nach 7 Tagen Kultur mit Nährmedium (b) Zeit (h) Abnahme der L-Milchsäure während der Kultur der Fasern * P. Kaiser, S. Reich, D. Leykam, M. Willert-Porada, A. Greiner, R. Freitag, Macromol. Biosci. 2017, DOI: /mabi

12 Nassgesponnene Biokomposit-Fasern Verarbeitung zu Gewebe Fasern versponnen mit Nitrobacter winogradskyi Fasern stabil zum Weben mit Webrahmen Erhalt von textilem Gewebe; nach PPX Beschichtung stabil in Kulturmedium Abbau von Nitrit bei händisch gewebtem Textil Erste Schritte zur automatisierten Herstellung textiler Gewebe unternommen mit: Fraunhofer Anwendungszentrum Textile Faserkeramiken (TFK) in Münchberg(Prof. Dr. Frank Ficker) Biokomposit-Fasern Hilfsgarn Händisch gewebtes Textil Textiler Schlauch mit den nassgesponnenen Fasern (weiß) 12

13 Elektrogesponnene Biokomposit-Vliese* Morphologie PVA (89% hydrolisiert) 2x10 9 Bakterien/mLsuspendiert in wässriger PVA-Lösung Durchmesser der elektrogesponnenen Mikrofasern liegt bei 450 nm(±140 nm) Vliese sind 16 cm² groß und werden auf Stahl- oder Kupfernetze aufgesponnen Nach der PPX-Beschichtung liegt der Faserdurchmesser bei 1,7 µm (±140 nm) SEM- Aufnahmen der PVA/S.oneidensis Vliese, vor (links) und nach PPX-Beschichtung (rechts) * P. Kaiser, S. Reich, D. Leykam, M. Willert-Porada, A. Greiner, R. Freitag, Macromol. Biosci. 2017, DOI: /mabi

14 Biokompositvliese Metabolische Aktivität Bakterien sind auch nach 3h Behandlung mit V noch vital Ebenfalls Besiedelung der freien Plätze durch lebende Bakterien nach Kultur in Nährmedium Lebend/Tot Färbung der Vliese vor (a) und nach 7 Tage in Kultur (b) Abnahme der L-Milchsäure im Kulturmedium Abbaurate planktonisch: 6,11 mg/h Abbaurate Biokomposit: 5,21 mg/h L-Milchsäure (mg) Biokomposit Planktonisch Zeit (h) Abnahme der L-Milchsäure im Nährmedium 14

15 Biokomposit-Vliese Elektrische Leistung Batchverfahren Anaerobe Kultur für 120 h Verwendung von 4 cm² Biokomposit Pt-beschichtetes Carbongewebe als Kathode 120 Biokomposit ruft geringe el. Leistung hervor Direktkontakt von Bakterien mit dem elektrischen Leiter verbessert die el. Leistung el. Leistung (mw/m²) [WERT] ,50 Kontrolle plankt. Zellen nat. Biofilm Biokomposit Auf Cu gesponnenes Biokomposit 65 15

16 Beschichtung von Biokomposit-Vliesen Tauchbeschichtung als Alternative zur PPX-Beschichtung Polyvinylacetat (PVAc) Polyvinylbutyral (PVB) Stabilitätstests der PVAc beschichteten PVA/Bakterien Vliese Stabilitätstests der PVB beschichteten PVA/Bakterien Vliese SEM-Bild von PVAc beschichteten PVA/Bakterien Vliese 500 x SEM-Bild von PVB beschichteten PVA/Bakterien Vliese 500 x 16

17 Beschichtung von Biokomposit-Vliesen Tauchbeschichtung als Alternative zur PPX-Beschichtung Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) Poly(methylmethacrylat) (PMMA) Stabilitätstests der ABS beschichteten PVA/Bakterien Vliese Stabilitätstests der PMMA beschichteten PVA/Bakterien Vliese SEM-Bild von ABS beschichteten PVA/Bakterien Vliese 500 x SEM-Bild von PMMA beschichteten PVA/Bakterien Vliese 500 x 17

18 Beschichtung von Biokomposit-Vliesen Tauchbeschichtung als Alternative zur PPX-Beschichtung Verwendung von M. luteus Kompositvliesen Beschichtet mit: Polyvinylacetat (PVAc) Polymethylmethacrylat(PMMA) Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) Polyvinylbutyral(PVB) Tauchbeschichtung (dip coating) PVAc PMMA ABSHI 10 PVB Vorversuche Wasserstabilität 18

19 Zusammenfassung Herstellung von Bakterienkompositen als Kapseln Herstellung von biologisch aktiven Fasern Erste Schritte zur maschinellen Verarbeitung der Fasern Elektroaktive Biokomposit-Vliese für den Einsatz in der MBZ Beschichtungsvarianten

20 Danksagung Dr.-Ing. Ludwig Körber, Koordinierungsstelle Universität Erlangen Dr. Holger Schmalz Jian Zhu Tobias Moss Christoph Sommer Prof. Dr. Frank Ficker Sabine Olbrich Markus Schmidt