Entwicklung neuer Ganzzellbiokatalysatoren

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1 Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Zwischenbilanz am 22. März 2017 in Erlangen Entwicklung neuer Ganzzellbiokatalysatoren Simone Gruber, Wolfgang Liebl TUM Lehrstuhl für Mikrobiologie Christian Burger, Dirk Weuster-Botz TUM Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik

2 Inhalt Einführung Expression und Analyse von membrangebundenen Dehydrogenasen in Gluconobacter oxydans Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Herstellung des Biokatalysators im Satzverfahren Wachstumsgekoppelte Ganzzellbiokatalyse Wachstumsentkoppelte Ganzzellbiokatalyse Zusammenfassung und Ausblick 2

3 Einführung Essigsäurebakterien: biotechnologisch relevante Mikroorganismen Gluconobacter oxydans: Gram-neg., α-proteobacterium, Acetobacteraceae Mesophil(30 C), säuretolerant, aerob, zuckerreiche Habitate(z. B. Trauben, Äpfel, Most, Bier, Wein), Keine vollständige Glykolyse, Gluconeogeneseund Tricarbonsäurezyklus, C-Assimilierung über Pentosephosphat- oder ED-Weg Unvollständige Oxidation von Substraten im Periplasma Diverse biotechnologische Anwendungen Gluconobacter oxydans (Bild von PD Dr. Michael Hoppert) 3

4 Einführung Biotechnologische Anwendungen von Essigsäurebakterien Ethanol Essigsäure Glukose Glukonsäure D-Sorbitol L-Sorbose Glycerin Dihydroxyaceton meso-erythritol L-Erythrulose Herstellung von Miglitol Zellulose:Gewebestützmaterial, Implantatmaterial, Wundauflagen in Human- und Tiermedizin hoch effiziente Biotransformationen 4

5 Einführung Atmungskette von Gluconobacter oxydans Besonderer Energiestoffwechsel: Katalytisches Zentrum im Periplasma Regio-und stereoselektive Oxidationen Elektronen werden direkt in die Atmungskette eingespeist Produkte der unvollständigen Oxidation akkumulieren im umgebenden Medium keine Transportlimitierungen Produkt Substrat Deppenmeier & Ehrenreich, JMMB, 2009 mdh UQH 2 Quinol Oxidase Periplasma Cytoplasma O 2 H 2 O 5

6 Expression und Analyse von mdhs in G. oxydans Expression im Vielfach-Deletionsstamm BP.9 S 6 P 6 S 7 P 7 S 8 P 8 S 9 P 9 S 5 P 5 O 2 S 4 P 4 H 2 O padh-sldab sldab 621H mdh-gen S 3 P 3 S 2 P 2 S 1 P 1 S 6 P 6 S 7 P 7 S 8 P 8 S 9 P 9 S 5 P 5 S 4 P 4 O 2 H 2 O S 3 P 3 S 2 P 2 S 1 P 1 6

7 Expression und Analyse von mdhs in G. oxydans Entwicklung von Stämmen mit neuen, verbesserten Eigenschaften Optimierter ESB-Stamm S 6 P 6 S 7 P 7 S 8 P 8 S 9 P 9 Hohe Substratspezifität Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen S 5 P 5 S 4 P 4 O 2 H 2 O Auch neue metagenomische mdhs können exprimiert werden S 3 P 3 S 2 P 2 S 1 P 1 S 9 P 9 S 9 P 9 S 9 P 9 S 9 P 9 Optimierung zu hoch-effizienten Ganzzellbiokatalysatoren S 9 P 9 S 9 P 9 O 2 H 2 O S 9 P 9 S 9 P 9 S 9 P 9 7

8 Expression und Analyse von mdhs in G. oxydans Entwicklung von Stämmen mit neuen, verbesserten Eigenschaften Umsetzungen: 1. Erythritol Erythrulose 2. Glukose Glukonsäure 5-Ketoglukonsäure Erythritol Erythrulose G sldab H Erythritol sldab Erythrulose 8

9 Expression und Analyse von mdhs in G. oxydans Entwicklung von Stämmen mit neuen, verbesserten Eigenschaften Umsetzungen: 1. Erythritol Erythrulose 2. Glukose Glukonsäure 5-Ketoglukonsäure Glukose Glukonsäure 5-Ketoglukonsäure GDH sldab Textilindustrie Lebensmittel Baustoffe chirale Synthesen L(+)-Tartrat [Vanadat] ph Ketoglukonsäure 9

10 Expression und Analyse von mdhs in G. oxydans Entwicklung von Stämmen mit neuen, verbesserten Eigenschaften Umsetzungen: 1. Erythritol Erythrulose 2. Glukose Glukonsäure 5-Ketoglukonsäure Charakterisierung der optimierten ESB-Stämme Genetische und physiologische Charakterisierung Reaktionskinetische Charakterisierung unter technischen Bedingungen Optimierte und in den industriellen Maßstab skalierbare Produktionsverfahren 10

11 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Charakterisierung von Enzymen aus verschied. Essigsäurebakterien DCPIP PMS Glukose Gluconobacter oxydans 621H Gluconobacter cerinus Gluconobacter frateurii Puffer Absorption bei 530 nm Zeit, min 11

12 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Charakterisierung von Enzymen aus verschied. Essigsäurebakterien Substrate G. oxydans G. oxydans G. oxydans G. albidus Ga. xylinus Ga. hansenii 621H DSM3504 (1) DSM3504 (2) Isolate LMG1693 LMG1524 Glycerol D-Arabitol meso-erythritol Mannitol Sorbitol D-Ribose D-Glukose / 0 L-Erythrulose Glukonat DCPIP Konzentration zu Beginn der Messung: 170 µm Messung der Reduktion von DCPIP nach 2 Stunden: + : schwache Oxidation: 50,25 µm reduziert ++ : mittlere Oxidation: 83,25 µm reduziert +++ : starke Oxidation: > 83,25 µm reduziert Glukonat sldab 5-Ketoglukonat sldab Erythritol Erythrulose 12

13 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Herstellung von L-Erythrulose mit verschied. Produktionsstämmen Promotoren: ermöglichen die regulierte Expression eines Gens Teil der Genregulatorischen Bereiche und dem betreffenden Gen direkt vorgeschaltet Die Art des Promotors bestimmt, wie stark ein Gen exprimiert wird. Promotor 35 Region 10 Region Promotor RBS mdh mdh Substrat Produkt CAGAAG AATAAA AAAGG CGTTTA TGCCAT GGAGG GTAGCT ACTTAC GGAGG Mientuset al., Appl Microbiol Biotechnol, 2017, modified 13

14 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Herstellung von L-Erythrulose mit verschied. Produktionsstämmen Wachstumsentkoppelte Biotransformation mit10g/(lerythritol)über6h Umsatz / Ausbeute %

15 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Herstellung von L-Erythrulose mit verschied. Produktionsstämmen Wachstumsexperimente mit 50 mm meso-erythritol über 30 h Vergleich macht Unterschiede in den Wachstumsraten der Produktionsstämme deutlich. Vergleich von genomischerund plasmidbasierterexpression zeigt keinen signifikanten Unterschied in den Wachstumsraten. A B OD 600 OD 600 Zeit, min Zeit, min 15

16 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Herstellung von 5-Ketoglukonat mit verschiedenen Stämmen Promotor mdh sldab mgdh p1msldab-l6gdh mdh Substrat Produkt H mgdh sldab Glukose Glukonat 5-Ketoglukonat 16

17 Optimierung der Ganzzellbiokatalysatoren Herstellung von 5-Ketoglukonat mit verschiedenen Stämmen Substrate G. oxydans 621H G. oxydans BP.9 p1msldab-l5mgdh G. oxydans BP.9 p1msldab-l6mgdh Alcohole (sek.) 3-Hexanol Alcohole (mix) 1,3-Butandiol ,2 Pentandiol Alcohole (zyklisch) 1,2 Cyclopentandiol ,2 Cyclohexandiol Polyole Glycerol D-Arabitol meso-erythritol D-Mannitol D-Sorbitol Aldosen L-Arabinose D-Glucose D-Mannose D-Ribose D-Xylose Ketosen L-Erythrulose Carboxylsäuren Glukonat Disaccharide Cellobiose Polyol-Dehydrogenase Membrangebundene Glucose-Dehydrogenase 17

18 Herstellung des Biokatalysators Satzprozesse im Liter-Maßstab Reaktionstechnische Untersuchungen Aerob betriebener Rührkesselreaktor Reaktionsbedingungen V = 3 L T = 30 C ph 6,0 p O2 > 50 % Komplexmedium 18

