Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia legendi für das Fachgebiet Lebensmitteltoxikologie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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1 Aus der Zentrumsabteilung für Lebensmitteltoxikologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für Antibiotika und Antiparasitika in Umwelt- und Lebensmittelproben Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia legendi für das Fachgebiet Lebensmitteltoxikologie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover Vorgelegt von Dr. rer. nat. Gerd Hamscher aus Idar-Oberstein Hannover 2003

2 Nicht öffentliche wissenschaftliche Aussprache:

3 Inhaltsverzeichnis 3 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 5 Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind 7 1 Einleitung und Problemstellung Einsatz von Human- und Tierarzneimitteln Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt Neue Eintragswege für Tierarzneimittel und antiparasitär wirksame Substanzen in die Umwelt 13 2 Forschungsbedarf 14 3 Zusammenfassung der Ergebnisse Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für Antibiotika in Umwelt- und Lebensmittelproben HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren für Tetracycline und Tylosin in Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben Weiterentwicklung der Probenahme für Wasserproben und räumliche und zeitliche Ausdehnung der Felduntersuchungen Kopplung HPLC/mikrobiologischer Assay und ESI-MS-MS zum Nachweis von Tetracyclinen in Umweltmatrices und Hühnereiern HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren für Sulfonamide in Gülle, Boden, Sickerund Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren zum Nachweis von Tetracyclinen, Tylosin, Sulfonamiden und Chloramphenicol in Stallstaub und Untersuchungen von Feldproben Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für Antiparasitika in Lebensmittel- und Umweltproben HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Carbamates Propoxur in Hühnereiern, Luft- und Staubproben HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Thiophosphorsäureesters Phoxim in Hühnereiern HPLC-DAD-Verfahren zum Nachweis des Pyrethroides Deltamethrin in Hühnereiern 33

4 Inhaltsverzeichnis 4 4 Zusammenfassende Diskussion der Ergebnisse Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt Eintrag von Tierarzneimitteln in die Gülle Eintrag von Tierarzneimitteln in den Boden Eintrag von Tierarzneimitteln in das Sicker- und Grundwasser Eintrag von Tierarzneimitteln in den Stallstaub Mögliche Risiken durch den Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt Problematik der Bekämpfung der Roten Vogelmilbe (Dermanyssus gallinae) in der Legehennenhaltung 43 5 Zusammenfassung 45 6 Summary 46 7 Literaturverzeichnis 47 8 Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Arbeiten 52 9 Ausführliche Darstellung der Ergebnisse (Publikationen 1 8) 55

5 Abkürzungsverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ACN Acetonitril BDF(s) Boden-Dauerbeobachtungsfläche(n) BLAC Bund-/Länderausschuß Chemikaliensicherheit C Grad Celcius ca. circa C18 Octadecyl-Rest cm Zentimeter CTC Chlortetracyclin DAD Diodenarray-Detektion EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products ESI Elektrospray-Ionisation EU Europäische Union EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft FEDESA European Federation of Animal Health g Gramm GÜN Gewässerüberwachungsnetz Niedersachsen HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography) HPLC-DAD Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Diodenarray-Detektion HPLC-MS-MS Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie HPLC-MS Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie kg Kilogramm L Liter λ Wellenlänge m Meter M Molar m/z Masse/Ladungs-Verhältnis

6 Abkürzungsverzeichnis 6 m 3 mg Kubikmeter Milligramm µg Mikrogramm min Minute ml Milliliter µl Mikroliter mm Millimolar MRL maximum residue limit MS Massenspektrometrie MS-MS Tandemmassenspektrometrie [M+H] + protoniertes Molekülion n Anzahl N Stickstoff ng Nanogramm nm Nanometer OTC Oxytetracyclin PEC erwartete Umweltkonzentration (predicted environmental concentration) ph negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität RP Umkehrphase (reversed-phase) RSA relative Standardabweichung SDB Styroldivinylbenzolphase t Tonne Tab. Tabelle TC Tetracyclin UBA Umweltbundesamt UMK Umweltministerkonferenz UV Ultraviolett vol Volumen

7 Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind 7 Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind Publikation 1: Hamscher G, Sczesny S, Abu-Qare A, Höper H, Nau H (2000): Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich hormonell aktiver Substanzen in der Umwelt: Erster Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 107, Publikation 2: Hamscher G, Sczesny S, Höper H, Nau H (2002): Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by highperformance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry 74, Publikation 3: Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H (2003): Abschlussbericht des UBA-Forschungsprojektes Tierarzneimittelanalysen gemäß BLAC- Untersuchungsprogramm (FKZ ). Eingereicht: Umweltbundesamt (Juni 2003) Publikation 4: Höper H, Kues J, Nau H, Hamscher G (2002): Eintrag und Verbleib von Tierarzneimittelwirkstoffen in Böden. Bodenschutz 7, Publikation 5: Hamscher G, Pawelzick HT, Höper H, Nau H (2003): Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after repeated fertilization with liquid manure. Eingereicht: Environmental Toxicology and Chemistry (September 2003)

8 Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind 8 Publikation 6: Sczesny S, Nau H, Hamscher G (2003): Residue Analysis of tetracyclines and their metabolites in eggs and in the environment by HPLC coupled with a microbiological assay and tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, Publikation 7: Hamscher G, Pawelzick HT, Sczesny S, Nau H, Hartung J (2003): Antibiotics in dust originating from a pig fattening farm: a new source of health hazard for farmers? Environmental Health Perspectives 111, Publikation 8: Hamscher G, Prieß B, Hartung J, Nogossek MI, Glünder G, Nau H (2003): Determination of propoxur residues in eggs with HPLC-DAD after treatment of stocked housing facilities for the poultry red mite (Dermanyssus gallinae). Analytica Chimica Acta 483,

