Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB-Biokunststoffe

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1 Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Zwischenbilanz am 22. März 2017 in Erlangen Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB-Biokunststoffe Prof. Dr. Thomas Brück Dr. Norbert Mehlmer Technische Universität München Fakultät für Chemie/ Fachgebiet Industrielle Biokatalyse (IBK)

2 Einleitung PHB: Poly-(R)-3-Polyhydroxybutyrat biologisch recycelbar 2

3 Ziele Produktion eines neuen, auf Polyhydroxybutyrat (PHB) basierenden Kunststoffs Aus erneuerbaren Ressourcen (Kleie-Hydrolysat) Nicht auf Erdöl-Basis Verbesserte Produkteigenschaften Kostengünstige Produktion Wachstumsmedium Kleie-Hydrolysat E. coli Kleie Genetisch optimierter E. coli-stamm zur Produktion von Designer PHB 3

4 Vorgehensweise Nachhaltige Fermentationsgrundlage Enzymatische Hydrolyse: Cellulasen Pectinasen Kleie (Weizen) Hemi-Cellulasen Zusammensetzung: Glucose(Hexose) Xylose(Pentose) 2 Zuckerzusammensetzungdes Hydrolysats Problem: Gleichzeitige Fermentation 4

5 Vorgehensweise Parallele Fermentation von Hexosen und Pentosen Wachstum (OD=optische Dichte, schwarz) von E. coli in einem Wachstumsmedium, das drei Zucker beinhaltet: Xylose (blau), Arabinose(lila), und Glukose (grün). Links: wild-typ E. coli. Rechts: ptsg Knockout. ptsg Knockout Gleichzeitige Verwertung von Glukose und Xylose Abb.: Xia et al.,

6 Vorgehensweise Verstärkter Xylose Metabolismus zur gesteigerten 3HB Produktion Pentose-Phosphate-Weg Üblicher Weg Xylose Dahm -Weg Abkürzung Xylose D-Xylose Isomerase D-Xylulokinase Transketolase Transaldolase Xylulose Xylulose-5-Phosphate Eingang zur Glycolyse D-Xylose Dehydrogenase Xylonate Dehydratase Aldolase Xylonate 2-keto-3-deoxy- Xylonate Glycolaldeyd Glyceraldehyde-3-Phosphat +Fructose-6-Phosphat Pyruvat Pyruvat Dehydratase Komplex Glycolyse Acetyl-CoA Pyruvat Pyruvat Dehydratase Komplex Acetyl-CoA 6

7 Ergebnisse Assemblierung des kompletten Dahm-Wegs D-Xylose Dehydrogenase Xylonate Dehydratase Xylose Xylonate Aldolase 2-keto-3-deoxy- Xylonate Pyruvat Gylcolaldeyd Klonierung Pyruvate Dehydratase Komplex Acetyl-CoA Herausforderung: Optimierung der Expressionsstärke: RBS 7

8 Neue Strategie zur Synthese von PHB Stoffwechselweg zu PHB EndogeneSynthesevon PHB (taktisch) phba: β-ketoacy-coa Thiolase phbb: Acetoacetyl-CoA Dehydrogenase phbc: PHB Polymerase Synthesedes Designer PHB 3HB thioesterase II + CoASH Neue Synthesestrategie Partiell ataktisches PHB 8 Abb. Ausschnitt: Madison und Huisman, 1999

9 Ergebnisse: Produktion von 3HB 3HB Produktionsstamm Plasmid E. coli Produktionsstamm Abgeschlossen: Plasmid mit phbaund phbb Fermentation in E. coli Erste Fermentationen ~ 0.14 g/l 3HB im synthetischen Medium 3HB-Nachweismethode Nächsten Schritte: Ko-Expression mit dem Dahm-Plasmid und Expressions-Optimierung Genomische Integration 9

10 Vorgehensweise Neue synthetische Strategie zur Polymerisierung Übersicht: Lactonisierung Ring-Öffnungspolymerisation Ziel: Partiell ataktisches PHB 10

11 Vorgehensweise: Lactonisierung Biokatalytische Lactonisierung von 3-HB Natives Substrate PL CD6 PL HS6 Substrat (Funktionelle Gruppe) Zielsubstrate 11

12 Ergebnisse: Mutagenese Strukturbasierte Mutagenese von PlaO1 C-Terminale Region Substratspezifische Bindung Hauptansatzpunkt zur gezielten Mutagenese Doppelsträngige ß-Helix Konserviertes Eisen-Bindemotiv Abb.: Peer Lukat,

13 Ergebnisse: Mutagenese Klonierung und Mutagenese von PlaO1 Ausschnitt Strukturmodell: Expressionsplasmid Identifizierte Ziele (rot) Arg251, Arg247 and Thr128 PCR-basierte Mutagenese/Klonierung PLaO1 Mutantenbibliothek His-Tag Proteinreinigung In vivonachweis Aktivitätsnachweis mittels 3HB Schnelle Durchmusterungsmethode Abb. links: Peer Lukat,

