Aufwertung von Glycerol Die Produktion von Polyhydroxybuttersäure (PHB) in Bacillus megaterium

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1 Aufwertung von Glycerol Die Produktion von Polyhydroxybuttersäure (PHB) in Bacillus megaterium Polyhydroxyalkanoate Polyhydroxyalkanoate (PHA) sind natürlich vorkommende lineare Polyester. Diese Verbindungen werden von vielen Bakterien unter bestimmten Bedienungen als Reservestoffe für Energie gebildet. Diese Biopolymere haben mechanische Eigenschaften wie die klassische Plastik. Von daher werden die zur Herstellung von Biokunststoffen verwendet. Ein großer Vorteil von diesem Biokunststoff besteht darin, dass er biologisch abbaubar ist. Die Biosynthese von PHA wird durch bestimmte Mangelbedienungen (z.b. Mangel an den Makroelementen Phosphor und Stickstoff) und Überschuss an Kohlenstoff aufgefordert. Die am meisten produzierte Form von PHA ist die Polyhydroxybuttersäure (PHB). PHB besteht aus 1000 bis Hydroxyfettsäureneinheit. Abbildung 1: Polyhydroxbuttersäure. aus n von 1000 bis Hydroxyfettsäureneinheite besteht die PHB. Biosynthese von PHB Die Biosynthese in Bakterien verläuft in 3 Schritten, die von 3 Enzymen katalysiert werden, wie es in Abbildung 2 zu sehen. Zwei Moleküle Acetyl-CoA kondensieren durch Katalyse der der β-ketothiolase zu Acetoacetyl-CoA. Dieses Produkt wird anschließend durch eine Reduktase zu R-3-

2 Hydroxybutyryl-CoA reduziert, welches als Substrat der PHB-Synthase dient. Die PHB-Synthase katalysiert die Polymerisation zum PHB. Abbildung 2: PHB Biosynthese Produktion von PHB Die Kosten der industriellen Produktion von PHB sind bis jetzt höher als die von der herkömlichen Plastik (petrochemisch-basierende Plastik). Ein Grund dafür ist die Tatsache, dass PHB intrazellulär akkumuliert wird, so dass bestimmte Chemikalien und Methoden, z.b. Lösungsmittel oder enzymatische Verdauung, bei der Aufreinigung zum Einsatz kommen müssen.

3 Im Jahr 2002 wurde in einer wissenschaftlichen Arbeit berichtet (Nagatsuta-cho, Midori-ku, Yokohama, 2002), dass das Lyse-System einer Phage für eine Autolyse der Bakterien verwendet werden kann. Das lysegen wurde in einem Schuttelvektor eingebaut und in Bakterien eingeschleust. Dieses Gen liegt unter der Kontrolle von Xylose-Promoter und somit wird die Expression durch im Medium vorhandene Xylose induziert. Allerdings ist der Hauptquelle für Kohlenstoff, Glukose, ein Inhibitor für die Expression des Lysegen. Nur wenn Glukose verbraucht ist, kommt es zur Expression des Targetgens. Ein weiterer Grund für die hohen Kosten der Produktion von PHB sind die Preise der Kohlenstoffquellen. Die Kostenanalyse zeigen, dass der Beitrag von Kohlenstoffquelle allein 25 bis 45% der gesamten Kosten ausmacht. Tatsächlich kamen günstige Kohlenstoffquellen zum Einsatz, z.b. Abfälle aus Agroindustrie. Es gibt sowohl gram negativ als auch gram positive Bakterien, die die PHB synthetisieren können. Allerdings werden heutzutage nur gram Negative in der industriellen Produktion eingesetzt. Ist aber bekannt, dass gram negative Bakterien Lipopolysaccharide (LPS) auf ihrer Oberfläche enthalten. Diese Lipopolysaccharide treten als Nebenprodukt im Downstream Prozess. LPS wirken als Antigene und aus diesem Grund kann das Hauptprodukt, PHB, nicht in Biomedizin verwendet werden. Glycerol als Kohlenstoffquelle Große Mengen Glycerol werden als Nebenprodukt der Biodieselherstellung produziert. Durch eine Umesterung von pflanzlichen Ölen mit Methanol wird Glycerol in Biodieselindustrie erzeugt. Glycerol kann als Kohlenstoff- und Energiequelle für das bakterielle Wachstum eingesetzt werden. In verschiedenen Industriebranchen, z.b. Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharma-Industrie, wird Glycerol verwendet. Glycerol wird auch in Produktion von PHB verwendet. Dies ist auch viel versprechend, aufgrund der bis jetzt niedrigen Preise.