9 1 Einleitung und Problemstellung 9 1 Einleitung und Problemstellung Die Gesunderhaltung von Tieren sowie die Produktion hochwertiger tierischer Lebensmittel in der heutigen Quantität wäre ohne den gezielten Einsatz von Tierarzneimitteln nicht zu gewährleisten. Die rechtlichen Anforderungen an Tierarzneimittel sind hoch. Seit 1978 müssen Tierarzneimittel, die neu auf den Markt kommen sollen, einem aufwändigen Zulassungsverfahren unterworfen werden. Einerseits müssen die Qualität des pharmazeutischen Erzeugnisses, die Wirksamkeit sowie die Unbedenklichkeit vom Hersteller nachgewiesen werden. Andererseits muss bei Tierarzneimitteln, die bei lebensmittelliefernden Tieren eingesetzt werden sollen, der Schutz des Verbrauchers vor gesundheitlich bedenklichen Rückständen dieser Stoffe im Lebensmittel gewährleistet sein. Werden diese Anforderungen nicht erfüllt, so wird einer Zulassung nicht statt gegeben (Kietzmann 2003). Darüber hinaus müssen Arzneimittel auch hohe Anforderungen an die Stabilität im Organismus, an die Resorbierbarkeit und vor allem hinsichtlich ihrer Wirksamkeit erfüllen. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es jedoch auch möglich, dass Arzneimittel nach einer mehr oder wenigen starken Metabolisierung im Organismus ausgeschieden werden und in die Umwelt gelangen können. Mögliche Folgen sind: Die chemische Stabilität eines Arzneimittels im Organismus kann dann zur Persistenz in der Umwelt führen. Die mehr oder weniger gute Wasserlöslichkeit von Arzneimitteln oder deren Metaboliten bedingt eine gewisse Mobilität in der aquatischen Umwelt. Die erwünschte Wirkung eines Arzneimittels (z. B. an einem Rezeptor) kann zu toxischen Wirkungen an dafür nicht vorgesehenen Zielorten von Organismen in der Umwelt führen. Obwohl Arzneimittel schon seit Jahrzehnten in großen Mengen in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden, war bis Anfang der 90er Jahre nur sehr wenig bekannt über Vorkommen, Verteilung und Verhalten dieser Stoffe in der Umwelt. In der Zwischenzeit sind insbesondere für den Bereich der Humanarzneimittel viele Arbeiten erschienen, die dazu beigetragen haben, diese Wissenslücken zu schließen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Substanzen insbesondere über den Weg Abwasser-Kläranlage-Oberflächengewässer in das Grundwasser und auch in das Trinkwasser gelangen können. Relevante Substanzgruppen sind Antibiotika (z. B. Erythromycin, Sulfamethoxazol), Antiphlogistika (z. B. Diclofenac, Ibupro-

10 1 Einleitung und Problemstellung 10 fen, Naproxen), Arzneistoffe mit hormonellen Wirkungen, Lipidsenker (z. B. Clofibrinsäure, Bezafibrat), Psychopharmaka und Zytostatika. Die ermittelten Konzentrationen (unterer µg/l bis ng/l-bereich) liegen in der Regel deutlich unterhalb der pharmakologisch wirksamen Dosis dieser Substanzen. Allerdings können ökotoxikologische Wirkungen, insbesondere bei synthetischen Hormonen, nicht ausgeschlossen werden (umfassende Übersichten geben Daughton und Ternes 1998, Heberer 2002, Kümmerer 2001, Sattelberger 1999). Im Bereich der Tierarzneimittel sind bis heute nur wenige Arbeiten durchgeführt worden, allerdings ist auch hier die Umweltrelevanz dieser Substanzen erkannt worden. Diskutiert werden in diesem Zusammenhang neben rein toxischen Wirkungen auch die Induktion bzw. Verbreitung von Antibiotikaresistenzen und ein möglicher Einfluß auf die Zusammensetzung von mikrobiologischen Lebensgemeinschaften im Boden (Halling-Sørensen et al. 1998). Erkenntnisse insbesondere über den Eintrag und das Verhalten der mengenmäßig bedeutendsten Tierarzneimittel in der Umwelt können nur gewonnen werden, wenn die Entwicklung neuer selektiver und sensitiver spurenanalytischer Nachweisverfahren für diese Substanzen vorangetrieben wird. 1.1 Einsatz von Human- und Tierarzneimitteln Arzneimittel zählen zu den Stoffen, die in beträchtlichen Mengen hergestellt und demzufolge auch in bedeutendem Maße in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden. Von der Europäischen Förderation für Tiergesundheit (FEDESA) liegen Zahlen für den Antibiotika- Einsatz in der Tierhaltung und der Humanmedizin für die Jahre 1997 und 1999 für die EU- Mitgliedsstaaten und die Schweiz vor (siehe Tabelle 1). Im Jahr 1999 kamen in der Tierhaltung t Antibiotika-Wirkstoffe zum Einsatz, davon wurden ca t als Tierarzneimittel und ca. 800 t als Futterzusatzstoffe (Leistungsförderer) verwendet. Der Verbrauch an Antibiotika in der Humanmedizin war 1999 mit t knapp doppelt so hoch (Anonymus 2001). Nach Angaben der FEDESA für 1997 machte die Wirkstoffgruppe der Tetracycline bei den Tierarzneimitteln mit t fast zwei Drittel der eingesetzten antimikrobiell wirksamen Substanzen aus, es folgen Makrolid-Antibiotika (424 t), -Laktame (322 t) und Aminoglykoside (154 t). Erhebungen in Deutschland (basierend auf Herstellungsaufträgen für Fütterungsarzneimittel) über den Einsatz von Tierarzneimitteln in der Region Weser-Ems, Brandenburg und Schleswig-Holstein zeigen ähnliche Verbrauchsmuster, allerdings werden hier als zweit-

11 1 Einleitung und Problemstellung 11 häufigste Gruppe Sulfonamide genannt (Broll et al. 2002, Kratz et al. 2001, Winckler und Grafe 2000). Diese Zahlen werden auch durch eine vergleichbare Erhebung aus Kenia bestätigt: hier wurden im Mittel der Jahre insbesondere Tetracycline (54,7%) und Sulfonamide (21,3%) eingesetzt (Mitema et al. 2001). Der weltweite Einsatz vor allem dieser beiden Substanzklassen läßt sich nahezu ausschließlich mit den sehr günstigen Preisen dieser Mittel erklären. Der therapeutische Nutzen ist aufgrund der ausgeprägten Resistenzen gegenüber Tetracyclinen und Sulfonamiden umstritten, oftmals wird nur noch bei höherer Dosierung eine Wirkung erzielt (Löscher et al. 1999). Tab. 1: Antibiotika-Einsatz in der EU in den Jahren 1997 und 1999 (FEDESA). Einsatzgebiet Veränderung t % t % % Tierarzneimittel , ,5 + 11,7 Antibiotische Futtermittelzusatzstoffe (Leistungsförderer) , ,9-50,8 Humanarzneimittel , ,6 + 11,3 Gesamt , ,0 + 3,6 1.2 Eintrag von Tierarzneimitteln in die Umwelt Es ist aus verschiedenen Untersuchungen bekannt, dass Tetracycline und Sulfonamide nach Applikation teilweise metabolisiert und innerhalb von 7 10 Tagen nahezu vollständig ausgeschieden werden und so in die Exkremente gelangen können (Berger et al. 1986, Kroker et al. 1983, Langhammer et al. 1989, Winckler und Grafe 2000). Sulfonamide liegen zu ca. 50% als ihre N 4 -Acetyl-Derivate vor, die aber in der Gülle während des Lagerungsprozesses durch Mikroorganismen gespalten werden können und so den originären Wirkstoff wieder freisetzen (Langhammer 1989). Tetracycline hingegen werden zum größten Teil unmetabolisiert ausgeschieden (Winckler und Grafe 2001). Im Gegensatz zu Humanarzneimitteln, bei denen der Eintrag in die Umwelt wie bereits erwähnt hauptsächlich über Kläranlagenabflüsse in die Oberflächengewässer erfolgt, ist für

