Institut für Lebensmitteltechnologie Fachgebiet: Allgemeine Lebensmitteltechnologie und -mikrobiologie Prof. Dr. W.R Hammes

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Benjamin Maus
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1 Institut für Lebensmitteltechnologie Fachgebiet: Allgemeine Lebensmitteltechnologie und -mikrobiologie Prof. Dr. W.R Hammes Großtechnische Fermentation von Lactobacillus curvatus und Pediococcus pentosaceus für den Einsatz als Starterkulturen in der fleischverarbeitenden Industrie Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Vorgelegt der Fakultät für Allgemeine und Angewandte Naturwissenschaften der Universität Hohenheim von Michael Metz aus Stuttgart April 1992

2 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung und Zielsetzung Aufgabenstellung und Ablauf der Arbeit Einsatz von Milchsäurebakterien bei der Rohwurstreifung Historie Starterkulturen in der Praxis Herstellung und Reifung von Rohwurst Fermentationen im Labor- und großtechnischen Maßstab und ihr Einsatz bei der Herstellung von Starterkulturen Begriffsbestimmungen Starterkultur Rohwurst Biotechnologie Geräte Zusammenstellung der eingesetzten Laborgeräte Kurzbezeichnung Anlagenelemente Fermentationsanlagen Laborfermenteranlage Fermenteranlage und Separator Material und Methoden Material Lösungen für die Plasmidmusterbestimmung Lösungen für die Karl-Fischer-Titration Gefrierschutzmittel Rezeptur für Rohwurstherstellung Analytik Probenahme Probenahme aus dem Fermenter

3 Probenahme aus dem Gefriertrockner Physikalische Bestimmungsmethoden Bestimmung des ph-wertes Bestimmung des Redoxpotentiales Bestimmung des Sauerstoffgehaltes Bestimmung der Zelltrockensubstanz Bestimmung des Wassergehaltes Bestimmung der optischen Dichte in Fermentationslösungen Bestimmung des eutektischen Punktes von gefrorenem Bakterienkonzentrat Enzymatische Bestimmungen Schnelltest auf Glucose Glucose D-L-Lactat Fehlerbetrachtung Mikroorganismen und Stammhaltung Mikroorganismen Stammhaltung Nährmedien Modifizierte MRS-Bouillon zur Erstellung von Zuckerspektren Medium zur Säuerungsaktivitätsbestimmung Modifiziertes MRS-Medium für Oberflächenkulturen Verdünnungslösung für Keimzahlbestimmung Modifizierte MRS-Bouillon zur Anzucht von Lactobazillen in Inokulationsflaschen Medium zur Anzucht von Pediokokken in Inokulationsflaschen Fermentationsmedien für 30 I Labormaßstab und technischen Maßstab Methoden zur Isolierung, Differenzierung und Charakterisierung Mikroskopie Bestimmung der Lebendkeimzahl Auswertung der Platten Bestimmung des Zuckerspektrums Herstelluna von Plasmidmustern Bestimmung der Säuerungsaktivität in einem Modellsubstrat

4 3.5.'6 Bestimmung der Säuerungsleistung und der Umrötung in einer standardisierten Rohwurst Berechnete Größen Berechnung der spezifischen Wachstumsrate /u und der spezifischen Säuerungsrate r\_ Berechnung der Gesamtzelltrockenmasse X Berechnung der spez. Produktbildungsrate q x, q z Berechnung des spez. Substratverbrauches q s Berechnung der Ausbeutekoeffizienten Y c und Y P Berechnung von Substratverbrauch m kz und Produktbildungsrate p KZ Berechnung des spez. Keimgewichtes KZgp Berechnung des Anteils toter Zellen an der Gesamtzellzahl KZ nv Berechnung der Überlebensrate nach Gefriertrocknung Verfahren zur Fermentation von Starterkulturen Charakterisierung der Fermentationsarten Charakterisierung der Batch-Fermentation Charakterisierung der Fed-batch-Fermentation Charakterisierung der kontinuierlichen- und der Fedbatch-Fermentation mit Zellrückführung Die Animpfkultur Herstellung der Ausgangskültur Berechnung der Animpfverhältnisse Propagationsschema Fermentationen im Labormaßstab Batch-Fermentationen im 301 Laborfermenter Fed-batch-Fermentationen im 301 Laborfermenter Beschreibung der Substratdosage Fermentationen im Produktiomsmaßstab Batch-Fermentationen im 5000 I Produktionsfermenter Kontinuierliche- und Fed-batch-Fermentationen mit Zellrückführung im 5000 I Produktionsfermenter Beschreibung des Verfahrensablaufs Verfahren zur Aufarbeitung von Biomasse Zellernte über Separator Gefrierverfahren 66