4 Abbildung 3: Glycerol als Nebenprodukt in Biodieselherstellung. Ziel der Arbeit Das Ziel dieser Arbeit war eine technische und wirtschaftliche Analyse der Produktion von PHB zu erstellen. Dafür wurde das gram positive Bacillus megaterium verwendet. Ein Vergleich zwischen Glucose und Glycerol als Substrat wurde etabliert. Noch dazu sollten die optimalen Fermentationsbedienungen bestimmt werden. A. Substratkonzentration Um festzustellen welche Rolle die Substratkonzentration in der Produktion spielt, wurde 3 verschiedene Anfangskonzentrationen verwendet: 10, 20 und 50 g/l. Alle anderen Bedienungen waren wie folgendes: Temperatur 30 C, air flow 12 l/min and nicht-kontrollierter ph. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der verschiedenen Fermentationen. Es ist deutlich, dass die Fermentation mit einer Anfangskonzentration von 50 g/l die höchste Biomasse liefert. Allerdings ist die Produktkonzentration identisch wie im Fermenter mit einer Anfangskonzentration von 20 g/l ist.

5 Abbildung 4: Biomasse- und Produktionsprofil von 3 verschiedenen Fermentationsprozesse. Die Fermentationsprozesse unterscheiden sich nur in Substratkonzentration. B. Temperatur 3 Fermentationen bei 3 verschiedenen Temperaturen wurden gestartet. Nur leichte Änderungen der Biomasse in den verschiedenen Fermentationen sind beobachtet. Im Produktionsprofil sind allerdings große Unterschiede, dabei hat die Fermentation bei 33 C die höchste Produktkonzentration, wie es in Abbildung 5 zu sehen. Abbildung 5: : Biomasse- und Produktionsprofil von 3 verschiedenen Fermentationsprozesse. Die Fermentationsprozesse unterscheiden sich nur in Temperatur. Substratkonzentration war in allen Fermentationen 20 g/l.

6 C. Glycerol oder Glucose Tabelle 1 zeigt ein Vergleich der experimentellen Ergebnisse aus der Produktion von PHB aus Glycerol und Glucose. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von Bacillus megaterium PHB aus sowohl Glucose als auch Glycerol mit vergleichbarer Ausbeute. Tabelle 1: Glycerol und Glucose als Substrat für PHB Produktion. D. Wirtschaftliche Analyse Die Gesamtkosten der Produktion wurden für die beiden Fälle, Glycerol oder Glucose als Substrat, ausgerechnet. Dabei wurden 2 verschiedene Downstream Prozesse miteinander verglichen. Es hat sich am Ende ergeben, dass die kosten am wenigsten im Fall Glycerol als Substrat und die Downstream DSP B sind. Durch diese Analyse würde der Preis von PHB 2,6 USD/kg kosten. Hier ist zu erwähnen, dass der aktuelle Preis zwischen 3,1 und 4,4 USD/kg liegt.

7 Literaturverzeichnis Valorization of glycerol through the production of biopolymers: The PHB case using Bacillus megaterium, Javier M. Naranjo, John A. Posada, Juan C. Higuita, Carlos A. Cardona, Bioresource Technology 133 (2013) Polyhydroxybutyrate synthesis on biodiesel wastewater using mixed microbial consortia, Zachary T. Dobroth a, Shengjun Hub, Erik R. Coats a, Armando G. McDonaldBioresource Technology 102 (2011) Large-scale production and efficient recovery of PHB with desirable material properties, from the newly characterised Bacillus cereus SPV, Valappil SP, Misra SK, Boccaccini AR, Keshavarz T, Bucke C, Roy I., J Biotechnol Nov 1;132(3):251-8 Construction of self-disruptive Bacillus megaterium in response to substrate exhaustion for polyhydroxybutyrate production. Hori K, Kaneko M, Tanji Y, Xing XH, Unno H. Graduate School of Bioscience and Biotechnology, 4259 Nagatsuta-cho, Midori-ku, Yokohama , Japan.