12 1 Einleitung und Problemstellung 12 Tierarzneimittel der Eintragsweg über die Gülle in den Boden und dann möglicherweise mit dem Sickerwasser in das Grundwasser von höchster Relevanz (siehe Abbildung 1). Grundwasser Mensch, Tier?? Arzneimittel Aquakultur Lokale Kläranlagen von Fischfarmen Ausbringen von Gülle oder Klärschlamm Effekte auf Bodenlebewesen Arzneimittel zur Behandlung von Tierbeständen Exkremente auf landwirtschaftlichen Nutzflächen Auswaschung Arzneimittel als Leistungsförderer oder Kokzidiostatika Gülletank Oberflächengewässer Grundwasser Effekte auf Wasserlebewesen Exposition Deposition Effekte Abb. 1: Mögliche Eintragspfade für Tierarzneimittel in die Umwelt (modifiziert nach Jørgensen und Halling-Sørensen 2000). Legt man die von Winckler und Grafe (2000) erhobenen Verbrauchsmengen zugrunde, so wäre bei einem gleichmäßigen Eintrag von Tetracyclinen in die landwirtschaftliche Nutzfläche der Region Weser-Ems mit Konzentrationen von ca. 5 µg/kg Tetracyclin und 9 µg/kg Chlortetracyclin im Bereich der Ackerkrume (0 30 cm) zu rechnen. Berechnungen dieser Autoren basierend u. a. auf einer praxisüblichen Behandlung eines Mastschweinebestandes mit einem tetracyclinhaltigen Fütterungsarzneimittel und anschließender Lagerung der Gülle über einen Zeitraum von 180 Tagen ergaben, dass nach Gülleausbringung eine lokale Tetracyclinkonzentration in den ersten 5 cm des Bodens von bis zu 166 µg/kg zu erwarten ist.

13 1 Einleitung und Problemstellung Neue Eintragswege für Tierarzneimittel und antiparasitär wirksame Substanzen in die Umwelt Die in Abbildung 1 dargestellten möglichen Eintragswege für Tierarzneimittel stellen in quantitativer Hinsicht gesehen die bedeutendsten dar und stehen daher auch im Mittelpunkt des gegenwärtigen Forschungsinteresses. Im Rahmen der landwirtschaftlichen Produktion entstehen insbesondere in der Schweine- und Geflügelmast nicht nur enorme Mengen an Gülle bzw. Geflügelmist. In der Regel fallen auch hohe Mengen an Stäuben an (Hartung et al und 1998, Pederson et al. 2000), die über die Ablufteinrichtungen der Ställe in die Umwelt gelangen können (Hartung et al. 1995, Seedorf und Hartung 2002). Stäube aus der landwirtschaftlichen Produktion sind seit vielen Jahren bekannt als eine Quelle zahlreicher unerwünschter Stoffe wie z. B. Mykotoxine, Endotoxine, Viren, und Milbenbestandteile (Hartung 1997) und werden daher als gesundheitliches Risiko eingestuft (Iversen et al. 2000, Nowak 1998, Platz et al. 1995, Radon et al. 2002). Inwieweit dieser Eintragsweg auch für Tierarzneimittel und antiparasitär wirksame Stoffe von Relevanz ist, wurde bislang nicht untersucht. Die Rote Vogelmilbe (Dermanyssus gallinae) ist derzeit der wirtschaftlich wichtigste Ektoparasit in der Legehennenhaltung in vielen europäischen Ländern (Chauve 1998) einschließlich Deutschland (Iburg et al. 1998). Es wird intensiv nach Wirkstoffen gesucht, die einerseits die direkte Bekämpfung des Parasiten im belegten Stall ermöglichen und andererseits keine bzw. toxikologisch unbedenkliche Rückstände im Hühnerei verursachen. Ein wesentliches Problem in der Bekämpfung besteht darin, dass die Parasiten nach einer Blutmahlzeit in ihre Verstecke zurückkehren (Nordenfors et al. 2001). Daher besteht eine wesentliche Strategie der Bekämpfung darin, die Verstecke der Milben gezielt zu besprühen. Diese Art der Behandlung beinhaltet zwei mögliche Risiken: einerseits eine Exposition der Tiere und somit eine Kontamination der hieraus gewonnenen Lebensmittel, andererseits einen Eintrag in die Umwelt. Dies könnte nach Entwicklung geeigneter Analyseverfahren durch die Untersuchung von Eiern, Luft- und Staubproben vor und nach der Behandlung im belegten Stall untersucht werden.

14 2 Forschungsbedarf 14 2 Forschungsbedarf Aus dem in den Kapiteln dargelegten Schrifttum ließen sich daher folgende Ansätze für eigene Forschungsarbeiten ableiten: Es fehlte an geeigneten analytischen Verfahren zur Bestimmung von Tierarzneimitteln in den unterschiedlichsten Umweltmatrices. Unter Berücksichtigung der Erhebungen zum Einsatz von Tierarzneimitteln in der Region Weser-Ems (Winckler und Grafe 2000) war die Entwicklung spurenanalytischer Nachweisverfahren insbesondere für die mengenmäßig bedeutendsten Substanzklassen der Tetracycline und Sulfonamide in Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser als Grundlage für eine Expositionserfassung prioritär durchzuführen. Die Frage, ob neben den Muttersubstanzen auch antimikrobiell aktive Metabolite existieren war für eine umfassendere Expositionsabschätzung von hoher Relevanz. Hierzu musste neben den physikalisch-chemischen Analysenverfahren auch ein funktioneller Assay entwickelt werden, der einen wirkungsbezogenen Nachweis dieser Substanzen z. B. nach Extraktion und chromatographischer Auftrennung ermöglichte. Mittels dieser neuen Nachweisverfahren mussten die Eintragspfade Gülle, Boden, Sickerund Grundwasser systematisch untersucht und die wichtigsten Tierarzneimittel quantifiziert werden. Die Durchführung von kontrollierten Felduntersuchungen in Regionen mit intensiver Tierhaltung zur Beurteilung der räumlichen Verteilung und dem Verhalten von Tierarzneimitteln waren hierfür besonders geeignet. Eine weitere wesentliche Grundlage der durchzuführenden Arbeiten stellte das Erfassen verfügbarer und repräsentativer Standorte dar. Im Rahmen des Niedersächsischen Programmes zur Boden-Dauerbeobachtung (Kleefisch und Kues 1997) konnten solche Flächen beispielsweise in der Region Weser-Ems beprobt werden. Boden-Dauerbeobachtungsflächen stellen eine ideale Forschungsplattform dar, um den Eintrag, das Verhalten und gegebenenfalls auch die Effekte von Tierarzneimitteln auf Böden zu untersuchen.

