Overview on the Biotechnological Production of L-DOPA

Transkript

1 Overview on the Biotechnological Production of L-DOPA Kyoungseon Min; Kyungmoon Park; Don-Hee Park; Young Je Yoo; Appl Microbiol Biotechnol (2015); MINIREVIEW 1. Einleitung: L-DOPA, oder auch 3,4-Dihydroxyphenyl-L-Alanin wird als Parkinsonmedikament eingesetzt. Hauptsächlich wird L-DOPA durch eine asymmetrische Hydrierung hergestellt und der Weltmarkt beträgt 250 t pro Jahr. Dieser Prozess wurde von Monsanto entwickelt und wird seit den 1960er Jahren eingesetzt. L-DOPA (siehe Abb. 1) ist ein Aminosäure-Analogon von L-Tyrosin und stellt ein Precursormolekül von Dopamin dar. Abbildung 1: Strukturformel von L-DOPA Parkinson ist eine degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems, die durch einen Mangel des Neurotransmitters Dopamin im Gehirn hervorgerufen wird. Dopamin selbst kann die Blut-Hirn-Schranke nicht überqueren und kann daher nicht als direkte Medikation eingesetzt werden. Im Gegensatz dazu ist L-DOPA in der Lage über die Blut-Hirn-Schranke ins Gehirn zu gelangen und eignet sich daher für die Behandlung. Krankheitssymptome von Parkinson sind Akinesie (Bewegungsarmut), Tremor (Zittern) und Rigor (Starre/Steifheit). 2. Herstellung von L-DOPA Zur kommerziellen Herstellung von L-DOPA wird überwiegend die von Monsanto entwickelte Methode der asymmetrischen Hydrierung angewandt. Dieses Verfahren benötigt teure Metallkatalysatoren wie beispielsweise Rubidiumkomplexe. Es kommt zur Anlagerung von zwei Wasserstoffatomen und der Einsatz eines chiralen 1

2 Katalysators hilft dabei eine enantiomerenreine Verbindung zu erhalten. Dadurch kann eine enzymähnliche Selektivität erreicht werden, was für die Herstellung von Arzneimitteln von großer Bedeutung ist. Nachteile der asymmetrischen Hydrierung sind die extremen Reaktionsbedingungen, die geringe Substratspezifität, eine schlechte Umsatzrate und eine geringe Enantioselektivität. Um die Umsatzrate und die Enantioselektivität zu verbessern und um den Prozess ökonomischer zu machen wird an der biotechnologischen Herstellung von L-DOPA geforscht. Dazu gibt es fünf verschiedene Ansätze. a) Mikrobielle Fermentation mit Hilfe von Tyrosinase Tyrosinase ist eine Kupfer-enthaltende Oxidoreduktase, die zwei katalytische Aktivitäten besitzt. Zum einen die Cresolase Aktivität, welche für die Herstellung von L-DOPA von Bedeutung ist und die Catecholase Aktivität. Die Cresolase Aktivität ist verantwortlich für die o-hydroxylierung von L-Tyrosin. Die Catecholase Aktivität führt zu einer unerwünschten Oxidation von L-DOPA zu DOPAquinon. DOPAquinon stellt ein Nebenprodukt dar, dessen Bildung verhindert werden soll. Ein Problem dabei ist die effizientere Umwandlung von L-DOPA zu DOPAquninon als von L-Tyrosin zu L- DOPA. Zur Gewinnung von Tyrosinase wurden verschiedene Fungusarten aus phenolreichem Milieu untersucht. Die größte Tyrosinasekonzentration wies dabei ein Pilz namens Acremonium rutilum auf. b) Mikrobielle Fermentation mit Hilfe von Tyrosin Phenol Lyase (Tp1) Tp1 baut L-Tyrosin zu Pyruvat, Ammoniak und Phenol ab. Diese Reaktion ist reversibel und wird für die Produktion von L-DOPA umgekehrt. Tp1 ist ein L-Tyrosin induzierbarer Biokatalysator, woraus sich ein Problem bei der Aufreinigung von L- DOPA aus dem Kulturmedium aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von L-Tyrosin und L-DOPA ergibt. Als Wirt für die Herstellung von L-DOPA mit Tp1 wurde E. herbicola ausgewählt, da dieser Mikroorganismus eine extrem hohe Enzymaktivität aufzeigt. Im Zuge dessen wurden weitere Versuche mit Tp1 durchgeführt, wie beispielsweise die zufällige Mutagenese des tyrr-gens in E. herbicola. Desweiteren wurde das tp1 Gen verschiedener Mikroorganismen in E. coli kloniert und dort teilweise überexprimiert. 2

