Amtliche Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen

Transkript

1 Amtliche Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen Stand: März 2009

2 Inhaltsverzeichnis Einleitung... 3 Nationale Referenzlaboratorien Affenpocken Afrikanische Pferdepest Afrikanische Schweinepest (ASP) Amerikanische (bösartige) Faulbrut Ansteckende Schweinelähmung (Teschovirus Enzephalomyelitis) Aujeszkysche Krankheit (AK) Aviäre Influenza Befall mit Kleinem Beutenkäfer (Aethina tumida) Befall mit der Tropilaelaps-Milbe (Tropilaelaps spp.) Beschälseuche Blauzungenkrankheit BVD/MD - Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease Bovine Herpes Virus Typ 1-Infektion (alle Formen) Brucellose der Rinder, Schweine, Schafe und Ziegen Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) Epizootische Haemorrhagie der Hirsche Enzootische Leukose der Rinder Equine Enzephalomyelitis (Eastern/Western) Infektiöse Anämie der Einhufer (Blutarmut) Infektiöse Anämie der Salmoniden (ISA) Infektiöse Hämatopoetische Nekrose der Forellen (IHN) Virale Hämorrhagische Septikämie der Forellen (VHS) Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV) Klassische Schweinepest Lumpy skin disease (Dermatitis nodularis) Lungenseuche der Rinder Maul- und Klauenseuche (MKS) Milzbrand Newcastle Disease (ND) Psittakose Q-Fieber Rauschbrand Rifttal-Fieber Rinderpest Rotz (Malleus) Salmonellose der Rinder Schaf- und Ziegenpocken Stomatitis vesicularis Tollwut TSE bei kleinen Wiederkäuern Trichomonadenseuche des Rindes Tuberkulose der Rinder Vesikuläre Schweinekrankheit (SVD) Vibrionenseuche der Rinder

3 Einleitung Die Methodensammlung beinhaltet eine Reihe von Informationen zu den Krankheiten, die der Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen (TierSeuchAnzV) in der Fassung der Bekanntmachung vom 3. November 2004 (BGBl. I S. 2764), zuletzt geändert durch Artikel 2 der Verordnung vom 24. November 2008 (BGBl. I S. 2315) unterliegen. Diese Informationen werden i.d.r. vom Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) zur Verfügung gestellt. Die Methodensammlung stellt insbesondere eine Auflistung von empfohlenen Nachweismethoden für die jeweiligen anzeigepflichtigen Tierseuchen dar. Dabei gilt jedoch der Grundsatz, dass die nach 17 c Absatz 1 des Tierseuchengesetzes vom Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) zugelassenen Diagnostika anzuwenden sind. Auf diese Weise soll eine dem neuesten Stand der Wissenschaft und Technik entsprechend qualitativ hochwertige Tierseuchendiagnostik in Deutschland auf breiter Basis gewährleistet werden. Eine Liste der zugelassenen Mittel ist auf der Homepage des FLI ( zu finden. Falls für bestimmte Anwendungen keine zugelassenen Diagnostika zur Verfügung stehen, sind die von den entsprechenden Nationalen Referenzlaboratorien festgelegten Methoden zu verwenden. Der Einsatz neuer Methoden und Protokolle ist mit dem zuständigen Nationalen Referenzlabor abzustimmen. 3

4 Nationale Referenzlaboratorien Krankheit Affenpocken Afrikanische Pferdepest Afrikanische Schweinepest Amerikanische Faulbrut der Bienen Ansteckende Schweinelähmung (Teschener Krankheit) Aujeszkysche Krankheit Nationales Referenzlabor Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Frau Dr. S. Blome, Vertr.: Dr. B. Haas sandra.blome@fli.bund.de, bernd.haas@fli.bund.de Telefon: Telefax Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg (Dienstgebäude Tierhygiene) Am Moosweiher Freiburg Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. W. Ritter wolfgang.ritter@cvuafr.bwl.de Tel.: Fax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. M. Dauber, Dr. H. Schirrmeier malte.dauber@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für Epidemiologie Seestraße Wusterhausen Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. T. Müller thomas.mueller@fli.bund.de Telefon: Telefax:

5 Krankheit Befall mit Kleinem Bienenbeutenkäfer (Aethina tumida) Nationales Referenzlabor Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg (Dienstgebäude Tierhygiene) Am Moosweiher Freiburg Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. W. Ritter wolfgang.ritter@cvuafr.bwl.de Tel.: Fax: Befall mit Tropilaelaps-Milbe Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg (Dienstgebäude Tierhygiene) Am Moosweiher Freiburg Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. W. Ritter wolfgang.ritter@cvuafr.bwl.de Tel.: Fax: Beschälseuche der Pferde Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Frau PD Dr. I. Moser irmgard.moser@fli.bund.de Telefon: Telefax: Blauzungenkrankheit Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Bovine Virusdiarrhoe/ Mucosal Disease Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. H. Schirrmeier horst.schirrmeier@fli.bund.de Telefon: Telefax o Bovines Herpesvirus Typ 1-Infektion (alle Formen) Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: PD Dr. M. Beer martin.beer@fli.bund.de Telefon: , Dw Telefax o

6 Krankheit Brucellose der Rinder, Schweine, Schafe und Ziege Nationales Referenzlabor Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. F. Melzer falk.melzer@fli.bund.de Telefon: direkt 466 Telefax: Epizootische Haemorrhagie der Hirsche Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Enzootische Leukose der Rinder Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: PD Dr. Dr. T. Vahlenkamp thomas.vahlenkamp@fli.bund.de Telefon: (Dw , 72 70) Telefax: Equine Enzephalomyelitis (alle Formen) Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Prof. Dr. M. Groschup martin.groschup@fli.bund.de Telefon: Telefax Infektiöse Anämie der Einhufer (Blutarmut) Infektiöse Anämie der Salmoniden (ISA) Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald -Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. P. König patricia.koenig@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. S. M. Bergmann, Dr. D. Fichtner sven.bergmann@fli.bund.de, dieter.fichtner@fli.bund.de Telefon: , Dw Telefax:

7 Krankheit Infektiöse Hämatopoetische Nekrose der Forellen (IHN) und Virale Hämorrhagische Septikämie der Forellen (VHS) Koi-Herpesvirus-Infektion Klassische Geflügelpest (Hochpathogene Aviäre Influenza) Klassische Schweinepest Nationales Referenzlabor Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. D. Fichtner, Dr. S. M. Bergmann Telefon: Telefax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. S. Bergmann, Dr. D. Fichtner sven.bergmann@fli.bund.de; dieter.fichtner@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald-Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: PD Dr. T. Harder timm.harder@fli.bund.de Telefon: , Telefax , Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Frau Dr. S. Blome sandra.blome@fli.bund.de Telefon: Telefax Lumpy-skin-Krankheit (Dermatitis nodularis) Lungenseuche der Rinder Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. M. Heller, Dr. Evelyn Schubert martin.heller@fli.bund.de, evelyn.schubert@fli.bund.de Telefon: 03641/ oder 03641/ Telefax /

8 Krankheit Maul- und Klauenseuche Milzbrand Nationales Referenzlabor Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Haas bernd.haas@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Frau Dr. Mandy Elschner mandy.elschner@fli.bund.de Telefon: , Telefax: Newcastle-Krankheit Psittakose Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Herr PD Dr. C. Grund christian.grund@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. K. Sachse konrad.sachse@fli.bund.de Telefon: Telefax: Rauschbrand Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. C. Seyboldt christian.seyboldt@fli.bund.de Telefon: Telefax: Rifttal-Fieber Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax

9 Krankheit Rinderpest und Pest der kleinen Wiederkäuer Rotz Salmonellose der Rinder Schaf- und Ziegenpocken Nationales Referenzlabor Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Frau Dr. Mandy Elschner mandy.elschner@fli.bund.de Telefon: , Telefax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. U. Methner ulrich.methner@fli.bund.de Telefon: (Dw ) Telefax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax Stomatitis vesicularis Tollwut Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Haas bernd.haas@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für Epidemiologie Seestraße Wusterhausen Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. T. Müller thomas.mueller@fli.bund.de Telefon: Telefax:

10 Krankheit Transmissible spongiforme Enzephalopathien (BSE, Scrapie, TME, CWD, FSE) Trichomonadenseuche der Rinder Tuberkulose der Rinder Vesikuläre Schweinekrankheit (SVD) Vibrionenseuche der Rinder Virale Hämorrhagische Septikämie der Salmoniden (siehe IHN und VHS) Nationales Referenzlabor Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Prof. Dr. M. Groschup martin.groschup@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Seestraße Wusterhausen Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. K. Henning klaus.henning@fli.bund.de Telefon:: (80-156) Telefax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Frau PD Dr. I. Moser irmgard.moser@fli.bund.de Telefon: Telefax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Haas bernd.haas@fli.bund.de Telefon: Telefax Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96 a Jena Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. H. Hotzel helmut.hotzel@fli.bund.de Telefon: ( ) Telefax: Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. D. Fichtner, Dr. S. M. Bergmann dieter.fichtner@fli.bund.de; sven.bergmann@fli.bund.de Telefon: Telefax:

11 1. Affenpocken In Deutschland anzeigepflichtig seit Inkrafttreten der Verordnung (EG) Nr. 1398/2003 der Kommission vom 5. August 2003 zur Änderung von Anhang A der Richtlinie 92/65/EWG des Rates zwecks Aufnahme des kleinen Bienenstockkäfers (Aethina tumida), der Tropilaelapsmilbe (Tropilaelaps spp.), der Ebola und der Affenpocken. Nationales Referenzlabor: FLI, Insel Riems Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Greifswald - Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann bernd.hoffmann@fli.bund.de Telefon: Telefax:

12 2. Afrikanische Pferdepest 2.1. Charakterisierung der Infektion Erreger Der Erreger ist ein dsrna Orbivirus der Familie Reoviridae. Neun verschiedene Serotypen des Afrikanischen Pferdepest Virus (African Horse Sickness Virus, AHSV) sind bekannt Klinische Symptomatik Die Afrikanische Pferdepest ist eine meist tödlich verlaufende Erkrankung der Equiden. Der Erreger ist ein dsrna Orbivirus der Familie Reoviridae. Das Virus wird durch Arthropoden der verschiedenen Culicoides Spezies übertragen und das Auftreten der Krankheit ist saisonal bedingt. Die klinischen Erscheinungen sind durch Kreislaufstörungen und respiratorische Symptome gekennzeichnet. Die Krankheit kommt endemisch in Afrika südlich der Sahara vor, einzelne Ausbrüche treten auch in Nordafrika, im Mittleren Osten und in Europa (Spanien u. Portugal) auf. Es gibt vier klassische klinische Verlaufsformen: 1. die pulmonale Form 2. die Herzform 3. die gemischte Verlaufsform (Herz- und Lungenaffektion) 4. das Pferdepest-Fieber Differentialdiagnostik Obwohl die klinischen Zeichen meist charakteristisch sind, ist die Labordiagnose wegen der leichten Verwechslungsmöglichkeit mit anderen Pferdekrankheiten essentiell. Als Virus- Differentialdiagnostik kommen in Frage: Arthropoden-übertragene Pferdenzephalitiden (VEE, WEE, EEE), Pferde-Arteriitis Diagnostische Indikation siehe Richtlinie 92/35/EWG Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, Insel Riems Rechtsgrundlagen Richtlinie 92/35/EWG, Richtlinie 90/426/EWG, Entsch. 2002/160/EC 12

13 2.2. Untersuchungsmaterial Gerinnungsgehemmtes Blut Gewebestücke von Milz, Lunge oder Lymphknoten (post mortem) Versand bei + 4 C oder auf Trockeneis, wenn das Material bereits gefroren gelagert ist Untersuchungsgang Erregernachweis (NUR DURCH DAS FLI DURCHZUFÜHREN) Virusisolierung: In BHK- oder Vero- Zellen: cpe zwischen 2. bis 8. Tag p.i. Antigennachweis: Mit ELISA nach der Methode des OIE Referenzlabors: zwei nach den Fängerantikörpern (polyklonales Antiserum und monoklonale AK gegen VP7) unterschiedliche Methoden sind etabliert und liefern in ca. 4 Stunden ein Ergebnis. Polymerase Kettenreaktion (PCR): Eine PCR zum Nachweis von AHSV-4 RNA wurde entwickelt, wobei die Primer zum 5 - (nt 1-21) und 3 - Ende (nt ) der RNA von Segment 8 komplementär sind (Arch. Virol. 136, (1994)). Basierend auf Empfehlungen des spanischen EU-Referenzlabors wurden real-time RT-PCR Systeme etabliert, die eine schnelle, sensitive und spezifische Detektion der AHSV-RNA erlauben. Antikörpernachweis (NUR DURCH FLI DURCHZUFÜHREN) Der Antikörpernachweis ist die wichtigste Aufgabe im Rahmen der ständigen Export-/Import- Kontrollen. Die Antikörper-Untersuchungen werden mittels Kompetitions-ELISA durchgeführt. Als weitere ergänzende serologische Untersuchungen sind beschrieben: Immunoblotting, die KBR und der Virus-NT nach dem OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. 13

14 3. Afrikanische Schweinepest (ASP) 3.1. Charakterisierung der Infektion Erreger Die Afrikanische Schweinepest (ASP) wird durch ein dsdns-virus aus der Familie der Asfarviridae verursacht Klinische Symptomatik ASP ist eine hochkontagiöse, perakut bis chronisch verlaufende Infektion von Haus- und Wildschweinen. Sie ist klinisch nicht von der Klassischen Schweinepest (KSP) zu unterscheiden und wird durch den Nachweis von ASP-Virus oder ASP-spezifischen Ak festgestellt. Latent mit ASP infizierte Wildschweine bzw. Schweine aus infizierten Gebieten bilden ein permanentes Risikopotential für deutsche Haus- und Wildschweine. Als Einschleppungswege sind insbesondere lebende Schweine, Samen, tierische Erzeugnisse, tierische Rohstoffe, Speiseabfälle und infizierte Zecken denkbar. Die Virusausscheidung beginnt bei Schweinen am 1. bis 4. Tag p. i. und kann bei Tieren, die die Krankheit überleben, gelegentlich über 12 Monate andauern. Die Übertragung zwischen Hausschweinen kann durch direkte oder indirekte Kontakte bzw. über kurze Entfernungen aerogen erfolgen. Die klinischen Symptome können in Abhängigkeit von der Virulenz der Stämme sehr unterschiedlich sein. Sie reichen von deutlichen Veränderungen mit hoher Mortalität bis hin zu kaum erkennbaren subklinischen Verläufen. Infizierte Schweine serokonvertieren i.d.r. nach etwa einer Woche. Die im EU-Recht angenommene maximale Inkubationszeit beträgt 45 Tage. Gegen ASP gibt es keinen Impfstoff Differentialdiagnose Da ASP klinisch und pathologisch-anatomisch nicht von KSP unterschieden werden kann, ist eine labordiagnostische Differentialdiagnose zwingend erforderlich Diagnostische Indikation Gemäß Schweinepest-Verordnung Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, Greifswald Insel Riems; Tel Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die Schweinepest und die Afrikanische Schweinepest in der jeweils gültigen Fassung, die Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der jeweils gültigen Fassung, die Richtlinie 2002/60/EG sowie die Entscheidung 2003/422/EG (Diagnostik-Handbuch) 14

15 3.2. Untersuchungsmaterial Für die Probenziehung ist die Entscheidung 2003/422/EG (Diagnostik-Handbuch) maßgeblich. Die folgenden Ausführungen dienen daher nur der Erläuterung bzw. Konkretisierung des Vorgehens in Deutschland. In Deutschland kann ein ASP-Verdacht, außer bei Hinweisen auf Kontakt mit Tieren, Personen oder Erzeugnissen aus ASP-verseuchten Gebieten (z.b. Sardinien, Afrika), dann entstehen, wenn bei klinischen und pathologisch-anatomischen Hinweisen auf Schweinepest der Verdacht auf die klassische Schweinepest im Labor nicht bestätigt werden kann. Insofern ist bei Verdacht auf Schweinepest in bisher nicht betroffenen Regionen auch daran zu denken, dass eine Untersuchung auf ASP notwendig werden könnte. Es ist daher zu empfehlen, geeignetes Probenmaterial gekühlt bei +4 C auch für eine ASP-Untersuchung zurückzuhalten. Falls ein Bestand mit unklarem Krankheitsbild, bei dem eine Untersuchung auf ASP in Frage kommen könnte, getötet und unschädlich beseitigt wird, sollten geeignete Proben gekühlt sichergestellt werden. Die Probenverpackung muss den ADR-Vorschriften entsprechen, auf jeden Fall aber flüssigkeitsdicht sein und äußerlich gut desinfiziert werden (z.b. mit 2 % NaOH). Sie darf außerhalb des zuständigen Labors nicht mehr geöffnet werden. Frische Proben sind gekühlt, aber nicht gefroren zu versenden (Hinweis: Falls nur gefroren aufbewahrte Proben zur Verfügung stehen, sind diese im Ausnahmefall einzusenden, da bestimmte Nachweisverfahren auch bei gefrorenen Proben anwendbar sind). Proben sind nach Möglichkeit per Kurier zum Friedrich- Loeffler-Institut, Südufer 10, Greifswald - Insel Riems zu schicken. Sie sind in jedem Fall telefonisch anzukündigen ( ). Bei einem ASP-Verdacht sind gekühlt, aber nicht gefroren, einzusenden: Blut, gerinnungsgehemmt (Heparin, 100 IU/ml, EDTA oder Na-Zitrat), 10 bis 20 ml je Tier. Hinweis: Empfohlen werden wassergefüllte Kühlakkus, die zu einer Temperatur von etwas über 0 C führen; CO 2 -Trockeneis ist nicht zu verwenden. Aus Untersuchungseinrichtungen oder von Schlachthöfen: Serum, 1 ml Lymphknoten, insbesondere der inneren Organe sowie Mandibular- und RetropharyngealLn, Milz, Tonsillen, Lunge, Niere, zusätzlich möglich: ungeöffnetes Brustbein. Blutproben mit Gerinnungshemmer und Seren sind von einer größeren Zahl von Tieren einzusenden. Das Diagnostik-Handbuch enthält Festlegungen hierzu und auch zur Untersuchung klinisch unauffälliger Kontaktbestände. Organproben sind möglichst von ausgewählten klinisch kranken bzw. pathologisch auffälligen Tieren einzusenden. Zu den Organproben ist ein Vorbericht über das Tier (Klinik, Pathologie) zu übermitteln. 15

16 Abbildung 1: Diffuse Blutungen im Mandibularlymphknoten Abbildung 2: Petechien in der Niere Abbildung 3: Splenomegalie 16

17 Im Anschreiben ist anzugeben: Wer sendet ein? (Veterinäramt, Bearbeiter; incl. dienstlicher und eventuell privater Telefon- und Fax-Nummer) Was wird eingesandt? (Art des Materials, von welchen Tieren, Anzahl etc.) Aus welchem Bestand stammen die Proben? Was wurde wann in dem Bestand festgestellt - anamnestischer Kurzbericht. Zusätzliche Angaben, soweit möglich: Wie groß ist der Bestand? Tierarten? Art des Bestandes (Zucht-, Mast-, Händlerbestand etc.)? Bestehen Kontakte zu ASP-verseuchten Gebieten? Bestehen Hinweise auf Speiseabfallverfütterung? Bemerkungen und weitere Hinweise auf eine mögliche Erregereinschleppung Untersuchungsgang (NUR DURCH FLI DURCHZUFÜHREN) Für die Untersuchung ist die Entscheidung 2003/422/EG (Diagnostik-Handbuch) maßgeblich. Die folgenden Ausführungen dienen daher nur der Erläuterung bzw. Konkretisierung des Vorgehens in Deutschland. Eine ASP-Infektion wird am FLI, Insel Riems, diagnostiziert durch den Nachweis von ASP-spezifischer Nukleinsäure (DNS) in Organen, Blut oder Leukozytenkulturen, infektiösem ASP-Virus aus Organen oder Blut, ASP-spezifischem Antigen in Organen, Blut oder Leukozytenkulturen, ASP-spezifischen Antikörpern. Nukleinsäurenachweis in der real-time PCR: Zeitaufwand: ca. 1 Tag; positive Ergebnisse sind in einer zweiten, konventionellen PCR (OIE-Methode) zu überprüfen (1 bis 2 Tage). Virusisolierung in Leukozytenkultur (Hämadsorption, CPE, Immunfluoreszenz): Zeitaufwand: 1. Passage ca. 10 Tage, 2. Passage ca. 10 weitere Tage. Die Hämadsorption kann in Abhängigkeit vom Virusstamm und dem Vorliegen von Antikörpern verzögert sein oder ausbleiben. Abschließend ist ein IFT durchzuführen. (Heute nur noch in Sonderfällen relevant ist die Virusisolierung mittels Tierversuch; Zeitaufwand: ca. 3 Wochen; bei deutlichen klinischen Erscheinungen im Herkunftsbestand der Proben spricht das Ausbleiben von Fieber bei parenteral infizierten Versuchstieren über etwa eine Woche gegen das Vorliegen der ASP.) 17

18 Antigen-Nachweis mittels ELISA oder direkter Immunfluoreszenz: Zeitaufwand: ca. 1 Tag. Der Antigennachweis gelingt i.d.r. nur in den ersten Tagen der Infektion, da später das Antigen durch Antikörper maskiert, d.h. blockiert wird, so dass falsch negative Ergebnisse auftreten können. Antikörpernachweis im ELISA (Kompetitions-ELISA) Zeitaufwand: ca. 1 Tag, positive Ergebnisse sind mittels Western Blot oder indirekter Immunfluoreszenz zu überprüfen Im Falle der Einschleppung der ASP können serologische Flächenuntersuchungen erforderlich werden, die mit kommerziell erhältlichen, nicht infektiösen ELISAs in Untersuchungsämtern durchzuführen sind. Für diese gelten dann nach der Entscheidung 2003/422/EG spezielle biohygienische Anforderungen, die aber geringer sind als für Laboratorien, in den das Virus vermehrt werden darf (u. a. kein Unterdruck erforderlich). 18

19 4. Amerikanische (bösartige) Faulbrut 4.1. Charakterisierung der Infektion Erreger Das Bakterium Paenibacillus larvae (vormals Bacillus larvae) kann immer in an Amerikanischer Faulbrut erkrankter Brut gefunden werden. Aufgrund von DNA-Analysen konnten verschiedene Genotypen nachgewiesen werden. Als Wirt ist ausschließlich die Honigbiene bekannt. Die Sporen sind sehr widerstandsfähig und bleiben über Jahrzehnte infektiös Klinische Symptomatik Je nach Genotyp tötet der Erreger die Brut vor oder nach der Verdecklung ab. Die Zelldeckel sind eingesunken und oft löchrig. Die Brut hat sich zu einer breiigen, kaffeebraunen Masse zersetzt, die in der Regel deutlich Fäden zieht. Nach etwa einem Monat trocknet die tote Brut ein und bildet in der unteren Zellrinne schwarzbraune Schorfe, die sich nur schwer entfernen lassen. Die Inkubationszeit kann je nach Infektionsdosis und Genotyp wenige Wochen bis einige Monate betragen. Weiterhin spielt der Zustand des Bienenvolks eine wesentliche Rolle. Bei geschwächten Tieren bricht die Erkrankung in der Regel schneller aus Differentialdiagnostik Das klinische Bild der Amerikanischen Faulbrut ist dem der Europäischen (Gutartigen) Faulbrut sehr ähnlich. An Amerikanischer Faulbrut eingegangene Brut bildet aber in der Regel einen schleimigen Faden und fest mit dem Zellboden verbundenen Schorf. Nur in der vegetativen Phase in junger Brut treten keine deutlichen Symptome auf. Bei Mischinfektionen mit Melissococcus pluton, dem Erreger der Europäischen Faulbrut, oder Viren (ABPV und SBV) ist eine Differentialdiagnose anzuraten Diagnostische Indikation Tierverkehr klinischer oder epidemiologischer Verdacht Untersuchungen im Rahmen des Nachweises der Seuchenfreiheit (Gesundheitszeugnisse für das Verbringen der Bienenvölker an einen anderen Standort) Verdacht aufgrund des hohen Sporenanteils im Futter Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungsämter, Tiergesundheitsämter bzw. Staatliche Lebensmittelund Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer oder die von den Ländern beauftragten staatlichen Einrichtungen. Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg, Tierhygiene, Am Moosweiher 2, Freiburg (Nationales Referenzlabor für Amerikanische Faulbrut und Referenzlabor für Bienenkrankheiten des Internationalen Tierseuchenamtes/OIE), Tel 0761/

20 Rechtsgrundlagen Bienenseuchenverordnung vom (BGBl. I S. 1552) in der jeweils geltenden Fassung 4.2. Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial Brut Verdächtige Brutwaben werden möglichst vollständig im Rahmen eingesandt und untersucht. Nur so ist eine Untersuchung auf klinische Symptome möglich. Um die veränderte Brutzellen identifizieren zu können und eine Kontamination durch auslaufendes Futter zu verhindern, sollten die Waben zunächst in Papier und anschließend in Plastikfolie eingepackt und in einem stabilen Karton versandt werden. Die Waben sollten möglichst frisch entnommen sein und eventuell kühl gelagert werden. Einfrieren verändert die Symptome ohne jedoch den Erregernachweis zu beeinflussen. Untersuchungsmaterial Futter Futterproben werden aus dem Bereich des Futterkranzes aus Brutwaben entnommen. Die Brut sollte ebenso wie das Futter gedeckelt sein, d. h. älter bzw. länger gelagert sein. Werden Proben in anderen Bereichen des Bienenstockes entnommen oder während Nektar bzw. Honigtau oder Futter eingetragen wird, so hat ein negativer Befund keine Aussagekraft Untersuchungsgang Mikroskopischer Erregernachweis Paenibacillus larvae ist ein grampositives, peritrich begeißeltes Stäbchen von sehr variabler Größe. Sie schwankt zwischen 0,5 und 0,8 µm Breite bzw. 2,5 und 5 µm Länge. Die ovalen Sporen sind doppelt so lang wie breit (0,6 bis 0,7 bzw. 1,1 bis 1,9 µm). Zur mikroskopischen Untersuchung wird die verdächtige Brut oder fadenziehende Masse mit einer Pinzette oder Impföse entnommen. Schorfe sollten mit einer sterilen 0,9%igen NaCl- Lösung suspendiert werden. Es wird entweder ein natives oder gefärbtes Präparat hergestellt. Hierzu wird das Untersuchungsmaterial direkt auf dem Objektträger ausgestrichen, luftgetrocknet und die vegetativen Formen nach Gram oder Gimsa und die Sporen nach Rakette gefärbt. Bei 1000-facher Vergrößerung (Ölimmersion) können die vegetativen Formen und die Sporen leicht erkannt werden. Die Geißeln werden erst nach ihrer Ablösung und Zusammenlagerung zu Geißelzöpfen sichtbar. Ihr Nachweis gelingt im direkten Präparat nur selten, nach vorheriger Anzucht in Columbia-Schafsblut-Schrägagar nach Plagemann (siehe dort) aber immer. Kulturmethoden Ein sicheres Erkennen und weitere biochemische Tests sind nur nach vorheriger Anzucht des Paenibacillus larvae mit speziellen Kulturmethoden möglich Paenibacillus larvae wächst sowohl in Nährbouillon mit Pepton und Dextrose als auch in Serumbouillon mit Dextrose. Diese können auch zur Anreicherung des Bakteriums verwendet werden. Als Nährböden haben sich Columbia-Schafsblut-Agar (CSA) und MYPGP-Agar am besten bewährt. Ein Zu- 20

21 satz von Nalidixinsäure (3mg auf 1 Liter Agar) verhindert das Wachstum von vielen keimen. Der Nachweis der Geißelzöpfe erfolgt auf Columbia-Blut-Schrägagar nach Plagemann (1985). Der beimpfte Schrägagar wird 3 bis 4 Tage bei 37 bis 38 C im Brutschrank belassen. Danach wird etwas Flüssigkeit vom Boden des Reagenzglases auf einen Objektträger gegeben und nach dem Trocknen hitzefixiert. Die Geißelzöpfe können am besten im Phasenkontrast oder mit Nigrosin sichtbar gemacht werden. Identifizierung der Kolonien Die Kolonien des Paenibacillus larvae auf MYPGP-Agar sind weiß und können leicht anhand ihrer konkaven Form und rauhen Oberfläche erkannt werden. Zusätzlich kann man einen biochemischen Test, insbesondere den Katalase-Test durchführen. Auf Columbia-Schafsblutagar sind die Kolonien je nach Typ grau-weißlich bis orange-pigmentiert. Nachweis in Futter- bzw. Honigproben Die Untersuchung von Futter- oder Honigproben auf Sporen des Paenibacillus larvae gehört zu den Standardmethoden im Routinelabuhr, da sie bei der staatlichen Seuchenbekämpfung anstelle einer zweiten klinischen Untersuchung gezielt eingesetzt wird. Als Nährböden eignen sich MYPGD-Agar und Columbia-Schafsblut-Agar. Neben den gezogenen Proben werden pro Untersuchungsreihe jeweils eine negative und positive Probe mitgeführt. Die Proben werden zur leichteren Verarbeitung auf 34 C erwärmt. Jeweils 5 g der bei Bedarf grob gefilterten Futter- bzw. Honigprobe und 5 ml steriles entmineralisiertes Wasser werden im Reagenzglas mit Hilfe eines Schüttlers bzw. Rührers homogenisiert. Alle Proben werden im auf 90 C + 1 Cvorgeheizten Wasserbad 6 Minuten lang erhitzt, um die Sporen anderer Bakterien und Pilze weitgehend abzutöten. Aus jedem Reagenzglas werden mindestens 100 µl der Suspension auf jeweils mindestens drei Platten pipettiert und mit einem Drigalskispatel ausgespatelt. Die Kulturen werden 6 Tage aerob im Brutschrank bei 37 C bebrütet. Im Begasungsbrutschrank mit 5 % Kohlendioxid reichen 4 Tage aus. Die gewachsenen Kolonien werden zunächst anhand ihrer äußeren Charakteristika differenziert. Zur weiteren Bestimmung kann ein Katalase-Test durchgeführt (siehe dort). Die Zahl der Kolonieformen mit negativem Katalase-Test kann man mit einem Kulturzählgerät bestimmen. Können die Kolonien nicht mehr gezählt werden, legt man entweder einen Verdünnungsausstrich an oder verdünnt die Ausgangsprobe entsprechend. Zur endgültigen Absicherung wird eine Kolonie auf Columbia-Schafsblut-Schrägagar überimpft (Plagemann, 1985) und 3 bis 4 Tage lang bei 37 C bebrütet. In der Flüssigkeit am Boden des Reagenzglases können z.b. mit Hilfe eines Nigrosin-Präparates oder im Phasenkontrast leicht Geißelzöpfe nachgewiesen werden, die auf P. larvae hinweisen. Da auch andere Bakterien Geißelzöpfe bilden können, wird zum sicheren Nachweis eine molekularbiologische Methode (PCR) empfohlen (siehe dort). Die Zahl der bei dieser Methode gewachsenen Kolonien gibt einen Hinweis auf einen möglichen Ausbruch der Amerikanischen Faulbrut. Ein Ausbruch der Seuche ist unwahrscheinlich, wenn keine Kolonien wachsen. Bei positivem Befund müssen die Bienenvölker auf klinische 21

22 Symptome durchgeschaut werden. Erst wenn diese nachgewiesen werden, gilt die Seuche als ausgebrochen. Wenn eine vom nationalen Referenzlabor geprüfte Standardsporensuspension als positive Kontrolle mitgeführt wurde, kann die Zahl der gewachsenen Kolonien zusätzlich zum positiven Befund mit niedrig (weniger als der Standard) oder mit hoch (höher als der Standard) angegeben werden. Diese Angabe gibt einen Hinweis auf einen möglichen Ausbruch der Amerikanischen Faulbrut: Bei niedrig ist der Ausbruch eher unwahrscheinlich, bei hoch sehr wahrscheinlich. Biochemischer Erregernachweis Die biochemischen Tests sind nicht eindeutig und sollten nur zur zusätzlichen Absicherung verwendet werden. Holst-Milch-Test Wenn Paenibacillus larvae sporuliert, produziert es eine große Menge an proteolytischen Enzymen. Durch diesen Abbau der Proteine wird Milch zu einer klaren Flüssigkeit (Holst, 1946). Das verdächtige Material in ein Reagenzglas geben, das eine 1%ige wässrige Milchlösung enthält. Im Wärmeschrank bei 37 C klärt sich die Milch nach spätestens 20 Minuten. Nitratreduktionstest Paenibacillus larvae besitzt das Enzym Nitratreduktase zur Reduktion von Nitrat zu Nitrit (Lochhead 1947). Im Nitratreduktionstest wird Natriumnitrat und eine Reagenz dem BHI- Nährboden zugegeben. Man kann auch von einer gut bewachsenen Bouillon 0,5 ml in eine spezielle mit Kaliumnitrat (KNO 3 ) versetzte Nährlösung geben (siehe Anhang) und diese drei bis vier Tage lang bei 37 C bebrüten. Der Nährboden bzw. die Bouillon verfärbt sich rot, wenn Nitrit produziert wird. Voges-Proskauer-Reaktion Dieser Test beruht auf dem Nachweis von Acetoin, das von Paenibacillus larvae als Produkt des Kohlenhydratstoffwechsels gebildet wird. Von einer gut bewachsenen Bouillon werden 0,5 ml in die speziell für den Nachweis zubereitete Nährbouillon (siehe Anhang) gegeben. Diese wird für zwei bis drei Tage bei 37 C bebrütet. Nach Zugabe der Prüfreagenz (siehe Anhang) zeigt die Rotfärbung eine positive Reaktion an. Katalase-Test Der Katalase-Test mit 3%igem Wasserstoffperoxyd eignet sich besonders zur zusätzlichen Identifizierung von auf Nährböden gewachsenen Kolonien des Paenibacillus larvae. Die meisten aerobischen Bakterien reduzieren mit ihrer Katalase das Wasserstoffperoxid unter Sauerstoffabspaltung zu Wasser. Bei Paenibacillus larvae kommt es zu keiner Gasbildung, die an der schäumenden Flüssigkeit sichtbar würde. Bei Kolonien auf Columbia-Schafsblut- Agar bringt der Test ein falsches Ergebnis. Die Kolonie muss daher auf einen sauberen Objektträger übertragen werden. Molekularbiologische Methoden: PCR Für die schnelle Untersuchung von Brut mit klinischen Symptomen der AFB, wird der Inhalt von zwei Brutzellen in 1 ml sterilen Wasser suspendiert und gründlich geschüttelt. 100 µl der 22

23 Suspension werden mit 9oo µl destillierten Wassers verdünnt. Von der im Vortex-Schüttler bearbeiteten Suspension werden 100 µ für die DNA Extraktion verwendet. Wenn Bakterienkolonien von Nährböden identifiziert werden sollen, wird eine Kolonie in 50 µl destillierten Wassers suspendiert und für 15 Minuten auf 95 C erhitzt. Nach der anschließenden Zentrifugation bei x g für 5 Minutenwerden 1 bis 5 µl des Überstandes als Template-DNA in einer 50 µl PCR Mixtur verwendet. Für die PCR Reaktion verläuft in einer Mixtur aus 5 µl Template-DNA, 50 pmol forward Primer (AFB-F) und reverse Primer (AFB-R), 10 nmol von Deoxynukleosid Triphosphat und U von Taq-Polymerase in geeignetem PCR Puffer (wird zusammen mit Taq Polymerase angeboten) mit 2 mm MgCl 2. Die Amplifikation eines spezifischen DNA Fragments erfolgt im Thermozycler unter den folgenden Bedingungen: ein 95 C (1 bis 15 Minuten) Schritt, 30 Zyklen bei 93 C (1 Minute), 55 C (30 Sekunden) und 72 C (1 Minute) und ein letzter Zyklus bei 72 C (5 Minuten). Die Molekulargewichte der PCR Produkte werden mit Hilfe der Elektrophorese in 0,8 % Agrose-Gel bestimmt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Primer AFB-F 5`-CTTGTGTTTCTTTCGGGAGACGCCA bp AFB-R 5`-TCTTAGAGTGCCCACCTCTGCG-3 969bp Serologische Tests Antiseren sind zurzeit nicht käuflich zu erwerben. 23

24 5. Ansteckende Schweinelähmung (Teschovirus Enzephalomyelitis) 5.1. Charakterisierung der Infektion Erreger Erreger sind Porzine Teschoviren (PTV) aus der Familie Picornaviridae, von denen mindestens 11 Serotypen unterschieden werden können (vormals zu den Porzinen Enteroviren gerechnet). Nachdem ursprünglich ausschließlich Stämme des PTV-1 für die Teschen-Talfan- Krankheit verantwortlich gemacht wurden, gibt es inzwischen Nachweise dafür, dass auch andere PTV-Serotypen vergleichbare Neurovirulenz besitzen und Krankheitsbilder verursachen können. Für praktische Zwecke ist es daher in der Regel völlig ausreichend, wenn ein Speziesnachweis geführt wird. Empfänglich für PTV sind ausschließlich Schweine, die Übertragung erfolgt oral-fäkal Klinische Symptomatik Die Teschovirus-Enzephalomyelitis der Schweine tritt als fieberhafte Allgemeinerkrankung auf, wobei Ausprägung und Schweregrad klinischer Symptome stark schwanken. Bei der erstmals 1930 aus der Tschechoslowakei als Teschener Krankheit beschriebenen fatalen Form traten Fieber, Anorexien und Depressionen auf, gefolgt von Inkoordinationen, Prostration, Koma und Tod. Die Mortalität erreichte bis zu 90 %. Ab Mitte der 1950er Jahre werden nur noch sporadisch überwiegend milde Verlaufsformen (Talfan Disease) mit Lähmungen der Hinterbeine beobachtet. Die Tiere gesunden gewöhnlich vollständig innerhalb weniger Tage, Todesfälle sind selten und in der Regel auf wenige Tiere beschränkt. Pathologisch-anatomisch sind Läsionen bis hin zur Paralyse im Zentralnervensystem zu beobachten. Die Läsionen gleichen histologisch weitgehend denen bei anderen viralen Enzephalomyelitiden, mit perivaskulären Infiltraten (Manschettenbildung), neuronaler Degradation und Gliosis. Die Ausdehnung der Läsionen korreliert mit dem Schweregrad der Klinik, bei besonders schweren Fällen können das gesamte Rückenmark, Gehirn und Meningen betroffen sein Differentialdiagnostik Polioenzephalomyelitis als Folge einer PTV-Infektion muss differenziert werden von anderen viralen Enzephalomyelitiden, insbesondere von der Aujeszkyschen Krankheit, von Schweinepest, Afrikanischer Schweinepest und Coronavirus-(Hämagglutinierender) Enzephalomyelitis. Ferner sind zu berücksichtigen Listeriose, bakterielle Meningo-Enzephalitis und Intoxikationen. Teschoviren sind ubiquitär verbreitet und es ist mit einer hohen PTV- Antikörperprävalenz in europäischen Schweinebeständen zu rechnen Diagnostische Indikation Die diagnostische Indikation einer Teschovirus-Enzephalomyelitis ist nur nach Erregernachweis unter Berücksichtigung klinischer und pathologisch-anatomischer Befunde möglich. Essentiell ist der Ausschluss von Schweinepest. Die Differenzierung zwischen der schweren Form der Erkrankung (Ansteckende Schweinelähmung) und der milden (Talfan Disease) kann bei signifikantem Erregernachweis nur an Hand des Krankheitsgeschehens erfolgen. Voraussetzung für die Feststellung eines Falles von Ansteckender Schweinelähmung ist das gehäufte Auftreten klinischer Erkrankungen. 24

25 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungs-, Tiergesundheitsämter bzw. Staatliche Lebensmittel- und Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, Greifswald - Insel Riems, Tel Rechtsgrundlagen Die Teschovirus-Enzephalomyelitis ist in ihrer schweren Ausprägung (Ansteckende Schweinelähmung) anzeigepflichtig im Sinne der ab dem 10. November 2004 geltenden Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen. Ferner gilt die Verordnung über Sperrbezirke bei Ansteckender Schweinelähmung vom 24. Juli Untersuchungsmaterial Zur Virusisolierung bzw. zum direkten Nachweis am Gefrierschnitt ist Graue Substanz aus Kleinhirn (Kerne, Rinde), Hirnstamm, Rückenmark (Ventralhörner) oder eventuell Material aus der motorischen Großhirnrinde zu entnehmen. Darüber hinaus sind Virusisolierungen aus Tonsille, Lunge und Kot möglich. Das Untersuchungsmaterial sollte von Tieren, die sich in einem möglichst frühen Krankheitsstadium befinden, entnommen werden. Virusisolierungsversuche aus dem ZNS bieten Aussicht auf Erfolg nur bis zum 3. Tag nach Auftreten zentralnervöser Symptome Untersuchungsgang Direkter Erregernachweis Der direkte Erregernachweis erfolgt vorzugsweise nach Anzüchtung des Virus in der Zellkultur. Der Nachweis an azetonfixierten Gefrierschnittpräparaten kann versucht werden, die Erfolgsaussichten sind jedoch als sehr gering einzuschätzen. Entsprechende Literaturhinweise beziehen sich ausschließlich auf experimentell infizierte Tiere. Aufbereitung des Untersuchungsmaterials Herstellung einer 10%igen Organsuspension in serumfreiem Erhaltungsmedium (EM) mit Zusatz von Antibiotika möglichst weiterer Aufschluss durch Ultraschallbehandlung Klärzentrifugation bei 1500 g für 10 Minuten, ggf. Filtration durch Membranfilter (0,45 µm) kurzzeitige Lagerung bei 4 C; falls längere Zwischenlagerung notwendig: Zugabe von z.b. 20 % Pferdeserum als Gefrierschutz und Lagerung bei -70 C Zellkulturen und deren Beimpfung Empfänglich sind insbesondere primäre sowie diploide und permanente Schweinenieren- und -hodenzellen. Von vorbereiteten Zellkulturen wird das Medium abgesaugt und im Doppelansatz mit unverdünnter bzw. 1:10 verdünnter Organsuspension überschichtet. Nach vierstündiger Bebrütung bei 37 C wird das unverdünnte Inokulum abgesaugt, die Zellkultur einmal mit EM gewaschen, anschließend werden alle Kulturen mit EM überschichtet und weiter bebrütet. Die Inokulum- und Medienmengen richten sich nach der Größe der Kulturgefäße (z.b. für 25

26 Petrischalen mit 3,5 cm Durchmesser 0,5 ml Inokulum und 2 ml Medium). Die Anzüchtung erfolgt unter Antibiotikaschutz. Nach etwa 6 Tagen erfolgt ein Mediumwechsel, die Kulturen können dann bis zum 12. Tag weiter bebrütet werden. Die inokulierten Zellkulturen und mitgeführte negative Kontrollkulturen werden zweimal passagiert. Hierzu werden die Kulturen einem dreimaligen Zyklus von Gefrieren bei -70 C und Tauen bei Raumtemperatur unterzogen und die Suspensionen durch Zentrifugation bei 1500 g für 10 Minuten geklärt. Es werden jeweils zusätzlich negative Kontrollkulturen mitgeführt. Bei Auftreten eines zytopathischen Effekts ist eine Identifizierung bzw. Typisierung des Isolates durchzuführen. Tescho- und Enteroviren sind chloroformresistent, so dass mittels Ausschütteln oder Homogenisieren mit 10 % Chloroform starke Kontaminationen eliminiert werden können. Das Chloroform ist anschließend durch Zentrifugation abzutrennen, der virushaltige Überstand darf jedoch nicht direkt auf den Zellrasen verimpft, sondern nur in das EM gegeben werden. Virusidentifizierung mittels Immunfluoreszenz (IFT) Zellkulturen werden in für die mikroskopische Betrachtung geeigneter Form angelegt (Petrischalen, Deckgläser, Mikrotiterplatten, Diagnostika-Objektträger) und der geschlossene Zellrasen mit dem Isolat bzw. einem Referenzvirus infiziert. Die Fixierung der infizierten Zellkulturen erfolgt zu einem Zeitpunkt, bei dem erste zytopathische Veränderungen erkennbar sind. Diese äußern sich gewöhnlich durch inselartig verstärktes Auftreten abgerundeter Zellen. In Abhängigkeit von Infektiosität und Impftiter des Virus kann dies zeitlich sehr verschieden sein (8 bis 48 Stunden p. i.). Gleichzeitig sind nichtinfizierte Zellkulturen als Negativ-Kontrollen zu fixieren. Kulturen auf Deckgläsern und Objektträgern können z.b. in Azeton für 10 Minuten bei Zimmertemperatur nach kurzem Abspülen mit isotonischem Puffer (IP) und anschließendem Lufttrocknen fixiert werden. Zellkulturen auf Titerplatten lassen sich nach Absaugen des Mediums mit gekühltem Azeton (1:2 mit destilliertem Wasser verdünnt) bei -20 C (20 Minuten) fixieren. Die Zwischenlagerung fixierter Kulturen ist bei -20 C über Wochen möglich. Immunfluoreszenz mit polyklonalen Seren Die Immunfluoreszenz mit polyklonalen Seren kann nur bedingt empfohlen werden. Polyklonale Seren kreuzreagieren häufig mit Viren heterologer Serotypen, nicht selten tritt jedoch auch der Fall auf, dass sie Isolate ihres Serotyps nicht oder nicht sicher erkennen. Geeignet sind ausschließlich solche Seren, die hochtitrig sind (mindestens 1:1000 verdünnbar), pan- PTV reagieren und keine Hintergrundmarkierungen verursachen. Keine Kreuzreaktivität besteht zwischen PTV und PEV-8 bzw. PEV-9 und 10. Es sollten vorzugsweise Schweineseren verwendet werden, deren Reaktion mit Zellproteinen möglichst gering ist. Ansonsten ist hochgereinigtes Virus zur Immunisierung z.b. von Kaninchen zu verwenden. Für eine Serotypisierung von porzinen Teschoviren mit polyklonalen Seren ist die Immunfluoreszenz ungeeignet. Zur Durchführung des IFT werden die fixierten Präparate mit geeignetem Antiserum überschichtet, die Arbeitsverdünnung richtet sich nach Titer und Kreuzreaktionsverhalten. Inkubation z. B. 1 Stunde bei Zimmertemperatur in einer feuchten Kammer anschließend 3x mit IP ph 7,8 waschen Puffer von den Präparaten absaugen oder abschwenken mit Konjugat (Antispezies- Fluorochrom, z.b. FITC, Carbocyanin) in geeigneter Verdünnung (etwa 1:100 bis 1:200) überschichten 26