5 IV Inhaltsverzeichnis Gefriertrocknung Lagerung der gefriergetrockneten Präparate Physiologische Untersuchungen Wachstumshemmung durch Lactat Wachstumshemmung durch Glucose Wachstumshemmung durch die Konzentration der Gesamtheit der Substratkomponenten Theoretische Ausbeute und Erhaltungsstoffwechsel Anteile an D- und L-Lactat während des Fermentationsverlaufes Scale-up der Fermentation vom 30 I auf 5000 I Maßstab Fermentationen im 30 I Laborfermenter im Batch- und Fed- Batch-Verfahren Bestimmung der optimalen Substratkomponenten Bestimmung der maximalen Substratkonzentration Optimales Verhältnis von Kohlenstoff zu Proteinquelle Umsatz von Glucose zu Lactat Substratkonzentration bei Fermentationsbeginn Vergleichende Fermentationen im 5000 I Produktionsfermenter im Batch-, Fed-batchund Zellrückführverfahren Batch-Fermentationen Grundlegende Untersuchungen zum Zellrückführsystem Mischzeiten im gerührten Kessel Zellschädigung im Separator in Abhängigkeit von Separationsdauer bzw. Häufigkeit Wachstumsverhalten nach Substratlimitierung Fermentation mit kontinuierlicher Substratdosage und kontinuierlicher Zellrückführung Fermentation mit diskontinuierlicher Substratdosage, diskontinuierlicher Zellrückführung und Teilernte Korrelation von optischer Dichte, Trockensubstanz und Keimzahl Vergleich der Kennwerte der Fermentationsverfahren 74

6 3.11 Qualitätskontrolle der Starterkulturlyophilisate Bestimmung der Überlebensrate nach Separation und Gefriertrocknung Wassergehalt im Lyophilisat Identitätsprüfung Säuerungsaktivität Rohwurstherstellung unter standardisierten Bedingungen Wichtige Aspekte der Verfahrensoptimierung Vergleich der Fermentationsparameter bei unterschiedlichen Verfahren Statistische Betrachtung der Fermentationsparameter Herstellkosten Anlageninvestitionskostenen Vergleich der Fermentationsarten Computersimulation der Fermentationsprozesse Ergebnisse Physiologische Untersuchungen Wachstumshemmung durch Lactat Wachstumshemmung durch Glucose Wachstumshemmung durch die Konzentration der Gesamtheit der Substratkomponenten Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur Substrat- und Produkthemmung Bestimmung der theoretischen Ausbeute und des Erhaltungsstoffwechsels Anteile an D- und L-Lactat im Fermentationsverlauf Optimierung der Fermentation von L curvatus und P. pentosaceus im 30 I Labormaßstab Fermentation im Batch- und Fed-batch-Verfahren mit L curvatus im 30 I Labormaßstab Bestimmung der optimalen Substratkomponenten Proteinkomponenten Glucosekonzentration Nährsalze 119

7 VI Inhaltsverzeichnis Oberflächenaktive Agentien (Tween80) Bestimmung der maximalen Substratkonzentration Verhältnis von Kohlenstoffquelle zu Proteinquelle Umsatz von Glucose zu Lactat Substratkonzentration bei Fermentationsbeginn Fed-batch-Fermentation mit L. curvatus im 30 I Laborfermenter Fermentationen mit L curvatus und P. pentosaceus im 5000 I Produktionsfermenter im Batch-, Fed-batchund Zellrückführverfahren Batch-Fermentationen im Produktionsmaßstab Grundlegende Untersuchungen zum Verfahren im 5000 I Fermenter mit Zellrückführsystem Mischzeiten im gerührten Kessel Zellschädigung im Separator Wachstumsverhalten nach Substratlimitierung Fermentation mit kontinuierlicher Substratdosage und kontinuierlicher Zellrückführung Verlauf der Fermentationsparameter für L. curvatus Substratverluste und Separatorleistung im kontinuierlichen Fermentationssystem Fermentation mit diskontinuierlicher Substratdosage, diskontinuierlicher Zellrückführung und Teilernte Verlauf der Fermentationsparameter für L. curvatus und P. pentosaceus Grenzwerte und Systemparameter für maximale Produktivität Korrelation von opt. Dichte, Trockensubstanz und Keimzahl Vergleich der Kennwerte der Fermentationsverfahren Substratkonzentration und Substratverhältnis Fermentationszeiten Optische Dichte und spez. Wachstumsrate im System Gesamtkeimzahl und Trockenmasse im System Biomasseverluste durch Aufarbeitung Keimzahlkonzentration und keimzahlbezogene, spezifische Produktbildungsrate Biomassekonzentration und spezifische Produktbildungsrate 171

8 VII 4.3:6.8 Lactatbildung, Lactatkonzentration und Umsatz von Glucose zu Lactat Ausbeutekoeffizienten Keimzahlbezogener Substratverbrauch Spezifischer, massenbezogener Substratverbrauch Spezifisches Keimgewicht Qualitätskontrolle der Starterkulturlyophilisate Bestimmung der Überlebensrate nach Separation und Gefriertrocknung Wassergehalt im Lyophilisat Identitätsprüfung der Organismen über Zuckerspektrum und Plasmidmusterbestimmung Säuerungsaktivität Rohwurstherstellung unter standardisierten Bedingungen Wichtige Aspekte der Verfahrensoptimierung Vergleich der Fermentationsparameter bei unterschiedlichen Verfahren Statistische Betrachtung der Fermentationsparameter Herstellkosten Anlageninvestitionskosten Vergleich der Fermentationsarten Computersimulation der Fermentationsverfahren für L. curvatus Diskussion Physiologische Untersuchungen Fermentationsverfahren Qualitätskontrolle der Lyophilisate Bewertung der Verfahrensoptimierung Zusammenfassung Literaturverzeichnis 247

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