19 Herstellung des Biokatalysators Vergleich rekombinanter Stämme mit dem Wildtyp Wildtyp: Gluconobacter oxydans 621H ( ) 19

20 Herstellung des Biokatalysators Vergleich rekombinanter Stämme mit dem Wildtyp Wildtyp: Gluconobacter oxydans 621H ( ) Expressionsstamm: Gluconobacter oxydans 621H BP9 pqidh-sldab( ) Höhere Zelldichten mit rekombinanten G. oxydans 20

21 Herstellung des Biokatalysators Variation der vorgelegten Glukosekonzentration 5 gl 1 Glukose 30 g L 1 Glukose 50 g L 1 Glukose Höhere Zelldichten bei erhöhter Glukosekonzentration, jedoch geringere Zellausbeuten 21

22 Wachstumsgekoppelte Ganzzellbiokatalyse Herstellung von L-Erythrulose mit wachsenden Zellen Satzkultivierung mit Gluconobacter oxydans 621H BP9 padh-sldab( ) Zugabe von 2,7 g L 1 meso-erythritol nach 45 h 22

23 Wachstumsgekoppelte Ganzzellbiokatalyse Herstellung von L-Erythrulose mit wachsenden Zellen Satzkultivierung mit Gluconobacter oxydans 621H BP9 padh-sldab( ) Zugabe von 2,7 g L 1 meso-erythritol nach 45 h Schnelle Oxidation von meso-erythritol Gebildete L-Erythrulose wird umgesetzt 23

24 Wachstumsentkoppelte Ganzzellbiokatalyse Herstellung von L-Erythrulose mit ruhenden Zellen Herstellung des Biokatalysators im Satzverfahren Abtrennen des Biokatalysators mit Zentrifugation Resuspendierender Ganzzellbiokatalysatoren zur Biotransformation (10 mm 66 mm Natrium- oder Kaliumphosphatpuffer) Start der Biotransformation durch Zugabe von meso-erythritol 24

25 Wachstumsentkoppelte Ganzzellbiokatalyse Herstellung von L-Erythrulose mit ruhenden Zellen Variation von ph und Temperatur 12 g L 1 meso-erythritol OD 600 = 0,5 V R = 12 ml t = 23 h n = 2800 U min 1 10 g L 1 meso-erythritol OD 600 = 2 V R = 50 ml t = 22 h n = 100 U min 1 25

26 Wachstumsentkoppelte Ganzzellbiokatalyse Herstellung von L-Erythrulose mit ruhenden Zellen Vollständiger Umsatz von meso-erythritol 95 % Ausbeute von L-Erythrulose nach 24 h Zellspezifische Aktivität 563 U g 1 BTM 10 g L 1 meso-erythritol OD 600 = 1,0 V R = 1,2 L t = 24 h n = 600U min 1 26

27 Zusammenfassung & Ausblick Zusammenfassung Steigerung der Effizienz der Ganzzellbiotransformation durch molekularbiologische Veränderungen Biotransformationen mit ruhenden Zellen (G. oxydans621h BP9 padh-sldab) Oxidation von meso-erythritol muss ph kontrolliert durchgeführt werden Hohe spezifische Aktivität (563 U g 1 BTM ) Ausblick Stammoptimierung für Produktion von 5-Ketogluconat Effizientere Herstellung der Ganzzellbiokatalysatoren Optimierung der Ganzzellbiotransformation (höhere L-Erythrulosekonzentration) Reaktionstechnische Untersuchungen zur Herstellung von 5-Ketogluconat 27

28 Projektfortschritt Arbeitspakete Methoden und Entwicklung von ESB-Stämmen für Erythrulose-und 5-Ketoglukonsäure-Produktion Isolierung neuer Dehydrogenasegene durch (Meta)Genomanalyse und bioinformatischen Methoden Untersuchung der Physiologie und Regulation, Produktanalysen, Stammoptimierung Reaktionstechnische Charakterisierung rekombinanter GluconobacteroxydansStämme Optimierung und Maßstabsvergrößerung Projektjahr

29 Danksagung TU München Mikrobiologie (Simone Gruber) Prof. Dr. W. Liebl Dr. Armin Ehrenreich Dr. Markus Mientus Dr. David Kostner Dr. Björn Peters TU München Bioverfahrenstechnik (Christian Burger) Prof. Dr.-Ing. D. Weuster-Botz Ludwig Selder Hannah Marienberg Tuan Hoang Son 29