27 mindestens 45 Minuten bei Zimmertemperatur in feuchter Kammer und bei Dunkelheit inkubieren wie oben 3x waschen; Deckgläser und Objektträger zum Schluss einmal kurz in entionisiertem Wasser spülen und mit Fluoreszenz-Erhaltungspuffer (DABCO) einbetten noch feuchte bzw. eingebettete Präparate unter Auflichtfluoreszenzmikroskop beurteilen Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörpern Für den Nachweis von PTV bieten sich spezies-spezifische monoklonale Antikörper (MAK) an. Eine PTV-Typisierung mit monospezifischen MAKs ist nur eingeschränkt möglich. In der Regel erkennen derartige Antikörper nur einen Teil von Virusisolaten ihres Serotyps. Für den allgemeinen Teschovirus-Nachweis werden empfohlen die MAKs 040/4B1 und 156/1B9, die Viren sämtlicher Serotypen erkennen. Zum Nachweis von PEV-8 (PEV-A) steht MAK 153/5B5 zur Verfügung. PEV-B (PEV-9 und 10) lässt sich nachweisen mit MAK 154/4H6. Die Durchführung des Testes erfolgt prinzipiell in gleicher Weise wie der IFT mit polyklonalen Seren. Es ist ein Anti-Maus-IgG-Konjugat einzusetzen. Bewertung der Fluoreszenz Mit PTV und PEV infizierte Zellen weisen eine kräftige grobkörnige, sich häufig in Kernnähe konzentrierende zytoplasmatische Fluoreszenz auf. Die Neigung infizierter Zellen zu starker Abrundung und Herauslösung aus dem Zellverband können die Entscheidung darüber, ob eine spezifische Markierung vorliegt, erschweren. Abgerundete Zellen erscheinen infolge Lichtbrechung gewöhnlich heller als ihr Umfeld. Zur Bewertung sind grundsätzlich Negativ- und Positivkontrollen einzubeziehen. Untersuchungsdauer Im Falle hochinfektiöser und leicht in der Zellkultur vermehrbarer Viren ist mit einem Ergebnis frühestens nach 5 Tagen zu rechnen, der Nachweis von in der Zellkultur schwach virulenten Virus-Isolaten kann bis zu 18 Tagen dauern. Virusnachweis mittels Immunperoxidasetechnik Alternativ zur Immunfluoreszenz kann auch die Immunperoxidasetechnik angewendet werden. Spezielle Erfahrungen zur Eignung und Sensitivität liegen jedoch nicht vor. Virusidentifizierung und -typisierung mittels Neutralisationstest (NT) Der NT kann prinzipiell als Serumneutralisationstest (SNT) und als Virusneutralisationstest (VNT) ausgeführt werden. Hierzu sind serotypspezifische Hyperimmunseren, häufig auch stammspezifische Seren mit bekannten homologen Titern notwendig. Die Verfahren sind aufwändig und grundsätzlich ist damit zu rechnen, dass gegen Referenzvirusstämme gerichtete Immunseren nicht oder nicht ausreichend Feldvirusisolate ihres Serotyps neutralisieren. Dies bedeutet, dass ein gewisser Teil aktueller Virusisolate sich serologisch keinem der anerkannten Typen zuordnen lässt. Darüber hinaus ist mit gleichzeitiger Infektion eines Tieres mit verschiedenen PTV-Serotypen zu rechnen. Serumneutralisationstest Das Virusisolat wird auf 100 KID50/100 µl eingestellt und mit den auf 5 % vom jeweiligen homologen Neutralisationstiter eingestellten und bei 56 C inaktivierten Antiseren für eine Stunde bei 37 C inkubiert. Das Gemisch wird auf geeignete Zellkulturen verimpft. Das Isolat wird dem Serotyp zugeordnet, durch dessen Antiserum es neutralisiert wird. Viruskontrolltitration, Zellkontrollen und Serumkontrollen sind mitzuführen. 27

28 Genauere Ergebnisse liefert das Austitrieren der Seren zur Bestimmung des jeweiligen Neutralisationstiters. Überschreitet dieser 5 % des homologen Titers eines Serums, wird das Isolat dem entsprechenden Serotyp zugeordnet. Virusneutralisationstest Hiermit können feinere antigene Unterschiede zwischen Virusstämmen erkannt werden. Das Virus wird in Anwesenheit konstanter Antiserumverdünnungen und eines Nullserums austitriert. Die Zuordnung eines Isolates zu einem Referenzvirus erfolgt auf der Grundlage des zu errechnenden Neutralisationsindex. Bei einzelnen Isolaten können im eindimensionalen NT intertypische Reaktionen auftreten. Eine Zuordnung zu einem Serotyp kann in diesen Fällen möglicherweise im Kreuzneutralisationtest erfolgen. Wegen des erheblichen Arbeitsaufwandes sollten derartige Untersuchungen in einem spezialisierten Labor durchgeführt werden. Nachweis von PTV und PEV mittels Polymerasekettenrektion (PCR) Die RT-PCR kann zum generellen Nachweis von porzinen Tescho- bzw. Enteroviren in Zellkulturmaterial oder Organproben genutzt werden, bei letzteren vorzugsweise als nested PCR (La Rosa et al. 2006, Zell et al. 2000). Aussagefähige Belege zur Anwendbarkeit der PCR für die Typdifferenzierung liegen bislang nicht vor Indirekter Erregernachweis Indirekter Erregernachweis mittels SNT Auf Grund der Typenvielfalt der PTV und der zu erwartenden hohen Antikörperprävalenz ist Serodiagnostik einerseits äußerst aufwändig, andererseits ist die Herstellung eines ätiologischen Zusammenhangs vielfach zweifelhaft. Es müssen mindestens Serumpaare (Zweitprobe im Abstand von 2 bis 3 Wochen) untersucht werden. Dem direkten Virusnachweis ist in der Regel der Vorzug zu geben. Zur Möglichkeit der Anwendung eines ELISA siehe bei Nardelli et al. (1993). Generell ist festzustellen, dass eine sichere Aussage nur bei Verwendung homologer Reaktionspartner, d.h. auch eines Virusisolates aus dem betreffenden Tierbestand möglich ist. Durchführung des Tests: Anzüchtung von Zellen in Mikrotiterplatten (1 bis 3 Tage vor dem Test) Inaktivierung der Seren bei 56 C für 30 Minuten Anlegen einer log2-verdünnungsreihe mit EM Jede Verdünnungsstufe in 14 Portionen abfüllen Mischen der Serumverdünnungen mit gleichen Volumina von auf 100 KID50/100 µl eingestelltem Virus der 13 Serotypen und der Serumkontrolle mit EM Inkubation der Mischung 1 Stunde bei 37 C Entfernen des Wachstumsmediums von den Zellkulturen Inokulation der Zellkulturen mit je 150 µl des Serum-Virus-Gemischs Zellkontrollen mit 150 µl EM ansetzen Inkubation der Mikrotiterplatten bei 37 C für 8 bis 14 Tage im CO 2 -Brutschrank Auswertung: Kontrolle der Mikrotiterplatten täglich, geschützte Kulturen weisen keinen zytopathischen Effekt auf Berechnung des Neutralisationstiters Ein vierfacher Titeranstieg bei Serumpaaren spricht für eine aktuelle Infektion mit dem entsprechenden Serotyp 28

29 Ein vierfacher Titeranstieg bei Serumpaaren spricht für eine aktuelle Infektion mit dem entsprechenden Serotyp Rezepturen und Bezugsquelle Zellzucht- und Virusvermehrungsmedien Beispiel: Medien für EFH-Zellen Medium zur Zellvermehrung Minimal Essential Medium (MEM) Hanks, mit Zusatz von 1 % nicht essentiellen Aminosäuren und 10 % FKS Erhaltungs- und Virusvermehrungsmedium (EM) L-EM: Hanks-Salzlösung mit Zusatz von 3 % Leibovitz-Medium (L-15) Bei Herstellung und Verimpfung von Organanreibungen sind den Medien Antibiotika zuzusetzen (z.b. Baytril 10%ig 1 ml/l und Amphothericin B, wasserlöslich, 45%ig 5,6 mg/l). Zellkulturen Für die Anzüchtung und Vermehrung von PTV/PEV geeignete Zellen (z.b. EFH, ST, PS-EK und IB-RS-2) können bezogen werden von der Zellbank des Friedrich-Loeffler-Instituts, Südufer 10, Greifswald - Insel Riems, Tel /7260. PEV-Typstämme PTV- und PEV-Referenzstämme sind u.a. erhältlich von der Virusbank im Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler-Institus, Südufer 10, Greifswald - Insel Riems, Tel /7204. Antiseren PTV/PEV-Antiseren vom Meerschweinchen für den IIFT in kleinsten Mengen erhältlich vom Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt Arnsberg Zur Taubeneiche Arnsberg Tel /8090 und vom Kaninchen für den NT von der Virusbank im Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler-Institus Südufer Greifswald - Insel Riems Tel /7204 Monoklonale Antikörper Monoklonale Antikörper MAK 040/4B1, 156/1B9, 154/4H6 und 153/5B5 sind zu beziehen vom Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler-Institus, Südufer 10, Greifswald - Insel Riems, Tel /7204 Konjugate Z.B. DTAF/FITC-markiertes, affinitätsgereinigtes F(ab )2-Fragment der Ziege gegen Meerschweinchen-IgG, Cy3-markiertes, affinitätsgereinigtes F(ab )2-Fragment der Ziege gegen Maus-IgG(H+L) (Dianova, Hamburg) 29

30 Literatur Auerbach, J. (1995): Porzine Enteroviren. AVID-Mitteilungen I/1995 Dauber, M. (1999): Identification of group I porcine enteroviruses by monoclonal antibodies in cell culture. Vet. Microbiol. 67, 1-12 La Rosa, G., Muscillo, M., Di Grazia, A., Fontana, S., Iaconelli, M., Tollis, M. (2006): Validation of RT-PCR assays for molecular characterization of porcine teschoviruses and enteroviruses. J. Vet. Med. B 53, Nardelli, S., Farina, L., Selli, L., Parpaidola, R., Zuin, A. (1993): Research on the presence of porcine enterovirus serotype 1 in North-Eastern Italy. J. Vet. Med. B 40, Zell, R., Dauber, M., Krumbholz, A., Henke, A., Birch-Hirschfeld, E., Stelzner, A., Prager, D., Wurm, R. (2001): Porcine teschoviruses comprise at least eleven distinct serotypes: Molecular and evolutionary aspects. J. Virol. 75, Zell, R., Krumbholz, A., Henke, A., Birch-Hirschfeld, E., Stelzner, A., Doherty, M., Hoey, E., Dauber, M., Prager, D., Wurm, R., (2000): Detection of porcine enteroviruses by nrt-pcr: differentiation of CPE groups I-III with specific primer sets. J. Virol. Methods 88,

31 6. Aujeszkysche Krankheit (AK) 6.1. Charakterisierung der Infektion Erreger Das Virus der Aujeszkyschen Krankheit (Synonym Pseudorabiesvirus, PrV) gehört zur Familie der Herpesviridae, Subfamilie Alphaherpesvirinae und wird laut derzeit gültiger Taxonomie als Suid Herpesvirus 1 (SHV1) bezeichnet. Das Wirtsspektrum umfasst nahezu alle Säugetierarten; lediglich die Primaten und Einhufer weisen hohe natürliche Resistenzen auf. Als Hauptreservoir ist das Hausschwein (aber auch Schwarzwild) anzusehen, wobei die Empfänglichkeit bei diesen Tierarten stark vom Lebensalter und von der Virulenz des Erregers abhängt Klinische Symptomatik Die Inkubationszeit liegt in der Regel zwischen 1 bis 8 Tagen, in Abhängigkeit von der Infektionsdosis auch bis zu 3 Wochen. Die Pathogenität bzw. Virulenz des Erregers und die unterschiedlichen pathogenetischen Eigenheiten bestimmen die Krankheitserscheinungen bei den einzelnen Tierarten. Die klinischen Symptome beim Schwein variieren in Abhängigkeit des Lebensalters. Bei juvenilen Tieren überwiegen durch Meningoencephalitis und Virämie bestimmte Symptome (Appetitlosigkeit, Erbrechen, Mattigkeit, starker Durst, Lähmungserscheinungen, Krampfzuckungen, unphysiologische Bewegungen). Bei Adulten sind die klinischen Erscheinungen meist mild; innerhalb weniger Tage tritt Rekonvaleszenz ein (stumme Durchseuchung). In Mastbetrieben kommt es infolge der Sekundärinfektionen zu schweren katarrhalischen oder kruppösen Pneumonien. Bei den übrigen Tierarten stehen ausschließlich durch den Neurotropismus verursachte Symptome im Vordergrund (Reizungs-, Lähmungs-, vegetative Schockform), die innerhalb weniger Stunden bis Tage zum Tod führen. Das charakteristischste Symptom ist der akute Juckreiz (fehlt beim Schwein!) Differentialdiagnostik Als Differentialdiagnose sind beim Schwein hauptsächlich Coli-Enterotoxikose, Kochsalzvergiftung, ESP, Teschener Krankheit, sonstige Meningoencephalitiden, Schweineinfluenza und Pasteurellose in Betracht zu ziehen. Bei allen anderen Tierarten spielen die Tollwut und Vergiftungen die größte Rolle (Beer, J., Infektionskrankheiten der Haustiere, 1987, Gustav Fischer Verlag Jena, 881 pp) Diagnostische Indikation Tierverkehr (Tierhandel, Ausstellungen) klinischer oder epidemiologisch begründeter Verdacht Untersuchungen im Zuge von Anerkennungsverfahren und zum Nachweis der Seuchenfreiheit Quarantäne 31

32 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungs-, Tiergesundheitsämter bzw. Staatliche Lebensmittel- und Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Institut für Epidemiologie, Seestr. 55, Wusterhausen (nationales Referenzzentrum für Aujeszkysche Krankheit), Tel Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die Aujeszkysche Krankheit vom 5. November 1993 Richtlinie 64/432/EWG des Rates vom 26. Juni 1964 zur Regelung viehseuchenrechtlicher Fragen beim innergemeinschaftlichen Handelsverkehr mit Rindern und Schweinen/* KODIFIZIERTE FASSUNG CF 375Y0820(01) */ 93/24/EWG: Entscheidung der Kommission vom 11. Dezember 1992 über ergänzende Garantien hinsichtlich der Aujeszky-Krankheit für Schweine, die für seuchenfreie Mitgliedstaaten oder Regionen bestimmt sind Amtsblatt Nr. L 016 vom 25/01/1993 S /244/EWG: Entscheidung der Kommission vom 2. April 1993 über ergänzende Garantien hinsichtlich der Aujeszky-Krankheit für Schweine, die für bestimmte Teile des Gemeinschaftsgebiets bestimmt sind Amtsblatt Nr. L 111 vom 05/05/1993 S Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial Erregernachweis Nasen-, Rachen- und Genitaltupfer; Organmaterial wie Gehirn, Lunge, Tonsille (Menge: ca. 1 cm 3 ) bei verendeten bzw. geschlachteten Tieren, bei Saugferkeln evtl. auch Milz. Lagerung bei -20 C, optimal bei -80 C. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen führt zur drastischen Senkung des Virustiters und damit der Nachweisbarkeit in der Zellkultur. Untersuchungsmaterial Antikörpernachweis Nativblutproben, Seren; Menge: mindestens 500µl 6.3. Untersuchungsgang Erregernachweis Antigennachweis mittels direkter Immunfluoreszenz (IFT) Herstellung von Kryostatschnitten auf fettfreien Objektträgern, Fixierung der Kryostatschnitte in Azeton für 10 bis 15 min bei ca. -20 o C, Spülen in isotonischem Phosphatpuffer (IP) oder PBS, ph 7,2, für 5 min, Inkubation mit Konjugat in Arbeitsverdünnung bei 37 C (Dauer nach Produktinformation des Herstellers, Anti-PrV AV Gamakon B), 3mal Spülen in IP für insgesamt 10 min, kurzes Spülen in Aqua dest, lufttrocknen, Eindecken der Präparate in IP-Glycerol (9/1) 32

33 IF-Mikroskopie bei 200facher Vergrößerung unter Mitführung von Positiv- und Negativkontrollen Virusisolierung in der Zellkultur Das PrV vermehrt sich in Zellkulturen verschiedenster Herkunft mit charakteristischem cythopathogenem Effekt (CPE); am geeignetsten sind African Green Monkey (Vero)-Zellen. Folgende Methode hat sich bewährt: Virusisolierung Homogenisieren des Organmaterials, Herstellen einer Organsuspension (1:5 bis 1:10) unter Verwendung antibiotika- bzw. antimykotikahaltigen Mediums (Anlage), Lagerung für 1 bis 2 h bei 4 C im Kühlschrank, anschließende Zentrifugation. Inokulation des Überstandes auf die entsprechende Zellkultur (z.b. Vero, ML [mink lung]); zur Virusisolierung können 24-Lochplatten, Zellkulturröhrchen oder Zellkulturflaschen verwendet werden, das Zellkulturmedium sollte zur Verhinderung bakterieller Kontaminationen Antibiotika und Antimykotika in gebräuchlichen Konzentrationen enthalten (Anlage), anschließende Bebrütung bei 37 C für mindestens 7 Tage. tägliche Kontrolle des Auftretens eines CPE (bei hohem Virusgehalt diffus verteilte Zellabkugelungen nach ca. 1 bis 2 d, bei niedrigem Virusgehalt Entstehung von Synzytien oder einzelnen Plaques) bei latenten Infektionen kann unter Umständen eine bis zu 4fache Passagierung notwendig sein. Identifizierung des Virus durch Immunfluoreszenz an Deckglaskulturen Abtrypsinieren der CPE-Zellkultur, mischen mit einer Negativpopulation (1:2), vorsichtiges Abspülen der Objektträger in isotonischem Phosphatpuffer (IP), ph 7,2 (oder PBS), Auftragen der Zellen auf fett- und fluoreszenzfreie Objektträger, lufttrocknen, Fixierung in Azeton für 10 min bei Raumtemperatur (RT), 5 min IP, RT, nach kurzem Lufttrocknen Einlegen der Deckgläser in eine feuchte Kammer, Beschicken mit Konjugat (direkter IFT) bzw. monoklonalem Antikörper (indirekter IFT) (10 µl/objektträger je nach Gebrauchsverdünnung) die weitere Bearbeitung erfolgt unterschiedlich. Direkter IFT Inkubation mit FITC-Anti-AKV Konjugat (AV Gamakon B) in Gebrauchsverdünnung für 1 h bei 37 C (Gebrauchsverdünnung lt. Angaben des Herstellers) Indirekter IFT Inkubation mit monoklonalem AKV-Antikörper oder AKV-HIS vom Schwein je nach Gebrauchsverdünnung für 1 h bei RT in feuchter Kammer 2-malige kurzes Abspülen in IP und Einlegen in frischen Spülpuffer (IP) für mindestens 5 min Inkubation mit FITC-Anti-Maus IgG (Gebrauchsverdünnung lt. Hersteller) für 1 h bei RT, 2-maliges kurzes Abspülen in IP und Einlegen in frischen Spülpuffer für mindestens 10 min, kurzes Abspülen in A. dest, lufttrocknen, Präparate in noch leicht feuchtem Zustand auf fluoreszenzfreie Objektträger in IP- Glycerol (9/1) eindecken. 33

34 Identifizierung durch Virusneutralisationstest (s. NT) Inkubation des vermeintlichen PrV-Isolates in log 10-Verdünnungen mit einem PrVpositiven and PrV-negativen Referenzserum vom Schwein für 2 h bei 37 C, Inokulation des Virus-Serumgemisches auf 96-well Mikrotiterplatte (Vierfachansatz) und anschließende Bebrütung für 2 bis 3 Tage bei 37 C, Kontrolle der virusneutralisierenden Aktivität Nachweis von PrV-DNA mittels Polymerasekettenrektion (PCR) Die PCR kann zum Nachweis von PrV-DNA in Organproben sowie in Tupferproben genutzt werden und kann vor allem beim Nachweis latenter AK-Infektionen von Vorteil sein. Je nach Fragestellung sind in der Literatur verschiedene PCR-Techniken für die Aujeszkysche Krankheit beschrieben. Primer und die Amplifikationsparameter müssen entsprechend der Zielstellung ausgewählt werden. Die PCR muss für die jeweiligen spezifischen Bedingungen optimiert werden, um unter Routinebedingungen erfolgreich zu funktionieren. Der hohe GC- Gehalt des PrV kann zu Schwierigkeiten führen. Generelle Arbeitsschritte sind: Homogenisierung des zu untersuchenden Probenmaterials, Proteinase K-Verdau, 3x Phenol-Chloroform-Extraktion, anschließende Fällung der DNA mittels 3m Natriumacetat und absolutem Alkohol, Amplifikation Agarosegel-Elektrophorese Am nationalen Referenzzentrum für die Aujeszkysche Krankheit am FLI ist eine PCR zum Nachweis viraler DNA etabliert, mit der Fragmente des gp50-gens und des gc-gens nachgewiesen werden [Schang, L.M. and Orsorio, F. A. (1993). A quantitative technique for the study of the latency of Aujeszky virus. Rev. Sci. tech. Off. int. Epiz., 12, ]. Indirekter Erregernachweis Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Bezüglich der Durchführung der einzelnen ELISA-Tests wird auf die Produktinformationen der Hersteller verwiesen. Serumneutralisationstest zur Antikörperbestimmung (SNT) Mit dem VNT (s. NT) wird die spezifische und unspezifische virusneutralisierende Aktivität eines Testserums gemessen. Ausführung: Virusvermehrung aus Masterstockvirus (z. B. Laborstamm AK-64) auf Vero-Zellen in Zellkulturflaschen (Dichte Zellen/ml), Virusernte nach ca. 24 bis 48 h (CPE sollte ca. 80 bis 90 % des Zellrasens erfasst haben), 3x Einfrieren-Auftauen mit anschließender Zentrifugation Titration des Arbeitsvirus auf Mikrotiterplatten (Vierfachansatz), Bestimmung des Virustiters nach Kärber (nach 48 h), Arbeitsvirus aliquotieren in 1 ml Portionen, Lagerung bei -80 C, Einstellen der Virussuspension auf 200 KID 50 /0,1ml, Serum von Nativblutproben (keine EDTA-Plasmaproben); Inaktivierung in Mediumverdünnung (1:2) für 30 Minuten bei 56 C im Wasserbad, 34

35 Serumverdünnung der Test- und Referenzseren (Positiv- Negativserum) in lg2- Schritten in Mikrotiterplatte oder Röhrchen (100 µl) Zugabe eines äquivalenten Volumens (100µl) der Virussuspension (200 KID 50 /0,1ml), Inkubation für 2 h bei 37 C (Inkubation für 24 h erhöht die Sensitivität des Tests), Inokulation eines 1 d alten Monolayers (Vero-Zellen, Dichte ca Zellen/ml), bei dieser Zellkonzentration soll sich nach einem Tag ein fast konfluenter Monolayer ausgebildet haben), Platten für 3 Tage bei 37 C inkubieren. mikroskopische Ablesung des Tests, Bestimmung des Ak-Titers nach Kärber (Grenzwert = 1:4). Anhang Zelllinien Virusisolierung: Vero 76: VNT Katalognummer: 228 Bezugsquelle: Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin am FLI, Institut für Infektionsmedizin, Insel Riems, Dr. Riebe Medien Medien für Zelllinie Vero 76: Anzuchtmedium: 89 % Eagle MEM Dulbecco w/l-glut 10 % Fetales Kälberserum (FKS) 1 % Antibiotika Antibiotika: Amphotericin B (250µg/ml) Penicillin ( IE/l), Streptomycin (100 mg/l) oder Gentamycin (50mg/ml) Erhaltungsmedium: 96 % Eagle MEM Dulbecco w/l-glut 3 % FKS 1 % Antibiotika Puffer, Lösungen, Reagenzien PBS: 8,00g NaCl + 0,2g KH 2 PO 4 + 2,9g Na 2 HPO 4 x 12 H ,2g KCl ad ml Bidest, ph 7,2 Isotonischer 8,28g NaCl + 3,30g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 0 ad ml Bidest Phosphatpuffer: (IP) ph 7,8 IP-Glycerol: IP - Glycerol = 9 : 1 Anti-AKV-Konjugat: AV - Gamakon B (Bioveta, n.p. Nitra) 35

36 7. Aviäre Influenza 7.1. Charakterisierung der Infektion `Geflügelpest' ist ein historischer Krankheitsbegriff, der im englischen Sprachraum in den letzten Jahren generell durch `avian influenza' (aviäre Influenza) ersetzt wurde. Infektionen mit aviären Influenzaviren variieren, abhängig vom viralen Sub- bzw. Pathotyp sowie wirtsspezifischen Faktoren, stark in der Schwere der Erkrankung. Neben inapparenten Formen sind perakute Verlaufsformen mit bis zu100 % Mortalität möglich. Ausschlaggebend dafür ist vor allem die Virulenz des Erregerstammes. Der Begriff `Geflügelpest' beinhaltet nur die schweren, anzeigepflichtigen Verlaufsformen der aviären Influenza, hervorgerufen durch hochpathogene Virusstämme, die sich bislang ausschließlich aus den Subtypen H5 und H7 rekrutiert haben. Alle Infektionen des Hausgeflügels mit aviären Influenzaviren der Subtypen H5 und H7, also auch solche mit Stämmen niedriger Pathogenität, sind gemäß geltendem EU- Recht bekämpfungspflichtig Erreger Influenzaviren gehören zur Familie Orthomyxoviridae. Es sind umhüllte RNA-Viren, die aufgrund der Antigenität ihrer Nukleo- und Matrixproteine in die Typen A, B und C und, im Falle des Typs A, nach den Hüllantigenen Hämagglutinin (H) und Neuraminidase (N) in Subtypen unterteilt werden. Sie zeigen eine große antigene Vielgestaltigkeit und Wandlungsfähigkeit und ein breites Virulenzspektrum. Die von Vögeln isolierten Influenzaviren gehören ausnahmslos zum Typ A und umfassen derzeit mindestens 16 H- und 9 N-Subtypen in (theoretisch) 144 Kombinationen. Reservoir aller dieser Subtypen sind aquatisch lebende Wildvögel. Alle bisher isolierten hochpathogenen aviären Influenzaviren (HPAIV) - Erreger der Geflügelpest - gehörten zum Subtyp H5 oder H7. Es gibt jedoch auch H5- und H7-Virusisolate von niedriger Pathogenität (engl. `low pathogenic avian influenza viruses', LPAIV). Letztere haben die Potenz zu einer sprunghaften Pathogenitätssteigerung und sind als potentielle Erreger der Geflügelpest anzusehen. Entscheidend für Einstufung gemäß Tierseuchenrecht ist hierbei einerseits das Verhalten im Versuchshuhn (Bestimmung des intravenösen Pathogenitätsindex, IVPI) sowie gleichrangig- andererseits die Aminosäuresequenz im Bereich der endoproteolytischen Schnittstelle des Hämagglutinins (monobasisch versus polybasisch). Isolate mit einem IVPI > 1.2 werden als hochpathogen bewertet, solche mit Indices < 1.2 sind niedrigpathogen. Alternativ hierzu werden Isolate mit monobasischer Schnittstelle definitionsgemäß als niedrig-pathogen bewertet. Solche mit polybasischer Schnittstelle sind als hochpathogen einzustufen. Alle H5- und H7-Viren werden aufgrund der Bedeutung in der OIE- Klassifizierung als notifiable avian influenza = NAI bezeichnet Klinische Symptomatik Vermutlich sind alle Vogelspezies empfänglich für eine Influenzavirusinfektion; bei Wildvögeln treten jedoch nur selten Erkrankungen auf. Auch die Hausgeflügelarten erkranken nicht einheitlich. Hochempfänglich sind Hühnervögel, vor allem Puten und Hühner; bei ihnen kann die Mortalität nach Infektionen mit HPAIV bis 100 % betragen. Puten zeigen nicht selten auch bei Infektionen mit LPAIV klinische Symptome. 36

37 Abbildung 1: Pekingente mit zentralnervösen Störungen (Inkoordination, Lähmungen) nach Infektion mit HPAIV H5N1 (Dr. Werner, FLI) Die Hauptsymptome der durch HPAIV ausgelösten Geflügelpest sind Rückgang des Futterverbrauchs, Apathie, Atemnot, Ödeme der Kopfregion, Zyanose und Ödeme der Kopfanhänge, Durchfall, hohe Mortalität, bei Legetieren Einbruch der Eiproduktion. Oft sterben die Tiere auch ohne vorherige klinische Symptome. Bei der Sektion können gelegentlich Hämorrhagien auf den Serosen (Abb. 2), im Drüsenmagen u.a. Organen, Pankreasveränderungen (Abb. 3) sowie bei Legetieren hämorrhagische Eierstocksentzündung und Dotterperitonitis beobachtet werden. Weder klinisches Bild noch Sektionsbefund sind pathognomonisch. Abbildung 2: Subepikardiale petechiale Blutungen (Prof. Dr. Teifke, Institut für Infektions medizin, FLI) 37

38 Abbildung 3: Umschriebene Pankreasnekrosen (Prof. Dr. Teifke, Institut für Infektionsmedizin, FLI) Differentialdiagnostik Bei plötzlichem Auftreten einer schweren Allgemeinerkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität ist immer auch an Geflügelpest zu denken. Differentialdiagnostisch sind Newcastle Krankheit (engl. `Newcastle Disease', ND), Geflügelcholera und akute Vergiftungen abzuklären. Im Verdachtsfall sind frisch verendete oder moribunde Tiere im zuständigen Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt zu untersuchen. Für die Diagnose ist die Virusisolierung oder der molekular-diagnostische Genomnachweis und die Bestimmung der Pathogenität des Erregers mittels Tierversuch oder molekulardiagnostischer Verfahren erforderlich. In der Richtlinie 2005/94/EG vom 20. Dezember 2005, auf die sich auch die in Überarbeitung befindliche bundesdeutsche Geflügelpest-Verordnung bezieht (zuletzt gültige Neufassung vom 3. November 2004), ist für die diagnostischen Verfahren zur Bestätigung und Differentialdiagnose der Geflügelpest sinngemäß folgende Definition gegeben: Die Geflügelpest ist eine Infektionskrankheit, die von einem Influenza-A-Virus mit einem intravenösen Pathogenitätsindex (IVPI) in sechs Wochen alten Hühnern von 1,2 oder mehr verursacht wird bzw. eine Influenza-A-Infektion der Virussubtypen H5 und H7, bei der im Rahmen einer Nukleotid-Sequenzanalyse das Vorhandensein multipler basischer Aminosäuren im Spaltbereich des Hämagglutinins nachgewiesen wurde. Die oben genannte EU-Richtlinie legt in Übereinstimmung mit den Regelungen des OIE darüberhinaus fest, dass Infektionen des Hausgeflügels mit allen Viren vom Subtyp H5 und H7 (NAI), unabhängig vom jeweiligen Pathotyp, zu maßregeln sind. Weiterhin führen Nachweise des HPAIV H5N1 asiatischer Herkunft auch bei Wildvögeln zu weitreichenden Bekämpfungsmaßnahmen. 38

39 Diagnostische Indikation An Geflügelpest muss generell bei schwerer Allgemeinerkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität insbesondere in gegen ND geimpften Geflügelbeständen gedacht werden. Die Geflügelpest-VO legt fest, ab welchen welchen Verlustraten und bei welchen Veränderungen eine Untersuchung auf Geflügelpest (Ausschlußdiagnostik) unverzichtbar ist Zuständige Untersuchungseinrichtungen staatlich autorisierte Veterinäruntersuchungsämter bzw. Staatliche Lebensmittel- und Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Greifswald-Insel Riems (O.I.E. und Nationales Referenzlabor für aviäre Influenza), Tel Rechtsgrundlagen Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der aktuell gültigen Fassung Richtlinie 2005/94/EG vom 20. Dezember 2005 Diagnostikhandbuch der EU für Aviäre Influenza gem. Entscheidung 2006/437/EG vom 4. August 2006 Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest und die Newcastle Krankheit (Geflügelpest-VO) in der Fassung vom 3. Nov (zur Zeit in Überarbeitung) Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der Fassung vom 3. Nov Eine Serie von Eilverordnungen wurde seit 2005 im Zusammenhang mit Maßnahmen zur Prävention von Ausbrüchen durch das aus Asien stammende Geflügelpestvirus H5N1 erlassen. Die dort festgelegten Maßnahmen finden Eingang in die für 2007 zu erwartende Neufassung der Geflügelpestverordnung Untersuchungsmaterial Erregernachweis Kloakenabstriche oder Fäzes und Abstriche aus dem Oropharynx von lebenden Vögeln. Fäzes oder Darminhalt, Hirngewebe, Luftröhre, Lunge, Niere, Milz, Leber sowie andere Organe kürzlich verendeter oder getöteter Tiere. Fäkalmaterial ist von anderen Proben getrennt zu halten. Alle Probenmaterialien sollten während des Transportes gekühlt werden. Abstriche sollten ganz in ein Stabilisierungsmedium (antibiotisch, proteinhaltig) eingetaucht werden Antikörpernachweis Blutproben, von denen Plasma oder nach Gerinnung das Serum für die Untersuchung gewonnen wird. Anstelle von Serum kann auch Eidotter aufbereitet und untersucht werden. Die jeweils zu entnehmenden Stichprobengrößen regelt das Diagnostikhandbuch der EU im Detail. 39

40 7.3. Untersuchungsgang Siehe Abbildung 4 Abbildung 4: Untersuchungsgang zum direkten Erregernachweis bei Geflügelpest gem. EU- Diagnostikhandbuch, modifiziert durch NRL Direkter Erregernachweis Probenaufbereitung Organe und Gewebe können gepoolt werden, nur Fäkalmaterial ist gesondert zu behandeln. Abstriche sollten ganz in antibiotisches Medium getaucht werden. Fäzes und Organe sind in antibiotischem Medium im geschlossenen Homogenisator oder mit Mörser und Pistill und sterilem Sand zu zerkleinern (Sicherheitsvorkehrungen zur Vermeidung von Aerosolen sind zu beachten), um eine 10- bis 20%ige Suspension herzustellen. Zur Entfaltung der antibiotischen Wirkung sind die Suspensionen für etwa 2 Stunden bei Umgebungstemperatur (bei 4 C entsprechend länger) stehen zu lassen und danach durch Zentrifugieren zu klären (z.b. 800 bis 1000 g für 10 Minuten). Virusisolierung in embryonierten Hühnereiern Pro Probe sind mindestens 4 embryonierte, 8 bis 10 Tage vorbebrütete Hühnereier mit je 0,1 bis 0,2 ml des geklärten Überstandes in die Allantoishöhle zu beimpfen. Die Eier sollten aus einer spezifiziert pathogenfreien (SPF) Herde stammen; im Notfall können auch Eier aus einem Bestand verwendet werden, der nachweislich frei von Influenza-Antikörpern ist. 40

41 Die beimpften Eier werden bei 37,0 C bis 37,8 C weiterbebrütet und täglich durchleuchtet. Eier mit toten oder absterbenden Embryonen sind auf 4 C abzukühlen, ebenso alle verbliebenen Eier 5 Tage nach der Beimpfung. Die Allantois- und Amnionflüssigkeiten (AAF) sind auf Hämagglutination zu untersuchen. Läßt sich keine Hämagglutination feststellen, wird die unverdünnte AAF erneut auf Eier verimpft (2. Eipassage). Wird Hämagglutination festgestellt, so muss eine bakterielle Kontamination ausgeschlossen werden. Sind Bakterien vorhanden, so können die AAF durch 450 nm-membranfilter gegeben werden und nach Zugabe weiterer Antibiotika erneut auf embryonierte Eier verimpft werden. Zellkulturen sind wegen ihrer geringeren Sensitivität für die Isolierung von Influenzavirus derzeit nicht geeignet. Es wird mit Nachdruck empfohlen, diese Methode nicht als Standardmethode einzusetzen. Antigen-Schnelltests Für den Nachweis von Influenzavirusantigen binnen 20 bis 40 Minuten werden eine Reihe von konfektionierten Testbestecken kommerziell angeboten. Diese Tests zeichnen sich durch eine sehr einfache Handhabung aus und wären daher auch durch Laien und direkt im Stallbereich anwendbar. Derzeit liegen jedoch nur begrenzte Erfahrungen im Umgang mit diesen Tests im Felde vor. Aus experimentellen Untersuchungen, u. a. im NRL, wurde jedoch eine gegenüber der Virusiolierung und den PCR-Nachweisverfahren deutlich verminderte Sensitivität dieser Tests erkennbar. Somit sind diese Tests nicht für eine Ausschlussdiagnostik am Einzeltier einsetzbar, da ein negatives Ergebnis das Vorhandensein anzeigepflichtiger Influenzaviren des Typs A nicht sicher ausschließt. Diese Tests (auch wenn eine Zulassung des FLI vorliegt) können also derzeit bestenfalls für eine (nicht-amtliche!) grob orientierende Voruntersuchung eingesetzt werden und ersetzen niemals Untersuchungen mittels Virusisolierung oder RT-PCR. Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR Aus Kloaken- und Rachentupferproben und aus Organ- und Fäzesmaterial kann virale RNA mittels RT-PCR oder real-time RT-PCR (rrt-pcr) nachgewiesen werden. Der rrt-pcr ist aufgrund ihrer höheren Sensitivität und des geringeren Kontaminationsrisikos der Vorzug zu geben. Die PCR kann vor der Virusisolierung, parallel dazu oder als Bestätigungstest (z.b. virushaltige AAF) eingesetzt werden. Für den Ja-/Nein-Nachweis von Influenza A-Virus- RNA wird eine rrt-pcr durchgeführt, die einen Teil des Matrixprotein-Gens amplifiziert. Darüberhinaus werden rrt-pcr-teste zum subtypspezifischen Nachweis von H5-, H7- und N1-AIV eingesetzt. Die durch das Referenzlabor der EU derzeit validierten Methoden sind dem Diagnostikhandbuch der EU zu entnehmen oder können im Nationalen Referenzlabor (NRL) abgefragt werden. Gegenüber den Angaben des Diagnostikhandbuchs werden im NRL erweiterte rrt-pcr Methoden eingesetzt (Abb. 1), die auch den Einsatz einer internen Kontrolle zum Ausschluss falsch-negativer Befunde durch PCR-Inhibitionen beinhalten. Methodik und Referenzmaterial können im NRL abgefordert werden. ACHTUNG! Wurde ein Influenzavirus der Subtypen H5 oder H7 bei Hausgeflügel nachgewiesen, ist die Probe zusammen mit einem Aliquot der extrahierten RNA bzw. das Isolat sofort zur weiteren Charakterisierung an das Nationale Referenzlabor für aviäre Influenza im FLI, Insel Riems weiterzuleiten 41

42 Tabelle 1: Zu kalkulierende Dauer der diagnostischen Methoden zum Nachweis und zur Charakterisierung aviärer Influenzaviren PCR mit Ergebnis Influenza Ja/Nein Methodik PCR mit Ergebnis AIV H5 oder H7 sowie rrt- Pathotypisierung (H5); Pathotypisierung mittels Nukleotidsequenzierung Virusanzucht und H-Subtypisierung (Verdacht HPAIV) Aussagen zur Pathogenität mittels Tierversuch (Bestätigung HPAIV) Ausschluss Geflügelpest mittels klassischer Methodik (Nachweis von Influenzavirus mit IVPI < 1.2) bzw. Ausschluß AIV (fortgesetzte Passagierung mit negativem Ergebnis) Dauer 1 Tag 1-3 Tage 2-4 Tage 3-6 Tage 14 Tage 21 Tage Indirekter Erregernachweis Gezielte Untersuchungen auf Antikörper gegen Influenzavirus vom Subtyp H5 oder H7 oder einen anderen H-Subtyp können mit dem HAHT unter Einsatz des H-Subtyp-spezifischen Antigens erfolgen. Zur allgemeinen Voruntersuchung auf Antikörper gegen eine Influenza-A-Virusinfektion sind vor allem ELISA Tests geeignet, bei denen Antikörper nachgewiesen werden, die gegen die gruppenspezifischen Antigene gerichtet sind. Im Falle positiver Reaktionen müssen die Antikörper mittels HAHT subtypisiert werden. Die Anwendung kommerzieller ELISA-Kits erfolgt nach den Empfehlungen des Herstellers. Hierbei ist auf das Vorliegen einer Zulassung für amtliche Untersuchungen der einzusetzenden Tests durch das FLI zu achten. Hämagglutinations-Test (HAT) (Arbeitsvorschrift) Reagenzien Phosphatgepufferte isotonische Kochsalzlösung (PBS), ph 7,1 bis 7,3 Hühnererythrozyten-Suspension, 1%ig, dreimal gewaschen in PBS zu untersuchende Virussuspension - Ei- oder Zellkulturflüssigkeit oder Überstände von Organanreibungen, - AF als Antigen für Hämagglutinationshemmungsteste Arbeitsschritte 0,025 ml PBS in alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit U- oder V-Boden einfüllen. 0,025 ml Virussuspension in die erste Vertiefung geben. Eine 2er-Verdünnungsreihe des Virus über die gesamte Platte herstellen. Nochmals 0,025 ml PBS in jede Vertiefung füllen. 0,025 ml 1%ige Erythrozytensuspension in jede Vertiefung hinzugeben. Durch vorsichtiges seitliches Antippen oder Rütteln der Platten mischen. Nach 30 bis 40 Minuten bei Zimmertemperatur, wenn sich die Erythrozyten in der Erythrozytenkontrolle (ohne Virussuspension) abgesetzt haben, ist der Test abzulesen. 42

43 Die Platte schräg halten und beurteilen, ob die sedimentierten Erythrozyten ablaufen. Zeigen die Erythrozyten die gleiche Strömungsrate wie die in den nichtvirushaltigen Kontrollen, liegt keine HA vor. Der HA-titer ist die höchste Verdünnung, die Agglutination verursacht. Diese Verdünnung enthält 1 HA-Einheit (HAE). Für eine genauere HA-Titer-Bestimmung als Vortest für HAH muss bei der Virusverdünnung neben 1: 2 auch von einer Anfangsverdünnung 1: 3 ausgegangen werden. Hämagglutinations-Hemmungs(HAH)-Test (Arbeitsvorschrift) Reagenzien Phosphatgepufferte isotonische Kochsalzlösung (PBS), ph 7,1 bis 7,3 Virus- bzw. Antigensuspension, mit PBS verdünnt auf 4 HAE pro 0,025 ml Hühnererythrozyten-Suspension, 1%ig negatives Kontrollserum positives Kontrollserum zu untersuchendes Serum Arbeitsschritte 0,025 ml PBS in alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit U- oder V-Boden einfüllen. 0,025 ml Serum in die erste Vertiefung geben. Eine 2er-Verdünnungsreihe des Serums über die gesamte Platte herstellen. 0,025 ml verdünnte Virussuspension, die 4 HAE enthält, in jede Vertiefung geben. Durch vorsichtiges seitliches Antippen oder Rütteln der Platten mischen. Die Platten für 45 Minuten bei Zimmertemperatur stehenlassen. 0,025 ml 1%ige Erythrozytensuspension in jede Vertiefung zugeben. Durch vorsichtiges Antippen oder Rütteln mischen. Nach 30 bis 40 Minuten bei Zimmertemperatur, wenn sich die Erythrozyten abgesetzt haben, ist der Test auszuwerten. Die Platte schräg halten und beurteilen, ob die sedimentierten Erythrozyten ablaufen. Bei gleicher Strömungsrate wie in den nichtvirushaltigen Kontrollen liegt keine HA vor. Der HAH-Titer ist die höchste Serumverdünnung, die eine HA komplett hemmt. Wertung: Ein Serum mit einem HAH-Titer von 2 4 oder mehr gilt als positiv. ACHTUNG! Seren können unspezifische Inhibitoren enthalten, die eine Hemmung vortäuschen. Positive Reaktionen sind deshalb durch eine Vorbehandlung der Seren abzuklären. 43

44 Anlagen Antibiotisches Medium für Kloakenabstriche oder Fäzes-Material PBS oder Zellkulturmedium mit Einheiten/ml Penizillin 10 mg/ml Streptomyzin 0,25 mg/ml Gentamyzin Einheiten/ml Mykostatin Serumzusatz (5 bis 10%) Achtung! Kein Pferdeserum verwenden (enthält möglicherweise Influenzavirusspezifische Antikörper) Für Gewebeproben und Trachealabstriche wird nur 1/5 der Antibiotikakonzentration benötigt. Anstelle von Penizillin, Streptomyzin und Gentamyzin können auch 0,5 bzw. 0,1 mg/ml Enrofloxacin (Baytril) zugesetzt werden. Achtung! Nach der Zugabe der Antibiotika muss der ph-wert des Mediums wieder auf 7.0 bis 7.4 eingestellt werden. Kommerziell erhältliche Diagnostika: Eine Liste der zugelassenen Mittel für die AIV Diagnostik ist auf der Homepage des FLI ( zu finden. Sofern zugelassene kommerzielle Diagnostika nicht verfügbar sind, werden die vom NRL empfohlenen Methoden eingesetzt. Regelmäßige, z.b. jährliche Rückfragen beim NRL (timm.harder@fli.bund.de) betreffend Aktualisierungen dieser Methoden sind erforderlich. Die empfohlenen Methoden beruhen auf Vorschriften, die im Netzwerk der europäischen AI- Referenzlabore abgestimmt und validiert wurden. Literatur Hoffmann B, Harder T, Starick E, Depner K, Werner O, Beer M. (2007). Rapid and highly sensitive pathotyping of avian influenza A H5N1 virus by using real-time reverse transcription-pcr. J Clin Microbiol. 45:

45 8. Befall mit Kleinem Beutenkäfer (Aethina tumida) 8.1. Charakterisierung des Befalls Erreger Der Kleine Beutenkäfer, Aethina tumida Murray, Coleoptera: Nitidulidae (Murray 1867), kommt natürlich in Afrika südlich der Sahara vor. Der Käfer hat sich inzwischen durch Importe von Bienen auf andere Kontinente ausgebreitet. Der Käfer sucht seine Wirte, die Bienenvölker, zur Vermehrung auf. Nach der Verpaarung im Bienenvolk werden die Eier in unregelmäßigen Gelegen bevorzugt in Spalten der Beuten oder in Waben, die Pollen und Brut enthalten, abgelegt. Nach zwei bis sechs Tagen schlüpfen die Larven und beginnen zu fressen. Nach zehn bis 29 Tagen haben die Larven ihr Wachstum abgeschlossen und sind ca. zehn bis zwölf Zentimeter lang. Die Larven wandern nun durch den Stockeingang und bohren sich meist in unmittelbarer Nähe des befallenen Volkes in den Boden. Sie können aber auch größere Entfernungen zurücklegen. Im Boden bauen sie glattwandige Erdzellen, in denen sie sich verpuppen. Die Verpuppung dauert je nach Temperatur und Feuchtigkeit drei bis vier Wochen. Danach schlüpfen die ausgewachsenen Käfer und suchen neue Beuten mit Bienenvölkern auf. Damit ist der Lebenszyklus des Kleinen Beutenkäfers abgeschlossen Klinische Symptomatik Der Käfer lebt und vermehrt sich hauptsächlich in Bienenvölkern und gelagerten Bienenprodukten, z.b. Waben, kann sich jedoch auch auf Obst fortpflanzen. Die Larven fressen Honig, Pollen und Brut und zerstören dabei nicht nur die Waben, sondern verderben auch den Honig. Leicht befallene Waben zeigen Fressgänge der Larven, sowie Verschleimung des Honigs. Stark befallene Waben zerfallen. Am Beutenboden verbleibt bei starkem Befall häufig nur ein schwärzlich trockenes Mehl (Fraßmehl) aus dem Kot der Larven und zerstörtem Wachs. Sind Honigwaben befallen, so läuft der vergorene, schleimige Honig aus den Waben auf den Boden. Zusammen mit dem Kot der Waben ergibt sich ein fauliger Geruch Differentialdiagnostik Der Kleine Beutenkäfer kann z.b. mit dem nahe verwandten Glanzkäfer, Cychramus luteus, der ebenfalls in Bienenvölkern vorkommenden kann, leicht verwechselt werden. Die Eier des Kleinen Beutenkäfers sind mit 1,4x0,26 mm etwa um ein Drittel kleiner als Eier der Honigbiene. Käferlarven können von Wachsmottenlarven anhand ihrer morphologischen Merkmale leicht unterschieden werden: Wachsmottenlarven haben Bauchfüße am 3. und 6. Hinterleibssegment, Käferlarven besitzen sechs voll ausgebildete Beine in unmittelbarer Nähe des Kopfes und dorsale Stachelreihen Diagnostische Indikation Tierverkehr klinischer oder epidemiologischer Verdacht Untersuchungen im Rahmen des Nachweises der Seuchenfreiheit (Gesundheitszeugnisse für das Verbringen der Bienenvölker an einen anderen Standort) 45

46 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungsämter, Tiergesundheitsämter bzw. Staatliche Lebensmittelund Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer. Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg, Tierhygiene, Am Moosweiher 2, Freiburg (Nationales Referenzlabor für den Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer, Referenzlabor für Bienenkrankheiten des Internationalen Tierseuchenamtes/OIE), Tel 0761/ Rechtsgrundlagen Bienenseuchenverordnung vom (BGBl. I S. 1552),in der jeweils geltenden Fassung Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung bieten sich der adulte Käfer oder die Larven, der Beutenboden (Bodeneinlagen), und die Waben bzw. Honigwaben an. 1. Untersuchungsmaterial Gemülle Eine einfache Methode zur Diagnose des Kleinen Beutenkäfers besteht in der Untersuchung des Beutenbodens. Bei starkem Befall trockener Waben (Pollen und/oder Brut) verbleibt häufig nur noch ein schwärzliches trockenes Pulver (Fraßmehl) aus dem Kot der Larven und zerstörtem Wachs, das sich auf dem Boden der Beute anhäuft. In diesem Pulver können sich die Larven oder Käfer verstecken. So kann der Beuteboden direkt makroskopisch auf vorhandene Käfer oder Larven untersucht werden. Käferfallen Die Käfer verstecken sich vor Licht oder den attackierenden Bienen meist in Spalten und Ritzen, bevorzugt in der Nähe des Bodenbretts. Man kann daher am Beutenboden Käferfallen auslegen. Diese können im einfachsten Fall aus einem Stück Wellpappe bestehen, unter dem sich die Käfer sammeln. Effektiver kann man die Käfer in einem am Beutenboden ausgelegten Doppelstegstreifen aus Plastik ( mm) fangen. 2. Untersuchungsmaterial Waben Durch das Fressen und Kotabsetzen der Larven des kleinen Beutenkäfers werden die Honigwaben stark beschädigt und bekommen ein schleimiges Aussehen. Der Honig ist verdorben und unbrauchbar. Leere Waben und Brutwaben weisen Fraßgänge der Larven auf. 46

47 8.3. Untersuchungsgang 1. Identifizierung der adulten Käfer und Larven Die Bestimmung des Käfers und Larven erfolgt aufgrund ihres Aussehens und der morphologischen Besonderheiten. Weiteres hierzu siehe in der Broschüre des Bundesministeriums für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft Der kleine Beutenkäfer Erkennen und Bekämpfen. Als Vergleichsmaterial dienen abgestorbene Käfer bzw. Larven. 2. Molekularbiologische Methoden: PCR Molekulargenetische Methoden werden in Kürze angeboten. 3. Serologische Tests Antiseren sind zurzeit nicht käuflich zu erwerben. 47

48 9. Befall mit der Tropilaelaps-Milbe (Tropilaelaps spp.) 9.1. Charakterisierung der Infektion Erreger Tropilaelaps-Milben sind braun-rot-gefärbte, längliche Parsiten mit einer Größe von 0,7mm bis zu 1mm.. Sie können sich sehr schnell auf den Waben der Honigbienen fortbewegen. Bis zu zwei Tagen halten sie sich auf erwachsenen Bienen auf (phoretische Phase). Dort parasitieren sie nicht, da sie im Gegensatz zu Varroa-Milben den Chitinpanzer der Bienen nicht durchstechen können. Die Milbenweibchen (bis zu einem Dutzend pro Zelle) legen kurz vor der Deckelung 1 bis 4 Eier in die Brutzellen der Bienen. Die Milbenentwicklung dauert ca. eine Woche, danach verlassen die ausgewachsenen Milben einschließlich des Gründerweibchens mit der schlüpfenden Biene die Zelle Klinische Symptomatik Bienen mit verkürztem Abdomen und missgebildeten Flügeln, sowie missgebildeten oder fehlenden Gliedmassen können ein Anzeichen für den Befall mit Tropilaelaps-Milben sein. Brutwaben weisen ähnlich wie bei einem Befall mit Varroa-Milben tote Brut mit eingesunkenem oder teilweise entferntem Zelldeckel auf Differentialdiagnostik Die Differentialdiagnose mit Varroamilben (Varroa destructor) oder Bienenläusen (Braula coccea) ist leicht visuell oder makroskopisch mit einer schwachen Lupe (vierfache Vergrößerung) möglich. Eine genauere Abgrenzung hinsichtlich der morphologischen Merkmale ist bei Pollenmilben und anderen auf den Waben laufenden Milben notwendig Diagnostische Indikation Tierverkehr klinischer oder epidemiologischer Verdacht Untersuchungen im Rahmen des Nachweises der Seuchenfreiheit (Gesundheitszeugnisse für das Verbringen der Bienenvölker an einen anderen Standort) Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungsämter, Tiergesundheitsämter bzw. Staatliche Lebensmittelund Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer oder die von den Ländern beauftragten staatlichen Einrichtungen. Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg, Tierhygiene, Am Moosweiher 2, Freiburg (Nationales Referenzlabor für den Befall mit dem Tropilaelaps- Milben, Referenzlabor für Bienenkrankheiten des Internationalen Tierseuchenamtes/OIE), Tel 0761/ Rechtsgrundlagen Bienenseuchenverordnung vom (BGBl. I S. 1552),in der jeweils geltenden Fassung. 48

49 9.2. Untersuchungsmaterial Um einen Befall in einem Volk zu erkennen, müssen die Proben gezielt gesammelt und entnommen werden. 1. Untersuchungsmaterial Gemülle Eine einfache Methode zur Diagnose des Befalls mit Tropilaelaps-Milben besteht in der Untersuchung von dem im Bienenvolk gewonnenen Gemülle, das auf einer am Boden der Beute eingelegten Einlage gesammelt wird. Die Bodeneinlagen sollten nicht länger als zwei Tage im Volk liegen, da die Milben sonst von Ameisen entfernt werden könnten. Es kann von Vorteil sein, die Bodeneinlagen mit Vaseline oder Melkfett zu bestreichen, damit die Milben darin haften. 2. Untersuchungsmaterial Bienenbrut Für die Diagnose des Befalls der Brut mit Tropilaelaps-Milben kann nur gedeckelte Brut verwendet werden. Drohnenbrut eignet sich besser als Arbeiterbrut. 3. Untersuchungsmaterial adulte Bienen Bienenproben eigen sich nur bedingt zur Untersuchung auf den Befall mit Tropilaelaps- Milben. Die Milbe sitzt sehr locker auf den Bienen und verlässt tote Bienen sofort. Am besten füllt man lebende Bienen direkt in ein Gefäß und tötet sie darin durch Einfrieren ab Untersuchungsgang 1. Untersuchung von Gemülle Ist nur wenig Gemülle vorhanden, kann die Bodeneinlage direkt makroskopisch auf vorhandene adulte Milben untersucht werden. Bei sehr großen Gemüllemengen ist es vorteilhaft, eine Untersuchung mit Hilfe des Flotationsverfahrens durchzuführen. Das Gemülle sollte vor der weiteren Verarbeitung für die Dauer von 24 Stunden getrocknet werden. Anschließend wird es mit der doppelten Menge vergälltem Alkohol aufschwemmt und für eine Minuten gerührt. Nur wenn das Gemülle Propolispartikel enthält, muss es 10 bis 20 Minuten gerührt werden. Die an der Oberfläche schwimmenden Milben können nun identifiziert und gezählt werden. 2. Untersuchung von Bienenbrut Welche der folgenden Methoden verwendet wird, hängt von dem Umfang der Probe und von der notwendigen Genauigkeit der Untersuchung ab. Soll ein Überblick über einen Befall gegeben werden, so kann die Brutfläche insgesamt untersucht werden. Untersuchung von Brutflächen Mit einem Messer werden die Zelldeckel der Brutfläche entfernt und die Brut direkt mit warmem Wasser aus der Handbrause in ein doppeltes Siebsystem gewaschen. Die Brut und andere Teile aus dem oberen groben Sieb (Maschenweite 2 bis 3 mm) kann man verwerfen. Die Milben können im unteren feinen Sieb (Maschenweite <1 mm) gesammelt werden. Zur leichteren Identifizierung der Milben schlägt man den Inhalt des Siebes auf eine helle Unterlage. 49

50 Untersuchung von einzelnen Brutzellen Zur Untersuchung von einzelnen Brutzellen werden die Zelldeckel mit einer Pinzette oder Skalpell entfernt, die Brut der Honigbienen aus der Zelle entfernt und dann die Brut sowie das Innere der Zelle unter Zuhilfenahme einer Kaltlichtlampe auf vorhandene Milben bzw. andere Anzeichen eines Milbenbefalls untersucht. 3. Untersuchung von adulten Bienen Bei einer kleinen Probe (< 50 Bienen) reicht es aus, die Bienen makroskopisch zu untersuchen. Bei großen Bienenmengen kann ein Auswaschungsverfahren verwendet werden. Auswaschungsverfahren: Noch lebende Bienen mit Äther abtöten oder alternativ für die Dauer von mindestens zwei Stunden in ein Tiefkühlfach bei etwa < -12 C stellen. Die toten Bienen in einen Glaskolben mit der doppelten Menge an vergälltem Alkohol füllen und 10 Minuten lang schütteln. Anschließend die Bienen von den Tropilaelaps-Milben mit einem Sieb (Maschenweite 2 bis 3 mm) trennen und auszählen 4. Auswertung Tropilaelaps-Milben können mit bloßem Auge erkannt werden. Die Bestimmung der Milben und deren Nachkommen erfolgt aufgrund ihres Aussehens und ihrer morphologischen Besonderheiten. Nähere Angaben im Manual Standards for Diagnostic and Vaccines der OIE (2008). 5. Molekularbiologische Methoden: PCR Molekulargenetische Methoden stehen in Kürze zur Verfügung. 6. Serologische Tests Antiseren sind zurzeit nicht käuflich zu erwerben. 50

51 10. Beschälseuche Charakterisierung der Infektion Erreger Beschälseuche (Dourine) ist eine klassische Deckseuche. Sie wird durch die Infektion mit Trypanosoma equiperdum (Doflein, 1901) verursacht und befällt ausschließlich Einhufer. Im Gegensatz zu allen übrigen Trypanosomen wird der Erreger nicht durch Insekten übertragen, sondern ausschließlich beim Deckakt Klinische Symptomatik In der Regel nimmt die Krankheit einen chronischen Verlauf, der sich über Jahre erstrecken kann. Gelegentlich sind aber auch akute Fälle beobachtet worden, die innerhalb von wenigen Wochen zum Tode führen. Typische klinische Erscheinungen im Frühstadium sind ödematöse Schwellungen im Bereich der Genitalien, kreisförmige Ödeme am Unterbauch und im Bereich der Rippen ("Talerflecken"). Später treten nervöse Symptome auf wie unkoordinierte Bewegungen der Hinterextremitäten, Facialislähmung u.a Differentialdiagnostik Einzelne ähnliche Krankheitserscheinungen treten auch bei der Deckdruse (Erreger: Streptococcus equi) und beim Bläschenausschlag (Koitales Exanthem, Erreger: Equines Herpes- Virus Typ III) auf Diagnostische Indikation Klinisch, epidemiologisch oder anamnestisch begründeter Verdacht, Handelsbestimmungen Zuständige Untersuchungseinrichtungen Staatliche Veterinäruntersuchungsämter Friedrich-Loeffler-Institut, Standort Jena, Referenzlabor für Beschälseuche, Naumburger Str. 96a, Jena Rechtsgrundlagen Tierseuchengesetz 79 Abs. 4 OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines in der jeweils aktuellen Fassung Untersuchungsmaterial Der Nachweis des Erregers ist ausgesprochen schwierig und gelingt nur sehr selten in Vaginal- oder Präputialspülproben, noch seltener im Blut. Somit zielen die diagnostischen Verfahren nicht auf den Erregernachweis sondern auf den Nachweis von spezifischen Antikörpern im Blutserum ab. Nach der Klassifizierung serologischer Verfahren durch die O.I.E. gilt hier die Komplementbindungsreaktion (KBR) nach wie vor als Methode der Wahl. Auch der "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) sowie der indirekte Fluoreszenz - Antikörpertest 51

52 (IFAT) sind im "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines" der OIE als alternative Verfahren aufgeführt. Ein Erregernachweis mittels PCR ist nur in bestimmten frühen Krankheitsstadien möglich Untersuchung Komplementbindungsreaktion (KBR) Antigen (s. Anhang) Das in Deutschland zugelassene Antigen wird durch das Referenzlabor für Beschälseuche (FLI, Standort Jena) hergestellt und als Lyophilisat an die Untersuchungsämter abgegeben. Das Lyophilisat ist mit A. dest. zu rekonstituieren Kontrollsystem Kontrollseren (s.anhang) werden als Lyphilisate vom Referenzlabor für Beschälseuche an die Untersuchungsämter abgegeben. Die Lyophilisate sind mit A. dest. zu rekonstituieren. In jedem Ansatz wird ein spezifisch positives (mit definiertem Titer) sowie ein antikörperfreies, d.h. negatives Kontrollserum mitgeführt. Resuspendierte Seren und Antigen können portioniert bei -21 C ±3 C gelagert werden. Sie sind danach mehrere Monate verwendbar. Weitere Kontrollen umfassen: o Serumkontrolle für jedes mitgeführte Serum (SK: Ansatz ohne Antigen) o Antigenkontrolle (AK : Ansatz ohne Serum) o o Komplementkontrolle (CK: Ansatz ohne Antigen und Serum) Hämolytisches System-Kontrolle (HS-K: Ansatz ohne Komplement, Serum und Antigen) Zu untersuchende Serumproben, Verdünnungspuffer und Antigen sind vor Beginn der Untersuchung auf Raumtemperatur (Wasserbad) zu erwärmen Inaktivierung der Seren Vor der Untersuchung sind alle zu untersuchenden Proben einschließlich Kontrollseren im Wasserbad in entsprechender Verdünnung wie folgt zu inaktivieren: Verdünnung: 1:5 in Veronalpuffer Temperatur: Pferd 56 bis 58 C Maultier/Esel 62 C Dauer: 30 Minuten Verunreinigte und hämolytische Seren sind zur Untersuchung nicht geeignet. Die folgenden Schritte ( , , ) entfallen, wenn man alle Reagenzien auf einander abgestimmt käuflich erwirbt (Standardisierung!) Hämolytisches System (HS) für 2%ige Erythrozytensuspension Wird das HS im Labor selbst hergestellt, so wird das mit Alsever s Lösung versetzte Hammelblut (Anhang 2 u.3) 3- bis 5-mal in Veronalpuffer (Anhang 1) gewaschen (bis die überste- 52

53 hende Flüssigkeit wasserklar ist), dabei jeweils 10 Minuten bei 1000 g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Erythrozytensediment mit Veronalpuffer resuspendieren. Aus dem gewaschenen Erythrozytensediment wird eine 2%ige Suspension hergestellt (Photometer!). Zum Gebrauch wird diese mit gleichem Volumen eines gebrauchsfertig verdünnten Ambozeptors gemischt. Bei getrennter Aufbewahrung von Erythrozytensuspension und Ambozeptorverdünnung (Anhang 4) können diese bis zu 48 h nach Herstellung verwendet werden Ambozeptor-(Hämolysin)-Auswertung (1x pro Charge) Werden die folgenden Schritte in Mikrotiterplatten durchgeführt, so empfiehlt es sich, das Volumen so anzupassen, dass 200 µl nicht überschritten werden. Erste Verdünnungsstufe ev. (Vol. > 200 µl) in separatem Reaktionsgefäß ansetzen. Ansatz folgender geometrischer Verdünnungsreihen des Ambozeptors: Röhrchen : : : n Reihe A) 1: : : : Reihe B) 1:750 1: : : : Ausgangsverdünnung 1:500 (z. B. 0,2 ml Ambozeptor + 99,8 ml VBD) Vorlage von 5 ml Veronalpuffer für Reihe A ab Röhrchen 2, für Reihe B ab Röhrchen 1 für Reihe A dem 1. und 2. Röhrchen 5 ml Ambozeptorverdünnung zufügen und ab Röhrchen 2 durch fortlaufendes Über-Pipettieren von jeweils 5 ml die weiteren Verdünnungen anlegen für Reihe B dem 1. Röhrchen 10 ml Ambozeptorverdünnung zufügen und durch fortlaufendes Über-Pipettieren vom jeweils 5 ml weitere Verdünnungen anlegen beide Titrationsreihen zu einer Verdünnungsreihe zusammenfügen Durchführung der Ambozeptorauswertung Tabelle 1: Ansatzschema der Ambozeptorauswertung Röhrchen Ambozep.-Verd. Veronalpuffer Erythroz.-Susp. Komplement 1:20 (0,5ml) (ml) (ml) (ml) 1 1:500 1,0 0,5 0,5 2 1:750 1,0 0,5 0,5 3 1:1000 1,0 0,5 0,5 : : : : : : : : : : : : : : : n 1: ,0 0,5 0,5 53

54 Kontrollen a) Erythrozytenkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 2,0 ml Veronalpuffer b) Komplementkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,5 ml Komplement 1:20 1,5 ml Veronalpuffer c) Ambozeptorkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,5 ml Ambozeptorverdünnung 1,5 ml Veronalpuffer Vorsichtig schütteln, Inkubation 30 min bei +37 C ±1 C im Wasserbad Ermittelt wird die höchste Ambozeptorverdünnung, die noch eine komplette Hämolyse bewirkt. Sie gilt als Ambozeptoreinheit (AE). Die Gebrauchsverdünnung beträgt 4 Einheiten, also die 4-fache Konzentration. Beispiel: 1 AE = 1:6000 Gebrauchsverdünnung = 1:1500 Die Kontrollen dürfen keine Hämolyse aufweisen Komplementauswertung Die Komplementauswertung dient der Feststellung der Komplementgebrauchsverdünnung für den Hauptversuch in Gegenwart der entsprechenden Antigengebrauchsverdünnung. Zum Vergleich wird eine zweite Reihe angesetzt, bei der das Antigenvolumen durch Veronalpuffer ersetzt ist. Das Komplement wird an jedem Untersuchungstag in 8 Konzentrationsstufen in der Wärmebindung geprüft. In der Tabelle 2, Teil 1, ist die Herstellung der 8 Verdünnungsstufen dargestellt. Werden alle Reagenzien auf einander abgestimmt käuflich erworben, so kann auf die Komplementauswertung am Untersuchungstag zwar nicht verzichtet werden, sie kann aber in der Regel im Umfang reduziert werden (z. B. 4 Verdünnungsstufen). Tabelle 2a: Komplementauswertung Komplementkonzentration (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Kompl. 1:10 (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Veronalpuffer (ml) 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 Die weiteren Arbeitsschritte sind in der Tabelle 2 b erklärt. 54

55 Tabelle 2b: Komplementauswertung Reihe 1 Reihe 2 Komplement je Verd.-Stufe (ml) 0,5 0,5 Antigengebrauchsverdünnung (ml) - 0,5 Veronalpuffer (ml) 1,0 0,5 - vorsichtig schütteln (mind. 30 sec), Wasserbad 60 min bei +37 C ±1 C HS (ml) 1,0 1,0 Es wird das Röhrchen mit der niedrigsten Komplementkonzentration bestimmt, das eine komplette Hämolyse aufweist. Die Gebrauchsverdünnung für den Hauptversuch ist die folgende höhere Konzentration. Beispiel: komplette Hämolyse Gebrauchsverdünnung = 2,0 % = 2,5 % Hauptversuch In der Tabelle 3 werden die Arbeitsschritte für eine Serumprobe und ein Antigen als Modell dargestellt. Tabelle 3: Hauptversuch Arbeitsschritte : : : Veronalpuffer (µl) : : : Serum (µl) Titration des Serums (25 µl) in Doppelverdünnung von 1 nach 10 und von 11 nach 12 (verwerfen von 25 µl aus den Cups 10 und 12). Cup 4. Veronalpuffer (µl) Antigen (µl) : : : Komplement (µl) : : : abgedeckte Platte eine Stunde bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren (Wärmebindung). 8. HS 30 min vorwärmen auf 37 C (Wasserbad) 9. HS (µl) : : : Inkubation 30 bei +37 C ±1 C im Wasserbad oder im Brutschrank in einer feuchten Kammer 11. Zentrifugation (empfohlen, nicht unabdingbar): 5 min/ca. 700 x g (2000 upm) 55

56 Auswertung Bei der Ablesung wird unterschieden: % Hämolysehemmung = 4 (++++) - 75 % Hämolysehemmung = 3 (+++) - 50 % Hämolysehemmung = 2 (++) - 25 % Hämolysehemmung = 1 (+) - keine Hämolysehemmung = negativ Bewertung O.I.E.: 1:5 ++ und mehr gilt als positiv E.U: 1:10 und mehr gilt als ein positives Ergebnis ELISA Durchführung Das Antigen (FLI, Gebrauchsverdünnung nach Angabe des Herstellers) wird in 5 ml Karbonatpuffer rekonstituiert und 3 mal 10 Sekunden bei maximal zulässiger Amplitudeneinstellung ultrabeschallt (z. B. Sonoplus - Ultraschall Homogenisator HD 200 der Firma Bandelin (Berlin) und der Sonotrode MS 73 (60 %)). Während der Beschallung wird das Antigen in Eiswasser gekühlt. Nach 5 Minuten Zentrifugation bei x g wird der Überstand in der angegebenen Gebrauchsverdünnung mit Karbonatpuffer (siehe Anhang) verdünnt. Die Kolumnen 1, 3, 5, 7, 9 und 11 werden mit 50 µl Karbonatpuffer beschickt, die Kolumnen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 mit 50 µl Antigen. Die Platten werden in einer feuchten Inkubationskammer 40 Minuten im Brutschrank bei +37 C ±1 C inkubiert. Die Platten werden dekantiert und mit A. bi-dest. 3-mal gewaschen. Anschließend Dekantieren der Platten. Zugabe von 200 µl Blocking - Puffer (siehe Anhang) pro Cup. Inkubation 30 Minuten bei +37 C ±1 C in feuchter Inkubationskammer. Die Platten werden dekantiert und 3-mal mit PBS - Tween (siehe Anhang) gewaschen. Anschließend Dekantieren der Platten. Trocknen der Platten bei +37 C ±1 C im Brutraum für 120 Minuten. Anschließend werden die Platten unter Vakuum in Vaku-Beuteln eingeschweißt. Bei einer Lagerungstemperatur von +7 C ±3 C (Kühlschrank) beträgt die Haltbarkeit ½ Jahr. Vor Beginn des ELISA die benötigte Anzahl an Testplatten auf Raumtemperatur erwärmen. Verdünnung der Probandenseren und Kontrollseren 1 : 100 in PBS - Tween / FKS. Die Kolumnen 1 bis 10 sind für den Doppelansatz der Probandenseren vorgesehen, die Kolumnen 11 und 12 für den Doppelansatz der Kontrollseren (Positives und negatives Kontrollserum, FLI Jena). Pro Cup werden 50 µl eingefüllt. Inkubation 30 Minuten bei +37 C ±1 C in feuchter Inkubationskammer. 56

57 Die Platten werden entleert und 3-mal mit PBS - Tween gewaschen. Anschließend Dekantieren der Platten. Zugabe von 50 µl Konjugat in Gebrauchsverdünnung pro Cup. Inkubation 30 Minuten bei +37 C ±1 C in feuchter Inkubationskammer. Die Platten werden dekantiert und 3-mal mit PBS - Tween gewaschen. Anschließend Dekantieren der Platten. Zugabe von 100 µl Chromogen - Substrat - Lösung pro Cup. Messung der Platte im Plattenphotometer bei 405 nm. Mindest - O.D.-Wert der positiven Kontrolle Je nach aktuellen Testbedingungen sollte dieser Wert nach 15 bis 30 Minuten Chromogen-Substrat-Inkubation bei Raumtemperatur (+22 C ±3 C)erreicht werden Bewertung Bestimmt wird die Netto-Extinktion, d.h. der Wert, der sich aus der Subtraktion der Extinktion des Ansatzes mit Antigen minus der Extinktion des Ansatzes ohne Antigen ergibt. Die Netto-Extinktion des schwach positiven Serums wird als 100 % angesehen. Zu diesen 100 % werden die Ergebnisse der Feldseren in Beziehung gesetzt, ebenfalls ausgedrückt in %. Ein Überschreiten der 100 % als ein positives Ergebnis Anhang Diagnostika Beschälseuche Antigen à 0.5 ml, lyophilisiert. Beschälseuche-Kontrollserum positiv v. Pferd à 1 ml, lyophilisiert. Beschälseuche-Kontrollserum negativ v.pferd à 1 ml, lyophilisiert Puffer, biologische und chemische Reagenzien Verdünnungslösung für KBR Die Verdünnungsflüssigkeit für alle Reagenzien ist Veronal-Puffer-Lösung. Zur besseren Haltbarkeit wird ein Veronalpuffer-Konzentrat im Verhältnis 5:1 hergestellt und portioniert bei +5 C ±3 C gelagert. Vor Gebrauch ist es 1:5 mit A. bidest. zu verdünnen. Veronalpuffer und alle anderen Reagenzien für die KBR (Erythrozyten-Suspension, Komplement, Ambozeptor) sind käuflich zu erwerben (z. B. Firma Virion/Serion in Erlangen) Herstellung des VBD-Konzentrates 5:1, (2000 ml) bei Eigenherstellung a) Stammlösung 1 - Natriumchlorid p. A. 83,00 g - 5,5 Diethylbarbitursäure Natrium-Salz 10,19 g - A. bidest. (heiß) ca. 800,00 ml 57

58 b) Stammlösung 2 - Magnesiumchlorid x 6H 2 O 20,30 g - Calciumchlorid x 2H 2 O 4,40 g - A. bidest ad 100,00 ml Die Lösung kann bei +5 C ±3 C 6 Monate aufbewahrt werden. Substanzen der Stammlösung 1 in einen Erlenmeyerkolben durch Rühren auf dem Magnetrührer heiß lösen tropfenweise Zugabe von 34,58 ml 1n Salzsäure (HCL) evtl. ausfallende Salze durch Zugabe von Aqua bidest. in Lösung bringen tropfenweise Zugabe von 5ml Stammlösung 2 nach Abkühlung der Lösung das Volumen mit A. bidest. auf 2000ml auffüllen Überprüfung des ph-wertes ph 7,3 ±0,2 Verdünnung von 1ml Veronal-Puffer-Konzentrates mit A. bidest. 1:5 Messung des ph-wertes Alsever s Lösung zur Konservierung von Hammelbluterythrozyten - Dextrose (Glucose) 18,66 g - Natriumchlorid 4,18 g - Natriumcitrat 8,00 g - A. bidest. ad 1000,00 ml - Lösen im Dampftopf für 20 min Hammelblut ("sheep red blood cells", SRBC) Das Blut wird vom Schaf unter sterilen Bedingungen durch Punktion der Vena jugularis entnommen und unter leichtem Schütteln zu gleichen Teilen mit Alseverslösung in einem sterilen Gefäß (im geschlossenen System) aufgefangen. Ein Zusatz von Penicillin ( IE/l) kann die Haltbarkeit erhöhen. Das konservierte Hammelblut ist bei +5 C ±3 C ca. drei Wochen haltbar. Ambozeptor (Hämolysin) Der Ambozeptor wird käuflich erworben und vor erstmaligem Gebrauch jeder Charge ausgewertet. Bei Reduktion des Titers des positiven Kontrollserums in der KBR empfiehlt sich eine erneute Auswertung. Komplement Das Komplement ist ein Misch-Plasma (also aus ungerinnbar gemachtem Blut) von gesunden Meerschweinchen, die vor dem Bluten 24 Stunden nicht gefüttert werden. Das Blut kann durch Kardialpunktion gewonnen werden. Es kann portioniert bei -21 C ±3 C aufbewahrt werden. Vor jeder KBR wird eine Komlement-Auswertung vorgenommen. Witte-Lösung (Kalium-Borlösung) zur Konservierung von Meerschweinchenkomplement Kaliumsulfat 10,0 g Borsäure 4,0 g A. bidest. ad 100,0 ml 1 h bei 100 C im Dampftopf lösen Komplement und Konservierungslösung werden zu gleichen Teilen gemischt. Der Verdünnungsfaktor des Komplements muss beim Ansatz (Komplementauswertung und Hauptversuch) berücksichtigt werden. Haltbarkeit bei geringem Titerabfall ca. acht Wochen. 58

59 2.7. Karbonatpuffer: (0,05 M, ph 9,6) Na 2 CO 3 1,59 g NaHCO 3 2,93 g A. dest. ad 1000 ml 2.8. Blocking-Puffer: Karbonatpuffer 0,05 M, ph 9,6 + 3 % fötales Kälberserum (FKS) Das Kälberserum kann portioniert bei -20 C eingefroren werden Phosphatpuffer mit Tween 20 (PBS-Tween 0,05 % ), ph 7,4 : NaCl 8,0 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O 2,9 g KH 2 PO 4 0,2 g KCl 0,2 g A. dest. ad 1000 ml Tween 20 0,5 ml Puffer für Proben, Kontrollen und Konjugat: PBS - Tween, ph 7,4 + 6 % FCS Konjugat Kaninchen anti-pferd IgG (H+L)/PO (Nordic Immunology, Tilburg, Holland, zu beziehen über TEBU, Frankfurt a. M.), Arbeitsverdünnung nach Herstellerempfehlung Chromogen Substrat - Lösung (ABTS, Serva oder Sigma) Citrat-Puffer, ph 6 C 6 H 8 O 7 x H 2 O 4,2 g 200 ml A. bidest. Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 7,16 g 200 ml A. bidest. ABTS 160 mg 400 ml Citratpuffer Haltbarkeit der Chromogen-Substrat Lösung: sollte immer frisch angesetzt werden Unmittelbar vor Gebrauch wird der Substratlösung 1 % (w/v) H 2 O 2 (Perhydrol) zugegeben Cave: H 2 O 2 -Konz. in Perhydrol (30 %) berücksichtigen! 59

60 11. Blauzungenkrankheit Charakterisierung der Infektion Erreger Das Bluetongue Virus (BTV) ist ein dsrna Orbivirus aus der Familie Reoviridae. Momentan werden 24 Serotypen unterschieden. Das komplette BTV-Partikel enthält ein Core mit Doppelkapsid, wobei die äußere Schale zwei Proteine enthält, von denen eines (VP7, 38 kd) die Hauptdeterminante für den Serotyp ist. Das innere, ikosaedrische Core enthält zwei Hauptund drei untergeordnete Proteine und 10 dsrna Segmente Klinische Symptomatik Bluetongue ist eine infektiöse, von Insekten ausgehende und unter Säugern nicht übertragbare Krankheit der Schafe sowie anderer domestizierter und wild lebender Wiederkäuer. In vielen Gebieten der Welt hat die Krankheit wegen der insektengebundenen Übertragung ein saisonales Auftreten. Die typischen klinischen Symptome sind nur beim Schaf anzutreffen, wogegen andere befallene Wiederkäuer meist asymptomatisch infiziert sind. Pathognomisch sind massive Ödeme und Hämorrhagien mit Fieber und Entzündungen bis hin zu Ulzera der Schleimhäute. Häufig kommt es zu Trächtigkeitsstörungen mit Aborten und Fetopathien, auch durch schwach virulente Serotypen und attenuierte Viren (Impfstoffe). Typisch und namengebend für die Krankheit ist die intensive Hyperämie und Schwellung der Zunge (Bluetongue) Differentialdiagnostik Grundsätzlich gilt, dass auch bei typischer Symptomatik die Diagnose BT anhand des klinischen Bildes lediglich mit einer Sensitivität von 76 % und einer Spezifität von 72 % gestellt werden kann (Elbers et al., 2008). Als Differentialdiagnosen kommen in erster Linie alle Zustände, die zu Fruchtbarkeitsstörungen und Aborten führen, in Frage. Als virale Infektionserreger sind hier zu nennen: MKSV, Rinderpest Virus, Akabane Virus, Border Disease Virus, ORF-Virus, EHDV, Bösartiges Katarrhalfieber Virus, BVD/MD und BHV1. Zudem sind auch Photosensibilität und Mykotoxikose als Differentialdiagnosen zu berücksichtigen Diagnostische Indikation siehe VO zum Schutz gegen die Blauzungenkrankheit Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, Greifswald - Insel Riems Rechtsgrundlagen Richtlinie 92/119/EWG Richtlinie 2000/75/EG Verordnung (EG) Nr. 1266/2007 Verordnung zum Schutz gegen die Blauzungenkrankheit vom 22. März 2002 in der jeweils geltenden Fassung 60

61 11.2. Untersuchungsmaterial Gerinnungsgehemmtes Blut. Hier eignet sich am besten EDTA-Blut, da mit diesem Untersuchungsmaterial sowohl der AK-Nachweis mittels Kompetitions-ELISA (celisa) als auch die real-time RT-PCR durchgeführt werden kann. Das EDTA-Blut sollte im gekühlten (+4 C) Zustand versendet werden. Lagerung über längere Zeit sollte bei -70 C erfolgen, weil BTV bei -20 C nicht lange stabil bleibt. Post mortem sind Milz und Lymphknoten die Organe der Wahl zur Virusisolierung, schnellstmöglicher Versand erfolgt bei +4 C. Für den Antikörpernachweis können Vollblut, EDTA-Blut oder mindestens 500 μl Serum/ Plasma eingesendet werden Untersuchungsgang Für den BTV-Genom-Nachweis und den Nachweis von BTV-Antikörpern stehen zugelassene Diagnostika zur Verfügung, die angewendet werden sollten (siehe dazu auch die Einleitung der amtlichen Methodensammlung). Darüber hinaus kann auf nachfolgende BTV- Nachweisverfahren hingewiesen werden. Aktuelle Methoden zur Viruscharakterisierung sollten im NRL-BT nachgefragt werden Erregernachweis Virusisolierung Die Virusisolierung in embryonierten Hühnereiern ist sehr schwierig in der Durchführung (intravasale Inokulation von 10 bis 12 Tage alten Eiern). Routinemäßig erfolgt die Anzucht von BT-Viren aus gerinnungsgehemmten Blut auf Aorten-Endothelzellen, Verozellen, Insektenzellen bzw. auf BHK21-Zellen. Generell ist die Effizienz der Zellkulturanzucht geringer als die der Virusisolierung in embryonierten Eiern. Antigennachweis Ein indirekter Sandwich-ELISA zum BTV-Antigennachweis wurde am Institute for Animal Health in Pirbright, U.K. entwickelt. Aufgrund der höheren Sensitivität und Spezifität der RT- PCR hat der AG-ELISA im Routinelabor an Bedeutung verloren. Polymerase Kettenreaktion (PCR) Für die Aufgaben des FLI ist in erster Linie der sichere und sensitive Nachweis von BTV wichtig. Neben den klassischen, Serotyp-übergreifenden PCR nach McColl et al. (1991) und der O.I.E. (Katz et al. 1993) stehen verschiedene real-time RT-PCR Systeme zur Verfügung. Für den Nachweis aller 24 Serotypen werden Pan-BTV-real-time RT-PCR (nach Toussiant et al. 2007) eingesetzt. Des Weiteren werden spezifische real-time RT-PCR Systeme zum Nachweis von BTV8-Europe, BTV1 und BTV6 (Eigenentwicklungen FLI) angewendet. Zusätzlich stehen klassische RT-PCR-Systeme zur Verfügung, die eine spezifische Amplifikation der 24 verschiedenen Serotypen erlauben. 61

62 Antikörpernachweis Ein Kompetitions-ELISA (celisa) zum spezifischen und Serotyp-übergreifenden Nachweis von BTVAntikörpern wurde von Anderson (1984) in Pirbright, U.K. entwickelt. In Deutschland sind kommerzielle celisa für den BTV-AK-Nachweis aus Serum und Plasma zugelassen (z.b. VMRD, ID-VET, Pourquier-IDEXX). Diese Tests werden aufgrund ihrer einfachen Anwendung, verbunden mit einer hohen Spezifität und Sensitivität, routinemäßig am FLI eingesetzt. Weiterhin ist es möglich, mittels kommerziellen Milch-ELISA BTV-AK auch in der Milch von Rind und Schaf zu detektieren. Als weitere Verfahren zum BTV-spezifischen Antikörpernachweis stehen nach dem OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests der Agargel- Immundiffusionstest (AGIDT) und der Neutralisationstest (NT) zur Verfügung. 62

63 12. BVD/MD - Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease Charakterisierung der Infektion Erreger Der Erreger bildet gemeinsam mit dem Virus der Klassischen Schweinepest, und dem Border Disease Virus das Genus Pestivirus in der Familie der Flaviviridae. Es werden 2 Genotypen als selbständige Spezies unterschieden, bei denen jeweils zytopathogene (cp) und nichtzythopathogene (ncp) Biotypen vorkommen. Weitere Subtypisierungen auf genomischer Grundlage sind möglich. Es handelt sich um ein 40 bis 60 nm großes, behülltes Virus, das Genom besteht aus einer einsträngigen RNA positiver Polarität von einer Länge von ca 12 kb Klinische Symptomatik Akute Infektionen verlaufen i.d.r. symptomlos, vor allem bei Kälbern können Fieber, Inappetenz, seröser Nasenausfluss, milde Atemwegserkrankung oder Durchfall auftreten, bei Kühen kann es zum Rückgang der Milchleistung kommen. Selten (in Amerika häufiger beschrieben) tritt ein hämorrhagisches Syndrom mit Blutungen an den Schleimhäuten und Parenchymen sowie hoher Mortalität auf. Eine Infektion trächtiger Tiere resultiert in Abhängigkeit von Zeitpunkt der Infektion in Fruchtbarkeitsstörungen (Umrindern infolge Fruchtretention), Aborten, Totgeburten, Missbildungen und Geburt von lebensschwachen Kälbern. Bei Infektionen zwischen dem 40. und dem 120. Graviditätstag werden persistent virämische Kälber geboren, die entweder kümmern (ca 50 %), aber sich auch normal entwickeln können. Die late onset Form der BVD stellt die tödlich verlaufende Mucosal Disease dar, die entsteht, wenn persistent virämische Tiere BVD-Viren beider Biotypen (cp und ncp- BVDV) tragen. Chronische Abmagerung, Fieber, Anorexie, blutige, therapieresistente Durchfälle, Speichelfluss, Erosionen im Bereich des harten Gaumens, am Flotzmaul und Naseneingang, weniger häufig im Zwischenklauenspalt sowie an Kronsaum und Euter treten auf Pathologie Zur pathologisch-anatomischen Untersuchung gelangen in erster Linie an Mucosal Disease verendete Tiere. Neben der bereits klinisch sichtbaren erosiven und ulzerativen Stomatitis (besonders harter Gaumen, Gingiva, Papillen der Backenschleimhaut), finden sich längliche Erosionen im gesamten Oesophagus, an Pansenpfeilern und an den Rändern der Blättermagenschleimhaut, in Labmagen und im gesamten Darm. Auch bei ausgeprägten pathomorphologischen Befunden ist mitunter kein Virus nachweisbar. Bestimmte hochvirulente ncp- BVDV-Stämme führen zu hochgradiger Thrombozytopenie mit nachfolgendem hämorrhagischem Syndrom. Intrauterine Infektionen bis zum 100. Graviditätstag führen zu Tod des Foetus, Aborten oder mumifizierten Früchten. Zu den nach Infektionen nach dem 100. Graviditätstag auftretenden Mißbildungen zählen Mikroenzephalie, zerebellare Hypoplasia, Hydranenzephalie, Hydrozephalus, Mikrophthalmie ( okulozerebellares Syndrom ), Thymusaplasie, Hypotrichosis congenita, Brachygnathie, Wachstumsverzögerung und Hypoplasie der Lungen. 63

64 Differentialdiagnostik Bösartiges Katarrhalfieber, Rinderpest, Maul und Klauenseuche und andere vesikuläre Erkrankungen, Stomatitis papulosa, Verätzungen, Intoxikationen Diagnostische Indikation Antigen-, Genom- und Antikörperuntersuchungen nach BVD-Verordnung Klinischer und/oder pathologischer Verdacht auf Mucosal Disease bzw. Vorliegen eines hämorhagischen Syndroms Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungseinrichtungen der Länder Nationales Referenzlabor für BVD/MD am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems (Tel.: ) Abklärungsuntersuchungen Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektion mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus BVDV-Verordnung Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestric Animals, Chapter , Bovine Viral Diarrhea, 5 th edition, Untersuchungsmaterialien und Probenschemata Der diagnostische Nachweis von persistent BVDV-infizierten Rindern kann durch die Aufnahme von BVDV-Antikörperhaltigem Kolostrum beeinträchtigt sein (Diagnostische Lücke). Diese Einschränkungen hängen von den aufgenommen Antikörpermengen, der angewendeten Diagnostik sowie vom Zeitpunkt der Probennahme ab. Im Folgenden werden zulässige diagnostische Verfahren zur Zertifizierung der BVD-Unverdächtigkeit eines Rindes bzw Rinderbestandes und zur Bestätigung der Antikörperfreiheit unter Berücksichtigung der Diagnostischen Lücke aufgeführt. Detaillierte Protokolle sind im Abschnitt Untersuchungsgang beschrieben Anerkannte Untersuchungen zum BVDV-Nachweis Erregernachweis bei Tieren mit positivem oder unbekanntem BVDV- Antikörperbefund Nach 17c Tierseuchengesetz zugelassene E RNS -Antigen-Fänger-ELISA-Tests Probenmaterial: Serum, Plasma, EDTA-Vollblut, gereinigte und gewaschene Blutleukozyten, Organproben und Hautbiobtate eines Tieres Probenmenge: Nach Angaben des Herstellers Probenaufbereitung: Einzelproben nach Angaben des Herstellers Probennahme: Vor Aufnahme von Kolostrum sowie im Alter von mehr als 60 Tagen für Blutproben, keine Einschränkung für Hautbioptate und andere Organproben. 64

65 Nach 17c Tierseuchengesetz zugelassene NS3-Antigen-Fänger-ELISA-Tests Probenmaterial: Blutleukozyten eines Tieres, Hautbioptate, soweit vom Hersteller vorgesehen Probenmenge: Nach Angaben des Herstellers Probenaufbereitung: Einzelproben nach Angaben des Herstellers Probennahme: Vor Aufnahme von Kolostrum oder im Alter von mehr als 90 Tagen; bei optimierter Leukozytenpräparation aus frischen, nicht hämolytischen EDTA-Blutproben mit intensivem Waschen von aufgereinigten Leukozyten-pellets ist eine Erweiterung Probenzeitraumes auf Tag 0 bis 3 post partum zulässig. Keine Einschränkung für Hautbioptate, allerdings ist bei Tieren < 90 Tagen eine negatives Ergebnis durch eine Antikörperuntersuchung am Ohrgewebelysat und ggf. weitere Tests abzuklären Durchflusszytometrische Analyse nach NS3-Immunfluoreszenzfärbung mit nach 17c Tierseuchengesetz zugelassenen NS3-spezifischen Antikörpern Probenmaterial: Probenmenge: Probenaufbereitung: Probennahme: Aufgereinigte Leukozyten eines Tieres Leukozyten aus mindestens 50 µl Vollblut eines Tieres Hämolyse, Waschen des Leukozytenpellets Vor Aufnahme von Kolostrum oder im Alter von mehr als 90 Tagen; bei optimierter Leukozytenpräparation aus frischen, nicht hämolytischen EDTA-Blutproben mit intensivem Waschen von aufgereinigten Leukozyten-pelletes ist eine Erweiterung des Probenzeitraumes auf Tag 0 bis 3 post partum zulässig Virusisolierung auf permissiven bovinen Zellkulturen, z. B. KOP-R-Zellen oder primäre bovine Zellkulturen Probenmaterial: Probenmenge: Probenaufbereitung: Probennahme: Aufgereinigte und gewaschene Leukozyten (vorzugsweise) oder Serum eines Tieres, Organproben (Milz, Lymphknoten, Thymus) Mehr als 1 x 10 6 Leukozyten eines Tieres im Doppelansatz, aufgearbeitete Organproben Hämolyse und effizientes Waschen des Leukozytenpellets; Organanreibungen. Vor Aufnahme von Kolostrum oder im Alter von mehr als 40 Tagen; bei optimierter Leukozytenpräparation aus frischen, nicht hämolytischen EDTA-Blutproben mit intensivem Waschen von aufgereinigten Leukozytenpelletes ist eine Erweiterung des Probenzeitraumes auf Tag 0 bis 7 post partum zulässig. Keine Einschränkung für Organproben 65

66 RT-PCR mit nach 17c Tierseuchengesetz zugelassenen Testkits Probenmaterial: Serum, Plasma, Vollblut, gereinigte und gewaschene Leukozyten, Milch, Organ- oder Gewebeproben. Poolproben von bis zu 50 Tieren bzw. nach Herstellerangaben Nach den Angaben der Hersteller Probenmenge: Probenaufbereitung: Nach den Angaben der Hersteller Probennahme: Für Einzelblutproben keine Einschränkung; für gepoolte Blutproben Tag 0 bis 7 post partum oder ab einem Alter von mehr als 40 Tagen, keine Einschränkung für Gewebeproben als Einzel- oder Poolproben Antigennachweis mittels Immunfluoreszenz mit nach 17c Tierseuchengesetz zugelassenen Antikörpern bzw. Konjugaten Probenmaterial: Organ- und Gewebeproben (Hautstanzen), Probenmenge: ca 6 bis 8 mm große Gewebestücke Probenaufarbeitung: Kryoschnitte, einschließlich negativer Gewebe- und Antikörperkontrollen Probennahme: postmortal oder am lebenden Tier (Hautstanzen), keine zeitliche Einschränkung Erregernachweis bei Tieren mit negativem BVDV-Antikörperbefund Alle unter Punkt genannten Methoden können bei nachweislich BVDV-Antikörpernegativen Tieren ohne Altersgrenze angewendet werden Bestätigungsuntersuchung Bei der Bestätigung von vermutlich persistent infizierten Tieren durch eine zweite Untersuchung muss die unterschiedliche Sensitivität der beschriebenen Methoden berücksichtigt werden. Es sind folgende Untersuchungsabstände einzuhalten: - Reverse Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR): mindestens 42 Tage - Virusisolierung: mindestens 28 Tage - Antigen-Fänger-Enzyme-Linked-Immunosorbant-Assays (ELISA): mindestens 21 Tage - Durchflusszytometrie: mindestens 21 Tage Ein negativer Befund kann bereits vor Ablauf dieser Fristen hoben werden Anerkannte Untersuchungen auf BVDV-Antikörper Alle BVDV-Antikörper-Tests müssen die BVDV-Referenzseren Ref1_BVDV1 und Ref3_BVDV2 - bereitgestellt vom Friedrich-Loeffler-Institut - sicher erkennen lassen Testsysteme für die Bestätigung der Antikörperfreiheit nach Nummer Neutralisationstest gegen BVDV-Typ 1 und BVDV-Typ 2 (BVDV-1/2-NT) mit 100 KID 50 Testvirus. - Zugelassene BVDV-NS3-Antikörper-blocking-Tests. - Zugelassene indirekte BVDV-Antikörper-ELISAs. 66

67 Testsysteme für die Diagnostische Stichprobe (z. B. Jungtierfenster ) Ab einem Alter der Tiere von sechs Monaten: Zugelassene indirekte BVDV-Antikörper-ELISAs Ab einem Alter der Tiere von zwölf Monaten: - Neutralisationstest gegen BVDV Typ 1 und BVDV Typ 2 (BVDV-1/2-NT) mit 100 KID 50 Testvirus. - Zugelassene BVDV-NS3-Antikörper-blocking-Tests - Zugelassene indirekte BVDV-Antikörper-ELISAs Die unterschiedliche, zeitliche Einschränkung erfolgt aufgrund der unterschiedlich hohen Sensitivität der Testsysteme für kolostrale Antikörper. Ein negativer Befund dieser Teste ist auch im jüngeren Alter für die Stichprobenbeurteilung geeignet Testsysteme für die Untersuchung von Tankmilchproben Alle für die Untersuchung von Tankmilch zugelassenen Testsysteme. Es ist ausschließlich eine Differenzierung in Milch-positive und Milch-negative Bestände vorzunehmen Untersuchungsgang Erregernachweis Virusisolierung Leukozyten Hämolyse und Waschen der Leukozyten, z.b. 1,5 ml EDTA-Blut + 4,5 ml Lysispuffer (8,29 g/l NH4CL, 1,0 g/l KHCO3, 1 mm EDTA), 10 min Eis, Zentrifugation bei 1000 rpm, 2 mal Waschen mit Zellkulturmedium + Antibiotika (z.b. Gentamycin,50 ng/ml; Baytril, 20 µg/ml; oder Penicillin/Streptomycin), Resupendierung, in der Aufarbeitung sollten >106 Leukozyten sein. Alternativ: 5 bis 10 ml EDTA-Blut mit 1 ml Dextransulfatlösung versetzen und nach vorsichtigem Schwenken etwa 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur (alternativ 30 Minuten bei 37 C) stehen lassen. In dieser Zeit setzen sich die Erythrozyten ab. Den leukozytenhaltigen milchigtrüben Überstand absaugen und für 10 Minuten bei 2000g zentrifugieren Das Sediment wird nach zweimaligem Waschen in je 5 ml Ca-Mg-freier phosphatgepufferter Salzlösung (PBSminus) in 2 ml Kulturmedium aufgenommen. Die konzentrierte Leukozytensuspension dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Material bei 70 C gelagert werden. 67

68 Organmaterial Ca. 1 g Organmaterial wird mit der Schere fein zerkleinert und in 10 Vol serumfreiem Zellkulturmedium bzw. isotonischem Puffer mit Antibiotika in einem Mörser, bei Notwendigkeit mit sterilem Seesand homogenisiert. Andere Methoden der Homogenisierung (Homogenisatoren, tissue lyser) sind möglich. Nach mindestens einstündiger (besser über Nacht) Aufbewahrung bei 4 bis 8 C wird die Organsuspension für 15 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Material bei 70 C gelagert werden. Inokulation der Zellkulturen Wie o.a. aufbereitetes Untersuchungsmaterial wird im Doppelansatz in einem Volumen, das 1/10 des Zellkulturmediums entspricht (z.b. 0,1 ml für 24 well, 0,3 ml für 6 well, 0,5 ml für TC12,5 usw) auf 1 bis 2 Tage gewachsene Zellkulturen, von denen das Anzuchtmedium vorher entfernt wurde, inokuliert. Nach einer Adsorptionszeit von 30 bis 60 min bei 37oC, wird das Inokulum entfernt (nicht bei frischem Leukozytenpellet) und nach ein- bis zweimaligem Waschen Erhaltungsmedium zugegeben. Positiv- und Negativkontrollen sind mitzuführen. Die Zellkulturen werden 3, besser 5 Tage bei 37 C inkubiert. Während dieser Zeit werden die Zellkulturen auf das Auftreten zytopathischer oder zelltoxischer Effekte mikroskopisch kontrolliert. Die Zellkulturplatten können anschließend einer Immunfärbung unterzogen werden, die Kulturflaschen werden nach Gefrier-Tau-Zyklus weiter passagiert bzw auf 96 well Zellkulturplatten mit dem Ziel einer Immunfärbung weiterverimpft. Es werden in der Regel bis zu drei Passagen durchgeführt. Immunfärbung Fixation Das Kulturmedium wird abgesaugt und der Zellrasen einmal mit isotonischem Phosphatpuffer (z.b. PBS) gewaschen. Vor der Fixation für 2h in einem Trockenschrank bei 80 C ist der Zellrasen gründlich zu trocknen (z.b. Fön). Nach dem Abkühlen der Platten erfolgt die Immunfärbung. Wenn die zu untersuchenden Platten nicht sofort weiter bearbeitet werden können, besteht die Möglichkeit sie kurzfristig (<1 Woche) bei 4 C und längerfristig (>1 Woche) bei 20 C zu lagern. Alternative laborübliche Fixationsmethoden (z.b. 80 % Azeton, 4 % Paraformaldehyd) können angewendet werden, wenn ihre Eignung gezeigt wurde. Immunfärbung Die Immunfärbung kann direkt mit einem geprüften BVDV- bzw. pan-pesti-konjugat durchgeführt werden. Alternativ besteht die Möglichkeit, indirekt mit einem monoklonalen Antikörper, der an das Testvirus bindet und einem FITC-, bzw. POD-makierten Anti-Maus- Antikörper zu färben. Durchführung der Fluoreszenzfärbung Direkte Methode: Zugabe von 50 bis 100 µl eines Fluorochrom- (z.b. FITC-) markierten Antikörpers in Gebrauchsverdünnung in IP bzw. PBS -, (bei Bedarf 0,001 % Evans blue), Inkubation bei 37 C für 1 h, Waschen der Zellen 2x mit PBS - oder IP ph 7,2 und 1 x 10 mit PBS - oder IP ph7,2, Puffer absaugen, 1 x Waschen mit Aquadest, Eindecken der Zellen mit Fluoreszenzerhaltungspuffer (DABCO-Puffer) 68

69 Indirekte Methode: Zugabe von 50 bis 100 µl eines antigenspezifischen monoklonalen Antikörpers (z. B. C16, Bommeli; Wb103/105, c.c.pro) in Gebrauchsverdünnung in PBS - oder IP ph7,2, Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde, Absaugen des Antikörpers, einmal Waschen in IP bzw. PBS Zugabe von 50 bis 100 µl des 2. Antikörpers FITC-Anti-Maus-IgG (z.b. Firma DA- KO Dänemark Best.-Nr. F0479) in Gebrauchsverdünnung (bei Zugabe von Evans blue 0,001 % Endkonzentration) Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde, Absaugen des Konjugats, Waschen der Zellen 2x mit PBS - oder IP ph 7,2 und 1x 10 min Absaugen des Puffers, 1x Waschen mit Aquadest Eindecken der Zellen mit Fluoreszenzerhaltungspuffer (DABCO-Puffer) Durchführung der Peroxydasefärbung (indirekt) Zugabe des 50 bis 100 µl eines antigenspezifischen monoklonalen Antikörpers (z. B. C16, Wb103/105) in Gebrauchsverdünnung in Verdünnungspuffer (PBS bzw IP, 0,005 % Tween 20, 2 % Pferdeserum) Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde, Absaugen des Antikörpers, einmal Waschen in Waschpuffer (PBS bzw IP, 0,005 % Tween 20) Zugabe des 2. Antikörpers POD-Anti-Maus-IgG (z.b. Sigma, A-9044) in Gebrauchsverdünnung Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde, Absaugen des Konjugats, Waschen der Zellen in Waschpuffer (2mal kurz, einmal 10 min) Absaugen des Puffers, Substratreaktion: Dazu wird 1 Tablette AEC(3-amino-9-Ethylcarbazol) in 2,5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst (Stammlösung). Zur Anwendung werden für eine Platte 0,25 ml Stammlösung in 5 ml 0,05 M Natriumazetatpuffer, ph 5,0 verdünnt, mit 15 µl 3 % H 2 O 2 versetzt und je 50 µl /well pipettiert. Nach 15 min wird die Färbelösung abgesaugt und mit PBS-Tween 20 aufgefüllt Die AEC-Stammlösung wird portioniert bei 20 0C gelagert Achtung, AEC ist kanzerogen! (Laborhandschuhe tragen) Geräte und Reagenzien Zellkuturflaschen (z.b. TC12,5, TC25) Pipetten Zellkulturplatten (6-, 24, 48, 96-well) Sterile Plastikspitzen Empfängliche Zellinien, vorzugsweise KOP-R, MDBK,, Klu, (Herkunft: Zellbank des FLI) oder primäre bovine Zellkulturen Spezifische monoklonale Antikörper gegen BVDV bzw. Pestiviren ( z. B. c.c.pro) FITC-markiertes anti-bvd-konjugat (z.b. BioX, c.c, pro) Peroxidasemarkierte(POD) bzw. Fluoresceinisothiocyanatmarkierte (FITC) Anti- Maus-Antikörper (z.b. Sigma, DAKO) Waschpuffer, Substrat/Chromogenlösung (Rezeptur siehe Anhang) Standardmäßige Laborausstattung für ein Viruslabor (Sterilwerkbank, Umkehrmikroskop, CO 2 -Schrank (37 C), Zentrifuge, Inkubator (80 C), Kühlschrank, Kühltruhe (-20 C, -70 C). 69

70 Puffer PBS - : 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,15 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 ad 1000 ml Aqua dest IP ph 7,2 - : 8,28 g NaCl 1,186 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 ad 1000 ml Aqua dest Fluoreszenzerhaltungspuffer (DABCO): 2,5 g 1,4-Diazobicyclo[2,2,2]-octan (DABCO) in 90 ml Glycerol lösen (37 C, Wasserbad) + 10 ml PBS ph mit HCl konz. auf 8,6 einstellen (wenige Tropfen) für rote Kernfärbung: zu 100 ml Fluoreszenzpuffer 100 µl Propidiumiodid- Stammlösung (2 mg/ml) zugeben Antigennachweis mittels ELISA Für den Antigennachweis werden amtlich zugelassene ELISA-Testkits nach Herstellerangaben eingesetzt. Folgende Testkits sind derzeit in Deutschland zugelassen: Herdchek BVDV AG/Leukozyten (IDEXX) Herdchek BVDV Ag/Serum Plus (IDEXX) BVD/MD p80 Ag (Inst. Pourquier) BVDV-antigen mix (Inst. Pourquier) PrioBVDV Ag PI plus PrioCHECK Ag PI focus Antigennachweis mittels Indirekter Immunfluoreszenz Zielstellung: Detektion persistent virämischer Tiere Hautstanzen (vorzugsweise mind. 6 mm Ø) werden in flüssigem Stickstoff oder in auf ca. -70 C herabgekühltem n-heptan schockgefrostet und bei -70 C gelagert. Etwa 5 µm dicke Kryostatschnitte werden luftgetrocknet (ca. 30 min). Die Fixierung erfolgt in auf ca. -20 C vorgekühltem Azeton für 15 bis 20 min bei ca. -20 C. Fixierte Kryostatschnitte können mehrere Monate bei ca. -20 C gelagert werden. In einem Prüfansatz werden bearbeitet: 1. Schnitte von verdächtigen Organproben, 2. Schnitte von Organproben eines BVDV-freien Rindes ( = negative Kontrollen), 3. Schnitte eines BVDV-positiven Rindes (= positive Kontrollen). In jedem Prüfansatz kommen zur Anwendung: 1. Anti-Pestivirus-mAk (z.b. WB 103/105, c.c. pro) 2. Irrelevanter mak 70

71 Protokoll Alle folgenden Schritte erfolgen bei Raumtemperatur. Waschen der fixierten Kryostatschnitte in PBS für 5 min Blockierung mit 5 % bovinem Serumalbumin (BSA) in PBS für 30 min Kurz waschen in PBS Inkubation mit mak in vom Hersteller empfohlener Arbeitsverdünnung in PBS für 60 min Waschen in PBS: 3x 5 min Inkubation mit FITC-markiertem Sekundärantikörper (Anti-Maus-Ig-FITC-Konjugat) in empfohlener Arbeitsverdünnung für 60 min: Verdünnung in PBS und Zusatz des Kontrastfarbstoffes Evans blue (3 Teile Konjugat- Arbeitsverdünnung + 1 Teil 0,005 % Evans blue in PBS). Waschen in PBS: 3x 5 min Waschen in A. dest. für mindestens 5 min Lufttrocknung Eindecken der noch leicht feuchten Schnitte mit PBS-Glycerol-Gemisch (1 Teil PBS + 9 Teile Glycerol) oder DABCO-Fluoreszenzerhaltungs-Puffer Mikroskopische Beurteilung der Schnitte Für die mikroskopische Beurteilung der Schnitte ist ein aufrechtes Mikroskop mit Auflichtfluoreszenz (Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe HBO 100 W) erforderlich. Die Beurteilung der Schnitte erfolgt im Vergleich mit den negativen und positiven Kontrollschnitten. Pestivirusantigen-positive Zellen zeigen zytoplasmatische, weitgehend homogene, leuchtende hellgrüne Fluoreszenz. Die Zellkerne bleiben dunkel ausgespart. Virusantigen findet sich in Keratinozyten der Epidermis, im Haarfollikelepithel, in Haarmatrixzellen der Haarzwiebel sowie in der dermalen Haarpapille Antigennachweis mittels Durchflusszytometrie Der Virusnachweis mittels Durchflusszytometrie wird nur noch in wenigen Laboren angewandt. Hier sind laborintern validierte Protokolle zu verwenden Virusgenomnachweis mittels RT-PCR Für den Nachweis von BVD-Virusgenom werden zugelassene Testkits bzw. an ihnen validierte PCR-Protokolle eingesetzt. Nachstehende PCR-Kits sind in Deutschland amtlich zugelassen: ADIAVET BVD REALTIME, (AES-Laboratoire) BVDV-LC LightCycler RT-PCR Kit, (AnDiaTec) BoVir-SL TaqMan RT-PCR-Kit (AnDiaTec) BVDV Q-PCR-HP (Inst. Pourquier) Virotype BVDV (LDL Leipzig) Protokolle für eine konventionelle pan-pesti PCR unter Verwendung der Standardprimer nach Vilcek, eine subtypenspezifische BVD-RT-PCR und eine vom AVID zur Anwendung empfohlenen real time RT-PCR sind im folgenden aufgeführt. 71

72 Konventionelle pan pesti RT-PCR (Hoffmann, mod. nach Vilcek) RNA-Isolierung:Die RNA-Isolierung erfolgt mit Extraktionsverfahren, die für die Aufreinigung von viraler RNA aus den verschiedenen Ausgangsmaterialien zugelassen sind. zellfreie Proben: z.b QIAamp RNA viral Mini Kit (Qiagen), Trizol (Invitrogen) zellhaltige Proben: z.b. RNeasy Mini Kit (Qiagen), Trizol (Invitrogen) (1) Die gleichzeitige Aufreinigung von sicher negativen Proben zur Kontrolle des kreuzkontaminationsfreien Arbeitens während der RNA-Extraktion ist empfohlen. Für die Aufreinigung von bis zu 7 Feldproben sollte mindestens eine RNA-Isolierungs- Kontrolle (RIC) mitgeführt werden. Bei einer größeren Anzahl von Proben sollte die Anzahl der RIC entsprechend erhöht werden. (2) Die RNA-Extraktion erfolgt nach den Vorgaben der Hersteller und wird nur durch die Zugabe einer Internen Kontroll-RNA (IC) zu jeder Probe modifiziert. Diese IC kontrolliert den Erfolg der RNA-Extraktion und der RT-PCR. (3) Die Zugabe von Interner Kontroll-RNA (IC) zur Probe erfolgt nachdem der Lysispuffer die RNasen der Probe zerstört hat. Die Menge der eingesetzten IC-RNA richtet sich nach dem Elutionsvolumen und sollte davon 1/10 betragen. Zum Beispiel bei einem Elutionsvolumen von 50 µl werden 5 µl IC der lysierten Probe zugesetzt IC-RNA in RNA-Safe-Buffer (RSB): 2x 10 5 Kopien/µl 10 sec kräftig per Hand mixen Proben kurz zentrifugieren (4) Weitere Co-Extraktion von viraler und IC-RNA entsprechend den Protokollen der Hersteller Lagerung der RNA: kuzfristig auf Eis; mittelfristig bei 20 C; langfristig bei 70 C Durchführung der PCR: (1) Die Amplifizierung erfolgt auf Basis des Superscript III One-Step RT-PCR Kits (# ; Invitrogen) in 25 µl Gesamtvolumen. (2) Als Kontrollen werden neben der RNA-Isolierungskontrolle (RIC) eine No Template Kontrolle (NTC) und mindestens eine positive Kontrolle mitgeführt. (3) Nach Herstellung der Mastermixe werden je 20 µl vorgelegt und 5µl Template zugefügt. 72

73 Mastermix Panpesti-Nachweis 1 X N X RNase freies Wasser 4,0 µl 2x Reaction Mix 12,5 µl MgSO 4 (5 mm) 0,5 µl SS III RT/Platinum Taq-Mix 1,0 µl Primer-1: ML120 (20pmol/µl) 1,0 µl Primer-2: ML121 (20pmol/µl) 1,0 µl Total Volumen Mastermix: 20 µl Template: je 5µl Feldprobe/n (N x) RIC NTC (SDW) T7-PK3alf (2 x 10 3 Kopien/µl) Cycler-Programm: RT 30 min 50 C Inaktiv./Aktiv. 2 min 94 C Denaturierung 30 sec 94 C Annealing 1 min 57 C 40 Zyklen Elongation 1 min 68 C Auswertung: Die eingesetzten Primer amplifizieren ein Produkt von ca. 300 bp in den allermeisten Pestiviren (Ausnahme: atypisches Pesitvirus Hobi) Für die NTC und die RIC sollte kein Amplifikat feststellbar sein. Für die PC (T7-PK3alf) sollte ein Produkt von ca. 300 bp feststellbar sein. Reagieren die positive und negativen Kontrollen entsprechend den Erwartungen, ist eine Auswertung der Feldproben möglich. Hierbei werden alle Banden, die eine der PC ähnliche Größe aufweisen, als verdächtig angesehen. Eine abschließende Charakterisierung der positiven Feldproben ist über eine Sequenzierung von Abschnitten der 5`-NTR möglich. Primer-Sequenzen (Vilcek) Primer ML120 (=V324) Primer ML121 (=V326) 5`-ATG CCC WTA GTA GGA CTA GCA-3` 5`-TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC-3` 73

74 Genotypspezifische RT-PCR (n. Strebelow) RNA-Isolierung Die RNA-Isolierung erfolgt üblicher Weise durch chromatographische Trennung an Silica- Oberflächen. Dafür sind in Abhängigkeit von der Probenart verschiedene kommerziell erhältliche Kits verwendbar. Denaturierungsmix Reagenzien Konzentration µl / Probe DMSO p.a. 99,5 % 0,5 Primer rev. 15 pmol 1,0 Probe 2,5 Zur Denaturierung wird der Reaktionsansatz im Thermocycler erst 5 min auf 95 o C und dann für 2 min auf 42 o C erhitzt. Danach erfolgt Abkühlung auf 4 o C. Der Reaktionsansatz wird dann zentrifugiert (zur Entfernung evtl. vorhandener Tröpfchen vom Gefäßrand oder Deckel). Dann erfolgt die Zugabe des RT-Mix. RT-Mix Reagenzien Konzentration µl / Probe 5x RT-Puffer 1x 3,0 dntp-mix je 100 mm 0,4 Dest. Wasser Rnase frei 7,15 Rnasin 4 U 0,1 AMV-Revertase 3,5 U 0,35 Je 11 µl RT-Mix werden zur denaturierten Probe pipettiert. Der Ansatz wird geschüttelt und zentrifugiert und dann für 30 min bei 42 o C inkubiert. Zur Inaktivierung der Revertase wird dann für 5 minn auf 98 o C erhitzt. Dann wird der Reaktionsansatz auf 4 o C abgekühlt und zentrifugiert. Danach erfolgt die Zugabe des PCR-Mix. PCR-Mix Reagenzien Konzentration µl / Probe Magnesiumchlorid 25 mm 2,1 10x Polymerasepuffer 1x 3,5 steriles dest.wasser 28,15 Primer forw. 15 pmol 1,0 Taq-Polymerase 1,25 U 1,25 Je 35 µl PCR-Mix werden zur Probe (RT-Ansatz) pipettiert. Mit 35 µl Mineralöl wird überschichtet. Die Reaktion wird dann einem Thermocyclus aus Denaturierung, Annealing und Elongation unterzogen. 74

75 Primer und Temperaturprofil für BVDV I UTR51 (rev. Primer): 5 -CAA CTC CAT GTG CCA TGT AC-3 BVD I (forw. Primer): 5 -GGT AGC AAC AGT GGT GAG TTC-3 Temperaturprofil: 3 min 92 C; 35 x (30 sec 92 o C, 30 sec 55 o C, 1 min 72 o C); 7 min 72 o C; 4 o C bis Ende (258bp) Primer und Temperaturprofil für BVDV II UTR51 (rev. Primer): 5 -CAA CTC CAT GTG CCA TGT AC-3 BVD II (forw. Primer): 5 -AGC GGT AGC AGT GAG TTC ATT-3 Temperaturprofil: wie für BVDV (257bp) Auswertung und Validierung Die Auswertung der RT-PCR erfolgt durch Analyse der PCR-Produkte mittels Agarosegelelktrophorese. Die Spezifität positiver Reaktionen wird durch anschließende Direktsequenzierung der PCR-Fragmente überprüft. Real time RT-PCR (n. Gaede) Prinzip Nach der Nukleinsäure-Isolierung erfolgen mit Hilfe eines one-tube RT-PCR Kits die reverse Transkription viraler RNA in cdna und die anschließende Amplifikation im als real-time RT-PCR im geschlossenen System. Für den Virusnachweis ohne Speziesdifferenzierung werden Primer und eine Sonde mit pan- Pesti-Spezifität eingesetzt. Damit wird die sichere Detektion aller bisher bekannten BVDV- Stämme gewährleistet. Positive Resultate werden mit diesem System auch für KSPV und BDV erzielt. Der spezifische Nachweis einer Infektion mit BVDV 2 ist mit Hilfe spezies-spezifische Sonde in Kombination mit einem weiteren pan-pesti-primerpaar möglich. Ein analoges spezifisches System für BVDV 1 existiert nicht. Die Sonde PPV reagiert zwar negativ auf BVDV 2, detektiert aber neben BVDV 1 auch BDV und KSPV. Indirekt ist die spezifische Bestätigung des Vorliegens von BVDV 1 nur durch den Ausschluss von BVDV 2, BDV und ggf. KSPV mit für diese Virusspezies spezifischen Sonden möglich. Alternativ wird auf die Möglichkeit der Differenzierung durch die Analyse der viralen Gensequenzen bzw. durch spezifische Anfärbung von Virusisolaten mit Hilfe monoklonaler Antikörper verwiesen. RNA-Isolierung Die RNA-Isolierung erfolgt üblicher Weise durch chromatographische Trennung an Silica- Oberflächen. Dafür sind in Abhängigkeit von der Probenart verschiedene kommerziell erhältliche Kits verwendbar. In automatisierten Systemen kann die aktive Silica-Oberfläche zur Separation an Magnetpartikel gekoppelt sein.die hier dargestellte Auflistung umfasst lediglich einige erprobte und geeignete Beispiele. 75

76 Blutserum und EDTA-Plasma (auch gepoolt) Die RNA-Isolierung aus Blutproben erfolgt nach den Herstellerangaben der jeweiligen Kithersteller. RNeasy Mini Kit, (Qiagen, Hilden, Deutschland) High Pure Viral RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) High Pure Viral Nucleic Acid Isolation Kit*** (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Agowa Mini Kit, manuelle und automatisierte Nukleinsäureextraktion (Agowa, Berlin, Deutschland) *** bevorzugt bei unsauberen Plasmen mit Anteil an Zellen bzw. Hämoglobin, auch bei Vollblut einsetzbar Milch (auch gepoolt) Der BVDV-Nachweis in Milchproben erfolgt im Zellsediment. Dazu werden die Zellen von ca. 10 bis 50ml (bei Poolproben) zur Sedimentation für 10min bei 3000g zentrifugiert, mit PBS gewaschen und nochmals zentrifugiert. Die weitere Bearbeitung erfolgt wiederum nach den Herstellerangaben der jeweiligen Kithersteller. RNeasy Mini Kit, (Qiagen, Hilden, Deutschland) High Pure Viral Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Gewebe und Tupfer Die RNA-Isolierung aus Geweben erfolgt nach den Herstellerangaben der jeweiligen Kithersteller. RNeasy Mini Kit, (Qiagen, Hilden, Deutschland) High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Zellkulturen Zellen von Zellkulturen mit BVDV-verdächtigem CPE werden durch Abzentrifugieren gewonnen und danach entsprechend den Herstellerangaben des verwendeten Kits zur RNA- Isolation aufbereitet. RNeasy Mini Kit, (Qiagen, Hilden, Deutschland) High Pure Viral Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Ansatz der RT-PCR Die hier beschriebenen Parameter gelten für die Verwendung des Quantitect Probe RT-PCR Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) auf dem Mx3000 (Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande) und icycler (Biorad, Hercules, USA). Bei Verwendung anderer Geräte-Systeme für die real-time PCR kann eine Anpassung erforderlich werden, insbesondere wenn diese Geräte nicht im üblichen 96er Blockformat arbeiten. Die Eignung anderer Enzymkits ist im Bedarfsfall zu prüfen. 76

77 Reaktionsgemisch (20 µl): enthaltend 10 µl QuantiTect Probe RT-Mastermix, 0,2 µl QuantiTect Probe RT-Mix, 1,0 µl forward-primer (Gebrauchslösung: 10 pmol/µl), 1,0 µl reversed-primer (Gebrauchslösung: 10 pmol/µl), 1,0 µl Sonde (Gebrauchslösung: 4 pmol/µl**** ) und 2 µl RNA-Template **** Die optimale Konzentration der Sonde kann variieren und muss ggf. überprüft werden. Thermocycler-Programm für one-step RT-PCR: reverse Transkription: 50 C, 30 min, Denaturierung und Aktivierung der Taq-Polymerase: 95 C, 15 min, 45 Zyklen: Denaturierung bei 94 C für 20 sek und Annealing/Primer-Extension bei 60 C für 1 min. Messung der Fluoreszenz zum Ende der Annealingphase (FAM-Filter) Auswertung und Validierung: Die Spezifität und die diagnostische Sensitivität der real-time RT-PCR zum Nachweis und zur Differenzierung von BVDV 1 und BVDV 2 wurden in umfangreichen Untersuchungen an Virusisolaten der verschiedenen pestivirus-spezies geprüft. Die real-time RT-PCR dient in erster Linie zum qualitativen Nachweis von BVDV. Durch Erstellung von Eichkurven nach Paralleltitration von Virusstämmen für die PCR wie auch für die Virusisolierung auf der Zellkultur kann ein quantitativer Nachweis erfolgen. Eine absolute Quantifizierung bzw. die Ermittlung der labor-spezifischen Nachweisgrenze sind ebenfalls durch die Verwendung eines synthetischen Standards (Bezugsquelle: FLI Insel Riems) möglich. Die typische Nachweisgrenze liegt bei ca. 50 bis 100 Viruskopien. Bei BVDV-PI werden üblicherweise ct-werte von 25 bis 30 (positive Signale zwischen dem 25. und 30. Zyklus) gemessen. Bei der Untersuchung von Poolproben, die Blut oder Milch von PI enthalten, muss ein ct-wert von ca. 30 bis 35 erwartet werden. Eine Laborvergleichsuntersuchung hat ergeben, dass bei Zykluszahlen >35 die Gefahr falsch-positiver Reaktionen proportional zunimmt. Wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen können dagegen durch die Freisetzung zellulärer RNasen zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Tabelle 1: Primer für die BVDV real-time RT-PCR (pan-pesti) Pestivirus-spezific Primers (5 -UTR) Quelle Primer: Pesti 3 CCT GAG TAC AGG RTA GTC GTC A Hyndman ~171 bp Primer: Pesti 4 et al. (1998) GGC CTC TGC AGC ACC CTA TCA Primer: A 11 AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG McGoldrick ~220bp Primer: A 14 et al. (1998) CAA CTC CAT GTG CCA TGT ACA GCA G Fragment Anwendung one-step RT-PCR zum simultanen Nachweis von BVDV 1 und BVDV 2 in Kombination mit der Sonde TQ-Pesti Differenzierung von BVDV 1 und BVDV 2 in Kombination mit den Sonden PPV oder BVD-2 77

78 Tabelle 2: TaqMan-Sonden für den simultanen Nachweis von BVDV 1 und BVDV 2 sowie zur Differenzierung von BVDV 1 und BVDV 2 TaqMan DNA-probes Quelle Spezifität (5 -FAM und 3 -TAMRA) Sonde: TQ-Pesti ( Reiting-Sonde ) Gaede et al. Genus Pestivirus TGC YAY GTG GAC GAG GGC ATG C (2005) Sonde: BVD-2 McGoldrick BVDV 2 CTG ATA GGG TGT AGC AGA GAC CCT et al. (1999) Sonde: PPV McGoldrick BVDV 1, außerdem CTG ATA GGG TGC TGC AGA GGC CCA CT et al. (1999) CSFV und BDV Indirekter Erregernachweis Neutralisationstest Prinzip Dieser Test basiert auf einer in vitro Neutralisation einer definierten Virusmenge durch spezifische (neutraliserende) Antikörper in Seren. Durch logarithmische Verdünnung der Seren wird der neutralisierende Antikörpertiter bestimmt. Die Visualisierung der Testergebnisse erfolgt mittels Immunfluoreszenz bzw. Immunperoxydasetest. Testdurchführung Probenaufarbeitung Der Neutralisationstest wird mit Serum durchgeführt. Nur in Ausnahmefällen, wenn kein Serum zur Verfügung steht oder wenn spezielle Fragestellungen zu beantworten sind, kann der Test auch mit Plasma durchgeführt werden. Dann ist aber ein höherer Grenztiter (~ 1:20) anzusetzen. Serum wird aus Blutproben ohne gerinnungshemmenden Zusatz gewonnen. Für die Verwendung im Neutralisationstest werden die Seren für 30 min bei 56 C inaktiviert. Plasma wird aus Blutproben mit gerinnungshemmenden Zusätzen gewonnen. Verdünnungsreihen Der Der Test wird in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte unter Verwendung von Zellkulturmedium mit Antibiotikazusatz (siehe Anhang) durchgeführt. Es wird eine Serumverdünnungsreihe in 2er-Stufen (z.b. von 1:5 bis 1:640) mit je einem Volumen von 50 µl pro Kavität hergestellt. Pro Serumverdünnungsstufe werden zwei oder vier Kavitäten (Doppelansatz, bzw. Vierfachansatz) nebeneinander beschickt. Ein Beispiel für eine Plattenbelegung ist w.u. gezeigt. In die Kavitäten der ersten Vertiefungsreihe werden 80 µl, in die Kavitäten der anderen Reihen 50 µl Kulturmedium vorgelegt. Zur ersten Vertiefungsreihe wird dann 20 µl Serumprobe zugegeben. Mit einer Multikanalpipette werden aus der ersten Verdünnungsstufe (1:5 Verdünnung) 50 µl aufgenommen, in die nächste Reihe gegeben, durchmischt, und die Verdünnungsreihe fortgesetzt (8 bis 12 Verdünnungsstufen). Die letzten 50 µl werden verworfen. Jede Kavität enthält jetzt 50 µl einer Serum-Medium-Verdünnung. Mindestens zwei positive Referenzseren (BVD-ref1 oder 2 für BVD1-AK; BVD-ref3 für BVD2-AK; Herkunft: BVDV-NRL, FLI Insel Riems) werden in gleicher Weise als Kontrollen mitgeführt (positive Serumkontrollen). 78

79 Mindestens zwei positive Referenzseren (BVD-ref1 oder 2 für BVD1-AK; BVD-ref3 für BVD2-AK; Herkunft: BVDV-NRL, FLI Insel Riems) werden in gleicher Weise als Kontrollen mitgeführt (positive Serumkontrollen). Testvirus In jede Kavität werden danach 50 µl mit 100 KID 50 der Testvirussuspension gegeben. Die Testvirussuspension muss unmittelbar vor Gebrauch mit Kulturmedium auf 100 KID 50 /50µl (2000 KID 50 /ml) eingestellt werden. Die benötigte Menge an Testvirus (ca. 5 ml pro Mikrotiterplatte) ist in einem Ansatz herzustellen. Der Verdünnungsfaktor um die Testvirussuspension auf 100 KID 50 /50 µl einzustellen wird rechnerisch ermittelt. Ein Rechenbeispiel ist w.u. zu finden. Kontrollen Neben den positiven Serumkontrollen werden eine Zellkontrolle (100 µl Kulturmedium ohne Serum und Virus), je zu testendes Serum eine virusfreie Serumkontrolle (Grundverdünnung), eine Viruskontrolle und eine Rücktitration des Testvirus zur Bestimmung der eingesetzten KID50 mitgeführt. Mit der Rücktitratrion kontrolliert man den tatsächlichen Virusgehalt im Test. Hierbei wird die im Test eingesetzte Virusverdünnung in log-2-schritten beginnend bei 1:10 bis 1:1280 ausverdünnt. 180 µl Kulturmedium werden vorgelegt, 20 µl Testvirussuspension dazugegeben (1:10) und anschließend ausverdünnt. Pro Verdünnungsstufe werden zwei oder vier Kavitäten nebeneinander mit 100 µl Virusverdünnung beschickt. Neutralisation Die Mikrotiterplatte inkubiert daraufhin für 2 Stunden bei 37 C in einer feuchten Umgebung in einem CO 2 -Schrank (2,5 bzw. 5 % CO 2 ). Während dieser Zeit findet der Neutralisationsprozess statt. Zellsuspension Nach der Inkubationszeit werden in jede Kavität 100µl der entsprechenden Zellsuspension hinzugefügt. Die Zelldichte muss so eingestellt sein, dass nach 24 Stunden ein konfluenter Zellrasen entsteht. (ca Zellen/ml). Die Mikrotiterplatte verbleibt für 72h zur Inkubation bei 37 C in einer feuchten Umgebung im CO 2 -Schrank (2,5 bzw 5 % CO 2 ). Immunreaktion Grundsätzlich, d.h. auch bei Verwendung eines zytopathogenen NT-Virus sollte die Auswertung des Testes nach Detektion des Virus mittel Immunfluoreszenz- bzw. Immunperoxydasetest nach 3 Tagen erfolgen Die Berechnung des Antikörpertiters erfolgt als ND50 nach Behrens und Kaerber. Neutralisationstiter = V-d(S-0,5) V: lg der ersten 100 % pos Serumverdünnung d: lg des Verdünnungsfaktors (0,3) S: Summe der pos. Reagenten von 0 bis 100 % Reagentenzahl je Verdünnung 79

80 Geräte und Reagenzien Mikrotiterplatten (96-well) Mehrkanalpipetten, Pipetten, sterile Plastikspitzen Empfängliche Zellkulturen, z.b.: MDBK, KOP-R, (Herkunft: Zellbank des FLI) Zellkulturmedien Referenzviren, BVD-1: NADL; BVD2: CS8644; Virusbank des FLI) monoklonale Antikörper gegen Pestiviren (Herkunft: kommerzielle Anbieter, z.b. cc pro) Peroxidasemarkierte Anti-Maus-Antikörper (Herkunft: kommerzielle Hersteller, z.b. Sigma) Positiv- und Negativreferenzen Standardmäßige Laborausstattung für ein Viruslabor (Sterilwerkbank, Umkehrmikroskop, CO 2 -Schrank (37 C), Zentrifuge, Wärmeschrank (80 C), Kühlschrank, Kühltruhe (-20 C, -70 C). Reagenzien Referenzseren: Antibiotikalösung Oder NRL BVD, FLI Insel Riems 1,25 g Penicillin 2 g Streptomycin In 20 ml sterilem Aqua bidest lösen, portionieren und bei 20 C einfrieren Gentamycin, 1 µl/ml Kulturmedium (50 ng/ml) Amphotericin, 10 µl/ml Rechenbeispiel zur Berechnung des Verdünnungsfaktors für das Testvirus Die im Neutralisationstest zum Einsatz kommende Virussuspension (Testvirus) soll einen Titer von 100 KID 50 /50 µl haben. Folglich muss das Ausgangsvirus entsprechend verdünnt werden. Die Berechnung des Verdünnungsfaktors erfolgt nach der Formel: Titer log 10 KID 50 /0,1 ml Ausgangsvirus minus * = log 10 Virusverdünnung; entlogarithmieren. Reziproker Wert = Virusverdünnung. (* 10 2,3 = 200 KID 50 pro 0,1 ml) Beispiel: Der Titer des Ausgangsvirus beträgt 10 6,3 KID 50 / ml. Das sind 10 5,3 KID 50 /0,1ml. Berechnung: 10 5,3-10 2,3 = 10 3 Entlogarithmierung 3,0 log 10 = 1000 Das Ausgangsvirus muss 1 : 1000 in Kulturmedium verdünnt werden. 80

81 Plattenbelegungsschema: Serum 1 Serum 2 Serum 3 Serum 4 Serum 5 Serum A B C D E F G H ND50 Serum 7 Serum 8 Serum 9 Serum 10 Rücktitration Serum-/ Zellkontrollen A S1 S2 B S3 S4 C S5 S6 D S7 S8 E S9 S10 F ZK ZK G H VK VK ND Antikörper-ELISA Für den Antikörpernachweis werden amtlich zugelassene ELISA-Testkits nach Herstellerangaben eingesetzt. Folgende Testkits sind derzeit in Deutschland zugelassen: HerdChek BVDV Ab (IDEXX) indirekt Svanovir BVDV (2 Handelsformen) (Svanova) indirekt Ceditest BVDV (Cedi Diagn.), kompetitiv BVD/MD p80 Antikörper (Inst. Pourquier) kompetitiv Chekit BVD-Sero II (Bommeli) indirekt SERELISA BVD/MD Antikörper (Synbiotics) kompetitiv 81

82 13. Bovine Herpes Virus Typ 1-Infektion (alle Formen) Charakterisierung der Infektion Erreger Das Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV1) gehört zur Familie der Herpesviridae, Subfamilie Alphaherpesvirinae, Gattung Varicellovirus. Es verursacht verschiedene Krankheitsbilder, verhält sich aber immunologisch einheitlich. Nur über Analysen des Genoms ist in vielen Fällen eine Differenzierung zwischen IBR-Stämmen" und IPV/IBP-Stämmen" möglich. Die Infektion ist weltweit verbreitet und erreicht in vielen Ländern hohe Prävalenzen. Dänemark, Österreich, Bozen, Schweden, Finnland und die Schweiz sind anerkannt BHV1-frei. Deutschland besitzt derzeit als einziges Land die EU-Anerkennung für sein BHV1-Bekämpfungsprogramm (2004/215/EG und 2004/558/EG) und damit den so genannten Artikel 9-Status gemäß der Richtlinie 64/432/EWG Klinische Symptomatik Die BHV1-Infektion ist eine überwiegend akut verlaufende, hochkontagiöse virusbedingte Allgemeinerkrankung des Rindes und anderer Boviden. Die Inkubationszeit liegt bei allen Verlaufsformen etwa zwischen 2 und 6 Tagen. Die vorwiegend respiratorische Manifestationsform wird als Infektiöse Bovine Rhinotracheitis (IBR) bezeichnet. Sie geht in ihrer akuten Form mit Fieber bis zu 42 C, serösem Nasenausfluss, einer Hyperämie der Schleimhäute von Flotzmaul und Nase sowie Speicheln einher. Bereits zu Beginn der Erkrankung sinkt die Milchleistung laktierender Tiere. Später treten Husten und Augenausfluss auf. Teils sind auf der Nasenschleimhaut stecknadelkopfgroße, pustelartige Erhebungen zu beobachten. Die Krankheitsdauer beträgt 10 bis 14 Tage. Bei Kälbern fällt die IBR in der Regel als fieberhafte Allgemeinerkrankung mit vorwiegend respiratorischen Symptomen auf. Bakteriell bedingte Pneumonien treten als schwere Sekundärinfektionen auf. Sehr selten werden innerhalb weniger Tage letal verlaufende Meningoenzephalitiden bei Kälbern im Alter von 4 bis 6 Monaten beobachtet. Trächtige Kühe können vor allem im 5. bis 8. Trächtigkeitsmonat nach einer Inkubationszeit von 3 bis 6 Wochen abortieren. Nicht selten verläuft die Infektion jedoch bei einzelnen Tieren oder in ganzen Herden klinisch inapparent. Die genitale Form der Infektion tritt als Infektiöse Pustuläre Vulvovaginitis (IPV) beim weiblichen Rind und als Infektiöse Balanoposthitis (IBP) beim Bullen auf. Sie geht oft mit leichtem Fieber, Rötung und Schwellung der Schleimhaut der äußeren Genitalien, Unruhe und schmerzhaftem Harndrang einher. Auf der Genitalschleimheit bilden sich stecknadelkopf- bis kirschkerngroße, bläschenartige, grauweiße Erhebungen mit gerötetem Hof, die sich zu Pusteln, kruppösen Veränderungen und ulzerativen Erosionen weiterentwickeln können. Einmal infizierte Tiere bleiben wie generell bei den Herpesvirusinfektionen lebenslang latent infiziert. Nach Reaktivierungen der Infektion, die klinisch inapparent bleiben kann, kommt es zur Virusausscheidung und zur Übertragung auf andere Tiere. Auch geimpfte Tiere können Wildtypvirus aufnehmen und ohne Erkrankung zu Virusträgern werden. Die Virusausscheidung erfolgt hauptsächlich mit den Sekreten der Schleimhäute des Genitaltraktes (IPV/IBP), des Respirationstraktes und dem Konjunktivalsekret (IBR), aber auch mit dem Kot und mit dem Sperma. Die Virusausscheidung dauert selten länger als 14 Tage über den Respirationstrakt, vaginal bis zu 14 Tagen und beim Bullen bis zu 4 Wochen. In der Rekonvaleszenzphase befindliche Tiere können das Virus diskontinuierlich ausscheiden. Die Reaktivierung latenter Infektionen kann durch Immunsuppression (z. B. durch Behandlung mit Glukokortikoiden oder besondere Belastungen wie Geburtsstress)provoziert werden. 82

83 Differentialdiagnostik Differentialdiagnostisch kommen bei der IBR andere viral oder bakteriell bedingte Respirationserkrankungen sowie Infektionen mit Lungenwürmern in Betracht. Die IPV muss gegen bakteriell und parasitär (Tritrichomonas fetus) bedingte Deckinfektionen abgegrenzt werden. Bei der differentialdiagnostischen Abklärung infektiöser Abortursachen sind unter anderem die BVD/MD-Infektion, bakterielle Erkrankungen (z.b. Leptospirose, Chlamydiose, Coxiellose) und parasitäre Infektionen (z.b. Neosporose) in Erwägung zu ziehen Diagnostische Indikation Diagnostische Indikationen sind beim Auftreten klinischer Erkrankungen und Aborte, bei der Bestandssanierung, beim Verbringen von Rindern in Bestände mit BHV1-freien Tieren sowie beispielsweise bei An- und Verkaufsuntersuchungen gegeben (siehe auch 6) Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungs-, Tiergesundheitsämter bzw. Staatliche Lebensmittel- und Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer. Nationales und OIE Referenzlabor für BHV1, FLI Insel Riems. Nationales Referenzlabor für BHV1 am Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler- Institutes, Insel Riems (Tel.: ) Abklärungsuntersuchungen Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektion mit dem Bovinen Herpesvirus Typ 1 (BHV1-VO) in der Neufassung vom 03. November 2004 (Bundesgesetzblatt Jahrgang 2004 Teil I Nr. 57, Seite ). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestric Animals, Chapter IBR (BHV1), 5 th edition, Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial für den Erregernachweis Nasen- und Genitaltupfer; zusätzlich Abortmaterial, Organmaterial wie Lunge, Gehirn, Ganglien, Tonsille (Menge: ca. 0,5 bis 1 cm 3 ) bei verendeten bzw. geschlachteten Tieren sowie Spermaproben (Frischsperma oder abgefüllte Proben in Verdünnerlösung). Lagerung bei -20 C, optimal bei -80 C. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen führt zur drastischen Senkung des Virustiters und damit der Nachweisbarkeit in der Zellkultur Untersuchungsmaterial für den Antikörpernachweis Plasma, Serum; Menge: mindestens 500 µl Milchproben: Einzel- oder Sammelmilch; für Nativmilchverfahren mindestens 500 µl, für Konzentrierungsverfahren mindestens 50 ml 83

84 13.3. Untersuchungsgang Erregernachweis Virusisolierung in der Zellkultur BHV1 vermehrt sich in bovinen Zellkulturen und -linien (z.b. MDBK, KOP-R), teilweise auch in Zellen anderer Herkunft. Die Infektion verläuft zytopathisch und führt im Monolayer zur Plaque-Bildung. Bei den meisten Zelllinien runden sich die Zellen innerhalb der Plaques ab oder bilden seltener kleine Synzytien. Ausführung: Homogenisieren des Organmaterials, Herstellen einer Organsuspension (1:5 bis 1:10) unter Verwendung antibiotika- bzw. antimykotikahaltigen Mediums (Anlage), Lagerung für 1 bis 2 h bei 4 C im Kühlschrank, anschließende Zentrifugation. Tupferproben werden in Virusanzuchtmedium für etwa 15s stark geschüttelt (Vortex). Die Probenflüssigkeit kann dann direkt auf die Zellkultur aufgebracht werden. Nicht angeimpfte Proben können bei 70 C gelagert werden. Blutproben werden im Verhältnis 1:4 mit Lysispuffer versetzt und für 15 min auf Eis lysiert. Nach zwei Waschschritten mit PBS werden die Blutleukozyten pelletiert (2000 x g, 3 min) und je ml Ausgangsblutvolumen in einem ml Zellkulturmedium resuspendiert. Die Proben sollten weder gefriergetaut noch mit Ultraschall behandelt werden. Spermaproben in Verdünnerlösung (in der Regel gebrauchsfertig in Pajetten verpackt) werden unverdünnt und in einer 1:10 Verdünnung (Virusanzuchtmedium) angeimpft. Die Proben sollten tiefgefroren geliefert und sofort nach dem Auftauen bearbeitet werden. Native Spermaproben werden vor der Animpfung 1:10 und 1:100 in Virusmedium verdünnt. Nicht angeimpfte Proben können bei 70 C gelagert werden. Inokulation der bearbeiteten Probe auf die entsprechende Zellkultur (z.b. MDBK, FBTr oder KOP-R) sollte im Doppelansatz erfolgen. Zur Vermeidung von toxischen Effekten (z. B. bei Spermaproben) kann die Probe nach 4h (Adsorption) wieder entfernt und vollständig durch Virusanzuchtmedium ersetzt werden. Zur Virusisolierung können 24-Lochplatten, Zellkulturröhrchen oder Zellkulturflaschen verwendet werden, das Medium sollte zur Verhinderung bakterieller Kontaminationen Antibiotika und eventuell Antimykotika in gebräuchlichen Konzentrationen enthalten (Anlage). Die Bebrütung sollte bei 37 C für mindestens 7 Tage erfolgen. Nach 7 Tagen werden 100µl Zellkulturüberstand aus den beimpften Zellkulturen jeweils auf frisch angelegte Kulturen verbracht (1. Passage) und für weitere 5 bis 7 Tage bei 37 C inkubiert. Die Überstände können bei Bedarf (z. B. Rücklage für weitere Abklärung) bei -70 C gelagert werden. Eventuell sind weitere Passagen notwendig. tägliche Kontrolle des Auftretens eines CPE (bei hohem Virusgehalt diffus verteilte Zellabkugelungen nach ca. 1 bis 2 Tagen, bei niedrigem Virusgehalt einzelne Plaques mit Abrundung der Zellen oder Ausbildung kleiner Synzytien). Zur Sicherung der Diagnose kann der Zellrasen nach Fixierung mit Hilfe von BHV1-spezifischen Antikörpern (polyklonales Antiserum oder monoklonale Antikörper) angefärbt werden (Immunfluoreszenz- oder Immunperoxidasefärbung). 84

85 Identifizierung durch Virusneutralisation Das vermeintliche BHV1-Isolat in log10-schritten mit einem BHV1-positiven und BHV1- negativen, monospezifischen, Referenzserum vom Rind (kann vom NL für BHV1 angefordert werden) verdünnen und für 2 h bei 37 C inkubieren, anschließend: Inokulation des Virus-Serumgemisches auf eine 96-well Mikrotiterplatte (Vierfachansatz) und anschließende Bebrütung für 4 Tage bei 37 C, Kontrolle der virusneutralisierenden Aktivität. Nachweis von BHV1-DNA mittels Polymerasekettenrektion (PCR) Die PCR kann zum Nachweis von BHV1-DNA in Organproben, in Tupferproben und in Blutproben während der Virämie genutzt werden. Die PCR eignet sich ferner für den BHV1- Nachweis in Spermaproben. Der Nachweis latenter Infektionen mittels PCR (z. B. Nachweis in Organproben) ist schwierig und für die allgemeine Diagnostik nicht geeignet. Je nach Fragestellung sind in der Literatur verschiedene PCR-Techniken für die BHV1-Infektion beschrieben. Primer und die Amplifikationsparameter müssen entsprechend der Zielstellung ausgewählt werden. Die PCR muss für die jeweiligen spezifischen Bedingungen optimiert werden, um unter Routinebedingungen erfolgreich zu funktionieren. Generelle Arbeitsschritte sind: Homogenisierung des zu untersuchenden Probenmaterials, DNA-Extraktion (z. B. Phenol-Chloroform-Extraktion nach Proteinase K-Verdau oder Verwendung fertiger Systeme wie z. B. PUREGENE DNA Kit oder QIAamp DNA Kit) Amplifikation in der PCR, in Ausnahmefällen nested-pcr Agarosegel-Elektrophorese für die Differenzierung von BHV1-Markerimpfvirus und Wildtypvirus können beispielsweise ge- und gb-spezifische Primer eingesetzt werden. Nähere Angaben zur Anwendbarkeit der PCR im Rahmen der BHV1-Diagnostik sind beim NRL für BHV1 zu erhalten (Tel ). Angaben zu Primern, Reagenzien und Zykluszeiten finden sich im Anhang. Hinweis: o Die BHV1-PCR ist bisher von der OIE nicht als validierte Methode anerkannt. Standardmethode sollte daher immer die Virusisolierung sein o Positive PCR-Ergebnisse sollten möglichst durch die Virusisolierung und nachfolgende serologische Untersuchungen verifiziert werden. Neue real-time PCR-Protokolle zum Nachweis von BHV1 sind bisher nicht publiziert Indirekter Erregernachweis Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Mehrere kommerziell erhältliche und in Deutschland zugelassene ELISA-Systeme existieren, mit denen Antikörper gegen ganzes Virus (indirekter Vollvirus ELISA) oder gegen einzelne 85

86 Glykoproteine (gb- bzw. ge-blocking ELISA) nachgewiesen werden können. ELISA- Systeme zum Nachweis von Antikörpern gegen das Glykoprotein E (IDEXX GmbH; Dr. Bommeli Diagnostics/IDEXX) dienen als spezifisches Diagnostikum zur Unterscheidung von uninfizierten Rindern und Tieren, die mit ge-markerimpfstoff immunisiert wurden, von solchen, die mit Wildtyp-BHV1 in Kontakt waren. Bezüglich der Durchführung der einzelnen ELISAs wird auf die Produktinformationen der Hersteller verwiesen. BHV1-Referenzseren für die ELISA Diagnostik können vom NRL für BHV1 angefordert werden. Derzeit werden vom NRL für BHV1 alle ge-blocking-elisa-testchargen einer Prüfung unterzogen. Andere BHV1-Antikörper-ELISAs werden nach einer Freistellung von der Chargenprüfung stichprobenartig untersucht. Die höchste Sensitivität besitzen die gb-blocking-elisas sowie moderne indirekte ELISA- Systeme (> 98 %). In der Regel ist die Sensitivität dieser Systeme sogar höher als die des Neutralisationstests. Geringere Sensitivitäten werden hingegen mit den ge-blocking-elisas erreicht. Dies ist insbesondere bei Einzeltieruntersuchungen problematisch. Im Gegensatz hierzu ist die Herdensensitivität der ge-blocking-elisas als hoch zu bewerten. Für Milchproben eignen sich ausschließlich die zugelassenen indirekten ELISA-Systeme. Moderne indirekte ELISAs erlauben sogar die sensitive und spezifische Untersuchung von Nativmilchpools von bis zu 50 Tieren. Diese Testsysteme sind in der Lage, ein schwach positives Tier in einer Poolprobe zu erkennen. Ein zuverlässiger Markertest für Milchproben existiert dagegen bisher nicht. Die zugelassenen ge-blocking-elisas reagieren mit Sammelmilchproben erst dann sicher positiv, wenn mehr als 10 % der Herde BHV1-gE- Antikörper-positive Reagenten sind. Neutralisationstest zum Nachweis von BHV1-Antikörpern (s. NT) Der Neutralisationstest basiert auf dem Nachweis der neutralisierenden Aktivität von Rinderseren gegen das BHV1. Durch logarithmische Verdünnung der Seren wird der neutralisierende Antikörpertiter im Vergleich zu mindestens einem schwach positiven und einem negativen Standardserum bestimmt. Die Titer werden nach der Tabelle von Kärber als neutralisierende Dosis 50 % oder 100 % (ND 50 oder ND 100 ) berechnet. Eine Rücktitration des Testvirus stellt zudem die Verwendung einer korrekten Virusmenge für die Neutralisierung sicher. Aufgrund ihrer Sensitivität und der Eignung für Massenuntersuchungen haben ELISATestsysteme den NT für allgemeine diagnostische Zwecke weitestgehend abgelöst. Er sollte jedoch als Referenzmethode zur Verfügung stehen. In jedem Fall ist eine Serum-Virus-Inkubation von mindestens 12 besser 24 Stunden einzuhalten, da die Sensitivität damit im Vergleich zu einer 1- bis 2-stündigen Serum-Virus- Inkubation signifikant ansteigt. Ausführung: Herstellen und Titrieren von BHV1-Testvirus MDBK-Zellen niedriger Passage 1:8 in 175 cm² Kulturflaschen teilen. Nachdem sich ein konfluenter Zellrasen gebildet hat (nach 24 bis bis 8 h) Erhaltungsmedium zugeben und mit etwa 0,1 infektiösen Einheiten BHV1 (z. B. Stamm Schönböken) pro Zelle beimpfen (etwa 100 µl einer BHV1-haltigen Virussuspension mit einem Titer von 107 KID50/ml je 175 cm² Kulturflasche). Nach h, wenn erste Zeichen eines zytopathischen Effektes sichtbar werden, Überstand von den Kulturflaschen steril entnehmen, bei 2500 x g für 3 min zentrifugieren und in 1 ml-portionen abfüllen. Die 86

87 Lagerung erfolgt sofort bei mindestens -70 C. Diese Viruspassage wird im Folgenden als Testvirus (TV) bezeichnet. Zwei Röhrchen mit eingefrorenem Testvirus schonend auftauen, in log10-schritten von 10-1 bis 10-8 in Anzuchtmedium verdünnen und jeweils 100 µl der verdünnten Virussuspension im Achtfachansatz auf 96-Loch-Mikrotiterplatten pipettieren und für 24 h bei 37 C und 5 % CO2 inkubieren. MDBK-Zellen auf eine 75 cm² Kulturflasche 1:6 teilen und für 24 h inkubieren. Nach 24 h Zellen mittels Trypsinlösung ablösen, zählen und auf Zellen/ml mit Anzuchtmedium verdünnen. Je 100 µl Zellsuspension auf die vorinkubierten Mikrotiterplatten geben. Nach 4 Tagen zytopathischen Effekt beurteilen (tägliche protokollierte Kontrolle!). Berechnung des BHV1-Titers erfolgt nach der Tabelle von Kaerber als kulturinfektiöse Dosis 50 % (KID50). Aus beiden Ansätzen wird das geometrische Mittel der erhaltenen 24-h-Titer berechnet (Summe der Exponenten geteilt durch Anzahl der Exponenten: z. B. 10 7,3 KID 50 /ml und 10 7,7 KID50/ml = 10 ((7,3+7,7)/2) = 10 7,5 KID 50 /ml). Vorbereiten der Seren Serum von Nativblutproben wird für 30 Minuten bei 56 C im Wasserbad inaktiviert. Testdurchführung Verdünnung der Test- und Referenzseren (Positiv-, Negativserum) in log2-schritten in der Mikrotiterplatte: 50 µl Mediumvorlage in alle Vertiefungen außer in Reihe A (unverdünnter Ansatz) pipettieren, 100 µl Serumvorlage in Reihe A zugegeben und jeweils 50 µl in nächste Reihe überführen, 8-mal pro Verdünnungsschritt mischen, in der letzten Reihe 50 µl verwerfen ( log2-verdünnungsreihe ). Je Serum sollte mindestens ein Dreifachansatz untersucht werden Testvirus durch Verdünnung in Anzuchtmedium auf 10 2 KID 50 /50µl (= 10 3,3 KID 50 /ml) einstellen. Hierfür sollte pro Verdünnungsschritt nicht weniger als 0,5 ml Virussuspension und keine Einzelverdünnung größer als 1:10 verwendet werden (z. B. Ausgangstiter des Testvirus = 10 7,3 KID 50 /ml, benötigte Virussuspensionsmenge = 50 ml. Daraus folgt ein Verdünnungsfaktor von 10 7,3 10 3,3 = 10 4 = 10000; Verdünnungsreihe: 0,5 ml Virussuspension + 4,5 ml Medium 0,5 ml VS1 + 4,5 ml M 0,5 ml VS2 + 4,5 ml M 5 ml VS ml M). Zugabe von 50 µl des verdünnten Testvirus (eingestellt auf 100 KID 50 /50 µl) zu den Serumverdünnungen, Platte kurz schütteln und für 24 h bei 37 C und 5 % CO2 inkubieren. Virusrücktitration in log10-stufen: 0,5 ml der verwendeten Virusverdünnung werden hierzu 10-1 bis 10-4 verdünnt und 50 µl der Virusverdünnung und der jeweiligen Rücktitrationsverdünnungen im Achtfachansatz pipettiert. Die Platte wird anschließend ebenfalls für 24 h bei 37 C und 5 % CO2 inkubiert. Für alle Seren sollte eine Serumkontrolle (unverdünnt) im Doppelansatz mitgeführt werden (Toxizitätskontrolle). Nach 24 h werden 100 µl MDBK-Zellsuspension in Anzuchtmedium (ca Zellen/100 µl) zu allen Vertiefungen gegeben. Platten für 4 Tage bei 37 C und 5 % CO2 inkubieren. 87

88 Ablesen und Auswerten des NT Alle Vertiefungen werden täglich mikroskopisch kontrolliert und die Ergebnisse protokolliert. Die endgültige Bestimmung des nak-titers (z. B. ND 100 ) erfolgt am Tag 4. Bereits ein Virusplaque macht die entsprechende Vertiefung positiv. Der NT ist valide, wenn die Rücktitration einen Titer von ,5 ergibt, das positive Kontrollserum nicht mehr als eine log2-stufe vom Erwartungswert abweicht und keine Virusneutralisation in den Vertiefungen des negativen Kontrollserums nachweisbar ist. Die Serumkontrolle darf keine oder nur geringgradige Zeichen toxischer Veränderungen aufweisen Berechnung des Neutralisationstiters (ND100): (-log2) = a/b + c a = Anzahl der Vertiefungen ohne Virusvermehrung b = Anzahl der Vertiefungen pro Verdünnungsstufe c = -log2 einer evtl. Vorverdünnung des Testserums (z. B. -log2 für 1:64 = 6) BHV1-positive und negative Referenzseren sowie Referenzmilchen zur Validierung der BHV1-Serologie sowie charakterisierte BHV1-Virusstämme können vom NRL für BHV1 angefordert werden. Für den NT existiert ein spezielles NT-Panel von 10 Seren mit unterschiedlichen BHV1-Antikörper-Titern. 88

89 Anhang I: Reagenzien Zelllinien Virusisolierung und VNT: Bezugsquelle: MDBK oder FBTr (Fötale Bovine Trachea) oder KOP (Kälberösophagus-Zellen) Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin, Friedrich- Loeffler-Institut (FLI) Insel Riems (Leiter: Dr. Riebe). Virusstämme BHV1-Virusstämme (z. B. Stamm Schönböken) können von der Virusbank des FLI Insel Riems angefordert werden (Leiter: Dr. Dauber). Medien Anzuchtmedium: Eagle MEM Dulbecco w/l-glut. 10 % Fetales Kälberserum (FKS) 1 % Antibiotika Antibiotika: Amphotericin B (250 µg/ml) Penicillin ( IE/l), Streptomycin (100 mg/l) oder Gentamycin (50 mg/ml) Erhaltungsmedium und Virusanzuchtmedium: Eagle MEM Dulbecco w/l-glut. 2 % FKS 1 % Antibiotika Puffer, Lösungen, Reagenzien PBS: 8,00g NaCl + 0,2g KH2PO4 + 2,9g Na2HPO4 x 12 H20 +0,2g KCl ad ml Bidest, ph 7,2 Isotonischer Phosphatpuffer: 8,28g NaCl + 3,30g Na2HPO4 x 12 H20 ad ml Bidest (IP) ph 7,8 IP-Glycerol: IP - Glycerol = 9 : 1 Trypsinlösung: Saline-Versen-Trypsinlösung zum Ablösen von Zellen Lysispuffer: 8,29g NH4Cl + 1,0 g KHCO3, 1mM EDTA ad 1000 ml Bidest, ph 7,4 89

90 Referenzmaterial Für die BHV1-Serologie kann beim NRL für BHV1 ein Panel an validierten Referenzseren und -milchen angefordert werden. Die deutschen Standardsera orientieren sich dabei an den EU-Standards EU1 (positiv), EU2 (schwach positiv) und EU3 (negativ). Die Seren sind als R1 (positiv), R2 (schwach positiv), R3 (sehr schwach positiv) sowie R31 (negativ) und R32 (negativ) bezeichnet. Diese Standardseren sollen jeweils als Basis für die Entwicklung laboreigener, angepasster Standardproben dienen. Zudem kann vom NRL für BHV1 auf Anfrage ein großes BHV1-Referenzpanel mit etwa 20 Seren sowie eine NT-Panel mit etwa 10 Seren zu Validierungszwecken angefordert werden. Anhang II: PCR-Protokoll Einleitung In der hier vorliegenden Labormethodenanweisung werden spezielle PCR-Protokolle zum Nachweis von Genomen des BHV1 aufgeführt (ge- und gb-spezifische Sequenzabschnitte). Material und Geräte Geräte: Thermo Cycler Pipetten variabel von 0,5 µl bis 100 µl Pipettenspitzen mit Filter ungepuderte Handschuhe 200 µl Reaktionsgefäße Reaktionsgefäßständer Mini-Zentrifuge -20 C Tiefkühltruhe -70 C Tiefkühltruhe Sterilbank Vortex Reagenzien Polymerase PFX Platinum (Gibco-BRL Life Technologies PCRx Enhancer System) 10X Puffer MgSO 4 10x Enhancer dntp mix Primer (ge und gb) mol.biol H 2 O. ca µl aufgereinigte DNA-Suspension (enthält etwa 1 bis 50µg DNA) Durchführung Die Durchführung teilt sich in Probenaufbereitung, eigentliche Polymerase-Kettenreaktion und den Nachweis spezifischer Amplifikate. 90

91 Probenvorbereitung Es werden mit Hilfe des Puregene-Kits (Fa. Biozym) oder des QIAamp-DNA-Isolierungs- Kits (Fa. Qiagen) aufgereinigte DNAs eingesetzt (Aufreinigung nach Beschreibung des Herstellers). Qualität und Quantität der DNA können im Agarosegel abgeschätzt werden. Es sind 1 bis 5 µl direkt nach der Aufreinigung gewonnene DNA-Suspension in der BHV1- PCR einzusetzen. Im Einzelfall kann von der Menge abgewichen werden und eine genaue Messung mittels Photometrie erfolgen. BHV1-PCR zum Nachweis von ge- und gb-spezifischen Genomabschnitten (PCR Protokoll) a) BHV1-gE-PCR: - Mastermix PFX Platinum (Invitrogen) 10X Puffer 5 µl MgSO 4 2 µl (50 mm stock solution) 10x Enhancer 5 µl dntp mix 4 µl (2,5 mm stock solution) Primer mix 2 µl (10 pmol/µl stock solution entspricht ca. 50 ng/µl) Template 2-5 µl (10 bis 500 ng) Taq Polymerase 2,5 U (PFX Platinum Taq Polymerase) H 2 O ad 50 µl - Primer ge_1: GCTTCGGTCGACACGGTCTT ge_2: GGTACGTCTCCAAGCTGCCC Produktgröße: etwa 265 bp - PCR-Zyklus 96 C 5 min 10x: 65 C 90 sec 72 C 100 sec 96 C 80 sec 15x: 54 C 90 sec 72 C 100 sec 96 C 80 sec 10x: 60 C 90 sec 72 C 100 sec 96 C 80 sec 72 C 10 min 4 C hold 91

92 b) BHV1-gB-PCR - Mastermix PFX Platinum (Invitrogen) 10x Puffer 5 µl MgSO 4 1,5 µl (50 mm stock solution) 10x Enhancer 5 µl dntp mix 4 µl (2,5 mm stock solution) Primer mix 2 µl (10 pmol/µl stock solution entspricht ca. 50 ng/µl) Template 2-5 µl (10 bis 500 ng) Taq Polymerase 2,5 U (PFX Platinum Taq Polymerase) H 2 O ad 50 µl - Primer gb1: TACGACTCGTTCGCGCTCTC gb2: GGTACGTCTCCAAGCTGCCC Produktgröße: etwa 478 bp - PCR-Zyklus 96 C 5 min 10x: 65 C 90 sec 72 C 100 sec 96 C 80 sec 15x: 54 C 90 sec 72 C 100 sec 96 C 80 sec 10x: 60 C 90 sec 72 C 100 sec 96 C 80 sec 72 C 10 min 4 C hold c) Kontrollen: Es sind stetes Positiv- und Negativkontrollen mitzuführen und auch als so genannte Extraktionskontrollen sowie Inhibitorenkontrollen einzusetzen. Zusätzlich wird bei jeder PCR eine Wasserkontrolle mitgeführt. Im Regelfall sind daher je PCR-Ansatz mindestens zwei negative Proben sowie eine positive Kontrolle mitzuextrahieren. Wenn möglich ist zudem jede Probe vor der Extraktion zu teilen und mit einer definierten Menge BHV1-DNA zu versetzen (spiken). Der Einsatz der Kontrollen ist für jede Proben mit dem Laborleiter oder seinem Stellvertreter abzustimmen. 92

93 Auswertung Die Auswertung erfolgt i.d.r. mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese mit Ethidiumbromid- Färbung aufgrund der Größe im Vergleich zu den Positiv-Kontrollen und einem mitgeführten Molekulargewichtsmarker. Die Untersuchungen sind nur valide, wenn die bei den einzelnen PCR-Methoden vorgeschriebenen Negativ- und Positiv-Kontrollen korrekt detektiert werden. Referenzen Fuchs et al. J. Clin. Microbiol. 37, ,

94 14. Brucellose der Rinder, Schweine, Schafe und Ziegen Charakterisierung der Infektion Erreger Die Brucellose wird durch eine Infektion mit Bakterien der Gattung "Brucella" verursacht. Brucella melitensis (Hauptwirt Schaf und Ziege) Brucella abortus (Hauptwirt Rind) Brucella suis (Hauptwirt Schwein) Brucella ovis (Hauptwirt Schaf) Brucella canis (Hauptwirt Hund)* Brucella neotomae (Hauptwirt Wüstenratte)* Brucella microti (Hauptwirt Feldmaus)* Brucella cetaceae (Hauptwirt Delphin)* Brucella pinnipedialis (Hauptwirt Robbe)* * Diese Spezies sind bisher bei landwirtschaftlichen Nutztieren noch nicht nachgewiesen worden Klinische Symptomatik Als Krankheitsanzeichen werden bei Tieren vorwiegend undulierendes Fieber, Arthritis, Bursitis, Orchitis, Aborte und Puerperalerkrankungen festgestellt, besonders schwer ist i.d.r. der Urogenitaltrakt betroffen. Deshalb sollten alle Aborte bei Nutztieren diagnostisch abgeklärt werden. Als Zoonoseerreger kommen Brucella (B.) melitensis, B. abortus und B. suis in Betracht. Sie führen zu akuten bis chronischen schweren Erkrankungen bei Menschen und stellen auch heute noch in vielen wirtschaftlich weniger entwickelten Ländern ein großes gesundheitliches Problem dar. Menschen infizieren sich i.d.r. durch kontaminierte Lebensmittel oder direkten Kontakt zu kranken Tieren bzw. tierischen Produkten Differentialdiagnostik Alle anderen bei Rindern, Schweinen, Schafen und Ziegen mit Aborten einhergehende Krankheiten Diagnostische Indikation siehe klinischer oder epidemiologisch begründeter Verdacht. 94

95 Zuständige Untersuchungseinrichtung Staatliche Veterinäruntersuchungsämter Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Bakterielle Infektionen und Zoonosen Jena, Nationales Referenzlabor Brucellose Rechtsgrundlagen Richtlinie 97/12/EG des Rates vom 17. März 1997 zur Änderung und Aktualisierung der Richtlinie 64/432/EWG zur Regelung viehseuchenrechtlicher Fragen beim innergemeinschaftlichen Handelsverkehr mit Rindern und Schweinen (ABl. EG Nr. L 109 S. 1) Brucellose-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 23. Dezember 2005 (BGBl. I S. 3602) Entscheidung 1999/466/EG der Kommission vom 15. Juli 1999 über die amtliche Anerkennung der Brucellosefreiheit von Rinderbeständen bestimmter Mitgliedstaaten und Regionen von Mitgliedstaaten und zur Aufhebung der Entscheidung 97/175/EG (ABl. EG Nr. L 131 S.34) Richtlinie 91/68/EWG des Rates vom 28. Januar 1991 zur Regelung tierseuchenrechtlicher Fragen beim innergemeinschaftlichen Handelsverkehr mit Schafen und Ziegen Untersuchungsmaterial Zum Nachweis des Erregers: Die zum Erregernachweis bevorzugten Organe variieren je nach Tierart, Geschlecht und Alter der Tiere sowie der zu erwartenden Brucellen - Art. Die für die einzelnen Untersuchungsgänge besonders geeigneten Proben werden dort gesondert aufgeführt. Auswahl und Entnahme: Organmaterial frisch verendeter, oder besser von getöteten erkrankten Tieren bzw. frisch abortierte Feten, Se- und Exkrete, Blut (bei Fieber), veränderte Organe. Auf sterile Entnahme achten! Die zu untersuchenden Tiere sollten nicht unmittelbar vor der Probennahme einer Antibiotikatherapie unterzogen worden sein. Transport und Lagerung: Untersuchungsmaterial umgehend vorschriftsmäßig in dicht schließenden Behältnissen verpackt, gekennzeichnet nach Gefahrgutverordnung Straße und Eisenbahn, Infektionsschutzgesetz, IATA-DGR in der jeweils gültigen Fassung, DIN EN 829, zusammen mit Vorbericht und Untersuchungsantrag an die Untersuchungseinrichtung schicken. Während des Transportes und evtl. notwendig werdender Lagerung ist das Material kühl (2 bis 7 C) aufzubewahren. 95

96 14.3. Untersuchungsgang Erregernachweis Der direkte kulturelle Nachweis des Erregers der Brucellose ist als beweisend anzusehen und daher in jedem brucelloseverdächtigen Tierbestand zu versuchen. Besondere Bedeutung kommt ihm in Herden zu, in denen serologische Untersuchungen zu keiner Abklärung führten, ebenso wie bei der Verfolgung epidemiologischer Zusammenhänge Mikroskopischer Nachweis Als Untersuchungsmaterial für den mikroskopischer Nachweis werden folgende Teile empfohlen: Feten: Mageninhalt (Bodensatz) Eihautteile: Kotyledonen (entzündete Areale) Organteile: Karunkeln (Oberfläche), Hoden, Nebenhoden Sekrete: Lochialsekret, Milch Von den genannten Tierkörperteilen werden Ausstrich- und/oder Abklatschpräparate angefertigt und nach Kіster (Anhang 1.1) und/oder nach Stamp (Anhang 1.2) gefärbt. Auch immunospezifische Färbungen sind möglich, haben sich aber nicht allgemein durchgesetzt. Brucellen sind kleine, kokkoide Bakterien, 0,5 bis 0,7 x 0,6 bis 1,5 µm groß, gramnegativ und unbeweglich. Sie sind meist einzeln gelagert, oft wird auch intrazelluläre Lagerung in Phagozyten beobachtet. Brucellen bilden keine Kapseln oder Sporen und färben sich sowohl in der Kіster- als auch in der Stamp - Färbung rot an. Bewertung: der alleinige mikroskopische Nachweis von Bakterien, die wie Brucellen aussehen, ist als verdächtig zu bewerten. Differentialdiagnose: Coxiellen und Chlamydien stellen sich im Stamp-gefärbten Präparat ähnlich wie Brucellen dar (Tabelle 3). 96

97 Kultureller Nachweis Als Untersuchungsmaterial für den kulturellen Nachweis werden folgende Organteile empfohlen: Feten: Labmageninhalt, Lunge, Leber (ersatzweise Niere, Gehirn) evtl. Darminhalt, Niere, und Placenta fetalis Eihautteile: Kotyledonen (ersatzweise andere Teile, bes. entzündete Areale); zur Unterdrückung der Begleitflora kann das Material für Minuten in 3%ige Kalilauge eingelegt werden. weibliche Tiere Karunkeln des Uterus, Euter-, und Darmbeinlymphknoten, Euter (alle Viertel), Milch (Bodensatz und Rahm), Lochialsekret, Vaginalschleim, männliche Tiere: Hoden, Nebenhodenkopf und -schwanz (besonders entzündete Areale), Sperma, Sediment von Präputialspülproben Bei Bedarf kann Gelenk- und Bursa-Punktate, weitere Lymphknoten, Milz, Leber, Lunge, untersucht werden: Blut, Tonsillen, Kopf- und Halslymphknoten, Abszesse Sämtliche o. g. Materialien werden direkt angelegt und evtl. zusätzlich in flüssige Anreicherungsmedien verbracht. Ein Zerkleinern des Organmaterials (z. B. mit Seesand) wird empfohlen Nährmedien Probleme in der Anzüchtung von Brucellen ergeben sich mitunter durch ihre oft sehr geringe Anzahl im Probenmaterial und in ihrem langsamen Koloniewachstum. Feste Nährmedien ohne Hemmstoffzusatz: Brucella - Agar (Anhang 1.4) Blutagarplatten (Anhang 1.3) mit Hemmstoffzusatz: Selektiv - Agar (Brucella - Agar mit Antibiotikasupplement, Anhang 1.5) Für die Anzüchtung von B. ovis, B.abortus Biovar (BV) 2 und B. suis BV 2 ist der Zusatz von 5 % Serum oder Blut zum Nährmedium erforderlich. Flüssige Anreicherungsmedien Brucella - Bouillon, ohne Hemmstoffzusatz (Anhang 1.3) Selektiv- Bouillon, mit Hemmstoffzusatz (Anhang 1.5) Blutkultur: handelsübliche Blutkulturmedien (z. B. Micrognost-Blutkulturflaschen, Biotest AG) Bebrütung: sowohl aerob als auch mikroaerophil ( 5 bis 10 Vol% CO 2 ) bei einer Temperatur von 37 C Agarplatten mindestens 5 bis maximal 21 Tage bebrüten, erste Ablesung nach 1 bis 2 Tagen. Flüssiganreicherungen mindestens 10 Tage (bis 6 Wochen) bebrüten, Subkultur auf feste Medien wöchentlich, beginnend am dritten Bebrütungstag. 97

98 Das Wachstum auf Selektivmedien kann um einige Tage verzögert sein. Blutkulturen bis zu 35 Tage bebrüten Ablesen (im Bedarfsfall mit Stereomikroskop) Auf festen Nährböden bilden Brucellen langsam wachsende, runde Kolonien, die in 2 bis 3 Tagen einen Durchmesser von 0,5 bis 2 mm erreichen; das Wachstum kann aber auch verzögert sein. Die Kolonien der glatten (S-) Form sind konvex, glattrandig, durchscheinend bis leicht gelblich und nicht hämolysierend Rauh- (R) und M-Formen, wie zum Beispiel die permanent rauhe Art B.ovis ist grauweiß, opak und leicht granuliert bzw. schleimig. Flüssige Nährmedien werden nach 7 Tagen gering gleichmäßig getrübt, es bildet sich wenig lockerer Bodensatz. Verdächtige Kolonien sind auf folgende Kriterien zu überprüfen (siehe auch Tabelle 3) Auf welchem Nährboden und bei welcher Atmosphäre wachsen die verdächtigen Kolonien? Brucellen wachsen aerob und/oder mikroaerophil auf hemmstofffreiem Agar und Selektiv-Agar Auf Blutagar keine Hämolyse. nach Gram und/oder Kіster/Stamp Oxidase-Test positiv Kolonien von hemmstofffreiem, blutfreiem Agar prüfen, Glasstab oder Platinöse benutzen, Positive Reaktion: Testpapier oder -stäbchen verfärbt sich innerhalb von 2 min. in blauviolett, Ausnahme: B. ovis reagiert im Oxidase - Test negativ! Positiver Katalase-Test auf einem Objektträger einen Tropfen Wasserstoffperoxyd (Konzentration 3%ig) mit einer Kolonie verreiben. Positive Reaktion: Starke Gasbildung. Beweglichkeitsprüfung Mit der Technik "Hängender Tropfen", möglichst aus gut bewachsener Bouillon; Brucellen sind unbeweglich Dissoziationsprüfung Mit Trypaflavin (Anhang 1.6) als Objektträgertest. Mit Kristallviolett (Anhang 1.7) Platte für 15 bis 20 sek. mit Kristallviolett-Gebrauchslösung fluten: glatte Kolonien nehmen keine Farbe an und sind weiß, raue Kolonien sind rot-violett ) Weiteres Vorgehen Bakterienstämme mit Brucella - ähnlichen Eigenschaften (Tabelle 3) möglichst einer Bio-und Genotypisierung zuleiten, die auch der Klärung epidemiologischer Fragestellungen dient. Das NRL Brucellose führt solche Untersuchungen durch. Regelwidrige Stämme können vorkommen. Bei Erstisolierung liegen mitunter Stämme in der R-Form vor, die sich dann bei weiteren Passagen in die S-Form wandeln, besonders bei Isolierung von B. melitensis aus der Milch. Rauformen können mit den herkömmlichen Tests nicht komplett typisiert werden. 98

99 Antigen-Nachweis Antigen-Nachweise mittels Latex-Agglutination und ELISA sind beschrieben. Haben sich jedoch in der Routinediagnostik nicht durchgesetzt. In den letzten Jahren sind vermehrt Nukleinsäuredetektionsmethoden (PCR) im Labor gebräuchlich geworden. Sie sind als Ergänzung zu klassischen bakteriologischen Methoden geeignet, um z. B. verdächtige Kolonien zu überprüfen, eine Erstuntersuchung einer Probe oder weitergehende Typisierungen durchzuführen. Zur Anwendung als alleinige Methode zum Nachweis Brucella spezifischer DNA in Nativmaterial fehlen bisher ausreichende Validierungsdaten. Hier besteht vor allem das Problem der Probenaufarbeitung (PCR inhibierende Inhaltsstoffe). Bei negativen PCR-Befunden muss eine bakteriologische Untersuchung erfolgen. Eine genusspezifische PCR (siehe Anhang beruht auf dem BCSP31 Gen (Baily et al., 1992) Antikörper-Nachweis Untersuchungsmaterial Geeignet sind Blutserum, Plasma, Milch und Milchserum. Entnahme möglichst keimarm, um eine lange Haltbarkeit der Proben zu gewährleisten. Blutproben sind zur Gerinnung in den ersten 2 bis 3 Std. nach Entnahme bei 18 bis 20 C und dann kühl aufzubewahren. Frosteinwirkung auf Blut führt zu Hämolyse. Trübe, verunreinigte, flockige und hämolytische Seren sowie sinnfällig veränderte Milchproben (Kolostralmilch, Mastitissekrete, saure Milch, Eutersekret von altmelkenden und trockenstehenden Tieren) sind für Untersuchungen ungeeignet. Die Proben sind auslaufsicher zu verpacken, zu kennzeichnen wie Organmaterial, schnell und frostfrei zu transportieren. Untersuchungsmethoden Je nach Untersuchungsziel und Tierart sind in Deutschland folgende serologische Methoden für die staatlich reglementierten Überwachungsuntersuchungen zugelassen (EU-Richtlinie 64/432/EWG -Rinder und Schweine- vom zuletzt geändert durch Verordnung (EG) Nr. 1226/2002 vom 08. Juli 2002, Verordnung 535/2002/EG, Entscheidung der Kommission 2004/226/EG und EU-Richtlinie 91/68/EWG -Schafe und Ziegen- vom ): Rind Antikörpernachweis im Blutserum: Antikörpernachweis in der Milch: Schwein Antikörpernachweis im Blutserum: Schaf und Ziege Antikörpernachweis im Blutserum: SLA, KBR, ELISA, RBT, ELISA (Poolproben), ABR RBT (Besamungsstationen) RBT, KBR SLA: Serumlangsamagglutination KBR: Komplemtentbindungsreaktion RBT: Rose - Bengal Test ABR: Abortus - Bang Ringtest ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 99

100 Ausführungsrichtlinien und Methodenbeschreibungen über die oben angegebenen serologischen Methoden sind gesetzlich geregelt. Bei kommerziellen ELISAs richtet sich die Durchführung nach der beiliegenden Gebrauchsinformation. Im Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004 herausgegeben von der OIE ist eine weitere serologische Untersuchungsmethode als ein möglicher vorgeschriebener Test für den internationalen Handel angegeben. Es handelt sich dabei um den Fluoreszenzpolarisationsassay (FPA). Bisher ist diese Methode jedoch nicht in den gesetzlichen Regelungen der EU verankert. Durchführung der serologischen Untersuchungsmethoden (Anhang 2) Bewertung der Ergebnisse: Der Brucella-Antikörpergehalt von Proben und Kontrollseren ist gegenüber einem als internationales Standardserum anerkanntem Rinderserum (OIEISS, vom CVL Weybridge), das 1000 Internationale Einheiten/ml (SLA) bzw.1000 Sensibilisierende Einheiten/ml (KBR) enthält, standardisiert und wird in I.E./ml bzw. SensE/ml ausgedrückt. Die Bewertung der ELISAs bei Poolmilchproben orientiert sich an den vom Hersteller mitgelieferten Kontrollen. Die Bewertung der serologischen Ergebnisse wird durch eine Vielzahl von serologischen Kreuzreaktionen, die durch Antigenverwandtschaft mit anderen Erregern, besonders mit Yersinien (Kittelberger et al.; 1998), bedingt werden, erschwert. 100

101 Tabelle 2: melitensis abortus suis 3 Biovare, meist S-, auch R- Formen 7 Biovare, (1-6, 9) meist S-, auch R- Formen Infektionsspektrum, Pathogenität und Übertragung B. melitensis, B. abortus, B. suis und B. ovis (nach Dediщ, et al., 1993) Brucella Untertypen und Kolonieformen Hauptwirtstiere Ziegen, Schafe Rind und andere Bovine Biovar 1-3: Schwein Biovar 2: Hase Biovar 4: Rentier weitere natürliche Wirtstiere Rind, Kamele, Alpaca, Fleischfresser, Wildwieder-käuer, (Schwein, Nagetiere) Einhufer, (Schafe, Kamele), Fleischfresser, (Wühlmäuse?) 5 Biovare (auch R- Formen) Biovar 4 syn. B rangiferi Wildschweine, Fleischfresser, Kleinnagetiere (Biovar 3), (Wiederkäuer) (konnatal), Kontakt, Geburt, (oral) Nachgeburt, Milch (genital), Zecken? (konnatal), Kontakt, Geburt (konjunktival, kutan), oral z.b. mit Nachgeburt oder Milch (genital, Besamung) genital, Kontakt, oral: Fleisch, Beutetiere, Kadaver, (stechende Insekten?) hoch; mehr akut erheblich bis hoch, mehr chronisch geringgradig (Biovar 2) bis hoch (Biovar1) Übertragung zwischen Tieren Pathogenität für Menschen Infektionsquellen für Menschen Kontakt, Tiergeburtshilfe, Milch und Käse (unpasteurisiert), Laborarbeiten, Schlachten Kontakt, Tiergeburtshilfe, Rohmilch, Laborarbeiten Schlachten, Behandeln von Fleisch und Wildbret, Laborarbeiten Biovar 5: Nagetiere ovis stets in R- Form Schafbock (Ziege?, Nagetiere?) genital, (Kontakt) keine bisher keine Infektionen beim Menschen nachgewiesen 101

102 Tabelle 3: Tests Morphologie Beweglichkeit bei 37 C Beweglichkeit bei 20 C Laktose Fermentation auf Mac Conkey Agar Säure Produktion auf Glukoseagar Haemolyse auf Blutagar Differential diagnostische Charakterisierung von Brucellen im Vergleich zu anderen gramnegativen Mikroorganismen (nach Alton, et al., 1988) kleine Kokken kleine Kokken Brucella Bordetella bronchiseptica Campylobacter fetus Komma fіrmig Moraxella diplokokkoid Acinetobacter Diplokokkoid Yersinia enterocolitica O:9 Stäbchen v a v b v v v Katalase v Oxidase c Urease d v v Nitratreduktion e v Zitratverbrauch v a Positive und negative Reaktionen innerhalb des Genus b B. neotomae kann geringgradig Fermentation zeigen c Mit Ausnahme von B. ovis, B. neotomae und manchmal B. abortus Stämme, welche negativ sind d Mit Ausnahme B. ovis, und manchmal B. abortus Stämme, welche negativ sind e Mit Ausnahme von B. ovis,welcher nicht Nitrat reduziert 102

103 Anhang 1 1) Färbung nach Kіster Ausstrich fixieren Ausstrich mit alkalisierter Safraninlösung* für 1 min. bedecken Abspülen mit Wasser Präparat kurzzeitig (8 bis 10 sek.) entfärben in 0,05%iger Schwefelsäure Abspülen mit Wasser Gegenfärben mit 3%iger wässriger Methylenblaulösung, etwa 8-10 sek. Abspülen mit Wasser und Präparat trocknen lassen *Alkalisierte Safraninlösung: Unmittelbar vor jeder Färbung frisch herstellen, indem zu 1,5 ml einer 1 molaren KOH- Lіsung 5 Tropfen einer 3%igen wässrigen Safraninlösung gegeben werden. Auswertung: Brucellen färben sich rot an, andere Bakterien und der Untergrund blau. 2) Färbung nach Stamp (modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbung) Ausstrich hitzefixieren Ausstrich mit 1:10 verdünntem Karbolfuchsin nach Ziehl-Neelsen* 10 min. bedecken Abspülen mit Wasser Präparat entfärben in 0,5%iger Essigsäure für 30 sek. Abspülen mit Wasser Gegenfärben mit 1%iger Methylenblaulösung, etwa 20 sek. Abspülen mit Wasser und Präparat trocknen lassen * Karbolfuchsin nach Ziehl-Neelsen, Stammlösung: 1,0 g basisches Fuchsin, gelіst in 10 ml absolutem Alkohol, zu 90 ml 5%iger Phenollösung gegeben Auswertung: Brucellen färben sich rot an, andere Bakterien und der Untergrund blau. Auch Coxiellen und Chlamydien färben sich rot an! 3) Blut - Agar Brucella-Agar mit Zusatz von 5 bis 10 % defibriniertem Blut von Schafen, Pferden, Rindern oder Kaninchen oder: Bacto-Pepton 10.0 g Natriumchlorid 5.0 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 2.0 g Fleischextrakt 6.0 g Aqua dest. ad ml Verwendung: wie Brucella-Agar, zusätzlich ist die Beurteilung von Hämolyse möglich ph =

104 4. Brucella - Agar/Bouillon Trypticase Pepton 10.0 g Thiotone Pepton 10.0 g Hefeextrakt 2.0 g Glucose 1.0 g Natriumchlorid 5.0 g Natriumdisulfit 0.1 g Agar (nicht bei Bouillon) 15.0 g Aqua dest. ad ml Verwendung: Isolierung, Anreicherung und Kultivierung von Brucella-Arten aus klinischem Material und Lebensmitteln (auch Milch und Milchprodukte) Brucella-Agar ist ein sehr gutes Basismedium und wird, auch mit Zusatz von 5 % defibriniertem Schafblut oder Antibiotika- Supplement, breit eingesetzt. Brucella-Agar ist zur Stammaufbewahrung geeignet ph = Brucella Selektiv-Agar/Selektiv-Bouillon mit Selektiv - Supplement Polymyxin B 2500 IE Bacitracin IE Cyclohexemid 50 mg Nalidixinsäure 2,5 mg Nystatin IE Vancomycin 10 mg Verwendung: Als Zusatz zum Basismedium zur Hemmung der Begleitflora bei Direktkultivierung und Anreicherung von Brucellen. Die Zusammensetzung des Supplements variiert je nach Hersteller geringgradig. Je Röhrchen Supplement aseptisch 10 ml Methanol/Aqua dest. -Mischung (50:50) zusetzen und min. bei 37 C inkubieren. Durch Schütteln vollständig lösen, die Lösung zu 500 ml auf 50 C abgekühltem Medium geben, mischen und abfüllen. Achtung: Das Produkt ist giftig! Sicherheitshinweise beachten! Das Produkt hat eine kurze Laufzeit, Verfallsdatum beachten! Das Produkt ist bei 2 bis 8 C zu lagern! 6) Trypaflavin zur Dissoziationsprüfung 10 mg Trypaflavin (Acriflavin) auf 10 ml aqua dest. Erst unmittelbar vor Gebrauch herstellen. 7) Kristallviolett zur Dissoziationsprüfung Lösung a) Lösung b) Stammlösung: Gebrauchslösung: Kristallviolett 2,0 g abs. Alkohol 20,0 ml Ammoniumoxalat 0,8 g Aqua bidest. 80,0 ml Lösungen a) und b) mischen, Haltbarkeit 3 Monate erst unmittelbar vor Gebrauch herstellen Stammlösung 1:40 mit Aqua bidest. verdünnen 104

105 Anhang 2 A) Arbeitsanleitung zur Durchführung der Serumlangsamagglutination in der Mikro-Methode (SLA) 1. Geräte Zentrifuge Brutschrank (+37 C ± 1 C) Kühlschrank (+5 C ± 3 C) Tiefkühlschrank (-21 C ±3 C) Präzisionswaage Kolbenhubpipetten (10 µl bis 100 µl, 100 µl bis 1000 µl) nach DIN/ISO 9001 Mehrkanalkolbenhubpipette nach DIN/ISO Kanal-Multistepper (50 µl bis 200 µl) nach DIN/ISO 9001 Dispenser (10 µl bis 5 ml) nach DIN/ISO 9001 Combitips nach DIN/ISO Gebrauchsmaterialien Reagenzgläser Messpipetten DIN 12691, 12695, (1, 5, 10 ml) Messzylinder DIN Erlenmeyerkolben DIN 12380, 12385, Stehkolben DIN 12347, Bechergläser DIN Mikrotiterplatten (U-Form, 8x12 cups) Pipettenspitzen DIN/ISO 9001 Reagenzglasständer feuchte Kammer Antigen, zugel. nach 17c TierSG Kontrollserum, positiv, zugel. nach 17c TierSG Kontrollserum, negativ, zugel. nach 17c TierSG 3. Chemikalien Natriumchlorid p.a. (NaCl) Safranin Aqua bidest. 4. Rezepturen 4.1. Physiologische NaCL-Lösung Natriumchlorid p.a. 8,9 g Aqua bidest ad 1000,0 ml 20' bei 121 C autoklavieren, Lagerung bei +5 C ±3 C, Haltbarkeit 6 Monate 105

106 4.2. Safranin-Lösung Safranin 0,5 g Aqua bidest ad 100,0 ml Aqua bidest unter ständigem Schwenken dem Safranin zufügen und bis zur vollständigen Lösung rühren, Lagerung bei +22 C ±3, Haltbarkeit 12 Monate 4.3. Verdünnungsflüssigkeit 1 Tropfen (ca. 50 µl) der 0,5%igen Safranin-Lösung + 20 ml physiologischer NaCl-Lösung 5. Durchführung 5.1. Antigen Das Antigen ist in der vom Hersteller angegebenen Gebrauchsverdünnung zu verwenden Kontrollsystem Kontrollseren: In jedem Ansatz wird ein dem Antigen homologes positives (mit definiertem Titer bzw. Angabe von IE/ml) sowie ein antikörperfreies, d.h. negatives Kontrollserum mitgeführt. Antigenkontrolle 5.3. Serumproben und Antigen auf Raumtemperatur erwärmen 5.4. Serumproben und Kontrollseren werden im Reagenzglas 1:5 vorverdünnt 5.5. Ansatz In der folgenden Tabelle werden die Arbeitsschritte für eine Probenuntersuchung dargestellt: Cup Arbeitsschritte : : : NaCl-Lösg. (µl) : : : Serum-Verd. 1:5 (µl) : : : - - Antigen- Kontrolle 3. Titration des Serums von 1 nach 11 durch Übertragung von 50 Еl der Serumverdünnung, 50 Еl Serumverdünnung der Reihe 11 verwerfen 4. Antigen- Gebrauchsverd. (µl) : : : Inkubation 18 bis 24 h bei 37 C ±1 C (feuchte Kammer) 106

107 6. Ablesen der Reaktionen - Positive Reaktion Bildung eines auf dem Boden gleichmäßig verteilten, mitunter an den Rändern leicht eingerolltes Agglutinat - Negative Reaktion eindeutige Knopfbildung des Antigens - Positive Kontrolle muss dem angegebenen Titer entsprechen (+/- eine Titerstufe) bzw. dient der Berechnung der IE/ml der zur untersuchenden Probe - Negative Kontrolle in jeder Serumverdünnung muss eine eindeutige Knopfbildung erkennbar sein - Antigenkontrolle eindeutige Knopfbildung 7. Bewertung: SLA ± 30 IE/ml 8. Validierung: durch Einsatz des 2, Internationalen Standard Brucella abortus Serum (ISabS) und Übersetzung der Ergebnisse in Internationale Einheiten (IE) B) Arbeitsanleitung zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion in der Mikro-Methode Brucellose (KBR) 1. Geräte Zentrifuge Brutschrank (+37 C ± 1 C) Wasserbad, Temp. variabel (55 C bis 65 C) Wasserbad (+37 C ± 1 C) Kühlschrank (+5 C ± 3 C) Tiefkühlschrank (-21 C ±3 C) Präzisionswaage Tafelwaage Magnetrührer (heizbar) ph-meter Kolbenhubpipetten (10 µl bis 100 µl, 100 µl bis 1000 µl) nach DIN/ISO 9001 Mehrkanalkolbenhubpipette nach DIN/ISO Kanal-Multistepper (50 µl bis 200 µl) nach DIN/ISO 9001 Dispenser (10 µl bis 5 ml) nach DIN/ISO 9001 Combitips nach DIN/ISO 9001 Pipettierhilfe 2. Gebrauchsmaterialien Reagenzgläser Messpipetten DIN 12691, 12695, (1, 5, 10 ml) Messzylinder DIN Erlenmeyerkolben DIN 12380, 12385, Stehkolben DIN 12347, Bechergläser DIN

108 Zentrifugengläser DIN 58970, Teil 2 Mikrotiterplatten (U-Form, 8x12 Cups) Pipettenspitzen DIN/ISO 9001 Reagenzglasständer feuchte Kammer Klebeband (Breite 8 cm) Magnetrührstäbchen PTFE Antigen, zugel. nach 17c TierSG Kontrollserum, positiv, zugel. nach 17c TierSG Kontrollserum, negativ, zugel. nach 17c TierSG Ambozeptor Komplement Hammelblut 3. Chemikalien Natriumchlorid p. A (NaCl) 5,5 Diethylbarbitursäure Natrium-Salz (C 8 H 11 N 2 NaO 3 ) Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) 6H 2 O Calciumchlorid (CaCl 2 ) 2H 2 O 1n Salzsäure (HCl) D(+)-Glucose-Monohydrat (C 6 H 12 O 6 ) H 2 O Natriumcitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7 ) 2H 2 O Kaliumsulfat (K 2 SO 4 ) Borsäure (H 3 BO 3 ) Eichlösungen für ph-meter Penicillin Aqua bidest. 4. Rezepturen 4.1. Verdünnungslösung (VBD) Die Verdünnungsflüssigkeit für alle Ragenzien ist Veronal-Puffer-Lіsung (veronal-buffereddiluent = VBD). Zur besseren Haltbarkeit wird ein VBD-Konzentrat im Verhältnis 5:1 hergestellt und portioniert bei +5 C ±3 C gelagert. Vor Gebrauch ist es 1:5 mit Aqua bidest. zu verdünnen Herstellung des VBD-Konzentrates 5:1, 2000ml a. Stammlösung 1 Natriumchlorid p.a. 83,00 g 5,5 Diethylbarbitursäure Natrium-Salz 10,19 g Aqua bidest. (heiß) ca. 800,00 ml b. Stammlösung 2 Magnesiumchlorid 6H 2 O 20,30 g Calciumchlorid 2H2O 4,40 g Aqua bidest. ad 100,00 ml Die Lösung kann bei +5 C ±3 C 6 Monate aufbewahrt werden. 108

109 Substanzen der Stammlösung 1 in einen Erlenmeyerkolben durch Rühren auf dem Magnetrührer heiß lösen tropfenweise Zugabe von 34,58 ml 1n Salzsäure (HCl) evtl. ausfallende Salze durch Zugabe von Aqua bidest. in Lösung bringen tropfenweise Zugabe von 5ml Stammlösung 2 nach Abkühlung der Lösung das Volumen mit Aqua bidest. auf 2000 ml auffüllen Überprüfung des ph-wertes ph 7,3 ±0,2 Verdünnung von 1 ml VBD-Konzentrates mit Aqua bidest. 1:5 Messung des ph-wertes 4.2. Alseverlösung zur Konservierung von Hammelbluterythrozyten Dextrose (Glucose) 18,66 g Natriumchlorid 4,18 g Natriumcitrat 8,00 g Aqua bidest. ad 1000,00 ml Lösen im Dampftopf für 20 min Bei längerer Erhitzung karamelisiert Dextrose in der Lösung 4.3. Hammelblut ("sheep red blood cells", SRBC) Das Blut wird vom Schaf unter sterilen Bedingungen durch Punktion der Vena jugularis entnommen und unter leichtem Schütteln zu gleichen Teilen mit Alseverlösung in einem sterilen Gefäß (im geschlossenen System) aufgefangen. Ein Zusatz von Penicillin ( IE/l) kann die Haltbarkeit erhöhen. Das konservierte Hammelblut ist bei +5 C ±3 C ca. drei Wochen haltbar Ambozeptor Der Ambozeptor wird käuflich erworben und vor erstmaligem Gebrauch jeder Charge ausgewertet. Bei Titerverlust empfiehlt sich eine erneute Auswertung Komplement Das Komplement ist ein Mischserum von gesunden Meerschweinchen, die vor dem Entbluten 24 Stunden nicht gefüttert werden. Es kann portioniert bei -21 C ±3 C aufbewahrt werden. Vor jeder KBR wird eine Komplementauswertung vorgenommen. Witte-Lösung (Kalium-Borlösung) zur Konservierung von Meerschweinchenkomplement Kaliumsulfat 10,0 g Borsäure 4,0 g Aqua bidest. ad 100,0 ml 1 h bei 100АC im Dampftopf lösen, Komplement und Konservierungslösung werden zu gleichen Teilen gemischt. Der Verdünnungsfaktor des Komplements muss beim Ansatz (Komplementauswertung und Hauptversuch) berücksichtigt werden. Haltbarkeit bei geringem Titerabfall ca. acht Wochen. 109

110 Alle Reagenzien sind auch kommerziell erhältlich und sollten möglichst aus einer Hand bezogen werden. Auf diesem Weg können die ansonsten sehr umfangreichen (s.o.) Vorarbeiten deutlich minimiert werden, was zu wesentlichen Kostenersparnissen (v.a. Personalkosten) führt! 5. Durchführung 5.1. Antigen Antigen ist in der vom Hersteller angegebenen Gebrauchsverdünnung zu verwenden Kontrollsystem Kontrollseren: In jedem Ansatz wird ein dem Antigen homologes positives (mit definiertem Titer bzw. Angabe von Sens.E./ml) sowie ein antikörperfreies, d.h. negatives Kontrollserum mitgeführt. Resuspendierte Seren können portioniert bei -21АC Б3АC gelagert werden. Serumkontrolle für jedes mitgeführte Serum (SK) Antigenkontrolle (AK) Komplementkontrolle (CK) Hämolytisches System-Kontrolle (HS-K) 5.3. Serumproben und Antigen auf Raumtemperatur erwärmen 5.4. Inaktivierung der Seren Vor der Untersuchung sind alle zu untersuchenden Proben einschließlich Kontrollseren im Wasserbad in entsprechender Verdünnung wie folgt zu inaktivieren: B.abortus/ B.melitensis/ B.suis Serumverdünnung Tierart Temp. (АC) Zeit (min) 1:5 Rd., Pfd., Meerschw., Wildwdk., Hasen, Schaf, Ziege, Wild- Schwein, schwein B. ovis 1:5 und 1:10 Schafe Verunreinigte und hämolytische Seren sind zur Untersuchung nicht geeignet. 110

111 5.5. Hämolytisches System (HS) Das mit Alseverlіsung versetzte Hammelblut wird 3- bis 5-mal in VBD gewaschen (bis die überstehende Flüssigkeit wasserklar ist), dazu jedes Mal 10 Minuten bei 1000 g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Erythrozytensediment mit VBD aufschwemmen. Aus dem gewaschenen Erythrozytensediment wird eine 1- bis 2%ige Suspension hergestellt. Zum Gebrauch wird diese mit gleichem Volumen eines gebrauchsfertig verdünnten Ambozeptors vermischt. Bei getrennter Aufbewahrung von Erythrozytensuspension und Ambozeptorverdünnung können diese bis zu 48 h nach Herstellung verwendet werden. 6. Ambozeptorauswertung 6.1. Herstellung einer 2%igen Erythrozytensuspension (s. Pkt. 5.5.) 6.2. Ansatz folgender geometrischer Verdünnungsreihen des Ambozeptors: Röhrchen : : : n Reihe A) 1: : : : Reihe B) 1:750 1: : : : Ausgangsverdünnung 1:500 (z.b. 0,2 ml Ambozeptor + 99,8 ml VBD) Vorlage von 5 ml VBD für Reihe A ab Röhrchen 2, für Reihe B ab Röhrchen 1 für Reihe A dem 1. und 2. Röhrchen 5 ml Ambozeptorverdünnung zufügen und ab Röhrchen 2 durch fortlaufendes Überpipettieren von jeweils 5 ml die weiteren Verdünnungen anlegen für Reihe B dem 1. Röhrchen 10 ml Ambozeptorverdünnung zufügen und durch fortlaufendes Überpipettieren vom jeweils 5 ml weitere Verdünnungen anlegen beide Titrationsreihen zu einer Verdünnungsreihe zusammenfügen 6.3. Durchführung der Ambozeptorauswertung Tabelle 4: Ansatzschema der Ambozeptorauswertung Röhrchen Amb.-Verd. VBD Erythr.-Susp. Kompl. 1:20 (0,5 ml) (ml) (ml) (ml) 1 1:500 1,0 0,5 0,5 2 1:750 1,0 0,5 0,5 3 1:1000 1,0 0,5 0,5 : : : : : : : : : : : : : : : n 1: ,0 0,5 0,5 111

112 Kontrollen a) Erythrozytenkontrolle : 0,5 ml Erythrozytensuspension 2,0 ml VBD b) Komplementkontrolle : 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,5 ml Komplement 1:20 1,5 ml VBD c) Ambozeptorkontrolle : 0,5 ml Erythrozytenkontrolle 0,5 ml Ambozeptorverdünnung 1,5 ml VBD schütteln, Inkubation 30 bei +37 C ±1 C im Wasserbad 6.4. Bewertung Ermittelt wird die höchste Ambozeptorverdünnung, die noch eine komplette Hämolyse bewirkt. Sie gilt als Ambozeptoreinheit (AE). Die Gebrauchsverdünnung beträgt 4 Einheiten, also die 4-fache Konzentration. Beispiel: 1 AE = 1:6000 Gebrauchsverdünnung = 1:1500 Die Kontrollen dürfen keine Hämolyse aufweisen. 7. Komplementauswertung Die Komplementauswertung dient der Feststellung der Komplementgebrauchsdosis für den Hauptversuch in Gegenwart der entsprechenden Antigengebrauchsverdünnung. Zum Vergleich wird eine zweite Reihe angesetzt, bei der das Antigenvolumen durch VBD ersetzt ist Durchführung Das Komplement wird an jedem Untersuchungstag in 8 Konzentrationsstufen in der Wärmebindung geprüft. In der Tabelle 5, Teil 1, ist die Herstellung der 8 Verdünnungsstufen dargestellt. Tabelle 5: Komplementauswertung, Teil 1 Kompl. 1:10 Komplementkonzentration (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 VBD (ml) 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 Die weiteren Arbeitsschritte sind in der Tabelle 5, Teil 2, erklärt. 112

113 Tabelle 5: Komplementauswertung, Teil 2 Reihe 1 Reihe 2 Komplement je Verd.-Stufe (ml) 0,5 0,5 Antigengebrauchsverdünnung (ml) - 0,5 VBD (ml) 1,0 0,5 - schütteln, Wasserbad 60 bei +37 C ± 1 C HS (ml) 1,0 1, Bewertung Es wird das Röhrchen mit der niedrigsten Komplementkonzentration bestimmt, das eine komplette Hämolyse aufweist. Die Gebrauchsverdünnung für den Hauptversuch ist die folgende höhere Konzentration. Beispiel: komplette Hämolyse = 2,0 % Gebrauchsdosis = 2,5 % 8. Hauptversuch 8.1. Ansatz In der Tabelle 6 werden die Arbeitsschritte für eine Probe und ein Antigen als Modell dargestellt. Tabelle 6: Hauptversuch Cup Arbeitsschritte : : : VBD (µl) : : : Serum (µl) : : : Titration des Serums von 1 nach 10 und von 11 nach 12 (verwerfen von 25 µl aus den Cups 10 u. 12) 4. VBD (µl) : : : Antigen (µl) : : : Komplement (µl) : : : abgedeckte Platte 18 bis 24h bei +5 C ±3 C inkubieren und auf Raumtemperatur erwärmen * ) 8. HS (µl) : : : Inkubation 30 bei +37 C ±1 C im Wasserbad oder im Brutschrank in einer feuchten Kammer * ) Beschälseuche-KBR: Inkubation 60 bei +37 C ±1 C im Brutschrank in einer feuchten Kammer 113

114 8.2. Kontrollen Bei der Durchführung des Hauptversuches sind jeweils folgende Kontrollansätze mitzuführen: a. Kontrolle der antikomplementären Wirkung des Serums (Serumkontrolle), angesetzt in den beiden Anfangsverdünnungen (Cup 11 und 12) Serumverdünnung : 25 µlbd : 25 µl Komplement : 25 µl HS : 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse b. Kontrollen des Antigens VBD : 25 µl ntigen : 25 µl Komplement : 25 µl HS : 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse c. Kontrollen des Komplements VBD : 50 µl Komplement : 25 µl HS : 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse d. Kontrolle des Hämolytischen Systems (HS) VBD : 75 µl HS : 50 µl Bewertung : 0 % Hämolyse e. Positives Kontrollserum Serumverdünnung : 25 µl Antigen : 25 µl Komplement : 25 µl HS : 50 µl Bewertung : definierter Titer ± 1 Titerstufe, bei standardisierten Seren = Berechnungsgrundlage für die Sensibilisierungseinheiten/ml f. Negatives Kontrollserum Serumverdünnung : 25 µl Antigen : 25 µl Komplement : 25 µl HS : 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse (jede Serumverdünnung) 114

115 9. Auswertung Bei der Ablesung wird unterschieden: 100 % Hämolysehemmung = 4 (++++) 75 % Hämolysehemmung = 3 (+++) 50 % Hämolysehemmung = 2 (++) 25 % Hämolysehemmung = 1 (+) keine Hämolysehemmung = negativ Bewertung: 20 sens.e./ml = positiv B. ovis: 50 sens.e./ml bezogen auf das Nationale Referenzserum. Dieses ist eingestellt am internationalen Brucella ovis Standardserum (Weybridge). C) Arbeitsanleitung zur Durchführung des Rose-Bengal-Tests (RBT) 1. Geräte Zentrifuge Kühlschrank (+5 C ± 3 C) Tiefkühlschrank (-21 C ± 3 C) Kolbenhubpipetten (10 µl µl) nach DIN/ISO 9001 Tafelwaage 2. Gebrauchsmaterialien Tüpfelplatten (eben oder mit Vertiefungen) Glasstäbe Pipettenspitzen nach DIN/ISO 9001 RBT-Antigen, zugel. nach 17c TierSG Brucellose-Kontrollserum, positiv, zugel. nach 17c TierSG Brucellose-Kontrollserum, negativ, zugel. nach 17c TierSG 3. Durchführung 3.1. Kontrollsystem In jedem Ansatz wird ein Brucellose-Kontrollserum, positiv, und ein Brucellose- Kontrollserum, negativ, mitgeführt. Resuspendierte Seren können portioniert bei -21 C ±3 C gelagert werden Serumproben und Antigen auf Raumtemperatur erwärmen 3.3. Übertragen von Serum auf Tüpfelplatten: 25 µl auf Platten mit Vertiefung, 30 µl auf ebene Platten µl bzw. 30 µl Antigen jedem Serum hinzufügen. Das Volumen des Antigens muss dem Volumen des Serums entsprechen. 115

116 3.5. Serum und Antigen mit Glasstab mischen 3.6. Serum-Antigen-Gemisch 4' kreisend schwenken 4. Ablesen der Reaktionen - Positive Reaktion Bildung von Agglutinaten jeder Reaktionsstärke innerhalb der Beobachtungszeit - Negative Reaktion Serum-Antigen-Gemisch bleibt innerhalb der Beobachtungszeit homogen rot gefärbt - Positive Kontrolle Agglutination - Negative Kontrolle Serum-Antigen-Gemisch bleibt innerhalb der Beobachtungszeit homogen rot gefärbt Brucella abortus-antigen für die SLA, amtl. Zulassungsnummer BFAV-B370, kommerziell erhältlich Brucella abortus-antigen für die KBR, amtl. Zulassungsnummer BFAV-B371, kommerziell erhältlich Brucellose-Kontrollserum, positiv, amtl. Zulassungsnummer BFAV-K076, kommerziell erhältlich RBT-Antigen, amtl. Zulassungsnummer BFAV-B368, kommerziell erhältlich Zusätzlich wird vom FLI ein positives und ein negatives Nationales Referenzserum für Brucellose bereitgestellt. Nähere Auskünfte: Friedrich-Loeffler-Institut, NRL Brucellose, Naumburger Str. 96a, D Jena Tel.: +49 (0) Anhang 3 Nachweis von Brucella spp. genusspezifischer DNA mittels der Primer B4 und B5 aus Kulturmaterial (nach Baily et al., 1992) 1. Arbeitsvorschrift 1.1. Material Verdächtige Kolonie direkt von Platte picken und in Eppendorf-Tube in ca. 200 µl PCR- Grade Wasser einbringen und für 2 h bei 90 C im Thermoschüttler schütteln (Abtötung und Zellaufschluss) Tabelle 1: Primer B4 B5 Nukleotidsequenz 5'-3' TGG-CTC-GGT-TGC-CAA-TAT-CAA CGC-GCT-TGC-CTT-TCA-GGT-CTG 116

117 Tabelle 2: PCR Mastermix Je Probe Thermocycler-Programm Wasser 18,3 µl "BRUC" 10x PCR-Puffer 2,5 µl 93 C 5 min, 35 x (90 C 1 min, 60 C dntp 10mM 1 µl 1min, 72 C 1 min), 72 C 5 min Primer B4 10 pmol/µl 1 µl Primer B5 10 pmol/µl 1 µl Taq-DNA-Polymerase 5U/µl 0,2 µl Template 1 µl 1.2. Ergebnis und Kontrolle Bei jedem Ansatz wird eine Negativ-Kontrolle (Wasser statt DNA) und mind. eine Positiv-Kontrolle (DNA von Referenzstamm) mitgeführt. Die Analyse der PCR- Produkte erfolgt nach ihrer Größe (Siehe Tabelle 3) in einem 1,5%igen Agarose-Gel Tabelle 3: Größe des Fragmentes Ergebnis B4/B5 223 bp Brucella ssp. nachgwiesen Die Positivkontrollen müssen positiv entsprechend ausfallen, die Negativ-Kontrolle bei der PCR muss negativ sein. Literatur Alton, G.G., L.M. Jones, R.D. Angus, J.M. Verger (1988): Techniques for the Brucellosis Laboratory. Institute National de la Recherche Agronomique (INRA), Paris. Baily GG, Krahn JB, Drasar BS, Stoker NG.: Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. J Trop Med Hyg Aug; 95(4): Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004: 117

118 15. Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) Charakterisierung der Infektion Erreger Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) ist eine infektiöse neurodegenerative Erkrankung des Rindes, die erstmalig 1985 in Großbritannien nachgewiesen wurde. Ätiologisch wird sie der Gruppe der TSE/Prionenerkrankungen zugeordnet, die durch Ablagerungen des pathologischen Prion-Proteins im Zentralen Nervensystem erkrankter Tiere gekennzeichnet ist. Als wichtigster Übertragungsweg wird die Verfütterung von infektiösem Tiermehl angesehen. Bisher sind europaweit mehr als BSE-Fälle diagnostiziert worden, davon mehr als 99% im Vereinigten Königreich Klinisches Symptomatik Das klinische Bild der BSE ist sehr vielfältig und in Tabelle 1 dargestellt. Erkrankte Tiere zeigen ein ungewöhnliches Verhalten und verändertes Temperament und können unter Nervosität, Tremor, Hyperästhesie und Juckreiz, Bewegungsstörungen bis zum finalen Festliegen, Gewichts- und Konditionsverlust sowie Milchrückgang leiden. Häufig wird ein Treten der Tiere in die Einstreu oder nach Personen beobachtet. Fieber tritt in der Regel nicht auf. Die Krankheit verläuft protrahiert (3 Wochen bis 6 Monate Krankheitsdauer). Infolge der langen Inkubationszeit sind nur erwachsene Tiere klinisch betroffen. Das Alter erkrankter Tiere mit nachgewiesener BSE lag zwischen 22 Monaten und 15 Jahren, wobei 4 Jahre alte Tiere am häufigsten erkrankt waren. Der Ausbruch der Erkrankung ist unabhängig von Trächtigkeit, Laktationsperiode oder Jahreszeit, obwohl im Vereinigten Königreich mehr Fälle während der Kalbezeit gemeldet wurden. Die BSE-Erkrankung bei Rindern entwickelt sich anfangs schleichend und unauffällig und kann bei oberflächlicher Betrachtung übersehen werden. Deshalb kann schon die kleinste Veränderung ein Hinweis auf eine sich entwickelnde BSE sein. Selbst im fortgeschrittenen Erkrankungsstadium sind oft nur einzelne Veränderungen und nur äußerst selten alle Symptome gleichzeitig bemerkbar. 118

119 Tab. 1: Überblick über die wichtigsten klinischen Anzeichen von BSE Allgemeines Störung des Verhaltens Störungen in der Empfindlichkeit Störung in der Bewegung Rückgang der Milchleistung bei erhaltener Fresslust Langsame Abmagerung bei erhaltener Fresslust Festliegen nach dem Abkalben Zunehmende Ängstlichkeit und Nervosität z.b. Zögern vor kleinsten Hindernissen (z.b. am Boden liegende Stange) oder vor dem Überschreiten des Kotgrabens, Angst vor Durchgängen Aggressivität (Ausschlagen gegen Menschen und Tiere, Schlagen beim Melken) Erhöhte Aufmerksamkeit und Schreckhaftigkeit Absondern von der Herde Häufiges Belecken der Nase Zähneknirschen Zusammenzucken infolge geringster Umwelteinflüsse (Lärm, Bewegung von Personen oder Tieren, Türen schlagen oder Herunterfallen von Gegenständen) Zusammenzucken beim plötzlichem Einschalten von Licht in einem dunklen Raum Überreaktion bei Berührung im Kopf- und Halsbereich Zittern oder Muskelzuckungen an Lippen, Flotzmaul, Ohren, Hals, Vorderkörper, Flanken oder am ganzen Körper Steifer Gang, Traber- und Hahnentrittartige Bewegungen Einknicken mit den Hinterbeinen Schwankender Gang Differentialdiagnosen Wichtige Differentialdiagnosen bei Rindern sind: Stoffwechselstörungen: Hypomagnesiämie, nervöse Form der Ketose, Kupfermangel, cerebrocorticale Nekrose (CCN) virale und bakterielle Infektionen des zentralen Nervensystems: Listeriose, Tollwut, Aujeszkysche Krankheit Aggressionen psychogener Ursache BSE-Überwachung In der EU wird gemäß Verordnung EU 999/2001 ein aktives BSE-Überwachungsprogramm mittels zugelassener BSE-Schnelltestverfahren ( durchgeführt, das die Untersuchung aller gesund geschlachteten Rinder über 30 Monate und aller Rinder über 24 Monate vorsieht, die not-, krankgeschlachtet oder getötet wurden, oder die verendet sind. Mit der Änderungsverordnung 571/2008 wurden hierzu auf Antrag beim Vorliegen einer verbesserten epidemiologischen Situation Ausnahmen gestattet. Diese Kriterien werden von den 15 alten Mitgliedstaaten erfüllt, so dass für diese ab dem 1. Januar 2009 die Testaltersgrenze generell auf 48 Monate angesetzt wurde. 119

120 Die BSE-Überwachungsmaßnahmen umfassen demnach die A B C D amtliche Untersuchung aller über 48 Monate alten, in Deutschland oder in Mitgliedstaaten mit vergleichbarem epidemiologischem Status geborenen und gehaltenen, normalgeschlachteten und verendeten Rinder mittels BSE-Schnelltest, ( Active surveillance ) in allen anderen EU-Mitgliedstaaten oder aus Drittländern stammenden die amtliche Untersuchung aller über 30 Monate alten normalgeschlachten Rinder mittels BSE-Schnelltest ( Active surveillance ) Schnelltest-Untersuchung aller über 24 Monate alten, aus EU-Mitgliedsstaaten, in denen kein jährliches Überwachungsprogramm durchgeführt wird, oder Drittländern stammenden, not- oder krankgeschlachteten bzw. getöteten oder verendeten Rindern, ( Active surveillance ) altersunabhängige Abklärung klinischer Verdachtsfälle ( Passive surveillance ) Untersuchung dürfen nur solche Tests verwendet werden, die für die Untersuchung dieser Spezies zugelassen sind ( Die Bestätigung eines reaktiven Testergebnisses hat in allen Fällen am NRL für BSE und Scrapie am FLI auf der Insel Riems zu erfolgen, alles verfügbare Material muss daher umgehend an das FLI weitergeleitet werden. Die Untersuchungsstelle hat das BMELV und das NRL am FLI bundeseinheitlich nach einem vorgegebenen Meldesystem (siehe Untersuchungsmaterial) über das Ergebnis der jeweiligen Untersuchungen zu informieren. Im Falle des klinischen Verdachtes einer TSE kann dieser nach den derzeitigen Vorgaben (Verordnung (EG) Nr. 103/2009) des OIE nicht durch ein negatives Schnelltest-Ergebnis ausgeräumt werden. Die Abklärung eines solchen Verdachtsfalles muß am NRL durchgeführt werden. Um bei einem klinisch erkrankten Tier eine umfangreiche Asservation von Proben (s. Untersuchungsmaterial) sicherzustellen, sollte das FLI in solchen Fällen frühzeitig benachrichtigt werden. Neben einer Verbringung des Tieres an das FLI ist auch eine Sektion vor Ort mit Unterstützung eines Mitarbeiters des FLI möglich. Abschließende Falldefinition für BSE Ein BSE-Verdacht wird auf Grund klinischer Symptomatik oder eines reaktiven Ergebnisses in einem der national und von der EU zugelassenen BSE-Schnelltests geäußert. Die Meldung eines BSE-Verdachts aufgrund eines reaktiven BSE-Schnelltest-Ergebnisses in TSN sollte keinesfalls erfolgen. Ein BSE-Fall ist nach Erhalt eines den Verdacht bestätigenden Befundes aus dem NRL für BSE/Scrapie am FLI festzustellen und in TSN einzustellen. 120

121 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Staatliche Untersuchungsstellen: BSE-Untersuchungen bei Schlachttieren, not- und krankgeschlachteten Tieren, tot aufgefundenen Tieren sowie bei klinischen Verdachtsfällen privat geführte Untersuchungslabors ausschließlich BSE-Untersuchungen bei Schlachttieren Bestätigungsuntersuchungen müssen durch das nationale Referenzlabor am FLI durchgeführt werden. Dies gilt für alle, bei Tieren auftretenden TSE Erkrankungen (z.b. auch CWD, FSE). Im nationalen Referenzlabor werden die in den geltenden Bestimmungen festgelegten Untersuchungsverfahren angewandt Rechtsgrundlagen EU: National: Anhang X der VO (EG) 999/2001 und alle Änderungen BSE-Maßnahmenkatalog BSE-Untersuchungsverordnung Internationales Tierseuchenamt (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008) Untersuchungsmaterial Probennahme Probennahme und Beprobung erfolgen entsprechend Anhang X, Kapitel C der VO (EG) 999/2001 sowie nach den Vorgaben des Internationalen Tierseuchenamtes (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008) Entnahme des Hirnstammes Der Gehirnstamm ist durch Amtstierärzte, amtliche Tierärzte und Fleischkontrolleure oder durch eingewiesene Probenehmer unter direkter Aufsicht des amtlichen Tierarztes zu entnehmen. Die Proben sollten so frisch wie möglich sein und unverzüglich nach dem Tod des Tieres entnommen werden um die fortschreitende Autolyse des Gewebes zu verhindern. Zur Entnahme des Hirnstammes sind folgende Methoden bekannt: a) mit dem Entnahmelöffel (scharfer Löffel) Diese Methode ist eine geeignete Technik zur Entnahme von Hirnproben. Die Entnahme hat mit einem Entnahmelöffel durch das Foramen magnum zu erfolgen. 121

122 b) mit Wasserdruck Bei dieser Methode wird das Hirngewebe mit Wasser, das mit einem geeigneten Gerät durch den Schusskanal zugeführt wird, durch das Foramen magnum herausgedrückt. Bei Anwendung dieser Entnahmetechnik kann es jedoch zu einer Verteilung von mit Risikomaterial kontaminiertem Tropfwasser kommen. Die Entnahmetechnik mit Wasserdruck ist geeignet, wenn - durch eine Gummimanschette vorn am Gerät das Zurückspritzen von Wasser verhindert und - der Wasserdruck am Gerät geregelt wird und - die Probeentnahme in einem Kopfkabinett erfolgt. Der Gehirnstamm ist unversehrt in das mit der Untersuchung befasste Labor zu senden. Dort werden die für den jeweils verwendeten Test notwendigen Proben genommen und der Probenrest bis zum Abschluss der Untersuchung bei + 4 o C gelagert Probennahme im Rahmen der Schnelltestuntersuchungen Unabhängig von ihrem Zustand ist im Rahmen der aktiven Überwachung prinzipiell jede Probe mittels Schnelltest zu untersuchen. Soweit es der Gewebezustand zulässt, ist dabei das Material aus der Obex-Region des Hirnstammes (Abb. 1 und 2) zu entnehmen. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit auch frühe, präklinische Stadien nachweisen zu können. Andere Hirnregionen und/oder das Rückenmark dürfen im Rahmen der Schnelltestuntersuchungen unter keinen Umständen verwendet werden. Ist die Obex-Region wegen fortgeschrittener Autolyse und Fäulnis des Gewebes nicht mehr auffindbar, muss in jedem Fall eine möglichst repräsentative Probe des Hirnstammes entnommen werden. In solchen Fällen ist ein positives Ergebnis gültig. Ein negatives Ergebnis hingegen kann nur unter Vorbehalt verwendet werden. Vorgehensweise: Es sollte eine würfelförmige Gewebeprobe unilateral, unter Schonung der Gegenseite (Abb. 2), vorzugsweise mittels eines Skalpells entnommen werden; alternativ kann die Probe auch mittels spezieller Entnahmetechniken (Entnahmespritze o.ä.) gewonnen werden; näheres hierzu regeln die jeweils amtlich zugelassenen Gebrauchsanweisungen der TSE-Schnelltests. 122

123 Abb. 1: Medianschnitt durch das Gehirn (nach Budras und Wünsche) Obex; Lokalisation für Schnelltestung Entnahmestelle für Histopathologie/Immunhistologie (Formalinprobe des Stammhirns) Medulla oblongata Reste des Kleinhirns Mittelhirn Abb. 2: Stammhirn von dorsal nach Abtragung des Kleinhirns. 123

124 Probennahme nach einem reaktiven Schnelltestergebnis (BSE-Verdacht) Reaktive BSE-Schnelltest-Ergebnisse führen zur weitergehenden Abklärung durch das nationale Referenzzentrum am INNT des FLI, Insel Riems. Einzelheiten des Versands der Proben siehe Kap. 3. Einsendungen an das NRL müssen telefonisch vorangemeldet werden. Zur Ankündigung der Einsendung ist zudem das FAX-Formular gemäß Anhang zu verwenden. Zur Untersuchung sind alle Vorergebnisse (Filme, ELISA-Werte der Probe - einschließlich des jeweiligen Cutoffs), alle zur Verfügung stehenden Proben sowie die Reste der ersten Homogenate einzusenden. Weiterhin sollte eine vollständige, transversale Scheibe (ca. 5 mm) aus der Region direkt kranial des Obex entnommen werden (Abb. 2). Diese dient der späteren histopathologischen sowie immunhistologischen Untersuchung. Um einerseits die Diagnostik beeinträchtigende morphologische Verluste zu vermeiden und andererseits eine schnellstmögliche diagnostische Untersuchung zu gewährleisten sollte diese Probe unabhängig vom Autolysegrad bereits im Schnelltestlabor in neutral gepuffertes Formalin (4 %) fixiert werden. Ein Einfrieren des für die histomorphologische Untersuchung gedachten Gewebes sollte unbedingt vermieden werden. Zusätzliche Probennahme nach einem reaktiven Schnelltestergebnis Bei Feststellung eines reaktiven BSE-Schnelltest-Ergebnisses müssen im Schlachthof alle noch verfügbaren Proben vom zugehörigen Tier unter amtlicher Verwahrung verbleiben. Die Aufbewahrung dieser Proben sollte getrennt von anderen Materialien und Schlachtprodukten vorerst bei + 4 o C erfolgen und die Proben sollten, sofern die Laboruntersuchung länger als 36 Stunden dauert, bei Minus 20 o C tiefgefroren werden. Bei Aufhebung des Verdachts erlischt die amtliche Verwahrung. Im Falle der Bestätigung des BSE-Verdachts könnten daher, sofern diese Möglichkeit besteht, zusätzliche Proben für die nationale BSE-Probenbank genommen werden. Sollte der Kopf des Tieres bis zum Abschluß der Untersuchungen noch identifizierbar sein, kann dieser an das FLI eingesandt werden. Besteht diese Möglichkeit nicht, sollten vor dessen Entsorgung nachfolgend ausgeführte Proben entnommen werden. Ein Teil dieser Proben sollte separat bei 20 C tiefgefroren, ein Teil sollte nach Rücksprache mit Mitarbeitern des FLI in neutral gepuffertes 4%iges Formalin eingelegt werden. BSE-positiv getestetes Schlachttier bzw. ein gefallenes (TKBA-)Tier: das gesamte Gehirn (soweit noch verfügbar evtl. auch autolytisches Gewebe) Ohrmarke mit anhängender Gewebeprobe je 10 g Skelettmuskulatur (M. longissimus dorsi, M. semitendinosus, M. biceps brachii) Tiere mit reaktiven Ergebnis eines BSE-Schnelltestes aus der Kohorte eines nachgewiesenen BSE-Falles Hirnstamm (verbliebenes Material nach Schnelltest; entnommen mit der Löffel- Methode) 10 ml Serum Ohrmarke mit anhängender Gewebeprobe 124

125 Probennahme bei einem klinischen Verdacht auf BSE Im Falle des klinischen Verdachtes einer TSE kann dieser nach den derzeitigen Vorgaben des OIE nicht durch ein negatives Schnelltest-Ergebnis ausgeräumt werden. Sollte eine Überweisung des Tieres an das FLI bzw. eine Sektion vor Ort mit Beteiligung eines Mitarbeiters des FLI nicht möglich sein, sollte das Tier mit einer Barbiturat-Überdosis getötet werden. Nach Eintritt des Todes sollten, sofern die Gegebenheiten dies zulassen, die nachfolgend (Tab. 1) aufgeführten Proben entnommen werden. Sollte dies nicht möglich sein kann auch der vollständige Kopf an das FLI eingesandt werden. Im Anschluss daran kann ein Schnelltest durchgeführt werden, wobei jedoch auch bei einem negativen Ergebnis alle vorhandenen ZNS-Proben an das FLI weitergeleitet werden müssen. Dies bezieht explizit auch das bereits zur Schnelltestung hergestellte Homogenat und ggfs. Gewebeblöcke und -schnitte für die Histologie mit ein. Die Proben sollten separat gekennzeichnet und verpackt werden. Tabelle 1: zu asservierendes Probenmaterial klinischen Verdacht auf BSE Gewebe +4 C -20 C Formalin (4 %) Nach der Sedation Blut 400 ml EDTA- Vollkblut (Isolierung der Leukozyten) 100 ml Vollblut, zentrifugieren und Überstand (Serum) einfrieren Milch ml -- Nach der Tötung Gehirn (paramedian zerteilt, ca. 1 cm neben der Medianen) Rückenmark -- kleinere Hälfte größere Hälfte -- vollständig -- nach Möglichkeit: Scheiben (5-10mm) aus dem Hals, Brust-, Lenden- und Sakralmark Auge -- vollständig vollständig Tonsille -- Hälfte max. 2 x 2 x 2 cm Darm (Ileum, Jejunum) je 10 cm mit anhängenden lymphati- -- schen Gewebe max. 2 x 2 x 2 cm Milz -- ca. 50 g max. 2 x 2 x 2 cm Skelettmuskulatur - M. longissimus dorsi, - M semitendinosus, - M. biceps brachii Zerebrospinalflüssigkeit (ohne Blutaspiration) erreichbare Nerven des peripheren Nervensystems (z.b. N. ischiadicus -- je 10 g max. 2 x 2 x 2 cm -- nach Zentrifugation Überstand einfrieren -- Hälfte des Materials Hälfte des Materials

126 Arbeitsschutzmaßnahmen Arbeitsschutzmaßnahmen bei der Probeentnahme bei Schlachttieren Die Entnahme von Probenmaterial bei klinisch unverdächtigen Schlachttieren kann im Rahmen der Schlachtung unter Einsatz von persönlicher Schutzausrüstung, wie flüssigkeitsdichte und feuchtigkeitsabweisende Handschuhe und Gesichtsschutz (Spritzschutz: Visier oder alternativ Schutzbrille sowie Mund- und Nasenschutz) erfolgen. Alle Instrumente, die für die Entnahme der Hirnstammproben bestimmt sind, dürfen ausschließlich zu diesem Zweck verwendet werden. Dieses Besteck ist nach jeder einzelnen Probeentnahme mechanisch (durch Abspülen oder Abwischen) zu reinigen und nach Abschluss der Arbeiten durch mindestens einstündiges Einlegen in 1 N NaOH oder Natriumhypochloritlösung mit mindestens 2% freiem Chlor2 zu dekontaminieren. Auf das Tragen von Augenschutz bei Tätigkeiten mit diesen Lösungen wird hingewiesen. Ein Abflammen des Besteckes reicht nicht aus und hat zu unterbleiben Arbeitsschutzmaßnahmen bei der Probenentnahme bei TKBA-Tieren und von klinischen BSE-Verdachtstieren Die Probenentnahme kann in den zur Sektion bzw. zur Zerlegung solcher Tiere zur Verfügung stehenden Räumen an der TBA, im Untersuchungsamt oder am Schlachthof durchgeführt werden. Bei der Probenentnahme sind folgende Sicherheitsmaßnahmen einzuhalten: a) Es ist persönliche Schutzausrüstung bestehend aus Geeigneter Schutzkleidung (langer geschlossener Kittel, Gummischürze), Flüssigkeitsdichten und feuchtigkeitsabweisenden Schutzhandschuhen und Gesichtschutz (Visier oder alternativ Schutzbrille und Mund- und Nasenschutz) zur Verfügung zu stellen. b) Die Schutzkleidung ist nur für diese Arbeiten zu verwenden. Die Schutzausrüstung ist bei positivem Befund einer chemischen (NaOH oder Natriumhypochloritlösung nach Nr ) oder thermischen (ABAS-Beschlüsse 602 und 603) Behandlung zur Inaktivierung der TSE-Erreger zu unterziehen. c) Bei der Entnahme der Proben müssen die Instrumente nach jeder einzelnen Probe einem Dekontaminationsschritt mit NaOH oder Natriumhypochloritlösung nach ABAS 602 und 603 unterzogen werden. d) Nach der Probenahme bzw. Sektion sind die Räume (Oberflächen, Boden) und Gegenstände mit NaOH oder Natriumhypochloritlösung nach ABAS 602 und 603 zu dekontaminieren. Die Einwirkzeit soll mindestens 60 Minuten betragen, bevor mit Wasser nachgespült wird (Wasserstrahl, kein Hochdruck). 2 Natriumhypochloritlösung: durch 1:5 Verdünnung einer 13%igen Stammlösung wird ein Gehalt an aktivem Chlor von 2,6% erreicht. Zum Erhalt der Wirksamkeit ist ein Gehalt von mindestens 2% aktiven Chlors notwendig. Daher ist es sehr wichtig, die Lösung mindestens alle 4 Wochen zu erneuern. 126

127 e) Das Aufsägen der Schädel ist auf ein Mindestmaß zu beschränken. Sollte es im Einzelfall dennoch notwendig sein, müssen Maßnahmen zum Schutz vor Spritzern getroffen werden, wie z. B. das Tragen eines Gesichtsschutzes f) Flüssige Abfälle sind so weit wie möglich zu vermeiden. Ansonsten sind sie einer chemischen oder thermischen (ABAS-Beschluss 602 und 603) Behandlung zu unterziehen Beförderung von Probenmaterial (Inland) Für die gefahrgutrechtliche Klassifizierung von Probenmaterial ist prinzipiell der Absender verantwortlich. Es werden drei Kategorien von TSE-Proben unterschieden: Routineproben zur BSE-Schnelltestung (sog. A-Proben) Für Spezifisches Risikomaterial den sog. SRM-Proben aus dem Gehirn von routinemäßig geschlachteten oder verendeten Rindern ohne gezielten TSE Verdacht wird -wie auch für das übrige Risikomaterial- ein Transport nach Maßgabe der Guidelines for the Safe Transport of Infectious Substances ans Diagnostics Specimen der WHO für den Local Surface Transport zwischen Entnahmeinstitution und Untersuchungslabor empfohlen (ABAS 602). Sie sind nicht als ansteckungsgefährliche Stoffe der Klasse 6.2 nach der ADR zu klassifizieren und unterliegen daher nicht den Anforderungen des Gefahrgutrechts für den Transport. Der Transport solcher Proben kann mit Kurier-Fahrzeugen der Überwachungs- bzw. Untersuchungsämter oder der Schlachtbetriebe nach Maßgabe der probenentnehmenden Veterinärbehörden oder anderen amtlich beauftragten Institutionen erfolgen. Hierbei sollten die Proben in verschließbaren Plaste-Röhrchen in Reagenzglasgestellen und diese in verschließbaren, beschrifteten Plaste-Boxen transportiert werden, die in den Transportfahrzeugen stoßfest zu sichern sind TSE-Verdachtsproben (sog. B-Proben) Gehirnproben, die im BSE-Schnelltest kein eindeutig negatives Ergebnis (= reaktives Ergebnis) ergeben haben, sowie Gehirnproben mutmaßlich an TSE klinisch-erkrankter Wiederkäuer gelten als TSE-Verdachtsproben. Solche Proben gelten als Gefahrgut und werden ab dem nach der anzuwendenden neuen ADR 2005 als ansteckungsgefährliche Stoffe der Gefahrenklasse 6.2 in die Kategorie B, UN 3373 Diagnostische Proben eingeordnet. Dieses Gefahrgut unterliegt in der Gefahrgut-VO jedoch keinen weiteren Reglementierungen. Es können unter Einhaltung der Verpackungsvorschrift P 650 wesentliche Erleichterungen beim Transport über öffentliche Straßen in Anspruch genommen werden, d.h. eine ordentliche Verpackung und Beschriftung mit den entsprechenden UN-Zetteln genügt, es sind keine Gefahrgutpapiere notwendig. (bestätigt in einer Stellungnahme des Robert-Koch-Institutes als Sicherheitsbehörde des Gefahrgut-Verkehrs-Beirates vom ). Auszüge aus der Verpackungsvorschrift P 650 : Die Proben müssen in Verpackungen von guter Qualität verpackt werden, die stark genug sind, um den normalerweise während der Beförderung einschließlich Umladen zwischen Fahrzeugen und/oder Warenlagern sowie Entnehmen von einer Palette oder aus einer Umverpackung zur weiteren manuellen oder mechanischen Behandlung auftretende Stöße und Belastungen standzuhalten. Die Verpackungen müssen so gebaut und verschlossen werden, dass ein Austreten des Inhalts aus der versandfertigen Verpackung, was unter den 127

128 normalen Bedingungen des Transports, durch Erschütterungen oder durch Temperatur-, Feuchtigkeits- oder Druckänderungen verursacht werden kann, verhindert wird. Die Gefäße als erste Verpackungen müssen in die zweite Verpackung so eingesetzt werden, dass sie unter den normalen Beförderungsbedingungen nicht zerbrechen oder durchstoßen werden können und dass ihr Inhalt nicht in die zweite Verpackung austreten kann. Zweite Verpackungen müssen durch geeignete Polstermittel in Außenverpackungen gesichert werden. Die Schutzeigenschaften der Polstermittel oder der Außenverpackungen dürfen durch austretenden Inhalt nicht wesentlich beeinträchtigt werden. Die Verpackung muß aus 3 Bestandteilen bestehen; Primärgefäß, Sekundärgefäß und Außenverpackung Die ersten Gefäße müssen wasserdicht sein. Jedes Versandstück muss klar und deutlich mit der Aufschrift UN 3373 Diagnostische Proben gekennzeichnet sein. Wenn mehrere zerbrechliche Gefäße in eine einzelne zweite Verpackung eingesetzt werden, müssen sie entweder einzeln eingewickelt oder so voneinander getrennt werden, dass eine gegenseitige Berührung verhindert wird. Eine Zertifizierung der Verpackung ist nicht erforderlich Definierte TSE-Proben (positives TSE-Material) Definiert TSE-haltige SRM-Proben (z. B. bestätigte BSE-Gehirnproben zur Durchführung von Ringversuchen, Versand positiver Kontrollproben, durch das FLI-bestätigte BSE- Verdachtsproben etc.) sind ansteckungsgefährliche Stoffe der Gefahrenklasse 6.2 und fallen ebenfalls seit dem in die Kategorie B der ADR 2005 und werden unter UN 3373 Diagnostische Proben klassifiziert. Denn unter Berücksichtigung von den in den letzten Jahren bekannt gewordenen wissenschaftlichen Erkenntnissen zu Infektionswegen und risiken, insbesondere einer BSE-Übertragung auf den Menschen, besteht beim Transport der TSE-Proben nach der Verpackungsvorschrift P 650 keine Exposition für Mensch oder Tier, um bei Austritt aus der Schutzverpackung eine lebensbedrohliche oder tödliche Krankheit zu verursachen. Gleichzeitig ist in der Liste der ansteckungsgefährlichen Stoffe unter Kategorie A kein TSE-Material aufgeführt. Diese Klassifizierung wurde ebenfalls in einer Stellungnahme des Robert-Koch-Institutes als Sicherheitsbehörde des Gefahrgut-Verkehrs-Beirates vom bestätigt. 128

129 15.3. Untersuchungsgang Zur Bestätigung von BSE-Fällen können ausschließlich die vom Internationalen Tierseuchenamt anerkannten Verfahren herangezogen werden Histopathologie Immunhistochemie SAF-Immunoblot ggf. der Nachweis der Infektiosität im Tierversuch Bestätigungsuntersuchungen müssen durch das nationale Referenzlabor am FLI durchgeführt werden. 129

130 Anhang Anmeldung einer BSE-/Scrapie-Verdachtsprobe zur Untersuchung an das FLI Insel Riems Bitte zunächst telefonische Anmeldung unter der Nummer: /7-161 (ggfs. Pforte /7-0 (rund um die Uhr besetzt). Anschließend per FAX an /7-192 Einsendung der Probe an (bitte für jede Einzeltierprobe separates Anmeldeformular) Nationales Referenzlabor für BSE/Scrapie Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger am FLI Insel Riems Südufer Greifswald - Insel Riems Anschrift des Einsenders: Ansprechpartner Name: Tel.: FAX: Vorbericht zur Probe Ohrmarkennr: Geburtsdatum: G Rind G Schaf G Ziege G sonst.: G Schlachthof G TBA G Klin. Verdacht G Kohorte Ergebnisse der Voruntersuchung (Initial/Wdh.) G TeSeE Werte: Cut-off: G Prionocs LIA Werte: Cut-off: G Enfer Werte: Cut-off: G Werte: Cut-off: G Prionics WB Formalinfixierte Obexprobe anbei G ja G nein Versand der Probe am um Uhr G Fahrer G TNT G sonst. voraussichtliche Ankunft am um Uhr Wir bitten um Übersendung des vollständigen Vorberichts (Vorergebnisse wie Elisa-Werte, Röntgenfilm etc.; Herkunftnachweis des Tieres incl. Ohrmarkennr. etc.). In Formalin eingelegte Proben bitte getrennt versenden und dieses Paket mit dem Hinweis bei Raumtemperatur lagern versehen, falls die Sendung am Wochenende oder nach Uhr am FLI eintrifft. Das andere Paket mit der gekühlten Probe bitte mit dem Hinweis gekühlt lagern kennzeichnen. Wichtiger Hinweis: aus Gründen des Arbeitsablaufes können am selben Arbeitstag nur Proben bearbeitet werden, die vor 8 Uhr am FLI eingetroffen sind! Bei späterer Ankunft kann die Untersuchung der Proben erst am folgenden Tag beginnen! 130

131 16. Epizootische Haemorrhagie der Hirsche Charakterisierung der Infektion Die Krankheit wird vor allem in Weißschwanzhirschen und anderen frei lebenden Huftieren (z.b. Antilopen) ausgelöst. Wegen serologischer Verwandschaft ist eine Differenzierung von BTV nötig. Es gibt monoklonale Antikörper, die EHDV gut von BTV differenzieren Erreger Das Virus der Epizootischen Haemorrhagie der Hirsche (EHDV) ist ein Vertreter des Orbivirus Genus der Reoviridae. Acht EHDV Serotypen sind bisher durch Neutralisationstests festgelegt worden. Überträger sind wie bei BTV Culicoides-Insekten Klinische Symptomatik Die Krankheit hat das gleiche Wirtsspektrum und zeigt einen ähnlichen Verlauf wie Bluetongue mit dem Unterschied, dass Antilopen und Weißschwanzhirsche die höchste Empfänglichkeit aufweisen und die Mortalität bei diesen Tieren am höchsten ist Differentialdiagnostik Wichtigste Differentialdiagnostik ist Bluetongue und die bei BTV angegebenen Viruskrankheiten Diagnostische Indikation siehe Richtlinie 92/119/EWG Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik Südufer 10, Greifswald - Insel Riems Rechtsgrundlagen Richtlinie 92/119/EWG Untersuchungsmaterial Gerinnungsgehemmtes Blut von Tieren. Das EDTA-Blut sollte im gekühlten (+4 C) Zustand versendet werden. Lagerung über längere Zeit sollte bei -70 C erfolgen, weil das EHDV bei - 20 C nicht lange stabil bleibt. Post mortem sind Milz und Lymphknoten die Organe der Wahl zur Virusisolierung, schnellstmöglicher Versand erfolgt bei + 4 C. Für den Antikörpernachweis können Vollblut oder mindestens 500µl Serum eingesendet werden. 131

132 16.3. Untersuchungsgang Solange die Seuche in Deutschland nicht auftritt, wird das FLI Proben an das Institut for Animal Health, Pirbirght, UK, weiterleiten Erregernachweis Zum Virusnachweis werden die gleichen Methoden wie zum BTV-Nachweis empfohlen, eine zur spezifischen EHDV-RNA Detektion (L3 Gen, Serotyp 1) entwickelte PCR ist beschrieben (Can. J. Vet. Res. 60, (1996)) und wird am FLI angewendet. Darüber hinaus wurde am FLI eine EHDV-real-time RT-PCR etabliert, die im Rahmen von differential-diagnostischen Abklärungen eingesetzt wird Antikörpernachweis Am Institut for Animal Health, Pirbirght, UK, gibt es als in-house-test einen Kompetitions- ELISA zum spezifischen Antikörpernachweis. 132

133 17. Enzootische Leukose der Rinder Charakterisierung der Infektion Erreger Die enzootische Rinderleukose (ERL) ist eine bei allen Rinderrassen und vereinzelt beim Schaf auftretende virusbedingte Tumorerkrankung des retikuloendothelialen Systems. Das infektiöse Agens ist das bovine Leukosevirus (BLV), ein exogenes B-Zell-lymphotropes Retrovirus Klinische Symptomatik Nach einer unterschiedlich langen Inkubationszeit sind ein klinisch inapparentes, ein präleukotisches und ein tumoröses Stadium zu unterscheiden. Die Ausbildung von Tumoren stellt das eigentliche Krankheitsbild dar, welches aber nur bei wenigen infizierten Tieren als Endstadium der Erkrankung auftritt und je nach Lokalisation der Veränderung und in unterschiedlichen Zeiträumen zum Tode führen kann. Plötzliche Todesfälle können durch Milzrupturen verursacht werden. Die Diagnostik erfolgt pathologisch-anatomisch durch den Nachweis des Tumorstadiums (Leukoseverdacht), histologische Tumordifferenzierung (pathognomonisch) serologisch durch den Nachweis von Antikörpern in Blut- und/oder Milchserum, durch den elektronenoptischen Nachweis des Erregers, durch den Provirusnachweis mit Hilfe der PCR Eine persistierende Lymphozytose mit sehr hohen Lymphozytenwerten wird als pathognomonisch angesehen Differentialdiagnostik Je nach Verlauf des Tumorstadiums kann es zu Leistungsdepressionen, Inappetenz, Lahmheit, Exophthalmus und Blutbildveränderungen kommen, die von entsprechenden Veränderungen vielfältiger anderer Genese (Formen der sporadischen Rinderleukose, wie sporadisch auftretende Jungtierleukose, Hautleukose und Thymusleukose) unterschieden werden müssen Diagnostische Indikation Siehe Punkt 6. Zusätzlich: Abklärung von Tumorerkrankungen beim Einzeltier, als Handels oder Quarantäneuntersuchung (Import/Export, Sanierungsbetriebe u.ä.). 133

134 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Auf der Grundlage der Leukose-Verordnung und der Zuständigkeitsregelungen der Bundesländer erfolgt durch staatliche Untersuchungseinrichtungen und in Tiergesundheitsämtern die Antikörperdiagnostik im Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und /oder Agargel-Immundiffusionstest (AGIDT, IDT) Die amtlich zugelassenen, kommerziell erhältlichen Tests und entsprechend freigegebenen Chargen sind in der Liste der nach 17 c TierSG zugelassenen Mittel bei der Zulassungsstelle des Friedrich-Loeffler-Instituts ( einzusehen. Amtliche Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen 133 Abklärungsuntersuchungen bei zweifelhaften Antikörper-Befunden werden durch das nationale Referenzlabor für ERL am Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Infektionsmedizin, Insel Riems u.a. mittels PCR zum BLV-Provirusnachweis durchgeführt. Die amtliche Feststellung der Seuche obliegt der zuständigen Veterinärbehörde. Impfungen und Heilversuche sind verboten. Nationales Referenzlabor: Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für Infektionsmedizin Südufer Greifswald - Insel Riems Tel.: (Durchwahl -7172, / -7270) Fax: Rechtsvorschriften Die erl ist in Deutschland als Tierseuche anzeigepflichtig und eine bei der OIE gelistete Erkrankung. Bestehende Rechtvorschriften sind dargelegt in: international: EG-Richtlinie 64/432, Anlage G der EWG Direktive 88/406, Änderungsrichtlinie 97/12/EG des Rates v national: Rinder-Leukose-Verordnung vom , BGBl.I, S.417 und vom , BGBl.I,16; geändert durch Art. 2 V v I 3499 Empfehlungen enthält das OIE-Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals,

135 17.2. Untersuchungsmaterial Vollblut, Serum, Plasma Durch die einschlägigen Untersuchungseinrichtungen werden Blutröhrchen zur Gewinnung von gerinnungsgehemmtem Vollblut (EDTA) bzw. Serum auf Anforderung bereitgestellt. Zur Einzeltierdiagnostik wird 3 bis 5 ml venöses Vollblut möglichst steril entnommen. Das Serum bzw. Blutplasma wird auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen BLV untersucht. EDTA-Blut wird zur Untersuchung BLV-spezifischer proviraler DNA in den Lymphozyten verwendet. Der Transport der Blutproben zur Untersuchungseinrichtung erfolgt vorzugsweise per Kurierdienst. Das Serum sollte frühestens einen Tag nach der Blutentnahme zur Untersuchung verwendet werden. Stark hämolytische oder offensichtlich veränderte Seren sind zur Untersuchung ungeeignet. Im Kühlschrank können Serumproben ca. eine Woche, bei mindestens -20 C mehrere Monate aufbewahrt werden. Amtliche Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen 134 Einzelmilch, Poolmilch, Sammelmilch (Tankmilch, Kannenmilch) Zur Untersuchung ist die weitgehend fettfreie, flüssige Sekretfraktion des Einzelgemelkes zu verwenden. Bis zu 50 Einzelgemelke können zu gleichen Teilen zusammengeführt werden (Poolmilch). Aus Milchtanks oder Milchkannen können Sammelgemelke entnommen werden. Hierfür dürfen in der Probe nicht mehr als 50 Gemelke laktierender Milchkühe enthalten sein. Die Milchproben können mit oder ohne Konservierungsmittel versetzt untersucht werden. Die Proben sind vor der Untersuchung zum Zwecke der Aufrahmung kühl zu lagern. Nicht genügend aufgerahmte Proben sind 20 min bei 2000 g zu zentrifugieren. Anschließend wird die Rahmschicht durch Absaugen oder Dekantieren entfernt oder mit der Pipettenspitze durchstoßen. Untersuchungsmenge: 1 bis 2 ml Milch Verunreinigte oder zersetzte Proben sind zur Untersuchung ungeeignet. Unkonserviert sind die Proben bei Kühlschranktemperatur bis zu fünf Tagen zur Untersuchung verwendbar. Eine längere Lagerfähigkeit ist bei mindestens -20 C gegeben. Präkolostrum, Erstkolostrum Im geburtsnahen Zeitraum kann im Blutserum der Antikörperspiegel unter die verfahrensbedingte Nachweisgrenze des Agargel-Immundiffusionstests (AGIDT) sinken. Im Stadium der Hochträchtigkeit erfolgt ein zunehmender Transfer von Antikörpern in das Eutersekret. Vier Wochen ante partum (Präkolostrum) bis zum ersten Gemelk post partum (Erstkolostrum) ist der BLVAntikörperspiegel im Eutersekret bis zu fünfmal höher als im Blutserum. Zur Abklärung des Leukoseverdachtes, bei Handelsuntersuchungen und während der Quarantäne von hochträchtigen Einzeltieren oder Frischabkalbern ist diese Besonderheit bei der diagnostischen Untersuchung mit dem AGIDT zu beachten. 135

136 17.3. Untersuchungsgang Dem indirekten Nachweis der Infektion durch die Bestimmung spezifischer Antikörper kommt eine zentrale Bedeutung zu. Die direkten Nachweisverfahren werden bei besonderen Fragestellungen am Nationalen und OIE-Referenzlabor für EBL am Friedrich-Loeffler- Institut bei serologisch zweifelhaften Befunden eingesetzt Direkter Virusnachweis Nachweis des BLV-Provirus durch PCR Bei infizierten Rindern ist das BLV in seiner proviralen Form in die DNA der Wirtszelle integriert und kann mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden. Die Methodik wird kontinuierlich weiterentwickelt. Eine Etablierung als diagnostische Methode zum Nachweis der BLV-Infektion wird international empfohlen (siehe "OIE-Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals", 2008). Die Dauer der Untersuchung beträgt ca. 24 bis 36 Stunden. Amtliche Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen 135 Andere Verfahren zum direkten Erregernachweis Der direkte Erregernachweis (BLV) kann erfolgen durch: Elektronenmikroskopie Virusisolierung mit Nachweis synzytienbildender Eigenschaften des BLV kompetitiven Radioimmunoassay (cria) Tierversuch Von praktischer Bedeutung ist die in vitro-kultivierung von Lymphozyten mit anschließender Erregerisolierung und -charakterisierung. Diese Methoden werden ausschließlich im Rahmen der experimentellen Leukoseforschung angewendet (Nationales Referenzlabor für ERL am Friedrich-Loeffler-Institut) Indirekter Erregernachweis (Antikörpernachweis) Antikörper können im Serum, Plasma und/oder in der Milch bei infizierten Rindern mit Hilfe kommerziell erhältlicher und zugelassener Testsysteme nachgewiesen werden. Die Diagnose erfolgt in staatlichen Untersuchungseinrichtungen. Die Liste der nach 17c TierSG zugelassenen Mittel bzw. freigegebenen Chargen ist bei der Zulassungsstelle des Friedrich-Loeffler- Instituts ( einzusehen. Der einheitlichen Diagnostik liegen die Rinder-Leukose-Verordnung vom in der aktuellen Fassung sowie die Zuständigkeitsregelungen der Bundesländer zugrunde. Gemäß Ausführungshinweisen zur Leukose-VO-Rinder werden folgende Testsysteme, deren Antigen gegen ein Standardserum geprüft sein muss, zum Antikörpernachweis gegen BLV eingesetzt: 136

137 Diagnostischer Standard: amtliches OIE-Referenzserum E05, geliefert vom Nationalen Referenzlabor des Friedrich-Loeffler-Instituts. Nationale Referenzseren und Milch, geliefert vom Nationalen Referenzlabor des Friedrich-Loeffler-Instituts. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis von Antikörpern gegen BLV in Blutserum und Milch, in Einzel- und Sammelproben gemäß Richtlinie 88/406/EWG des Rates zur Änderung der Richtlinie 64/432/EWG vom Die Empfindlichkeit des ELISA muss so hoch sein, dass das OIE-Referenzserum (E05) positiv reagiert, wenn es zehnmal (Blutserum) bzw. 250-mal (Milchproben) mehr verdünnt wird als die Lösung, die Einzelproben ergeben, wenn diese in Pools zusammengefaßt werden. Die Sensitivität des ELISA ist ca. 100mal höher als die des IDT. Eine Befundmitteilung ist innerhalb von 24 Stunden möglich. Die Bewertung der Untersuchungsbefunde bei Milchuntersuchungen ergibt sich aus dem jeweiligen Einsatz einer Positivkontrolle auf der Grundlage des diagnostischen Standards. Die Einsatzverdünnung für den positiven Serumstandard E05 in negativer Milch als Bezugsreferenz für Milchproben beträgt: 1: (250 x n x 2) Amtliche Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen 136 Somit ergeben sich folgende Einsatzverdünnungen: E05/ bzw. E05/ für Tankmilch aus Beständen mit einer Obergrenze von 100 Milchkühen (bzw. 200 nach Konzentrierung der Milch), E05/ für Tankmilch aus Beständen mit max. 50 laktierenden Kühen, E05/ für Tankmilch aus Beständen mit max. 25 laktierenden Kühen oder für Laborpools aus 50 Einzelmilchproben, E05/5.000 für Laborpools aus 20 Einzelmilchproben, E05/2.500 für Laborpools aus 10 Einzelmilchproben, E05/250 für eine Einzelmilchprobe. Die Durchführung der Tests erfolgt nach den Gebrauchsanweisungen der Hersteller. Agargel-Immundiffusionstest (AGID) zum Nachweis von Antikörpern im Blutserum bei Einzeltieren. Die Dauer der Untersuchung beträgt 4 Tage. Diese Untersuchungsmethode ist auch zur Untersuchung von Prä- und/oder Erstkolostrum bei Einzeltieren geeignet. 137

138 18. Equine Enzephalomyelitis (Eastern/Western) Charakterisierung der Infektion Erreger Die Erreger der Pferdeenzephalitiden sind Viren des Genus Alphavirus der Familie Togaviridae. Es handelt sich dabei um die Viren der Eastern equinen Enzephalomyelitis, der Western equinen Enzephalomyelitis und der Venezuelan equinen Enzephalomyelitis. Diese Erreger gehören zu der Gruppe der Arboviren, die bei einer Infektion mittels hämatophager Insekten aus dem ökologischen Reservoir (Vögel für Eastern und Western; kleine Nager für Venezuelan) auf neue Wirte übertragen. Pferde und Menschen stellen bei diesen Infektionen Fehlwirte dar, von denen im Fall von Eastern und Western keine direkte Übertragung auf andere Individuen der gleichen Spezies möglich ist. Bei der Venezuelan equinen Enzephalomyelitis ist eine solche Intraspeziesübertragung jedoch beschrieben Klinische Symptomatik Western und Eastern equine Enzephalomyelitis Bei Pferden sind die Enzephalomyelitiden durch Fieber, Anorexie und starke Depression charakterisiert. Infektionen von Pferden mit dem Eastern-Enzephalomyelitisvirus verlaufen meist tödlich, wohingegen Infektionen mit dem Western-Enzephalomyelitisvirus häufig einen subklinischen oder milden Verlauf zeigen. Im letzteren Fall liegt die Mortalität bei unter 30 %. Auch beim Menschen können diese Viren schwere bis tödlich verlaufende Krankheiten mit ähnlicher Symptomatik hervorrufen. Venezuelan equine Enzephalomyelitis Die Symptome einer Erkrankung mit dem Virus der Venezuelan equinen Enzephalomyelitis reichen bei Equiden und Menschen in Abhängigkeit von dem beteiligten Subtyp von milden fiebrigen Reaktionen auf die Infektion bis zu tödlich verlaufenden Enzephalomyelitiden Differentialdiagnostik Diagnostische Indikation Zuständige Untersuchungseinrichtungen Nationales Referenzlabor: Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Insel Riems Telefon: Telefax:

139 Rechtsgrundlagen Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der jeweils gültigen Fassung (derzeit 3. Nov. 2004) Untersuchungsmaterial Vorsichtsmaßnahmen Da es sich bei den Viren der equinen Enzephalomyelitiden um Erreger handelt, die potentiell auch Menschen infizieren können, ist während der Probennahme und der Verarbeitung der Proben bei Verdacht auf equine Enzephalomyelitis für den Probennehmer ein Schutz vor einer viralen Infektion empfohlen, sofern geimpftes Personal nicht zur Verfügung steht Probenmaterial Für die serologische Untersuchung Nativblutprobe oder Serum Für die virologische Untersuchung Organmaterial (Gehirn, Rückenmark) Zeitpunkt der Probennahme Der günstigste Zeitpunkt für eine Probennahme bei Verdacht auf eine Infektion mit einem equinen Enzephalomyelitisvirus ist wenige Tage nach der Infektion, da sich zu diesem Zeitpunkt IgM-Antikörper serologisch nachweisen lassen und auch eine Virusanzucht am einfachsten gelingt. Eine Organentnahme für die Virusanzucht erfolgt post mortem Probenversand Der Versand von Probenmaterial muss in Sicherheitsbehältern für Erreger der Sicherheitsstufe L3 erfolgen. Blut- und Organproben sollten in gefrorenem Zustand versendet werden Untersuchung Antikörpernachweis Gemäß OIE-Methoden können Antikörper aus infizierten Seren mittels Plaque- Neutralisationstest, Haemagglutinations-Hemmungstest, der Complementfixierung oder einem IgM-Capture-ELISA nachgewiesen werden. Um eine sichere Diagnose abgeben zu können, ist für alle Testsysteme ein 4 facher Anstieg des Antikörpertiters Voraussetzung Virusnachweis Der Nachweis von Viren kann direkt aus dem eingesendeten Organ-Material gemäß den Methoden der OIE erfolgen. Dabei kann das Virus aus dem Feldmaterial durch Inokulation von neugeborenen Mäusen, embryonierten Hühnereiern, Zellkulturen oder frisch geschlüpften Küken angezüchtet werden. Anschließend wird das Virus mittels Complementfixierung, Immunfluoreszenz oder den Plaque-Neutralisationstest identifiziert. 139

140 Des Weiteren erfolgt der Nachweis von viraler RNA mittels einer nested-reversen Transkriptase Polymerasekettenreaktion (nrt-pcr). Hierbei wird für die Erreger der Eastern und der Western equinen Enzephalomyelitis eine kombinierte nested PCR durchgeführt. Die Identifikation erfolgt dann über die Auswertung der PCR-Produkte, die sich durch den Einsatz von spezifischen Primern leicht anhand ihrer Größe unterscheiden lassen. Virale RNA des Venezuelan equinen Enzephalomyeltis-Virus wird in einer von der OIE empfohlenen semi-nested PCR nachgewiesen. Diese Methoden des Nachweises der viralen RNA durch nrt-pcr sind Bestandteil der Diagnostik des nationalen Referenzlabors für equine Enzephalomyelitiden. 140

141 19. Infektiöse Anämie der Einhufer (Blutarmut) Charakterisierung der Infektion Erreger Die Infektiöse Anämie der Einhufer, auch bezeichnet als Equine infektiöse Anämie (EIA), ist eine systemische Viruserkrankung der Pferde, Ponys, Esel, Maultiere und Zebras. EIAV, ein Lentivirus aus der Familie der Retroviren, verursacht eine persistierende Infektion und vermehrt sich in Monozyten und Makrophagen. Der Erreger besitzt ein einzelsträngiges RNA- Genom positiver Polarität. Die Glykoproteine der Virushüllmembran zeigen eine kontinuierliche, langsame Veränderung der immunitätsinduzierenden Strukturen (Antigendrift). Das Hauptstrukturprotein p26 des Virusinnenkörpers ist hingegen konserviert und wird daher für die serologische Diagnose der EIA-Infektion herangezogen. Die Krankheit ist in Deutschland anzeigepflichtig und wird durch die Verordnung zum Schutz gegen die ansteckende Blutarmut der Einhufer (Stand 2000, BGBl. I S. 531) reglementiert, die eine Tötung positiver Tiere sowie Sperrung und Untersuchung der betroffenen Bestände und der Kontaktbetriebe vorschreibt. Immunprophylaxe oder Therapie sind nicht verfügbar. Eine Gefährdung des Menschen durch EIA liegt nicht vor. Vorkommen EIA ist weltweit verbreitet und tritt regional gehäuft in Nord- und Südamerika, Afrika, Asien, Australien sowie Süd- und Osteuropa auf. Sie kommt in nord- und mitteleuropäischen Länder nur sporadisch vor. Das Virus ist in Deutschland nicht heimisch, jedoch kommt es immer wieder zu vereinzelten EIA-Ausbrüchen. Die letzten Ausbrüche wurden im Jahr 2002 in Hessen und im Jahr 2006 in Sachsen und Thüringen registriert. Epidemiologie Die Übertragung erfolgt in erster Linie mechanisch durch große blutsaugende Insekten wie Pferdebremsen und Wadenstecher (Tabanus, Stomoxys). Diese können bei einer Unterbrechung der Blutmahlzeit infektiöses Blut an ihren Mundwerkzeugen auf ein benachbartes Tier übertragen. Das EIA-Virus bleibt nur für kurze Zeit infektiös (ca. 30 Minuten), daher kommt eine Übertragung durch Insektenvektoren über größere räumliche Distanzen hinweg nicht vor. EIA-Infektionen treten saisonal gehäuft in den vektorreichen Jahreszeiten (Sommer und Herbst) auf. Infizierte Tiere scheiden Virus mit Körpersekreten wie Speichel, Milch und Sperma aus. Eine Virusübertragung durch Exkrete erfordert einen sehr engen Kontakt der Tiere. Intrauterine Infektionen sind ebenfalls beschrieben. EIAV kann darüber hinaus durch infizierte biologische Produkte übertragen werden. Eine etwaige Verschleppung durch Injektionskanülen, tierärztliche Instrumente oder Pflegezubehör ist durch Verwendung von Einwegmaterial bzw. durch geeignete Desinfektions- und Hygienemaßnahmen auszuschließen Klinische Symptomatik Infektionen mit Lentiviren, zu denen das EIAV gehört, sind dadurch charakterisiert, dass sie zu persistierenden Infektionen führen. Spezifische Antikörper sind zwei bis drei Wochen (in Ausnahmefällen bis zu 60 Tage) nach der Infektion nachweisbar. Aufgrund der stetigen Veränderung der Antigeneigenschaften des Virus führt die induzierte Immunantwort nicht zur Eliminierung des Erregers. Infizierte Tiere bleiben lebenslang Virusträger und stellen potentielle Infektionsquellen dar. 141

142 Die Erkrankung zeigt sich in akuter oder chronischer Form mit jeweils vereinzelt tödlichem Verlauf. Die akute Verlaufsform äußert sich in Fieber, Apathie, Schwäche, Ataxie, Ikterus, Tachykardie, Arrhythmie sowie petechialen Blutungen auf Schleimhäuten und Lidbindehäuten sowie insbesondere auf der Zungenunterseite. Die chronische Verlaufsform ist hingegen durch Krankheitsschübe mit rekurrierenden Fieberanfällen, Konditionsverlust, Anämie sowie Ödembildung an Unterbauch und Extremitäten gekennzeichnet. Eine Anämie (Blutarmut) entsteht nach Infektion mit EIAV vorrangig durch immunpathologische Auflösung der roten Blutkörperchen, aber auch durch eine Störung ihrer Neubildung. Pathologische Veränderungen haben im akuten Stadium eher degenerativen (Lebernekrosen, fokale Blutungen) und im chronischen Stadium eher lymphoproliferativen Charakter (Hepatosplenomegalie, Hämosiderose, Lymphadenopathie). In 30 bis 90 % der Fälle treten keine Krankheitssymptome auf, die Tiere bleiben gesund erscheinende Virusträger, sogenannte asymptomatische Carrier Differentialdiagnostik Fieber, geringgradiger Ikterus und Nachhandschwäche werden auch bei Babesiose, Ehrlichiose und Leptospirose beobachtet. Ödembildung kann auch im Rahmen von Nephrosen, Nephritiden, Herz-, Kreislaufinsuffizienz und starkem Wurmbefall auftreten. Die immunvermittelte hämolytische Anämie (IMHA) kommt bei Pferden zwar selten vor, ist in Deutschland aber die häufigste Ursache einer hämolytischen Anämie. Akute Infektionsverläufe können dem klinischen Bild der Equinen Viralen Arteritis (EVA) ähneln. Eitrige Herdinfektionen können zu ähnlichen klinischen Befunden führen, wie sie bei dem chronischen Verlauf der EIAV- Infektion zu beobachten sind Diagnstische Indikation Gemäß Verordnung zum Schutz gegen die ansteckende Blutarmut der Einhufer Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungseinrichtungen der Länder Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems: Nationales Referenzlabor für EIA am Institut für Virusdiagnostik Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die ansteckende Blutarmut der Einhufer (Einhufer- Blutarmut-Verordnung) vom 02. Juli 1975 (BGBl. I S. 1845) in der jeweils geltenden Fassung (letzte Fassung vom ; BGBl. I S. 531) 142

143 19.2. Untersuchungsmaterial Für die hämatologische Untersuchung gerinnungsgehemmte Blutprobe (EDTA, Heparin, Citrat) Für die serologische Untersuchung: Nativblutprobe oder Serum Für die virologische Untersuchung: gerinnungsgehemmte Blutprobe (EDTA [Anzucht!], Heparin, Citrat) Organmaterial (Leber, Milz, Niere) Untersuchung Der Agargel-Immunodiffusiontest (AGID, Coggins-Test) ist der Test der Wahl für die Diagnosestellung. Der EIAV-Antikörper-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) beruht auf einem enzymatischen Nachweis der Antikörper und muss bei einer positiven Reaktion durch den AGID bestätigt werden. Der direkte Nachweis des Virus ist üblicherweise nicht notwendig, da davon ausgegangen wird, dass ein serologisch positives Tier das Virus beherbergt und es potentiell weiterverbreiten kann. Der Nachweis von viralem Erbmaterial aus Blut und Organmaterial ist mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) möglich. Die Untersuchungen erfolgen nach dem O.I.E. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (2005, Part 2, Section 2.5, Chapter 2.5.4). Weiterführende Ergänzungen können der AVID-Methodensammlung entnommen werden ( Antikörpernachweis Von Pferden, die sich möglicherweise in einer frühen Infektionsphase befinden, sollte nach 1 bis 2 Wochen erneut eine Blutprobe untersucht werden. Um für Fohlen eine Aussage treffen zu können, muss der Antikörperstatus der Mutterstute bekannt sein. Falls im Blut der Stute Antikörper gegen EIAV nachgewiesen werden, kann der serologische Befund des Fohlens erst nach dem sechsten Lebensmonat beurteilt werden, da erst nach dieser Periode passiv übertragene maternale Antikörper abgebaut sind Agargel-Immunodiffusiontest (AGID, Coggins-Test) In den ersten zwei bis drei Wochen nach der Infektion fällt der Test üblicherweise negativ aus. In Ausnahmefällen können bis zum Auftreten nachweisbarer Antikörper bis zu 60 Tage vergehen. Präzipitierende Antikörper aus dem Testserum diffundieren in einem Agargel gegen ein ebenfalls diffundierendes Antigen (Kapsid/Core p26). Eine entstehende Präzipitationslinie ist dann als positiver Befund zu bewerten, wenn diese Bande mit der Präzipitationsbande des positiven Kontrollserums kommuniziert. Kommerzielle Testkits beinhalten rekombinantes diagnostisches Antigen und positives Kontrollserum EIAV-Antikörper-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Kommerzielle indirekte sowie blocking ELISA-Tests sind zum Nachweis von Antikörpern gegen p26 (Kapsid) oder gp45 (Transmembran-Glykoprotein) verfügbar. Aufgrund ihrer höheren Sensitivität und der schnellen Durchführung stellen sie eine sinnvolle Ergänzung zum Agargel-Immunodiffusiontest dar, insbesondere bei der Routineuntersuchung größerer Pro- 143

144 benzahlen. Ein positives ELISA-Testergebnis muss im AGID verifiziert werden, da in den ELISA-Tests vereinzelt falsch positive Reaktionen auftreten können Virusnachweis Da das Virus im infizierten Tier persistiert, ist ein positiver serologischer Befund ausreichend für die Diagnosestellung der EIAV-Infektion. Eine Virusisolierung ist zeitaufwändig, und die Durchführung ist nicht routinemäßig erfolgreich. EIAV kann in primären Makrophagen- und Leukozytenkulturen angezüchtet werden, in Pferdehaut- und Nierenzelllinien vermehrt sich das Virus deutlich schlechter. Eine nested Polymerase-Kettenreaktion (n-pcr) kann zum Genomnachweis eingesetzt werden (Nagarajan et al. 2001, J. Virol. Methods, 94, ). Der Nachweis viraler RNA erfolgt aus zellfreiem Material (Plasma, Serum), der Nachweis von integrierter proviraler DNA aus Blutzellen oder Organmaterial. Da die Viruslast sehr niedrig sein kann und die Sequenzen der zirkulierenden EIAV-Stämme auch im gag-bereich (p26) variieren können, ist lediglich ein positiver PCR-Befund als aussagekräftig zu bewerten. Virus-Übertragungsversuche mit dem Blut verdächtiger Pferde können in Ausnahmefällen durchgeführt werden. 1 bis 25 ml Vollblut eines infizierten Tieres, in Einzelfällen bis zu 250 ml, werden benötigt, um nach intravenöser Inokulation eine Infektion in einem Empfängertier zu etablieren (Beobachtungszeitraum 45 Tage). 144

145 20. Infektiöse Anämie der Salmoniden (ISA) Charakterisierung der Infektion Die Infektiöse Anämie (Infectious Salmon Anemia, ISA) ist eine Infektionskrankheit der Atlantischen Lachse (Salmo salar) und wird durch ein Orthomyxo-like Virus, dem ISA-Virus (ISAV), verursacht. Infizierte Lachsbestände sind in Kanada, Norwegen, den USA, den Faroe- und den Shetland-Inseln sowie in Schottland sowie in Irland bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) im Salzwasser nachgewiesen worden wurde in Chile ein ISA- Ausbruch beim pazifischen Silberlachs (O. kisutch) bestätigt. Dies ist somit die zweite Spezies, die für die ISAV empfänglich ist. Neben den beiden Lachsarten konnte ISAV aus der Meerforelle (Salmo trutta trutta), der Regenbogenforelle (O. mykiss) und dem Atlantischen Hering (Clupea harengus) isoliert werden. Diese Fischarten erkranken nicht, können aber offensichtlich als Überträger des Virus fungieren. Nach der Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG (1) gelten Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), Atlantischer Lachs (Salmo salar) und Forelle (Salmo trutta) als empfängliche Arten Erreger und seine Einordnung Die ISA wird durch ein behülltes Virus hervorgerufen, welches morphologische, biochemische und genomische Eigenschaften der Orthomyxoviren besitzt. Es ist nach seinem Gefährdungspotential für Fische derzeit noch nicht in eine Risikogruppe eingeordnet. Die Krankheit ist aber als nicht exotische Krankheit im Anhang IV der Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG (1) aufgeführt. Laborarbeiten mit ISAV sollten unter L2-Bedingngungen nur mit zusätzlichen Auflagen (eingeschränkter Personenverkehr, 2 Tage kein Kontakt zu Nutzfischen) gestattet werden. Für Tierversuche müssen L3-Bedingungen gefordert werden Klinische und pathologisch-anatomische Symptomatik Klinisch ist die systemische und letal verlaufende Viruserkrankung durch Anämie, Ascites, geschwollene und vergrößerte Leber (sehr dunkel) und Milz, aber auch durch petechiale Blutungen im Peritoneum gekennzeichnet. Blutungen wurden ebenfalls im Auge beobachtet. Typische histopathologische Befunde sind degenerative und nekrotische Veränderungen in den Leberzellen sowie tubuläre Nekrosen und Blutungen in der Niere. Die Erkrankung tritt meist bei Fischen auf, die im Salzwasser gehalten wurden bzw. Salzwasser ausgesetzt waren. Es häufen sich aber die Berichte über das Auftreten der ISA bei Süßwasser-Lachsen. In der Regel verbreitet sich das Virus dort langsam und besitzt nur eine geringe Virulenz, wobei Ausbrüche im Salzwasser durch eine hohe Mortalität gekennzeichnet sind. Zur weiteren phenound genotypischen Charakterisierung werden das Virus und seine RNA gegenwärtig bearbeitet Vorkommen ISAV wurde in Kanada, Norwegen, Chile, den USA, den Faroe- und den Shetland-Inseln sowie in Schottland und Irland nachgewiesen. In Kanada wurde ISA ursprünglich als Hämorrhagisches Nieren Syndrom (HKS) beschrieben. Bisher konnte das ISAV aus Lachsen, aus Meer- und Regenbogenforellen sowie aus dem Atlantischen Hering nach natürlicher oder experimenteller Infektion isoliert werden. Nach künstlicher Infektion des Steinbutt (Psetta ma- 145

146 xima), der Wrasse (Labrus bergylta), der Seebrasse (Dicentrachus labrax) oder des Kabeljau (Gadus morhua) war eine Reisolierung des ISAV nicht möglich. Ein natürliches Reservoir des ISAV ist bisher nicht bekannt. Eine Ausbreitung des Virus als eine Folge von subklinischen Infektionen der Smolt -Lachse erfolgte nachweisbar von Farm zu Farm durch Wellboats bzw. von Schlachthäusern oder der Fischindustrie dann, wenn Fische transportiert oder Organmaterial ISA-infizierter Tiere und unbehandeltes Abwasser direkt ins Meer eingeleitet wurden. Zu den Umweltfaktoren, die die Infektion beeinflussen, zählen in latent infizierten Populationen verschiedene Stressfaktoren, wie z. B. Behandlungen gegen Forellenläuse oder Cestoden, aber auch gegen andere Infektionskrankheiten. Diese Belastungen können 2-3 Wochen später zu einem ISA-Ausbruch führen Diagnostik der ISA Die ISA-Diagnostik basiert gegenwärtig auf der ISA-typischen Klinik, der pathologischen Anatomie, der Histopathologie und den hämatologischen Veränderungen sowie der Kultivierung des ISAV in SHK-1-Zellen und/oder dem Nachweis der Viren mittels Immunfluoreszenz in charakteristischen zellulären Veränderungen der Organe als Ergänzung bei einem untypischen Krankheitsgeschehen. Zur Bestätigung von positiven Befunden als auch zur primären Diagnostik wurde eine RT-PCR entwickelt. Die Methoden sind in der Entscheidung der Kommission 2001/183/EG zur Festlegung der Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen (2) vorgegeben Bekämpfung Die Inzidenz der ISA kann erfolgreich durch die Einführung von allgemeinen Maßnahmen, wie der Reglementierung des Fischtransports, einer obligatorischen Kontrolle der Bestände und der Schlachthäuser, reduziert werden. Gleichzeitig müssen spezifische Maßnahmen festgelegt werden, die infizierte, infektionsverdächtige und deren Nachbarfarmen betreffen. Die Schlachthaushygiene, das Rein-Raus-Prinzip in produzierenden Farmen sowie die Desinfektion von Abwässern aus Farmen, Schlachthäusern und der fischverarbeitenden Industrie müssen ebenfalls in die Bekämpfung einbezogen werden Zuständige Untersuchungseinrichtung Die virologischen Untersuchungen zum Nachweis der Freiheit der Fischbestände vom ISAV für die Anerkennung seuchenfreier Gebiete bzw. Fischfarmen und die Überwachung der Seuchenfreiheit werden in den zugelassenen, regionalen Untersuchungsämtern der Bundesländer durchgeführt. Die Bestätigung eines Ausbruches bzw. von ISA-Verdachtsfällen erfolgt am FLI Insel Riems im Nationalen Referenzlabor für ISA (NRL-ISA). Das NRL-ISA koordiniert die Diagnose der ISA auf der Grundlage der EU- und nationalen Gesetzgebung Rechtsgrundlage ISA ist eine anzeigepflichtige Tierseuche (2). Die Diagnose und Bekämpfung der ISA ist in Deutschland durch die "Verordnung zum Schutz gegen Süßwasserfisch-Seuchen, Muschelkrankheiten und zur Schaffung seuchenfreier Fischhaltungsbetriebe und Gebiete (Fischseuchen-Verordnung)" (3) geregelt. Diese Verordnungen dienen zur Umsetzung der Aquakultur- Richtlinie 2006/88/EG (1), die zur Harmonisierung der Diagnose und Bekämpfung von Fischseuchen innerhalb der Europäischen Union erlassen wurde. In Entscheidung 2001/183/EWG der Kommission (4) werden die Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zum Nachweis der 146

147 ISA festgelegt und ist für die Diagnose der ISA in der BRD verbindlich. Die Entscheidung wurde deshalb für die Erstellung der folgenden methodischen Hinweise zugrunde gelegt. Eine Anleitung zur Diagnose der ISA und weiterer, gegebenenfalls differentialdiagnostisch abzugrenzender, Fischkrankheiten findet man auch im "Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases" (5) des Office International des Epizooties (O.I.E.) von 2000 bzw. in der regelmäßig überarbeiteten Ausgabe Untersuchungsmaterial für die ISA-Überwachung Zeitplan Es wird eine Harmonisierung der Vorschriften zur Untersuchung auf VHS, IHN und ISA vorbereitet. Der Zeitplan für IHN und VHS soll auch für die ISA-Überwachung Gültigkeit besitzen Probennahme Histologische Proben Proben für histologische Untersuchungen werden von frisch getöteten Fischen, die deutliche klinische Zeichen der ISA zeigen, gewonnen. Fische mit vorhandenen äußeren und inneren pathologisch-anatomischen Organveränderungen sollten ebenfalls einzeln beprobt werden. In jedem Fall werden Proben von Leber, Mittelniere, Herz und Milz eines Fisches mit einem Skalpell herausgeschnitten und in 8- bis 10%igem neutralen Formalin fixiert. Das Verhältnis von Probe zu Fixativ sollte 1:20 betragen Proben für virologische Untersuchungen Material für die virologischen Untersuchungen wird von allen beprobten Fischen gewonnen. Teile von Leber, Kopfniere, Herz und Milz werden mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten und in ein Plastikgefäß mit 9 ml Transportmedium, z. B. Zellkulturmedium mit Antibiotikum, gegeben. Ein Kombination aus 12,5 µg Fungizone, 200 IU Polymyxine B und 200 µg Kanamycin pro ml Medium hat sich bewährt. Es können aber auch andere geprüfte Mischungen verwendet werden. Organteile von bis zu fünf Fischen können als Poolprobe in einem Plastikgefäß gesammelt werden. Das Gesamtgewicht der Poolprobe sollte etwa 1,0 +/- 0,5 g pro Gefäß nicht überschreiten Immunfluoreszenz vom Abklatschpräparat der Niere Ein Abklatsch der Niere darf nur vom frisch getöteten Fisch erfolgen. Dazu wird ein Teil der Mittelniere mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette herausgeschnitten. Das austretende Blut wird auf einer aufsaugenden Unterlage entfernt. Danach wird das Organstück wiederholt auf einen Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger gepresst, um eine Folge von Tupfpräparaten zu garantieren, die sich nicht überlappen sollten. Da Blut und Gewebsflüssigkeit den Test durch Koagulation stören können, wird das Präparat anschließend kurz auf eine aufsaugende Unterlage gedrückt. Das Abklatschpräparat soll lufttrocknen und anschließend bis zur Fixation, z. B. mit Aceton-Methanol Ratio 80:20, innerhalb von 72 h (nicht länger) kühl und trocken gelagert werden. 147

148 Proben für die Blutuntersuchung Von Fischen mit klinischen Zeichen einer Anämie wird nach Betäubung Heparinblut zur sofortigen Untersuchung von Parametern, wie z. B. die Bestimmung des Hämatokritwertes, gewonnen Proben für die RT-PCR Gewebe für die RT-PCR ist von allen untersuchten Fischen zu entnehmen. Dazu wird ein kleiner Teil der Kopfniere mit einem sterilen Skalpell entnommen und in ein Mikroröhrchen, welches 1 ml RNA-Stabilisierungslösung enthält, gegeben. Als Mittel der Wahl wird RNAlater (Ambion Inc., USA) empfohlen. Es können auch andere geprüfte RNA-Stabilisatoren mit gleicher Schutzwirkung verwendet werden. Gewebeteile von bis zu fünf Fischen können als eine Poolprobe in einem Mikroröhrchen gesammelt werden. Das Gesamtgewicht einer Poolprobe sollte 0,5 g nicht überschreiten. Im Fall der Beprobung von kleinen Fischen wird das empfohlene Gewicht von 0,5 g dadurch erreicht, indem zusätzlich Teile von Niere, Herz, Milz, Leber oder der Pylorusschläuche entnommen werden Versand von Probenmaterial Heparinisiertes Blut und Mikroröhrchen für virologische Untersuchung sowie für RT-PCR müssen in einem gekühlten Container (vorzugsweise eine dickwandige Polystyrol-Box mit Kühlaggregaten) versandt werden. Dabei ist zu sichern, dass die Kühlkapazität der Aggregate für die Transportzeit ausreichend ist und das Material gekühlt im Labor eintrifft. Ein Einfrieren des Materials ist unbedingt zu vermeiden. Ausnahmen können nur bei dem Material gemacht werden, welches für die RT-PCR verwendet wird. Durch das RNA-Schutzmedium kann die Probe bei -20 C oder darunter transportiert werden. Ein Auftauen ist dann zu vermeiden. Objektträger mit Abklatschpräparaten sollen im Objektträgerhalter oder -ständer mit ausreichendem Abstand zwischen den Objektträgern trocken und gekühlt versandt werden. Formalin-fixiertes Material für histologische Untersuchungen soll in auslaufsicheren Gefäßen in einem formalinresistenten Container (vorzugsweise eine dickwandige Polystyrol-Box) transportiert werden. Die virologischen Untersuchungen müssen schnellstmöglich begonnen werden, jedoch nicht später als 72 h nach der Probennahme. Ganze tote Fische sollten in einem aufsaugenden Papier eingeschlagen in einer Plastiktüte je nach Außentemperatur im Kühlcontainer oder ohne diesen versandt werden. Lebende Fische sollten entsprechend der Vorgaben der verantwortlichen Veterinärbehörde verschickt werden. Die RNA-stabilisierten Proben für die RT-PCR müssen entsprechend ihrer Lagerung bearbeitet werden. Für die RNA-Extraktion gelten folgende Grundregeln: Lagerung bei ( C) Bearbeitung nach 37 1 Tag 25 1 Woche 4 1 Monat -20 Länger als 1 Monat Alle Verpackungen sowie deren Beschriftung müssen den nationalen und internationalen Vorschriften entsprechen. 148

149 Gewinnung von zusätzlichem diagnostischem Material In Abstimmung mit dem diagnostischen Labor können auch andere Organe in unterschiedlicher Präparation gesammelt werden Untersuchungsgang Aufarbeitung der Proben für virologische Untersuchungen Wenn die gesammelten und gekühlten Proben nicht innerhalb von 72 h aufgearbeitet werden können, besteht die Möglichkeit, sie für 28 d bei -80 C einzufrieren. Das Probenmaterial darf vor der Untersuchung aber nur einem Gefrier-Tau-Zyklus unterzogen werden. Jede Poolprobe ist komplett mit entsprechenden Gerätschaften zu homogenisieren. Danach wird das Material zwischen 2000 bis 4000 g für 15 Min. bei 0 bis 6 C zentrifugiert, der Überstand filtriert (0,45 µm) und mit gleicher Menge eines Antiserums oder eines Pools von Seren gegen einheimische IPNV-Stämme (vorzugsweise Serotypen Ab und Sp) in geeigneter Verdünnung für 1 h bei 15 C inkubiert. Das Serum oder der Serum-Pool sollten einen Mindesttiter von 1:2000 im 50 % Plaque-Neutralisationstest gegen die IPNV aufweisen. Diese Suspension ist das Inokulum für die Zellkultur Animpfen der Zellkultur SHK-1-Zellen (weniger als 80 Passagen) oder ASK-Zellen sollen in L-15 Medium mit 5 % FKS, 2 % 200 mm L-Glutamin und 0,08 % 50 mm 2-Mercaptoethanol in 12-well Zellkultur- Platten wachsen. Es könne auch andere Zelllinien von gleicher geprüfter Effektivität und Empfänglichkeit für die Isolierung des ISAV verwendet werden. Das zu prüfende Material soll in eine aktiv wachsende Zellkultur inokuliert werden, wobei eine Endverdünnung des Gewebematerials zum Zellkulturmedium von 1:1000 erreicht werden sollte. Dazu sollte von jeder filtrierten Organanreibung 40 µl zu 2 ml Medium in eine Kavität der 12-well-Platte gegeben werden. Für jede Probennahmestelle auch innerhalb einer Farm ist eine separate 12- well-platte zu beimpfen. Als negative Kontrolle dient eine nicht beimpfte 12-well-Platte. Eine weitere separate 12-well-Platte wird mit einem Referenzstamm des ISAV beimpft (positive Kontrolle). Hier ist folgendermaßen vorzugehen: 100 µl ISAV mit einem Mindesttiter von 10 7 KID 50 /ml wird in der ersten Kavität in der oberen Reihe der Platte mit den 2 ml Medium gut gemischt. Die Platten sind bei 14 +/- 2 C bis zu 15 Tage zu inkubieren Mikroskopie Die Zellen sollen mindestens zweimal zwischen dem 5. bis 7. und dem 12. Bis 14. Tag nach der Inokulation mikroskopisch untersucht werden. Bei auftretenden CPE muss eine Virusidentifizierung mittels RT-PCR oder IFT erfolgen. Tritt innerhalb von 14 Tagen kein CPE auf, sollte ein Hämadsorptionstest durchgeführt werden Hämadsorption Die Zellkulturüberstände (ZKÜ) aller zu testender Kavitäten, positive und negative Kontrollen eingeschlossen, werden in sterilen Röhrchen abgefüllt. 500 µl einer 0,2%igen Lösung gewaschener Kaninchenerythrozyten oder einer 0,5%igen Suspension von gewaschenen 149

150 Regenbogenforellen oder Lachserythrozyten werden in jede Kavität gegeben und für 45 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Erythrozyten-Lösung abgenommen und die Kavitäten zweimal mit L-15-Medium gewaschen. Jede Kavität wird im Mikroskop betrachtet. Das Vorkommen von Erythrozyten-Ballungen an der Oberfläche der SHK-1-Zellen zeigt eine wahrscheinliche Infektion mit Orthomyxoviren an. Im positiven Fall ist eine Virusidentifizierung mittels RT-PCR oder IFT anzuschließen Subkultivierung oder Blindpassage Die Weiterpassage soll zwischen dem 13. bis 15. Tag post inoculationem (p.inoc.) erfolgen. Hierzu werden 225 µl des ZKÜ in eine frische SHK-1- oder ASK-Zelle auf einer 12-well- Platte überimpft. Diese wird dann bei 14 +/- 2 C für 14 bis 18 Tage bebrütet. Unter dem Mikroskop wird die Zelle am 5. bis 7. sowie am 14. bis 18. Tag auf CPE kontrolliert. Im positiven Fall ist eine Virusidentifizierung anzuschließen. Falls kein CPE zu beobachten ist, sollte ein Hämadsorptionstest durchgeführt werden. Falls das Inokulum zytotoxische Reaktionen in der Zelle vor dem 7. Tag p.inoc. induziert, ist eine sofortige zweimalige Subkultivierung für 14 bis 18 Tage anzuschließen. Tritt die Zytotoxizität nach dem 7. Tag p.inoc. auf, dann ist nur einmal zu subkultivieren. Die Dauer für beide Passagen sollte 28 bis 36 Tage von der primären Inokultion nicht überschreiten. Sind bakterielle Kontaminationen in der primären Kultur zu erkennen, muss die Probe erneut aus dem bei -80 C eingefrorenem Material angezüchtet werden. Vor der Inokulation in die Zellkultur ist das Homogenisat zu zentrifugieren (4000 g, 30 Min., 0 bis 6 C) und der Überstand zu filtrieren (0,22 µm Filter). Ist eine der Subkultivierungen bakteriell kontaminiert, dann ist der ZKÜ ebenfalls zu filtrieren (0,22 µm) und das Filtrat in eine frische Zellkultur zu inokulieren. Diese Passage wird für weitere 14 bis 18 Tage bei 14 +/- 2 C inkubiert Methoden der Virusidentifizierung Wenn ein CPE in der Zellkultur aufgetreten bzw. der Hämadsorpionstest positiv ausgefallen ist, muss eine Virusidentifizierung folgen. Als Methoden der Wahl zur Identifizierung des ISAV stehen dabei der Immunfluoreszenztest (IFT) und die RT-PCR zur Verfügung. Falls andere Viren (z. B. VHSV, IHNV, IPNV) vermutet werden, sind diese durch geeignete Test s zu identifizieren. Werden die Viren innerhalb einer Woche nicht eindeutig identifiziert, ist ZKÜ der betreffenden Kulturen an das NRL-FK Insel Riems bzw. an das EU-Referenzlabor für Fischkrankheiten (Aarhus, Dänemark) zu übersenden IFT Die Zellen werden mit dem beschriebenen Medium in 24-well-Platten angezüchtet, infiziert und mikroskopisch beobachtet, bis ein konfluenter CPE von 50 % auftritt. Dazu werden 225 µl des fraglich virushaltigen ZKÜ s in zwei Kavitäten gegeben und gemischt. Aus dieser Suspension werden wiederum 225 µl in zwei weitere Kavitäten überpipettiert (Verdünnung 1:5). Zwei unbeimpfte Kavitäten dienen als negative Kontrolle. Pools von Entnahmestellen einer Fischfarm bzw. Pools von unterschiedlichen Fischfarmen sollen auf separaten Platten angezüchtet werden. Eine weiter separat zu behandelnde Platte dient nach Animpfung mit einem ISAV-Referenzstamm (z. B. Stamm Glesvaer, Norwegen) als positive Kontrolle. Die bei 14 +/- 2 C inkubierten Platten werden ab dem 7. Tag p.inoc. täglich mikroskopisch untersucht. Wird ein CPE beobachtet bzw. ist bis zum 7. Tag kein CPE vorhanden, ist die Platte zu fixieren. Der ZKÜ wird abgenommen und die Platte ist mit PBS zu waschen. Danach werden die Zellen mit einem Azeton-Methanol-Gemisch (Ratio 80:20) für 20 Min. bei Raumtemperatur fixiert. Die anschließend luftgetrockneten Platten werden sofort weiter ver- 150