15 2 Forschungsbedarf 15 Auch für die Bestätigung positiver Rückstandsbefunde von Tetracyclinen in Lebensmitteln stehen in der Regel nur sehr aufwändige Probenvorbereitungsverfahren zur Verfügung. Hier war es sinnvoll zu prüfen, ob sich die für die Umweltanalytik etablierten Verfahren auch für die Lebensmittelanalytik einsetzen lassen. Erste Untersuchungen von Langhammer et al. (1989) zeigten, dass auch hohe Sulfonamideinträge über die Gülle im Boden schon nach kurzer Zeit nur Rückstände im Bereich weniger µg/kg Boden hinterließen. Ein möglicher Eintrag von Sulfonamiden in das Grundwasser wurde von dieser Gruppe daher nicht untersucht, da auch keine hinreichend empfindlichen Methoden für die Grundwasseranalytik zur Verfügung standen. Diesem Umweltkompartiment sollte in neuen Untersuchungen mit sensitiven Analysenverfahren besonderes Interesse gelten. Darüber hinaus schien auch die Untersuchung bislang nicht berücksichtigter Eintragspfade wie z. B. Stäube aus der Tierhaltung sinnvoll. Allerdings war auch hier eine wesentliche Grundvoraussetzung die Bereitstellung entsprechender Untersuchungsverfahren für die Matrix Staub. Eine weitere wichtige Voraussetzung war die Bereitstellung adäquaten Probenmaterials. Hier bestand die Möglichkeit, in den Jahren gesammelte Staubproben retrospektiv auf verschiedene Antibiotika hin zu untersuchen. Der Einsatz des Biozids Propoxur in der Bekämpfung der Roten Vogelmilbe kann einerseits Rückstände in Lebensmitteln und andererseits in der Umwelt hinterlassen. Bislang lagen keine systematischen Untersuchungen zu dieser Problematik vor. Daher war es sinnvoll, spurenanalytische Nachweisverfahren für Propoxur in Hühnereiern und in verschiedenen Umweltmatrices aufzubauen. Mittels kontrollierter Studien konnten darüber hinaus auch der Einfluss unterschiedlicher Haltungsformen für Legehennen auf das Rückstandsverhalten von Propoxur untersucht werden. Organische Phosphorsäureester und Pyrethroide stellen ebenfalls Substanzklassen dar, die zur Bekämpfung der Roten Vogelmilbe prinzipiell eingesetzt werden könnten. Für zwei geeignete Vertreter dieser Substanzklassen, Phoxim und Deltamethrin, war es sinnvoll zu prüfen, ob sich das für Propoxur etablierte Verfahren gegebenenfalls auch für den spurenanalytischen Nachweis dieser beiden Substanzen einsetzen ließ.

16 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 16 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 3.1 Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für Antibiotika in Umwelt- und Lebensmittelproben HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren für Tetracycline und Tylosin in Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben (siehe Publikation 1: Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich hormonell aktiver Substanzen in der Umwelt: Erster Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden und Publikation 2: Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry) Ein wesentliches Ergebnis der vorliegenden Arbeit stellt die Entwicklung eines HPLC-ESI- MS-MS-Verfahrens zum Nachweis von Tetracyclinen in verschiedenen Umweltmatrices wie Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser dar (Publikationen 1 und 2). Gülle, Boden und Sickerwasser stellen sehr anspruchsvolle Probenmatrices dar, für die es bislang zum Nachweis von Antibiotika keine spurenanalytischen Verfahren mit den hier erreichten Nachweisgrenzen gab. Als Methode der Wahl empfahl sich nach adäquater Probenvorbereitung der Einsatz der Hochleistungsflüssigkeitschronmatographie gekoppelt mit der Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS-MS). Da hierdurch ein sensitives und durch den Einsatz der Tandem-Massenspektrometrie auch ein hochselektives Detektionssystem zur Verfügung stand, konnten relativ einfache aber effektive Extraktionsverfahren für Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser entwickelt und eingesetzt werden. Tetracycline stellen analytisch schwer erfassbare Substanzen dar. Dies ist einerseits bedingt durch ihre Fähigkeit mit mehrfach geladenen Kationen wie Calcium, Magnesium, Aluminium und Eisen Chelate zu bilden. Andererseits wurde auch die Wechselwirkung mit Silanolgruppen, beispielsweise an Glasoberflächen oder an chromatographischen Trennsäulen, beschrieben (Oka et al. 2000). Dies kann zu großen Analytverlusten im Rahmen der Probenvorbereitung führen. Daher war eine Strategie in der Probenvorbereitung, die Zahl der Probenvorbereitungsschritte auf ein Mindestmaß zu reduzieren. Darüber hinaus mussten auch die adsorptiven Eigenschaften der Tetracycline im ganzen Analysenverfahren Berücksichtigung finden.

17 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 17 Diese Ziele wurden u. a. dadurch erreicht, dass alle Glaswaren, die im Zuge der Probenvorbereitung mit Tetracyclinen in Berührung kamen, mit einer gesättigten EDTA-Methanol-Lösung vorbehandelt wurden. Darüber hinaus wurden alle Glaswaren vor jeder Verwendung bei 450 ºC ausgeheizt, um organische Verunreinigungen zu zerstören aber auch um etwaige freie Silanolgruppen an den Glasoberflächen wieder zu vernetzen (Oehme 1998). Weitere Maßnahmen, die ergriffen werden mussten, um eine Adsorption der Tetracycline an Oberflächen zu verhindern, ist der Einsatz eines sehr sauren Fließmittels (0,5% Ameisensäure, ph 2,5), die Verwendung von endcap-säulenmaterialien und darüber hinaus der Einsatz einer speziellen Spüllösung für den eingesetzten Autosampler. Als optimal erwies sich eine Lösung von 1 mm Oxalsäure in Methanol/Wasser (90/10, vol/vol). Der Zusatz von Oxalsäure dient dazu, eine Adsorption von Tetracyclinen an die Leitungen des Autosamplers sowie ein mögliches Verschleppen (carryover) von Tetracyclinen nach Mehrfachinjektionen zu verhindern. Da eine reproduzierbare Extraktion der Tetracycline mittels (angesäuerter) organischer Lösungsmittel wie Methanol oder Essigsäureethlyester aus dem Boden nicht etabliert werden konnte, wurden die Bodenproben in Anlehnung an ein Verfahren nach Cooper et al. (1998) zur Bestimmung von Tetracyclinen im Hühnerei extrahiert. Die Bodenprobe wurde zunächst sorgfältig durchmischt, mit Citratpuffer bei ph 4,7 aufgeschlämmt und anschließend zweimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Überstände wurden zur Trockene eingedampft und in einer Lösung von 10 mm Ammoniumacetat in Acetonitril/Wasser (90/10, vol/vol) aufgenommen. Mit dem neuentwickelten Verfahren ist eine deutliche Absenkung der Nachweisgrenzen und damit ein direkter Nachweis der Tetracycline in Boden und Sickerwasser möglich (Publikationen 1 und 2). Durch die so modifizierte Extraktionsmethode konnte eine hohe Wiederfindungsrate von 69,2% für Chlortetracyclin und 74,2% für Oxytetracyclin erreicht werden. Die Wiederfindungsrate für Tetracyclin liegt für die untersuchten Sandböden mit 37,7% allerdings deutlich niedriger (Publikation 2). Die relative Standardabweichung lag bei diesen Versuchen im Bereich von µg/kg im Mittel unter 20% und ist unter Berücksichtigung der komplexen Matrix und der erreichten Bestimmungsgrenze von 5 µg/kg als sehr gut anzusehen. Gülleproben konnten mit der gleichen Aufarbeitungsprozedur wie Bodenproben untersucht werden. Da in dieser Matrix mit deutlich höheren Antibiotikagehalten als im Boden zu rechnen war, konnte auf eine Anreicherung der Analyten verzichtet werden. Die mittleren Wiederfindungsraten sind im Bereich von 0,2 1 mg/kg für alle Tetracycline nahezu 100%; die relativen Standardabweichungen liegen im Mittel sogar deutlich unter 10% (siehe Publikation 2).