14 Ergebnisse: Mutagenese Klonierung und Mutagenese von PlaO1 Ausschnitt Strukturmodell: Hochdurchsatz-Nachweis (Schweppes assay) Identifizierte Ziele (rot) Arg251, Arg247 and Thr128 Ein Stamm mit möglicher γ Butyrolactone Produktion Bestätigung mittels HPLC/NMR Evaluierung der P4HB Polymereigenschaften Abb. links: Peer Lukat,

15 Ergebnisse: Nachweismethoden für Hochdruchsatz Methoden 1. 3HB Nachweis mittels Kit Etabliert 3HB-Nachweis: Etabliert für 96-Well Maßstab 2. Schweppesassay Etabliert γ-butyrolacton-nachweis Etabliert für 96-Well Maßstab GBL 3HB 3. In vivo Lactone Reporter In Arbeit β-butyrolacton-nachweis Hochdurchsatzbiszu1x10 7 Klone möglich 15

16 Hochdurchsatznachweismethode: in vivo Lacton-Reporter AraC basierender Lacton-Reporter Inaktiv: ohne Substrat Aktiv: mit Substrat AraC Minus Arabinose Expression Effektor-Molekül Arabinose Mutagenese Expression: GFP & Resistenz Abb. oben Ausschnitte: Schleif,

17 Vorgehensweise AraC E. coli Stamm Deletion des endogenen Arabinose-Operons(mit AraC) AraC Mutagenese Klonierung des AraC-Gens in ein Expressionsplasmid(p15) Vollständige Mutagenese der involvierten AA: P8, T24, H80, Y82, and H93 Reporter-Kassette Promoterregion PBAD Positivselektion Kanamycin Negativselektion modifiziertes PheS Positiv/Negativselektion: GFP FACS Abb.: Ausschnitt, Tang et al.,

18 Ergebnisse/Fortschritt Lacton-Reporter Strategie: Klonierung der Reporterkassette O2 O1 RBS RBS RBS pbad-prom. GFP Kanamycin PheS Integration der Reporterkassette direkt ins Genom im Arabinose-Operon () Klonierungvon AraC Test: Negativselektion mit 4-Chloro-Phenylalanin (4CP) Ausstehend: AraC-Mutantenbibliothek Mehrere Runden Positiv/Negativselektion mit β-butyrolacton Hochdurchsatz-Durchmusterung nach neuen Lactonasen(Mutanten): Thioesterase II aus E. coli PON1 (Serum Paraoxonase/Arylesterase 1) EntF(Enterobaction Synthase) 18

19 Vorgehensweise Lipase-basierende Ringöffnungs Polymerization Lipase Lipase AP6 ß-Lactone Designer PHB 19

20 Vorgehensweise Optimierung der Produktausbeute Wie lässt sich die Ausbeute von 3HB steigern? Abb: Guevara-Martínez et al.,

21 Vorgehensweise Metabolische Flussanalyse und Optimierung der Produktivität Metabolite, Proteine, Transkripte Intermediat- Fluss Zellulärer Phänotyp 13C 12C Markierte Substrate Feed Zellkultur Metabolische Markierung Messung Abundance 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 Analyse Abb. Links: YupLee et al.,

22 Zusammenfassung PHB ist ein natürliches Biopolymer, das sich fermentativ einfach herstellen lässt Biologisch schnell abbaubar Nachhaltige Fermentationsgrundlage basierend auf Kleiehydrolysat Produktion von partiell ataktischem PHB durch eine neue Synthesestrategie durch Biokatalytische Lactonisierung von 3HB zu γ Butyrolacton Lipase-katalysierte Ringöffnungspolymerisation des Lactons Metabolische Optimierung der Produktausbeute 22

23 Zwischenbilanz: Übersicht Schlüssel-APs Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB-Biokunststoffe 1. Jahr 2. Jahr 3. Jahr Evaluierung Dahm-Stoffwechselweg AP2 Dahm-Weg: Klonierung, Expression in vitro Charakterisierung und HTS-Screen Etablierung der Nachweis und Quantifizierungsmethoden AP3 Etablierung einer Metall-Komplex-Reaktions-basierenden γ-butyrolacton Evaluierung In vivo GFP-Lacton-Nachweis AP4 Biokatalytischen Laktonisierung(γ) von 3-HB Entwicklung eines biotechnologischen Produktionsorganismus für β-bl AP5 23

24 Danksagung Prof. Dr. Thomas Brück Technische Universität München Fakultät für Chemie Dr. Daniel Garbe Dr. Monika Fuchs Dr. Farah Qoura Dania Awad Samer Younes Prof. Dr. Rainer Buchholz Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik FAU Erlangen-Nürnberg Koordinator:Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern