Ressourcenschonende Herstellung von Feinchemikalien

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Kasimir Hausler
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1 Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Zwischenbilanz am 22. März 2017 in Erlangen Ressourcenschonende Herstellung von Feinchemikalien Christoph Mähler, Dr.Kathrin Castiglione, Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz Technische Universität München Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik

2 Inhaltsverzeichnis Einleitung: Chirale Verbindungen Ziele des Forschungsvorhabens Projektfortschritt Zusammenfassung & Ausblick 2

3 Inhaltsverzeichnis Einleitung: Chirale Verbindungen Ziele des Forschungsvorhabens Projektfortschritt Zusammenfassung & Ausblick 3

Einleitung: Chirale Verbindungen Anwendungsgebiete

Die Optimierung von Herstellungsprozessen für

4 Einleitung: Chirale Verbindungen Anwendungsgebiete Chirale Verbindungen sind wichtige Ausgangsstoffe für die Synthese von Pharmazeutika Lebensmittelzusätzen Agrochemikalien Futtermitteln Die Optimierung von Herstellungsprozessen für chirale Verbindungen ist daher von großem wirtschaftlichen Interesse. 4

5 Einleitung: Chirale Verbindungen Asymmetrische Reduktion von Alkenen Sehr häufig angewendete katalytische Transformation Bis zu zwei Stereozentren können in einer Reaktion erzeugt werden In der Entwicklung Chemische Katalyse Biokatalyse Industrieller Standard 5

6 Einleitung: Chirale Verbindungen Enreduktasen Klassifikation Flavoenzyme aus der Old Yellow Enzyme Familie Reaktion Substrate Cofaktoren anti-spezifische Reduktion aktivierter Alkene Alkene mit elektronenziehender Gruppe (A) Flavinmononukleotid NADPH oder NADH (kostengünstiger und stabiler) 6

Einleitung: Chirale Verbindungen Enreduktasen Enzyme aus strikt anaeroben Bakterien Probleme: Sauerstoffempfindlichkeit Starke Präferenz für NADPH als Cofaktor Sauerstoffstabile Enreduktasen aus

7 Einleitung: Chirale Verbindungen Enreduktasen Enzyme aus strikt anaeroben Bakterien Probleme: Sauerstoffempfindlichkeit Starke Präferenz für NADPH als Cofaktor Sauerstoffstabile Enreduktasen aus aeroben Organismen Probleme: Moderate Enzymaktivität Starke Präferenz für NADPH als Cofaktor Enges Substratspektrum Neuer Ansatz: Enreduktasen aus Cyanobakterien Vorteile: Breites Substratspektrum Vergleichsweise hohe Aktivität mit NADH Exzellente Stereoselektivität 7

8 Einleitung: Chirale Verbindungen Enreduktasen aus Cyanobakterien Problem: keine Enreduktase aus Cyanobakterien vereint alle nötigen Eigenschaften 8

9 Inhaltsverzeichnis Einleitung: Chirale Verbindungen Ziele des Forschungsvorhabens Projektfortschritt Zusammenfassung & Ausblick 9

10 Ziele des Forschungsvorhabens 1. Projektabschnitt Optimierung von Enreduktasen aus Cyanobakterien durch Protein Engineering Änderung der Cofaktorpräferenz Steigerung der spezifischen Aktivität mit NADH (stabiler / kostengünstiger als NADPH) Beibehaltung der exzellenten Stereoselektivität 10

11 Inhaltsverzeichnis Einleitung: Chirale Verbindungen Ziele des Forschungsvorhabens Projektfortschritt Zusammenfassung & Ausblick 11

12 Projektfortschritt Auswahl der Zielproteine 12

13 Projektfortschritt Auswahl der Zielregion 13

14 Projektfortschritt Strategien des Protein Engineering Vier Strategien des Protein Engineerings wurden angewendet Punktueller Austausch einzelner Aminosäuren Austausch der Proteinregion Verkürzung der Proteinregion Circularpermutation: Verlegung der Proteinenden (N- und C-Termini) in die Proteinregion 14

15 Projektfortschritt Cofaktorpräferenz 1. Projektziel erfüllt: Änderung der Cofaktorpräferenz des Enzyms 2 war möglich Austausch der gesamten Proteinregion Einsatz der Proteinregion einer Enreduktase eines Proteobakteriums 15

16 Projektfortschritt Cofaktorpräferenz 1. Projektziel erfüllt: Änderung der Cofaktorpräferenz des Enzyms 2 war möglich Aber: Senkung der Aktivität mit NADH wurde beobachtet 16

17 Projektfortschritt Aktivität mit NADH 17

18 Projektfortschritt Aktivität mit NADH 2. Projektziel erfüllt: Steigerung der Aktivität mit NADH war möglich 18

19 Projektfortschritt Stereospezifität 3. Projektziel erfüllt: Beibehaltung der Stereoselektivität erwünschtes Produkt Vorstufe für einen Anti- Malaria Wirkstoff 19

20 Inhaltsverzeichnis Einleitung: Chirale Verbindungen Ziele des Forschungsvorhabens Projektfortschritt Zusammenfassung & Ausblick 20

21 Zusammenfassung 1. Projektabschnitt Optimierung der cyanobakteriellen Enreduktase Änderung der Cofaktorpräferenz Steigerung der Aktivität mit NADH als Cofaktor Beibehaltung der Stereoselektivität Zum ersten Mal konnte in der Familie der Enreduktasendie Aktivität mit NADH gesteigert werden! 21

22 Ausblick Arbeitspaket Optimierung der Enreduktasen durch Protein Engineering Projektjahr Vergleich von Verfahren mit isolierten Enzymen und ganzen Zellen Untersuchung verschiedener Zweiphasensysteme Reaktionskinetische Untersuchungen, Optimierung und Maßstabsvergrößerung 22

23 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit 23

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