18 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 18 Die Sicker- und Grundwasserproben wurden über Festphasenextraktion an einer Styroldivinylbenzolphase (SDB 1) angereichert. Diese Polymerphase bietet einerseits den Vorteil, dass keine Silanolgruppen vorhanden sind und sich andererseits störende Huminstoffe zumindest teilweise abtrennen lassen (Pichon et al. 1996). Auch konnte bei dieser Phase durch einen Waschschritt mit einem geringen Volumen Methanol eine effiziente Verbesserung der Probenvorreinigung erreicht werden, da eine vollständige Elution der Tetracycline nur mit essigsaurem Methanol möglich ist. Die Wiederfindungen sind im Bereich von 0,2 1,0 µg/l deutlich besser als im Boden, auch liegen die relativen Standardabweichungen im Mittel unter 20% (siehe Publikation 2). Die qualitative und quantitative Bestimmung der Antibiotikarückstände erfolgte bei allen Matrices nach HPLC-Trennung an einer RP-C18-Phase und Gradientenelution mittels Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS-MS, System: LCQ, Thermo-Finnigan). Nach chromatographischer Trennung der Substanzen wurden diese in einem Elektrospray-Interface ionisiert und nach Separation des Molekülions in einer Ionenfalle fragmentiert. Tetracycline zeigen unter diesen Bedingungen charakteristische Fragmentierungen. Sie resultieren aus dem Verlust eines Wasser- (-18 Masseneinheiten) bzw. eines Ammoniakmoleküls (-17 Masseneinheiten) und beider Moleküle (-35 Masseneinheiten). In Abbildung 3 der Publikation 2 sind in der linken Spalte die aus diesen Fragmenten rekonstruierten Ionenchromatogramme dargestellt und in der rechten Spalte die erhaltenen Massenspektren. Zu erkennen sind darüber hinaus noch ca. 5% des eigentlich fragmentierten protonierten Molekülions (im Spektrum ganz rechts, als [M+H] + dargestellt), auch dieses Ion kann zur Identifizierung herangezogen werden. Die dabei erhaltenen relativen Intensitäten der Fragmentionen sind für die Verbindungen charakteristisch und werden neben der Retentionszeit für eine eindeutige Identifizierung der Substanzen herangezogen. Darüber hinaus konnte in Publikation 2 am Beispiel des Nachweises von Tetracyclin und seinem Epimer in Gülle mittels MS 3 (= MS-MS-MS)-Techniken erstmalig gezeigt werden, dass durch diese multiple Massenspektrometrie hochselektive Spektren generiert werden können, die bislang nicht bekannte Identifizierungsmöglichkeiten dieser Substanzen gewährleisten. Dieses Nachweisverfahren lässt sich nur in Massenspektrometern basierend auf der Ionenfallen-Technologie durchführen: hierbei wird ein Ion, das aus einem tandenmassenspektrometrischen (= MS-MS) Experiment stammt, isoliert und erneut fragmentiert. Diese Technik könnte auch für die Bestätigungsanalytik von Tetracyclinrückständen in Lebensmitteln wertvolle Dienste leisten.

19 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 19 Da die Gülle den ersten Eintragspfad für Tierarzneimittel in die Umwelt darstellt, wurden für verschiedene BDFs die korrespondierenden Feldproben untersucht. In sieben von acht Proben (fünf Schweinegülleproben, zwei Kälbergülleproben, eine Hühnermistprobe) wurden mittels HPLC-ESI-MS-MS Tetracyclin und Chlortetracyclin in einer maximalen Konzentration von 45,3 mg/kg nachgewiesen (siehe Tabelle 1 in Publikation 4). Darüber hinaus lassen sich mit diesem hochselektiven Verfahren auch Epimerisierungs- und biologisch nicht aktive Abbauprodukte der Tetracycline (iso-verbindungen) nachweisen. Tylosin konnte in den Proben nicht nachgewiesen werden. Mit den entwickelten MS-MS-Verfahren konnten erstmalig Rückstände von Tetracyclin und Chlortetracyclin in güllegedüngten Ackerböden nachgewiesen werden (Publikation 1). In dieser Pilotstudie konnte gezeigt werden, dass Tetracycline in signifikanten Konzentrationen (über 10 µg/kg) in zehn von zwölf untersuchten Flächen vorlagen. Es wurde auch festgestellt, dass in den mit Schweinegülle beaufschlagten Flächen tendenziell höhere Konzentrationen zu finden waren als in den mit Rindergülle gedüngten. Ein weiterer Befund dieser Studie war, dass Tetracycline Persistenz in der Umwelt zeigen, da die Begüllung der untersuchten Fläche bereits 4 5 Monate zurücklag. Eine Verlagerung dieser Stoffe in tiefere Bodenschichten (40 90 cm) bzw. in das Sicker- und Grundwasser konnte oberhalb der Nachweisgrenzen des Verfahrens (1 µg/kg Boden, 0,05 µg/l Wasser) nicht festgestellt werden. Basierend auf dieser Pilotstudie erfolgten weitere Felduntersuchungen. Eine regelmäßig mit Schweinegülle beaufschlagte Fläche wurde in vier verschiedenen Kernzonen jeweils im Mai der Jahre 2000 und 2001 sowie im November 2000 untersucht (siehe Publikation 2). Die individuelle Untersuchung der vier Kernflächen zeigte, dass Tetracyclin und Chlortetracyclin durch die praxisübliche Gülleausbringung relativ gleichmäßig über das ganze Feld verteilt wurden. Mittels dieser Untersuchungen konnte darüber hinaus nicht nur gezeigt werden, dass Tetracycline im Boden nur langsam abgebaut werden: der relative Rückgang der Tetracyclinkonzentration von Mai 2000 nach November 2000 betrug 23%. Nach erneuter Zufuhr tetracyclinhaltiger Gülle im Mai 2001 wurde auch eine Akkumulation dieser Substanzen im Boden nachgewiesen (Publikation 2).