3 c) Mikrobielle Fermentation mit Hilfe von PHAH p-hydroxyphenylacetat-3-hydroxylase (PHAH) benötigt für die Umwandlung von L- Tyrosin zu L-DOPA NADH als Co-Faktor. Da NADH zu teuer ist um es in stöchiometrischen Mengen zur Reaktion hinzuzugeben wird gleichzeitig an der Entwicklung eines NADH-Regenerationssystems geforscht. Folglich ist Tyrosinase zur Zeit noch die günstigere Variante und wird bevorzugt eingesetzt. d) Enzymimmobilisierung Allgemeine Probleme, die bei der enzymatischen Synthese eines Arzneistoffs vorliegen sind beispielsweise die schlechte Isolierung des Produkts aus dem Reaktionsgemisch, die lange Reaktionsdauer und die sich daraus ergebende geringe Produktivität. Desweiteren kommt es zu einer schrittweisen Denaturierung des Biokatalysators. Um dem entgegenzuwirken und die Tyrosinase wiederverwendbar zu machen kann die Methode der Enzymimmobilisierung mit verschiedenen Trägermaterialien (siehe Tabelle 1) angewandt werden. Tabelle 1: Vergleich der eingesetzten Trägermaterialien zur Immobilisierung von Tyrosinase Trotz verbesserter Produktivitäten durch die vorgestellten Ansätze verbleiben einige Probleme bei der enzymatischen Herstellung von L-DOPA. Die L-DOPA Synthese ist durch die Nebenproduktbildung von DOPAquinon noch immer limitiert. DOPAquinon entsteht durch eine Oxidation von L-DOPA durch die Catecholase Aktivität der Tyrosinase. Bisher wird Ascorbinsäure als reduzierendes Agens 3

4 hinzugegeben. Der Nachteil dabei ist jedoch die inhibierende Wirkung von Ascorbinsäure auf die erwünschte Cresolase Aktivität (siehe Abbildung 2). Außerdem tritt bei zu hohen Konzentrationen eine irreversible Inhibierung der Tyrosinase ein. Abbildung 2: Enzymatische Umwandlung von L-Tyrosin zu L-DOPA durch die Cresolase Aktivität von Tyrosin und von L-DOPA zu DOPAquinon durch die Catecholase Aktivität. Ascorbinsäure wird als reduzierendes Reagenz hinzugegeben. Als alternative Methode zur Zugabe von Ascorbinsäure wurde die elektroenzymatische Methode entwickelt um die Nebenproduktbildung zu reduzieren. e) Elektroenzymatische Umsetzung Bei der elektroenzymatischen Umsetzung wird elektrische Energie anstatt reduzierender Reagenzien verwendet. Bei dieser Methode werden single-walled carbon nanotubes (SWNT) als Immobilisierungsunterstützung und Elektronenträger verwendet. Das elektroenzymatische System besteht aus einer dreidimensionalen Kathode mit der immobilisierten Tyrosinase, einem Platin-Draht und einer Silber- Silberchlorid-Elektrode, die als Arbeits-, Gegen- und Referenzelektrode dient. Durch die Kathode werden kontinuierlich Elektronen bereitgestellt mit deren Hilfe DOPAquinon zurück zu L-DOPA umgewandelt wird. 4

5 Abbildung 3: Elektroenzymatisches System mit einer Tyrosinase-immobilisierten Biokathode Durch den Einsatz der elektroenzymatischen Systeme konnte die Produktivität drastisch verbessert werden, allerdings wurden bisher nur Versuche im Labormaßstab durchgeführt. 3. Zusammenfassung Abschließend ist festzuhalten, dass die chemische Synthese derzeit aus wirtschaftlicher Sicht noch immer am lohnenswertesten. Die mikrobielle Herstellung mit Hilfe von Tyrosinase ein E. herbicola wird ebenfalls bereits seit 1993 kommerziell eingesetzt. Die biokatalytische Umsetzung zeigt ebenfalls vielversprechende Anwendungen in der Industrie, jedoch besteht das Problem der Nebenproduktbildung. Daher gibt es im Bereich der elektrochemischen Umwandlung noch einige Forschungsziele um die Umsetzung im industriellen Maßstab zu ermöglichen. Ein abschließender Vergleich der drei verschiedenen Herstellungsmethoden von L-DOPA mit Vor- und Nachteilen ist in Tabelle 2 aufgeführt. 5

6 Tabelle 2: Vergleich der chemischen, mikrobiellen und biokatalytischen Umwandlung Methode / Katalysator Vorteile Nachteile Chemischer Prozess - Hauptsächlich asymmetrische Hydrierung, - Metallkatalysatoren (z.b. Rb-Komplexe) - Kommerziell eingesetzter Prozess - Komplexer Prozess - Geringe Ausbeute - Geringe Enantioselektivität Mikrobielle Fermentation - Ganzzellkultur (z.b. E. herbicola) - Tyrosinase - Tyrosin-Phenol- Lyase - PHAH - Kommerziell eingesetzter Prozess - Höhere Substratkonzentrati on notwendig - Komplizierte Aufreinigung aus dem Kulturmedium - Lange Reaktionsdauer - Geringe Umsatzrate/ Produktivität Biokatalytische Umwandlung - Immobilisierte Enzyme - Tyrosinase (Cresolase-Aktivität) - Single-step Prozess - Wiederverwendbar er immobilisierter Biokatalysator - Sofortige Oxidation zu DOPAquinon - Reduzierende Agenzien oder elektrische Kraft zur Reduktion benötigt 6