20 3 Zusammenfassung der Ergebnisse Weiterentwicklung der Probenahme für Wasserproben und räumliche und zeitliche Ausdehnung der Felduntersuchungen (siehe Publikation 3: Abschlussbericht des UBA-Forschungsprojektes Tierarzneimittelanalysen gemäß BLAC-Untersuchungsprogramm (FKZ )) Die in den Publikationen 1 und 2 durchgeführten Studien lieferten bereits wichtige Erkenntnisse über das Vorkommen und das Verhalten von Tetracyclinen in der Umwelt. Das Projekt Ermittlung von Tierarzneimittelkonzentrationen in Gülle, Böden und Grundwasser im Rahmen des Bund-/Länder Untersuchungsprogramms Arzneimittel in der Umwelt Konzept für ein Untersuchungsprogramm UMK-Beschluss vom 27./28. Oktober 1999 sollte daher das bislang erhobene Datenmaterial bezüglich des Vorkommens von Tetracyclinen in Gülle, Böden und Grundwasser sowohl in zeitlicher als auch in räumlicher Hinsicht auf eine breitere Basis stellen. Ein weiteres Ziel dieses Projektes war die Optimierung der Probenahme speziell für Tetracycline in Sicker- und Grundwasser. Zur Erfassung der Stoffströme wurden zwei landwirtschaftliche Nutzflächen aus dem niedersächsischen Programm zur Boden-Dauerbeobachtung, die mit unterschiedlichen Wirtschaftsdüngern beaufschlagt wurden, ausgewählt. Über einen Zeitraum von 18 Monaten wurden Ober- und Unterboden (0 90 cm) in 10-cm-Segmenten sowie Grundwasser und Gülle beprobt und auf Oxytetracyclin, Tetracyclin und Chlortetracyclin untersucht. Die Bodenuntersuchungen wurden darüber hinaus um vierzehn weitere Flächen der gleichen Region erweitert. Für den Standort BDF 01, der überwiegend mit Schweinegülle beaufschlagt wurde, ließen sich sehr hohe Tetracyclinkonzentrationen nachweisen, wohingegen die Chlortetracyclinkonzentrationen meist nahe der Bestimmungsgrenzen lagen. Dieses Rückstandsprofil blieb über den gesamten Untersuchungszeitraum erhalten und spiegelt in qualitativer Hinsicht auch die Zusammensetzung der aufgebrachten Gülle wieder. Die Untersuchungen zeigten darüber hinaus, dass diese landwirtschaftliche Nutzfläche langfristig mit beträchtlichen Tetracyclinkonzentrationen exponiert war. Die persistenten Tetracyclinkonzentrationen im Oberboden (0 30 cm) lagen während der 18 Monate im Mittel bei ca. 160 µg/kg und damit über den gesamten Untersuchungszeitraum oberhalb des EMEA-Triggerwertes für Ökotoxikologie von 100 µg/kg. Bei Überschreitung dieses Triggerwertes im Boden sind seit dem 1. Juni 2001 bei der Zulassung von neuen Tierarzneimitteln weitergehende ökotoxikologische Untersuchungen zum Verhalten dieser Stoffe in der Umwelt erforderlich. Betrachtet man die Werte der Einzelproben, so lassen sich lokale Maxima ermitteln, die 500 µg/kg überschreiten. Aufgrund

21 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 21 des Unterpflügens frisch ausgebrachter Gülle ist jedoch in der Regel von einer relativ homogenen Verteilung der Tetracyclinrückstände in der gesamten Fläche und über die Tiefe in der Ackerkrume auszugehen. Ein Vergleich der Probengehalte von Juni und November 2002 zeigt einen Rückgang der mittleren Tetracyclinkonzentrationen um 37% bzw. 60%. Ob biotische oder abiotische Abbaufaktoren hier eine Rolle spielen, kann zurzeit nicht beantwortet werden. Im Mittel lagen die Bodentemperaturen in den betrachteten Zeiträumen 2001 und 2002 bei etwa 15 C, einer Temperatur die offensichtlich einen gewissen Abbau zulässt. Die Temperaturabhängigkeit des Abbaus von Chlortetracyclin wurde 1994 von Gavalchin und Katz erstmalig beschrieben. Der Standort BDF 02, der mit einer Mischung aus Rinder- und Schweinegülle beaufschlagt wurde, weist eine deutlich niedrigere Belastung an Tetracyclin und Chlortetracyclin auf. Über den gesamten Untersuchungszeitraum liegt die mittlere Tetracyclinkonzentration bei 11 µg/kg und die mittlere Chlortetracyclinkonzentration bei 12 µg/kg. Obwohl die Belastung mit Tetracyclinen sehr viel geringer ist als bei Standort BDF 01, ist auch hier ein kontinuierlicher Eintrag und eine gewisse Persistenz von Tierarzneimittelrückständen im Boden feststellbar. Die Untersuchung von weiteren 14 Standorten aus der gleichen Region von BDF 01 und BDF 02 ergab ein Rückstandsprofil mit im Allgemeinen deutlich höheren Tetracyclinkonzentrationen als Chlortetracyclinkonzentrationen. Bezogen auf die Gesamtbelastung des Oberbodens an Tetracyclinen überschreitet eine Fläche wiederum deutlich den EMEA-Triggerwert von 100 µg/kg, 10 von 14 Flächen liegen zwischen µg/kg und nur eine Fläche liegt unter 10 µg/kg. Die Konzentrationen bei zwei von 14 Flächen liegen unter den Nachweisgrenzen von 1 µg/kg für Tetracyclin bzw. 2 µg/kg für Chlortetracyclin. Um die Probenahme im Bereich Sicker- und Grundwasser weiter zu optimieren, wurden drei Saugsonden (Keramik, Nylon, Borosilikat) und eine Grundwassersonde aus Teflon unter Laborbedingungen getestet. Obwohl insbesondere die Keramiksonde bei Einsatz von Pufferlösungen eine deutliche Adsorption der Tetracycline zeigte, wurden diese unter praxisnahen Bedingungen durch Matrixeffekte des verwendeten oberflächennahen Grundwassers annähernd kompensiert. Unter diesen Bedingungen zeigte die Nylon-Membran die besten Eigenschaften und war somit für die folgenden Sickerwasseruntersuchungen das Saugsondenmaterial der Wahl. Für die Gewinnung der Grundwasserproben erwiesen sich die bereits bei den Pilotstudien eingesetzten Teflonsonden als unproblematisch bzgl. der Sorption von Tetracyclinen (siehe Abbildungen 5 und 6 aus Publikation 3).

22 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 22 An den beiden Boden-Dauerbeobachtungsflächen, an denen umfangreiche Bodenuntersuchungen durchgeführt worden waren, wurden ebenfalls Grundwasseruntersuchungen vorgenommen. Die Probenahme erfolgte an drei bzw. vier verschiedenen Entnahmestellen in ca. 5 m Abstand, so dass eine repräsentative Probenahme über die Fläche gewährleistet war. Die hier untersuchte BDF 01 wird einschließlich der Pilotstudie nunmehr seit fast drei Jahren regelmäßig beprobt. Trotz einer hohen Exposition mit einer mittleren Tetracyclinkonzentration von ca. 160 µg/kg Boden, waren die Tetracyclinkonzentrationen in mittels Nylon- und Borosilikat-Saugsonden beprobtem Grundwasser auch in Frühjahr und Herbst 2002 stets unterhalb der Nachweisgrenze von 0,05 µg/l (siehe Tabellen 5 7 in Publikation 3). Aus Peilbrunnen gewonnenes, oberflächennahes Grundwasser wurde am Standort BDF 02 untersucht. Auch hier wurde trotz worst-case-bedingungen (oberflächennahes Grundwasser, Tiefe 2,5 m unter Flur) kein Übergang von Tetracyclinen in das Sicker- oder Grundwasser oberhalb der Nachweisgrenze von 0,05 µg/l nachgewiesen. Abschließend ist aufgrund der Untersuchungen in diesem Projekt festzustellen, dass Tetracycline nach Ausbringung über die Gülle insbesondere im humusreichen Oberboden adsorbiert werden und dort auch in verhältnismäßig hohen Konzentrationen persistieren. Ein Eintrag in den Unterboden oder in die aquatische Umwelt konnte im Rahmen dieser Feldstudien nicht festgestellt werden.

23 3 Zusammenfassung der Ergebnisse Kopplung HPLC/mikrobiologischer Assay und ESI-MS-MS zum Nachweis von Tetracyclinen in Umweltmatrices und Hühnereiern (siehe Publikation 6: Residue analysis of tetracyclines and their metabolites in eggs and in the environment by HPLC coupled with a microbiological assay and tandem mass spectrometry) Die Kopplung der HPLC mit einem immunologischen (z. B. Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay) oder einem funktionellen Assay (z. B. mikrobiologischer Assay) erlaubt in der Regel einen empfindlichen sowie sehr selektiven Nachweis von biologisch aktiven Substanzen wie Peptiden (siehe Feurle et al. 1992, Hamscher et al. 1996) oder Vitaminen (Nau und Belz 1998) im Bereich weniger Pikogramm Analyt. Darüber hinaus lassen sich auch biologisch aktive Metabolite dieser Stoffe nachweisen, die aufgrund auch von geringsten Polaritätsunterschieden flüssigkeitschromatographisch getrennt werden können. Nachdem eine HPLC-Trennung für die verschiedenen Tetracycline entwickelt war (Publikation 2), musste als ein wichtiger Schritt, die Probenvorbereitung auf die Matrix Hühnerei adaptiert werden. Die von Cooper et al. (1998) beschriebene Probenvorbereitung wurde dahingehend modifiziert, dass nach dem Zusatz von 1 M Citratpuffer bei ph 5 durch eine einfache Acetonitrilextraktion die Tetracycline in hohen Ausbeuten extrahiert werden konnten. Anschließend erfolgte die Kopplung mit einem mikrobiologischen Assay, der einen tetracyclinsensitiven staphylococcus aureus Stamm als Testkeim einsetzt. Die HPLC-Eluate wurden fraktioniert in Mikrotiterplatten gesammelt. Wichtig hierbei war wiederum auch, dass in den Vertiefungen der Platten zuvor eine Tween-20-Lösung vorgelegt wurde, um eine Adsorption der Tetracycline beim nachgeschalteten Lyophilisierungsschritt zu verhindern (Publikation 6). Die Bestimmungsgrenze des so etablierten Verfahrens wurde für die Matrix Hühnerei ermittelt. Ein sichere Bestimmung aller untersuchten Tetracycline gelang ab einer Konzentration von 150 µg/kg, d. h. Überschreitungen des derzeitigen MRL-Wertes von 200 µg/kg Hühnerei können mit dieser Methode festgestellt werden. Die Kopplungs-Methode ist ebenfalls dazu geeignet, Bodenproben sowie Güllen und Güllekrusten auf Tetracycline und möglicherweise vorhandene antibiotisch aktive Tetracyclin- Metabolite hin zu untersuchen. Ein wesentliches Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass neben den Muttersubstanzen und ihren Epimeren keine weiteren mikrobiologisch aktiven Tetracycline detektiert werden konnten. Eine relativ schwach mikrobiologisch aktive Fraktion, die vor dem Oxytetracyclin eluierte (siehe Abbildung 3 in Publikation 6) konnte durch

24 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 24 weitergehende massenspektrometrische Untersuchungen nicht als Tetracyclin bzw. Tetracyclin-Metabolit identifiziert werden. Mit der für den mikrobiologischen Assay entwickelten Probenvorbereitung ließ sich das gleiche ESI-MS-MS-Verfahren wie bereits für die Umweltproben beschrieben durchführen. Da nur 10% des Eluentenstromes hierfür benötigt werden, konnten Massenspektrometrie und mikrobiologischer Assay parallel betrieben werden. Das MS-MS-Verfahren gestattete Bestimmungsgrenzen für Tetracycline im Bereich von einem Zehntel des derzeitigen Grenzwertes der EU-Verordnung 2377/90 in Eiern (200 µg/kg). Die Bestimmungsgrenze des Verfahrens liegt für alle untersuchten Tetracycline bei 20 µg/kg, die Nachweisgrenze bei 4 µg/kg, die mittlere Wiederfindung lag im Bereich µg/kg bei 84,3% (OTC), 95,5% (TC) bzw. 84,1% (CTC). Darüber hinaus konnten im Falle des Chlortetracyclins mit der Massenspektrometrie auch die mikrobiologisch nicht aktiven iso-verbindungen nachgewiesen werden (siehe Abbildung 5 in Publikation 6).

25 3 Zusammenfassung der Ergebnisse HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren zum Nachweis von Sulfonamiden in Gülle, Boden, Sicker- und Grundwasser und Untersuchungen von Feldproben (siehe Publikation 4: Eintrag und Verbleib von Tierarzneimittelwirkstoffen in Böden und Publikation 5: Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after repeated fertilization with liquid manure) Basierend auf der Methodik für Tetracycline wurden auch Verfahren zum Nachweis von sieben verschiedenen Sulfonamiden in den Matrices Gülle, Boden und Sickerwasser entwickelt. Es zeigte sich, dass die hierfür entwickelten Extraktionsverfahren größtenteils auch für die Analytik der Sulfonamide übernommen werden konnten (Publikation 5). Gülle- und Bodenproben können exakt der gleichen Aufarbeitungsprozedur unterzogen werden wie zur Tetracyclin-Bestimmung. Im Falle von Sicker- und Grundwasserproben müssen bei der Festphasensäulenextraktion die Sulfonamide mit Methanol und Acetonitril eluiert werden. Obwohl die erhaltenen Extrakte nunmehr matrixbelasteter als die für die Tetracyclinanalytik erhaltenen sind, ist eine empfindliche Detektion weiterhin gewährleistet. Für die anschließende HPLC- und MS-Bestimmung wurde das Gradientensystem unter Beibehaltung des Fließmittelsystems leicht modifiziert und so gelang es nach Optimierung sulfonamidspezifischer MS-MS-Parameter, sieben Sulfonamide in 14 min zu trennen (siehe Abbildung 2 in Publikation 5). Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für Sulfonamide liegen z. T. noch unter den für die Tetracycline erreichten. So wurden für das häufig verwendete Sulfamethazin Nachweisgrenzen von 0,5 µg/kg im Boden und 0,01 µg/l im Grundwasser ermittelt (siehe Publikation 4). Untersuchungen der bereits auf Tetracycline untersuchten sieben Gülleproben und des Hühnerfestmistes zeigten, dass in fünf der untersuchten Proben Sulfadiazin und Sulfamethazin in Konzentrationen zwischen 0,3 2,9 mg/l nachweisbar waren (siehe Tabelle 1 in Publikation 4). Fasst man die Untersuchungen auf die verschiedenen Antibiotika zusammen, so ließen sich in sieben von acht Proben bis zu vier verschiedene Substanzen nachweisen. Erstmalige Untersuchungen von vierzehn BDFs auf verschiedene Sulfonamide zeigten, dass von sieben untersuchten Substanzen nur Sulfamethazin in vier Proben mit einer maximalen Konzentrationen von 11 µg/kg Boden nachweisbar war (siehe Tabelle 2 in Publikation 4, Sulfadimidin = Sulfamethazin). Weitere Untersuchungen der Boden-Dauerbeobachtungsfläche aus den Publikationen 2 und 5, die eine hohe Tetracyclinexposition aufwies, zeigten

26 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 26 relativ geringe mittlere Sulfamethazin-Konzentrationen von unter 2 µg/kg im Oberboden (siehe Tabelle 2 in Publikation 5). In oberflächennahem Grundwasser dieser BDF (1,40 m Tiefe) konnte Sulfamethazin mit einer maximalen Konzentration von 0,24 µg/l an allen sechs Probenahmezeiten 2002 nachgewiesen werden. Auch in der ersten Probenahme 2003 war die Substanz noch im Grundwasser zu finden (siehe Tabelle 4 in Publikation 5).

27 3 Zusammenfassung der Ergebnisse HPLC-ESI-MS-MS-Verfahren zum Nachweis von Tetracyclinen, Tylosin, Sulfonamiden und Chloramphenicol in Stallstaub und Untersuchungen von Feldproben (siehe Publikation 7: Antibiotics in dust originating from a pig fattening farm: a new source of health hazard for farmers?) Auch für die Staubanalytik wurde das Extraktionsverfahren, dass bereits für den Tetracyclinund Sulfonamidnachweis in Boden- und Gülleproben eingesetzt wurde, als Methode der Wahl eingesetzt. Staub stellt eine heterogen zusammengesetzte Matrix dar, die vor allem durch einen hohen organischen Anteil von fast 90% gekennzeichnet ist. Bedingt durch den geringen Wassergehalt musste daher in der Probenvorbereitung eine Verdünnung des Analyten in Kauf genommen werden, da letztendlich 0,1 g Probe in 1 ml Lösungsmittel aufgenommen wurden. Die HPLC- und massenspektrometrischen Parameter konnten aus den bereits entwickelten Methoden für Boden, Gülle und Wasser übernommen werden. Da die Belastung der Stäube im Bereich von 0,1 10 mg/kg lag, zeigte das eingesetzte Verfahren immer noch eine ausreichende Empfindlichkeit für den beabsichtigten Einsatz. Darüber hinaus wurde das Verfahren auch für den Nachweis von Chloramphenicol erweitert. Aufgrund von Matrixeffekten musste die Quantifizierung mit der Methode des Standardadditionsverfahrens durchgeführt werden (siehe Publikation 7). Staubproben, die in einem Schweinestall kontinuierlich über die Jahre gesammelt und bei 4 C gelagert worden waren, wurden retrospektiv mittels HPLC-MS-MS auf elf verschiedene Substanzen untersucht. Erstmalig wurde der Nachweis erbracht, dass Antibiotika auch in den Staub von Tierställen gelangen können. Hierdurch können Antibiotika einerseits durch den Landwirt inhaliert werden und andererseits durch die Abluft auch in die Umgebung von Tierställen gelangen. Die Gesamtgehalte an Antibiotika in Staubproben aus einem Schweinemastbetrieb mit einer Besatzdichte zwischen 350 und 420 Tieren in den Jahren betrugen bis zu 12,5 mg/kg Staub. In 90% der Proben wurden bis zu fünf verschiedene Substanzen nachgewiesen, die häufigsten Einzelnachweise erfolgten für Tylosin in 80% und für Sulfamethazin in 65% der Proben (siehe Tabelle 2 in Publikation 7).

28 3 Zusammenfassung der Ergebnisse Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für Antiparasitika in Lebensmittel- und Umweltproben HPLC-DAD-Verfahrens zum Nachweis des Carbamates Propoxur in Hühnereiern, Luft- und Staubproben (siehe Publikation 8: Determination of propoxur residues in eggs with HPLC-DAD after treatment of stocked housing facilities for the poultry red mite (Dermanyssus gallinae)) Die Extraktion von Propoxur aus dem Hühnerei gelang nur nach sehr aufwändiger Probenvorbereitung, die sowohl eine Flüssig-Flüssig-Extraktion als auch eine säulenchromatographische Aufreinigung an Kieselgel beinhaltete. Der eigentliche Nachweis der Substanz wurde nach HPLC-Gradientenelution mittels Diodenarray-Detektion realisiert. Die Bestimmungsgrenze des Verfahrens lag bei 5 µg/kg, die Nachweisgrenze bei 2 µg/kg und die mittlere Wiederfindung im Bereich µg/kg bei 87,4%. Positive Rückstandsbefunde konnten über ein UV-Spektrum abgesichert werden. Damit wurde ein Verfahren entwickelt, dass eine sichere Detektion des Analyten im Bereich von einem Zehntel des derzeitigen Grenzwertes der Rückstands-Höchstmengenverordnung für Propoxur in Eiern (50 µg/kg) erlaubt. Das entwickelte HPLC-Verfahren wurde auch für die Untersuchung von Staub- und Luftproben eingesetzt. Die Probenvorbereitung für diese beiden Matrices konnte wesentlich einfacher durchgeführt werden als dies für die Matrix Hühnerei der Fall war. Luftproben wurden in Flaschen, die mit eisgekühltem Essigsäureethylester beschickt waren, gesammelt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurden die Proben in Methanol aufgenommen und mittels HPLC-DAD analysiert. Staubproben wurden mit Essigsäureethylester extrahiert, abzentrifugiert und eingedampft. Der in Methanol aufgenommene Rückstand wurde mittels HPLC- DAD analysiert. Trotz dieser einfachen Probenvorbereitung wurden keine Störsignale bei der Analyse von Staub- und Luftproben im Bereich der Retentionszeit von Propoxur festgestellt (Hamscher et al., in Vorbereitung). Zur genaueren Untersuchung des Rückstandsverhaltens von Propoxur wurden Legehennenställe mit drei verschiedenen Haltungsformen (Käfighaltung, ausgestalteter Käfig, Volierenhaltung) an Tag 0, an Tag 7 und an Tag 14 der Studie mit einer Propoxurlösung (Herstellerbezeichnung: CBM-8 ) so behandelt, dass vor allem die Verstecke der Milben erfasst wurden. Sechs Kontrolleier aus jeder Haltungsform wurden an Tag -3 und Tag -1 vor der ersten Behandlung gesammelt. Sechs Eier aus jeder Haltungsform wurden an den Tagen 1, 3, 5, 8,