151 arbeitet. Sie können auch nach einer Lagerung von 24 h bei 0 bis 6 C für den IFT genutzt werden. Der Doppelansatz der Kavitäten mit beiden ISAV-Verdünnungen werden mit dem monoklonalen Antikörper (mak) 3H6F8 (Dr. Knut Falk, Norwegen) oder mit anderen mak s der gleichen geprüften Effektivität und Empfindlichkeit in der angegebenen Verdünnung (PBS) überschichtet (z. B. FLI Insel Riems, Dr. Malte Dauber) und für 30 Min. bei 37 C inkubiert. Der ungebundene mak wird durch Waschen entfernt. Anschließend wird ein in PBS verdünntes anti-maus-fitc-konjugat zu den Kavitäten gegeben und für 30 Min. bei 37 +/- 4 C inkubiert. Die Verdünnung für den mak und das Konjugat sollte in jedem Labor ausgetestet werden. Alle Waschungen werden mit einer PBS-Tween-20-Lösung (0,05 % Tween 20, PBS- T) durchgeführt. Die Reaktion ist im geeigneten Fluoreszenzmikroskop mit den passenden Filtern für FITC zu beurteilen. Die Reaktion ist positiv, wenn fluoreszierende Zellen (Zellverband oder Einzelzellen) beobachtet werden. Der Test wird als gültig angesehen, wenn die positiven und negativen Kontrollen die erwarteten Reaktionen zeigen Untersuchung von Abklatschpräparaten der Niere mit der IFT Das folgende Protokoll wurde zur Untersuchung von Abklatschpräparaten der Niere in der IFT ausgearbeitet Präparation und Färbung der Abklatschpräparate Die Objektträger sollen mit Methanol/Azeton (1:1) für 3 Min. fixiert und anschließend luftgetrocknet werden. Vor der Färbung muss jeder Objektträger untersucht werden und die Nierenabklatsche sollen mit einem Stift (z. B. Pap Pen oder ImmEdge TM ) eingerahmt werden. Nach der Trocknung werden die Objektträger mit einer Blockierungslösung (6 % Trockenmagermilchpulver in PBS-T) überschichtet und unter leichtem Schütteln für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger sollen sich in einer feuchten Kammer befinden und immer feucht gehalten werden. Nach dem Absaugen der Blockierungslösung wird jeder Objektträger mit dem anti-isav-mak 3H6F8 (oder einem anderen geprüften mak) in einer Verdünnung von 1:10 und 1:100 mit 1 % Trockenmagermilchpulver im Verdünnungspuffer überschichtet (für jede Charge ist die optimale Verdünnung der mak s in jedem Labor zu ermitteln). Diese werden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend sind die Objektträger 3 x für 2 Min. mit PBS-T (0,1 % Tween 20) zu waschen. Die Objektträger sind nun mit einem FITC-Konjugat (z. B. Ziege-anti-Maus-Ig-FITC) in der ermittelten Verdünnung (z. B. 1:1000) im Verdünnungspuffer mit 1 % Trockenmagermilchpulver zu überschichten und für 1 h in einer feuchten Kammer zu inkubieren. Danach werden die Objektträger wieder 3 x gewaschen wie bereits angegeben. Jeder Objektträger wird nun mit einer Mischung von CI- TIFLOUR TM -Lösung (500 µl CITIFLOUR TM ) und 1,5 ml PBS-T (0,1 % Tween 20) für 10 Min. überschichtet und wiederum 3 x für 2 Min. gewaschen. Jetzt werden die Objektträger mit einer Propidiumjodid-Lösung (0,01 mg/ml) in PBS-T (0,1 % Tween 20) beschichtet und für 3 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgt eine weitere Waschung 3 x für 2 Min. Am Ende wird die Flüssigkeit um die Abklatschpräparate mit einem saugfähigen Material entfernt und der Objektträger mit CITIFLOUR TM überschichtet. Die Objektträger sind bis zur Untersuchung bei 4 C in Dunkelheit zu lagern. 151

152 Beurteilung der Reaktion im Fluoreszenzmikroskop Jeder Objektträger wird in einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop mit einem geeigneten Filter, der FITC anregt, beurteilt. Alle eingerahmten Gebiete auf dem Objektträger werden mit einer 10-fachen und 20-fachen Vergrößerung untersucht. Die verdächtig erscheinenden Abklatschpräparate werden mit einer 40fachen Vergrößerung erneut beurteilt, um die Zellverbundenheit der Fluoreszenz besser zu bestätigen. Mindestens eine weitere Person sollte im positiven Fall das gefundene Ergebnis bestätigen. Dies gilt auch für positive Fluoreszenz auf weiteren Objektträgern Kontrollen für die IFT Wenigstens 3 Kontrollen sollten ständig mitgeführt werden: - 1. neg. Kontrolle: Nierenabklatsch von einem gesunden Fisch (Lachs) - 2. neg. Kontrolle: eine nicht infizierte Zellkultur (oder eine andere für ISAV empfängliche Zelle) - 3. pos. Kontrolle: ISAV-inf. Zellkultur Falls möglich, sollte ein Abklatschpräparat von einem mit ISAV infizierten Lachs als weitere positive Kontrolle mitgeführt werden. Wenn eine der negativen Kontrollen positiv bzw. die positive Kontrolle nicht reagiert, ist die gesamte Untersuchungsreihe zu verwerfen und der Test ist erneut mit den Duplikaten der Abklatschpräparate durchzuführen Untersuchung andere Gewebe in der IFT Die gleiche Methode kann auch bei anderen Geweben wie Leber, Milz, Herz und, wenn in ausreichendem Maße vorhanden, auch mit Endothelzellen oder Leukozyten durchgeführt werden. Die Markierung der mak s mit dem FITC-Konjugat erfolgt nach den gleichen Prinzipien wie vorher beschrieben, wobei bei einigen Geweben die Propidiumjodid-Färbung weggelassen werden sollte Histologie Paraffinschnitte sollten ca. 5 µm dick sein und dann HE-gefärbt werden. Die Charakteristik der Veränderungen durch im histologischen Schnitt wurde bereits beschrieben. Bezugsquellen für diagnostische Reagenzien und Zellkulturen Kommerziell erhältliche Diagnostika: BioX Diagnostics S.P.R.L., Belgien, Anti-ISAV Monoklonaler Antikörper (in Deutschland zur Diagnose der ISA zugelassen) Referenzviren, im Handel nicht erhältliche Diagnostika und Zelllinien: Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer 10 D Greifswald Insel Riems Institut für Infektionsmedizin, Zellbank: Zelllinie SHK-1 (salmon haed kidney) Zelllinie ASK (atlantic salmon kidney) Anti-ISAV mak von Knut Falk (Oslo) oder Malte Dauber (Insel Riems) 152

153 Literatur 1. Richtlinie 2006/88/EG des Rates vom 24. Oktober 2006 mit Gesundheits- und Hygienevorschriften für Tiere in Aquakultur und Aquakulturerzeugnisse und zur Verhütung und Bekämpfung bestimmter Wassertierkrankheiten. Amtsblatt der EU Nr. L 328 vom 24. Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG (1) gelten 11.06, S Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 23. Mai 1991 (BGBl. I, S. 1178) 3. Verordnung zum Schutz gegen Süßwasserfisch-Seuchen, Muschelkrankheiten und zur Schaffung seuchenfreier Fischhaltungsbetriebe und Gebiete (Fischseuchen- Verordnung) Neufassung vom 3. November 2004 (BGBl. I S. 2754) 4. Entscheidung der Kommission 2001/183/EG vom 22. Februar 2001 zur Festlegung der Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen und zur Aufhebung der Entscheidung 92/532/EWG. Amtsblatt der EU Nr. L 56 vom , S OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Fifth Edition 2006, World Organisation for Animal Health, Paris. 153

154 21. Infektiöse Hämatopoetische Nekrose der Forellen (IHN) Virale Hämorrhagische Septikämie der Forellen (VHS) Charakterisierung der Infektionen Die VHS (Viral Haemorrhagic Septicaemia), auch bezeichnet als "Forellenseuche" oder Egtved-Krankheit, und die IHN (Infectious Haematopoietic Necrosis) verursachen in Europa große wirtschaftliche Schäden durch Verluste bis zu 100 %, vor allem bei in der Aquakultur gehaltenen Regenbogenforellen. Die Strategie der Europäischen Union zur Bekämpfung dieser Fischseuchen besteht in der weiteren Zurückdrängung der Krankheiten durch regelmäßige Überwachung der Fischbestände und darauf basierende gesetzliche Maßnahmen, wie die tierseuchenrechtliche Erklärung nachweislich seuchenfreier Fischhaltungsbetriebe, Gebiete oder Länder verbunden mit Handelsbeschränkungen für Fische aus nichtzugelassenen Beständen. Bei amtlicher Feststellung der IHN oder VHS in einem Fischhaltungsbetrieb sind die seuchenkranken oder seuchenverdächtigen Fische zu töten und unschädlich zu beseitigen Erreger Die Erreger dieser Fischseuchen, das VHSV und das IHNV, gehören zur Familie Rhabdoviridae, Genus Novirhabdovirus. Das Genom der Rhabdoviren besteht aus einer nichtsegmentierten RNS negativer Polarität mit einer Länge von etwa Basenpaaren, das bei den Fisch-Rhabdoviren für 6 Strukturproteine codiert. Die bisher in Europa isolierten VHSV werden in 3 bzw. 4 Serotypen eingeteilt. Die für die Mehrzahl der VHS-Ausbrüche in der Aquakultur Europas verantwortlichen Isolate werden dem Serotyp 1 (F1) oder bei Neutralisation mit monoklonalen Antikörpern (mak) der Gruppe I zugeordnet. IHNV-Isolate sind serologisch einheitlich, nur mit mak lassen sich Unterschiede feststellen. Auf der Grundlage der Gensequenz werden die Isolate in Genogruppen zusammengefasst. VHSV-Isolate mariner Spezies können serologisch nicht von den Süßwasser-Isolaten unterschieden werden. Durch Genomanalyse ist eine Abtrennung der marinen VHSV-Isolate möglich Klinische und pathologisch-anatomische Symptomatik VHSV und IHNV replizieren sich u. a. in den Endothelzellen der Blutkapillaren, den Leukozyten, in Zellen der hämatopoetischen Organen und der Niere. Das klinisches Bild einer VHS ist definiert als eine mit Ödemen und Hämorrhagien einhergehende Krankheit mit folgenden Kriterien: Lethargie und sporadische Hyperaktivität, Dunkelverfärbung, Exophthalmus, Anämie, Auftreiben des Leibes (durch Aszites), Pseudofaeces (lange weißliche, aus dem Rektum heraushängende Auswürfe), Hämmorrhagien, vorrangig an den Flossenansätzen. Die klinischen Symptome werden unter natürlichen Bedingungen bei Wassertemperaturen von 4 bis 14 C ausgebildet. Bei perakuten Todesfällen können diese Symptome fehlen. 154

155 Die Inkubationszeit beträgt bei Wassertemperaturen von 8 bis 10 C etwa 7 Tage. Sie ist abgängig vom Alter der Fische, von der Wassertemperatur, von der Infektionsdosis und von der Virulenz des Virus. Bei einem VHS-Ausbruch in einer bis dahin virusfreien Population unterscheidet man gewöhnlich 3 Phasen. An die erste, akute Phase, gekennzeichnet durch hohe Fischverluste in einer relativ kurzen Zeit, schließt sich eine zweite Phase mit chronischem Verlauf an. In der dritten, sogenannten "nervösen" Phase zeigen die Fische zentralnervöse Störungen, die durch Drehung um die Längsachse oder plötzliche, spiralförmige Schwimmbewegungen der Fische gekennzeichnet ist. Das klinische Bild einer IHN ist charakterisiert als eine ebenfalls mit Ödemen und Hämorrhagien einhergehende Krankheit mit den gleichen Symptomen: Lethargie und sporadische Hyperaktivität, Dunkelverfärbung, Exophthalmus, Anämie, Auftreiben des Leibes (durch Aszites), Pseudofaeces (lange weißliche, aus dem Rektum heraushängende Auswürfe), Hämmorrhagien, vorrangig an den Flossenansätzen. Die klinischen Symptome werden bei Wassertemperaturen von 8 bis 15 C ausgebildet. Bei perakuten Todesfällen können die Symptome fehlen. Die Inkubationszeit beträgt 5 bis 15 Tage und ist auch abgängig vom Alter der Fische, von den Wassertemperaturen, von der Infektionsdosis und von der Virulenz des Erregers. Die auffälligsten klinischen bzw. pathologisch-anatomischen Symptome bei beiden Krankheiten sind Absonderung der Fische vom Schwarm, Dunkelverfärbung der Haut und Exophthalmus sowie vielfältige hämorrhagische Diathesen und katarrhalische Enteritis. Aufgrund klinischer und pathologisch-anatomische Symptomatik lassen sich VHS und IHN nicht unterscheiden Vorkommen Die VHS hat als Infektionskrankheit vor allem Bedeutung bei Salmonidenarten. Als VHSVempfänglich gelten nach der Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG (1): Hering (Clupea spp.), Felchen (Coregonus sp.), Hecht (Esox lucius), Schellfisch (Gadus aeglefinus), Pazifischer Kabeljau (Gadus macrocephalus), Dorsch (Gadus morhua), Pazifischer Lachs (Oncorhynchus-Arten), Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), Seequappe (Onos mustelus), Forelle (Salmo trutta), Steinbutt (Scophthalmus maximus), Sprotte (Sprattus sprattus) und Esche (Thymallus thymallus). Bei Wildfischen wurden natürliche Epizootien aber selten festgestellt. Große Bedeutung haben die für VHS empfänglichen Wildfische allerdings als Carrier und Überträger des Virus. In den letzten Jahren wurden von zahlreichen marinen Spezies aus dem nordamerikanischen Teil des Pazifischen Ozeans, aus dem Nordatlantik und aus der Ostsee VHS-Viren isoliert. Eine zentrale Stellung bei den Infektketten nimmt der Hering (Clipea pallasi, Clupea harengus) ein. VHSV wurden auch nachgewiesen bei der Japanischen Flunder (Paralichthys olivaceus). Die marinen Isolate gelten bisher für Süßwasserfische als nicht oder nur schwach virulent. IHN ist eine Infektionskrankheit der Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss), verschiedener Pazifischer Lachse und des Atlantischen Lachses (Salmo salar). Nach der EU-Richtlinie 155

156 2006/88/EG (1) gelten als IHN-empfänglich: Keta-Lachs (Oncorhynchus keta), Silberlachs (O. kisutch), Japan-Lachs (O. masu), Regenbogenforelle (O. mykiss), Rotlachs (O. nerka), Biwa-Forelle (O. fhodurus), Königslachs (O. tshawytscha) und Atlantischer Lachs (Salmo salar). Die Bachforelle (Salmo trutta fario) gilt als IHN-widerstandsfähig, wenngleich nicht völlig resistent. In der Vergangenheit war das Vorkommen der IHN auf die pazifische Küste Nordamerikas begrenzt. Die Krankheit hat sich später durch den Handel mit infizierten Fische oder Eiern auch nach Europa und Fernost ausgebreitet Diagnostische Indikation Wird als Ergebnis der klinischen und pathologisch-anatomischen Untersuchung oder aufgrund epizootiologischer Erhebungen der Verdacht des Ausbruchs der IHN oder VHS geäußert, sind Fische an die zuständige diagnostische Einrichtung zur virologischen Prüfung einzusenden. Nach der Fischseuchenverordnung hat der Betreiber eines Fischhaltungsbetriebes seinen Fischbestand mindestens einmal jährlich nach näherer Anweisung der zuständigen Behörde tierärztlich klinisch und virologisch untersuchen zu lassen. Für die Erstzulassung oder Aufrechterhaltung der Zulassung seuchenfreier Gebiete oder Fischhaltungsbetriebe sind die Bestände i. d. R. zweimal jährlich klinisch zu untersuchen, und es sind gemäß den Vorschriften Fische zur Probengewinnung zu entnehmen. In den folgenden methodischen Hinweisen wird zwischen den Probenahme- und Analyseverfahren zur VHS- und IHN-Überwachung und den Maßnahmen zur Isolierung und Identifizierung von VHSV und IHNV aus Fischen bei Ausbruch oder Verdacht des Ausbruchs der VHS bzw. IHN unterschieden Zuständige Untersuchungseinrichtungen Die virologischen Untersuchungen zum Nachweis der Freiheit der Fischbestände von diesen Krankheitserregern für die Anerkennung seuchenfreier Gebiete bzw. Fischhaltungsbetriebe bzw. zur Überwachung der Seuchenfreiheit sowie zur Bestätigung von IHN- bzw. VHS- Verdachtsfällen werden in den zugelassenen, regionalen Untersuchungsämtern der Bundesländer durchgeführt. Das Nationale Referenzlaboratorium für IHN und VHS am Friedrich- Loeffler-Institut auf der Insel Riems koordiniert die Diagnose von Fischseuchen auf der Grundlage der EU- und nationalen Gesetzgebung. Zur Klärung fraglicher Befunde oder zur Bestätigung der Ergebnisse der regionalen Diagnoselaboratorien bei Ausbruch einer Fischseuche in einem als seuchenfrei erklärten Bestand oder Gebiet sind die Virusisolate zur Identifizierung oder weiteren Charakterisierung, z. B. Genomanalyse, an das Referenzlabor einzusenden. Repräsentative Isolate werden an das EU-Referenzlaboratorium übergeben, das die Diagnose der Fischseuchen auf EU-Ebene koordiniert Rechtsgrundlage IHN und VHS sind anzeigepflichtige Tierseuchen (2). Die Diagnose und Bekämpfung der VHS und IHN sind in Deutschland durch die "Verordnung zum Schutz gegen Süßwasserfisch-Seuchen, Muschelkrankheiten und zur Schaffung seuchenfreier Fischhaltungsbetriebe und Gebiete (Fischseuchen-Verordnung)" (3) geregelt. Diese Verordnungen dienen zur Umsetzung der Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG, die zur Harmonisierung der Diagnose und Bekämpfung von Fischseuchen innerhalb der Europäischen Union erlassen wurden (1). Die Entscheidung 2001/183/EWG der Kommission in der jeweils gültigen Fassung (4), in der die Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Überwachung und zum Nachweis der VHS und IHN festgelegt sind, ist für die Diagnose dieser Fischseuchen in Deutschland verbindlich und 156

157 wurde deshalb für die Erstellung der folgenden methodischen Hinweise zugrunde gelegt. Dabei sind die anzuwendenden Methoden zum Nachweis von VHSV und IHNV identisch. Eine Anleitung zur Diagnose der VHS, IHN und weiterer, gegebenenfalls differentialdiagnostisch abzugrenzender, Fischkrankheiten findet man auch im "Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases" (5) des Office International des Epizooties (O.I.E.) von 2006 bzw. in der regelmäßig überarbeiteten Ausgabe Untersuchungsmaterial (für die VHS- und IHN-Überwachung) Zeitplan In den Fischhaltungsbetrieben sind mindestens einmal, zum Erlangen oder Aufrechterhaltung der Zulassung i. d. R. zweimal jährlich (zwischen Oktober und Juni bzw. dann, wenn die Wassertemperatur unter 14 C liegt; Abstand zwischen den Untersuchungen mindestens 4 Monate) klinische Untersuchungen durchzuführen. Festlegungen, einschließlich Probenahme, für die Überwachung von Betrieben oder Gebieten im Hinblick auf die Erstzulassung oder die Aufrechterhaltung der Zulassung als VHS- und/oder IHN-frei sind aus der EU-Entscheidung 2001/183/EG (4) zu entnehmen. Alle Produktionseinheiten (Teiche, Rinnen, Behälter, Netzkäfige usw.) werden auf verendete, geschwächte oder verhaltensgestörte Fische kontrolliert. Besondere Beachtung ist nach Möglichkeit dem Wasserabflussbereich zu widmen, in dem sich geschwächte Fische strömungsbedingt meist aufhalten Wahl und Entnahme der Proben Für die Untersuchung gemäß Fischseuchenverordnung oder Entscheidung 2001/183/EG (4) werden Organ- und/oder Ovarialflüssigkeitsproben entnommen. Sind Regenbogenforellen im Bestand, sollte der gesamte Probenumfang von dieser Fischart entnommen werden. Ansonsten muss die Probe Fische aller für VHS- und/oder IHNempfängliche Arten des Betriebes umfassen. Jede Fischart muss in der Probe proportional vertreten sein. Wird für die Fischproduktion mehr als eine Wasserquelle verwendet, so müssen bei der Probenahme alle Wasserquellen berücksichtigt werden. Die Probe sollte bevorzugt geschwächte, verhaltensgestörte, moribunde oder soeben verendete Fische (ohne Anzeichen der Zersetzung) umfassen. Fehlen solche Fische, so muss sich die Probe proportional aus normal erscheinenden, gesunden Fischen aller Produktionseinheiten des Betriebes sowie aller Jahrgänge zusammensetzen. Dauer des Überwachungsprogrammes und Probenumfang sind aus der Entscheidung 2001/183 (4) zu entnehmen. Für Untersuchungen gemäß Fischseuchenverordnung sollte die zu untersuchende Probe bei Brütlingen aus mindestens 20, bei Fischen über 5 cm Länge aus mindestens 10 Fischen bestehen Aufbereitung und Einsendung der Proben Unter sterilen Kautelen entnommene Organe (Milz, Kopf- bzw. Vorderniere, Herz oder Gehirn) und/oder Ovarialflüssigkeit sind in ein steriles Kunststoffröhrchen zu füllen, das ein steriles Transportmedium (Zellzuchtmedium für Fischzelllinien mit 10 % Kälberserum und 157

158 Antibiotika, z. B. 200 I.E. Penicillin, 200 µg Streptomycin und 200 µg Kanamycin oder 50 µg Enrofloxacin pro ml) enthält. Ovarialflüssigkeit oder Organteile von höchstens 10 Fischen können als Sammelprobe (mindestens 0,5 g) in je ein 10 ml-kunststoffröhrchen gefüllt werden, das 4 ml Transportmedium enthält. Die Röhrchen sind in Isolationsbehälter (z. B. dickwandige Styroporkästen mit Eis oder Kühlelemente) zu packen, um zu sichern, dass die Proben beim Transport zum Labor bei einer Temperatur von 0 bis 5 C gehalten werden. Ein Anfrieren ist zu vermeiden. Während des Transportes darf die Temperatur zu keiner Zeit mehr als 10 C betragen. Bei der Ankunft sollten im Transportbehälter noch Eis oder gefrorene Kühlelemente vorhanden sein. Mit der virologischen Untersuchung ist so schnell wie möglich zu beginnen, spätestens jedoch 48, in Ausnahmefällen 72 Stunden nach der Entnahme, sofern das Untersuchungsmaterial durch das Transportmedium geschützt war und die Temperaturanforderungen während der Beförderung erfüllt wurden. Dauert der Transport länger als 48 Stunden, müssen die Proben gefroren (weniger als -10 C) transportiert werden. Dabei darf die Kühlkette bis zum Eintreffen im Labor nicht unterbrochen werden. Fische können unzerteilt (ganz) zum Labor gesandt werden, sofern die Temperaturanforderungen während der Beförderung erfüllt werden können. Ganze Fische müssen, unter Umständen mit saugfähigem Papier umhüllt, auslaufsicher verpackt werden Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial Im Einvernehmen mit dem Diagnoselaboratorium kann weiteres Probenmaterial entnommen und für weitere Untersuchungen aufbereitet werden Untersuchungsgang (für die VHS- und IHN-Überwachung) Aufbereitung der Proben für die virologische Untersuchung Nach Homogenisieren (z. B. Stomacher, Mixer, Mörser, Mikrohomogenisatorstempel) wird der Organbrei im Volumenverhältnis von 1:10 in dem ursprünglichen Transportmedium suspendiert. Ganze Fische mit weniger als 6 cm Länge werden nach Entfernung des hinter der Darmöffnung liegenden Körperteils in toto homogenisiert. Das Homogenisat wird bei 2000 bis 4000 g und 2 bis 5 C für 15 Min. abgeschleudert. Wurde die Probe nicht in einem antibiotikahaltigem Medium versandt, ist der Überstand für 4 Stunden bei 15 C oder über Nacht bei 4 C antibiotisch (z. B. 1 mg/ml Gentamycin) zu behandeln. Bakteriell kontaminierte Proben können filtriert werden. Erfolgt die virologische Untersuchung ausnahmsweise nicht sofort oder für Wiederholungsuntersuchungen kann die Probe bei -80 C gelagert werden. Die Untersuchung ist aber innerhalb von 14 Tagen vorzunehmen. Um einen IPNV-bedingten CPE auszuschließen, kann der Überstand vor der Zellkultur- Beimpfung mit IPNV-Antiseren (Titer im 50 %-Plaquetest mindestens 1:2000 gegen die einheimischen IPNV-Serotypen) gemischt und für mindestens 1 Stunde bei 15 C oder für höchstens 18 Stunden bei 4 C inkubiert werden. 158

159 Virologische Untersuchung Zellkulturen und Nährmedien BF-2- oder RTG-2- und EPC- oder FHM-Zellen werden bei 20 bis 30 C mit geeigneten Medien (z. B. Eagles Minimum Essential Medium) bei Notwendigkeit mit 10 % Rinderfetenserum und Antibiotika in Standardkonzentrationen angezüchtet. Die Medien sind bei Zellvermehrung in geschlossenen Flaschen mit Bikarbonat oder bei Zellzüchtung in offenen Systemen (z. B. Zellzuchtplatten) mit Tris-HCl (23 mm) und Natriumbikarbonat auf einen Wert von möglichst genau 7,6 zu puffern. Zum Zeitpunkt der Beimpfung sollten die Zellkulturen frisch (4 bis 48 Stunden alt) und noch nicht zusammengewachsen (Zellen vermehren sich noch) sein. Die Empfänglichkeit (Infektionsanfälligkeit) der Zellkulturen ist alle 6 Monate durch Titration mit tiefgefroren gelagerten VHS- und IHN-Referenzvirusproben zu überprüfen Beimpfen der Zellkultur Die mit Antibiotika versetzte Organsuspension wird unverdünnt und 1:10 verdünnt auf die Zellkultur gegeben, wobei das Verhältnis Inokulum : Zellkulturmedium etwa 1:10 betragen sollte. Dadurch entsteht eine Endverdünnung des Organmaterial im Zellkulturmedium von etwa 1:100 und 1:1000. Es sind mindesten 2 Zelllinien zu beimpfen. Für jede Verdünnungsstufe und Zelllinie ist eine Zellkulturfläche von mindestens 2 cm 2 (entspricht einer Mulde einer 24-Well- Zellkulturplatte) zu verwenden Bebrüten der Zellkulturen Die beimpften Zellkulturen sind für 7 bis maximal 10 Tage zu bebrüten. Bei Übersäuerung des Mediums ist der ph-wert mit steriler Bikarbonatlösung zu korrigieren. Die Zellkulturen sind täglich auf das Auftreten eines CPE zu prüfen. Bei offenkundigem CPE ist ein Virusnachweis durchzuführen Subkultivierung Tritt nach 7- bis 10-tägiger Erstbebrütung kein CPE auf, so ist die Stammkultur auf frische Zellkulturen abzuimpfen, wobei eine ähnliche Zellfläche zu verwenden ist wie bei der Stammkultur. Die Zellen können durch einen Gefrier-Tau-Prozess zerstört werden. Aliquote Volumina von sämtlichen Kulturen (Flaschen oder Mulden) jeder Zelllinie werden zu einer Sammelprobe vereint. Die Sammelproben werden wie vorn beschrieben unverdünnt und 1:10 verdünnt im Verhältnis 1:10 (wodurch Endverdünnungen des Überstandes von 1:10 bzw. 1:100 erreicht werden) in homologe Zellkulturen verimpft. Vor dem Abimpfen können die Sammelproben mit IPNV-Antiserum gemäß Punkt inkubiert werden. Die Passagen werden erneut bei 15 C für 7, maximal 10 Tage bebrütet. Tritt bei der Stammkultur ein toxischer CPE innerhalb der ersten 3 Tage des Bebrütens auf, so ist die Kultur in diesem Stadium zu passagieren. Jedoch muss diese Passage für 7 Tage und die 3. Passage nach erneuter Abimpfung für weitere 7 Tage bebrütet werden. Wenn sich der toxische CPE später als 3 Tage entwickelt, so sollte die Stammkultur nur einmal abgeimpft werden und so lange bebrütet werden, dass eine Gesamtzeit von 14 Tagen ab der Erstbeimpfung erreicht wird. In den letzten 7 Tagen des Bebrütens sollte keine Toxizität mehr auftreten. 159

160 Virusnachweis Virusnachweisverfahren Bei offenkundigem Auftreten eines CPE erfolgt die Virusidentifizierung mit einem oder mehrerer der folgenden Verfahren: Virusneutralisationstest, Immunfluoreszenztest, Enzymimmuntest. Haben diese Tests nach einer Woche keinen eindeutigen Virusnachweis erbracht, ist das Isolat an das nationale Referenzlaboratorium für Fischkrankheiten einzusenden. Die zum Virusnachweis verwendeten Diagnostika müssen bezüglich Qualität, Titer und Spezifität vom nationalen Referenzlaboratorium zugelassen sein Virusneutralisation (VNT) Das zellfreie (Zentrifugation bei 2000 bis 4000 g oder Filtration mit 0,45 µm-membranfilter), virushaltige Medium wird 1:1000 und 1:10000 verdünnt. Aliquote Mengen der Verdünnungen werden jeweils mit folgenden Reagenzien versetzt und für 60 Minuten bei 15 C bebrütet: - gruppenspezifische VHSV (Egtved-Virus)-Antikörper, 1:50 verdünnt*, - gruppenspezifische IHNV-Antikörper, 1:50 verdünnt*, - spezifisches Antiserum (gepoolt) gegen einheimische IPNV-Serotypen (Referenzstämme Sp, Ab, VR299), 1:50 verdünnt*, - Zellkulturmedium. (* oder wie vom Hersteller oder vom Referenzlabor angegeben) Von jedem Virus-Serum-Gemisch werden 50 µl in mindestens 2 Kavitäten einer 24-Well- Zellkulturplatte (oder im Verhältnis von etwa 1:10 in andere Zellzuchtbehältnisse) verimpft und bei 15 C bebrütet. Alternativ können auch andere erprobte Neutralisationsteste angewandt werden Immunfluoreszenztest (IFT) Für jedes Isolat sind jeweils 8 (12) Kavitäten (Multitest-Objektträger, 24-, 48- oder 96-Well- Zellkulturplatten) oder Deckgläser mit Zellsuspension (EPC-Zellen haften besonders gut auf Glasflächen) zu versehen. Sobald sich die Zellen auf dem Untergrund angeheftet haben (nach etwa 1 Stunde) oder nach 24-stündiger Inkubation werden je 4 (6) Kulturen in einem Volumenverhältnis von 1:10 und 1:100 mit dem zu identifizierenden Isolat beimpft. Frühestens nach einer Bebrütungsdauer von 20 Stunden können die Kulturen gespült, mit Azeton oder durch Hitze (60 Minuten bei 70 C) fixiert und z. B. in einem Zweischichten-IFT (indirekter IFT) angefärbt werden. Die erste Reagenzschicht besteht aus poly- oder monoklonalen Antikörpern gegen IHNV und VHSV (sowie IPNV). Die zweite Reagenzschicht ist ein FITCmarkiertes Antiserum gegen das in der ersten Schicht verwendete Immunglobulin. Für jeden zu prüfende Antikörper sind mindestens 2 hochdosierte und 2 niedrigdosierte Impfkulturen anzufärben. Bei der Untersuchung sind geeignete Negativ- und Positivkontrollen mitzuführen. Alternativ können auch andere IFT-Techniken (Zellsysteme, Fixierung, Antikörper, direkte Verfahren) angewandt werden Enzymimmuntest (ELISA) Beispielsweise kann ein ELISA auf Biotin-Streptavidin-Basis angewandt werden. Am Vortag der Untersuchung werden die einzelnen Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatte mit über 160

161 Protein-A-Säulen gereinigte Antikörper (Fangantikörper) in der empfohlenen und geprüften Verdünnung beschichtet. Gefolgt vom Waschen mit PBS-Tween-20-Puffer werden die Vertiefungen mit dem zu bestimmenden Virus in der Verdünnung 1:2 oder 1:4 beschickt und für 60 Minuten bei 37 C inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Tween-20-Puffer werden biotinierte, spezifisch gegen das gesuchte Virus gerichtete Antikörper zugegeben und für 60 Minuten bei 20 C inkubiert. Nach nochmaligem Waschen, wie vorstehend beschrieben, wird POD-konjugiertes Streptavidin zugegeben und die Mikrotestplatte für eine Stunde bei 20 C inkubiert. Die Mikrotestplatte wird letztmalig gewaschen und das gebundene Enzym durch Substratumsatz (z. B. OPD oder TMB) sichtbar gemacht. Weitere erprobte Antigen-ELISA-Varianten können angewandt werden Weitere Nachweismethoden Mit folgenden Methoden, die allerdings in der EU-Gesetzgebung noch nicht zugelassen sind, kann bei besonderen Fragestellungen IHNV oder VHSV ebenfalls nachgewiesen werden: Reverse Transkriptase-abhängige Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Immun-Elektronenmikroskopie oder Immunoblot. Die RT-PCR ist auch geeignet zur Identifizierung neuer Virustypen, für epidemiologische Untersuchungen oder zur Unterscheidung von Feld- und Impfvirusisolaten Probenahme und Diagnoseverfahren zur Bestätigung von VHS und IHN im Verdachtsfall Probennahme Zur Untersuchung sind mindestens 10 Fische mit Symptomen, die für IHN bzw. VHS sprechen, auszuwählen. Bei chronischem Verlauf der Krankheit sind Fische mit zentralnervösen Störungen (Drehbewegungen um Längsachse, spiralförmige Schwimmbewegungen) zu untersuchen. Von zentralnervös gestörten Fischen ist das Gehirn zu entnehmen. Dem zur virologischen Untersuchung eingesandten Organmaterial sind unter Umständen zusätzliche Proben für die bakteriologische, parasitologische oder sonstige Untersuchung zur Differentialdiagnose beizufügen (siehe "Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases" (5) des O.I.E.) Nachweisverfahren Zur IHN- und VHS-Diagnose können folgende Verfahren angewandt werden: Herkömmliche Virusisolierung mit anschließendem Virusneutralisationstest, Virusisolierung mit gleichzeitigem Virusneutralisationstest, andere Diagnoseverfahren (IFT, ELISA). Der Virusnachweis hat wie unter Punkt 3.3. beschrieben zu erfolgen. Beim Virusneutralisationstest wird nach der Zentrifugation der Organsuspension und der Behandlung mit Antibiotika und IPNV-Antiserum der Überstand in Zellkulturmedium jedoch 1:10 und 1:10000 verdünnt und anschließend mit gleichen Mengen VHSV- und IHNV- Antikörpern bzw. als Kontrollansatz mit Zellkulturmedium versetzt. 161

162 Die zuletzt genannten Schnellverfahren (IFT und ELISA) müssen durch den Virusneutralisationstest (siehe Punkt. 3.3.) innerhalb von 48 Stunden nach der Probenahme ergänzt werden, wenn ein negatives Ergebnis vorliegt oder bei Probematerial, das aus einem Erstausbruch von VHS oder IHN in einem zugelassenen Gebiet stammt, ein positives Ergebnis vorliegt. Organmaterial kann nach anderen Diagnoseverfahren (z. B. IFT mit Gefrierschnitten oder immunhistochemische Analysen mit Formalin-fixiertem Material) untersucht werden. Diese Verfahrenstechniken müssen stets durch Verimpfung von nicht fixiertem Material auf Zellkulturen ergänzt werden Indirekter Nachweis von IHN und VHS Serologische Methoden zur Ermittlung von Antikörpern für den indirekten Nachweis der VHS und IHN sind gegenwärtig in der europäischen Gesetzgebung noch nicht zugelassen, jedoch insbesondere für epidemiologische Untersuchungen notwendig. Folgende Methoden können angewandt werden: Serumneutralisationstest in verschiedenen Modifikationen, indirekter Immunfluoreszenztest, verschiedene Enzymimmunteste (ELISA) Abkürzungen BF-2 EPC FHM HRP IHN(V) IPN(V) MEM OPD PBS RTG-2 VHS(V) VNT Bluegill fry-2 (Zelllinie) Epithelioma papulosum cyprini (Zelllinie) Fathead minnow (Zelllinie) Meerettich-Peroxidase Infektiöse Hämatopoetische Nekrose (Virus) Infektiöse Pankreasnekrose (Virus) Minimal Essential Medium Ortho-Phenyldiamin Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Rainbow trout gonad-2 (Zelllinie) Virale Hämorrhagische Septikämie (Virus) Virusneutralisationstest Bezugsquellen für diagnostische Reagenzien und Zellkulturen Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Insel Riems Institut für Infektionsmedizin Nationales Referenzlaboratorium für IHN und VHS: VHS-Referenzvirus IHN-Referenzvirus IPN-Referenzviren (Serotypen Ab, Sp, VR299) VHSV-Antiserum 162

163 IHNV-Antiserum IPNV-Antiserum Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Insel Riems Institut für Infektionsmedizin Zellbank: Zelllinien EPC, FHM, RTG-2, BF-2 Kommerziell erhältliche Diagnostika Monoklonale Antikörper Anti-VHSV Monoklonale Antikörper Anti-IHNV Monoklonale Antikörper Anti-IPNV Monoklonale Antikörper Anti-VHSV FITC-konjugiert* Monoklonale Antikörper Anti-IHNV FITC-konjugiert* Monoklonale Antikörper Anti-IPNV FITC-konjugiert VHSV-Antigen-ELISA IHNV-Antigen-ELISA IHNV-VHSV-Antigen-ELISA (* Konjugate der Firma BioX, Belgien sind für Deutschland zum Nachweis von IHNV und VHSV zugelassen) Literatur 1. Richtlinie 2006/88/EG des Rates vom 24. Oktober 2006 mit Gesundheits- und Hygienevorschriften für Tiere in Aquakultur und Aquakulturerzeugnisse und zur Verhütung und Bekämpfung bestimmter Wassertierkrankheiten. Amtsblatt der EU Nr. L 328 vom , S Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 23. Mai 1991 (BGBl. I, S. 1178) 3. Verordnung zum Schutz gegen Süßwasserfisch-Seuchen, Muschelkrankheiten und zur Schaffung seuchenfreier Fischhaltungsbetriebe und Gebiete (Fischseuchen-Verordnung), Neufassung vom 3. November 2004 (BGBl. I S. 2754). 4. Entscheidung der Kommission 2001/183/EG vom 22. Februar 2001 zur Festlegung der Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen und zur Aufhebung der Entscheidung 92/532/EWG. Amtsblatt der EU Nr. L 56 vom , S OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Fifth Edition 2006, World Organisation for Animal Health, Paris. 163

164 22. Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV) Charakterisierung der Infektion Ende der 90er Jahre hat ein als Koi-Herpesvirus (KHV) bezeichnetes, neues Virus Massensterben bei Nutzkarpfen und bei Koi-Karpfen (Cyprinus carpio) in Israel und in Westeuropa verursacht. Die KHV-Infektion (KHV-I) hat sich durch den unkontrollierten Handel mit infizierten Koi- Karpfen aber auch mit Speisekarpfen weltweit verbreitet und stellt zunehmend einen Risikofaktor für die Produktion von Nutzkarpfen dar. Vor diesem Hintergrund wurde in Deutschland 2005 für die Feststellung der KHV-I bei Nutzkarpfen und 2006 für Koi-Karpfen die Anzeigepflicht eingeführt. Die KHV-Infektion wurde außerdem in die Liste der bedeutsamen, nicht exotischen Krankheiten in der Neufassung der Aquakulturrichtlinie (EU-Richtlinie 2006/88/EG) aufgenommen. Auch das Internationale Tierseuchenamt (O.I.E.) empfiehlt für die KHV-I die Meldepflicht Erreger Als Erreger dieser neuartigen Krankheit wurde ein Herpesvirus isoliert und später als KHV bezeichnet. Die Erkrankung wird international KHV Disease (KHVD), in Deutschland aber KHV-Infektion (KHV-I) genannt. Wissenschaftlich wird das Virus, in Abgrenzung vom Karpfenpockenvirus (CyHV-1) und dem Goldfisch-Hämotopoetischen-Nekrosevirus (CyHV- 2), als Cyprinid Herpesvirus-3 (CyHV-3) eingeordnet. Die erste Isolierung des KHV erfolgte mit der Zelllinie von der Flosse eines Koi-Karpfens (koi fin cell line) KF-1. Eine weitere Zelllinie vom Gehirn des Karpfens, die common carp brain cell line (CCB), ist ebenfalls zur Anzüchtung von KHV geeignet. Beide Zelllinien befinden sich unter den Registriernummern 843 und 816 in der Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin (CCVM) des FLI und stehen den Untersuchungsämtern zur Verfügung. Die elektronenmikroskopischen Ultradünnschnittuntersuchungen infizierter Zellen zeigten zahlreiche Stadien einer Virusproduktion, wie sie für bisher untersuchte Herpesviren beschrieben wurden. Dazu gehörten vor allem Nukleokapsidbildung im Zellkern, primäre Umhüllung an der inneren Kernmembran und die sekundäre Umhüllung im Bereich des Golgi- Apparats. Morphogenetisch besonders auffällig war allerdings die vergleichsweise große Zahl im Zellkern bzw. Zytoplasma akkumulierter Nukleokapside. Dies führte zu zahlreichen pseudokristallinen Einschlüssen im Zellkern, die häufig aus inkompletten Nukleokapsiden bestanden. Die große Anzahl produzierter Nukleokapside stand in deutlichem Widerspruch zur geringen Ausbeute an reifen Virusnachkommen. Dieses Missverhältnis dürfte auch die Beobachtung erklären, dass bei elektronenmikroskopischer Untersuchung der Virusanzüchtungen bzw. Organanreibungen infizierter Tiere im Negativkontrastverfahren nur sehr selten komplette Virionen nachzuweisen sind. Eine relativ hohe Empfindlichkeit kompletter Virionen gegenüber äußeren Einflüssen zeigt sich besonders im Nachweis zahlreicher deformierter Nukleokapside, wie sie für andere Vertreter der Herpesviridae bisher nicht bekannt sind. 164

165 Abb. 1: A: KHV markiert mit polyklonalem Hyperimmunserum vom Kaninchen und kolloidalem Gold (10 nm, GAR 10) B: KHV markiert mit monoklonalem Antikörper mab 11A4 und kolloidalem Gold (10 nm, GAM 10). Die Markerlänge entspricht 100 nm (Fotos: Granzow, FLI Insel Riems) Das doppelsträngige DNA-Genom des KHV ist mit etwa 295 kbp größer als die Genome aller anderen bisher bekannten Herpesviren Klinische und pathologisch-anatomische Symptomatik Die Krankheit zeigt sich klinisch bei Wassertemperaturen zwischen 16 und 29 C, in Ausnahmefällen auch bei Temperaturen ab 8 C. Die Inkubationszeit beträgt, abhängig von der Wassertemperatur, der Virulenz des Erregers und der Empfänglichkeit der Fische, 4 bis 21 Tage, kann aber auch einige Monate dauern. In latent infizierten Fischen kann der Viruseintrag Jahre zurück liegen. Die Morbidität beträgt bei hohen Wassertemperaturen zwischen 18 und 26 C meist 100 %, die Mortalität ist in der Regel sehr hoch und kann ebenfalls bis zu 100 % betragen. Bei den erkrankten Fischen sind die wichtigsten Symptome Atemnot, Kiemenverfärbungen und nekrosen (Abb. 2), Inappetenz bis hin zur Anorexie, Enophthalmus (Abb. 3), Flossenerosionen, Hautläsionen (meist mit verstärkter milchig-grauer Schleimbildung), später Blutungen, Schleimhautablösung und großflächige Entzündungen (Abb. 4). Inapparente latente bzw. persistente Infektionen können auftreten. Für eine KHV-I sprechen folgende klinischen Symptome: - Mortalität: % (u.a. abhängig von der Wassertemperatur, der Empfänglichkeit der Fische und der Virulenz des Erregers) - Apathie - Atemnot - Inappetenz / Anorexie - Kiemenblässe und -nekrosen - Enophthalmus - Blutungen am Flossenansatz, in den Flossen und in der Haut - kreisrunde bis konfluierende Schleimhautläsionen verbunden mit Schleimhautablösungen 165

166 Abbildung 2: Kieme eines erkrankten Kois mit umfangreicher Nekrose (Foto Kleingeld, LAVES Hannover Abbildung 3: Enophthalmus beim Karpfen (Foto: Bergmann, FLI, Insel Riems) Abbildung 4: Moribunder Karpfen mit vermehrter Schleimbildung (Rücken) und Blutungen an Bauch und den Flossen. (Foto: Bergmann, FLI, Insel Riems) 166

167 Vorkommen Der erste Ausbruch der Krankheit bei Nutzkarpfen wurde im Mai 1998 in Israel beobachtet. Bis zum Ende des Jahres 2000 hat die Krankheit bis zu 90 % der Fischfarmen Israels erfasst und verursachte in der Aquakultur jährlich Kosten von 300 Mill. US$. In den USA wurde die Krankheit erstmals Ende 1998 bei einem Koi beobachtet. Erste Hinweise über Massensterben bei Nutzkarpfen in Verbindung mit dem KHV wurden 1997 und 1998 in Deutschland beobachtet. In den Folgejahren wurde das KHV weltweit in zahlreichen Ländern nachgewiesen. Die wirtschaftliche Bedeutung des KHV als Erreger einer neuen Fischseuche unterstreichen zwei Ausbrüche in Deutschland. Im Sommer 2003 kam es zu Ausbrüchen in 3 Teichwirtschaften in Sachsen. Die Mortalität betrug zwischen 20 und 100 %. Die Gesamtverluste betrugen 48 t Karpfen. Der direkte Schaden durch Fischverluste betrug Die Folgeschäden wurden mit nochmals beziffert. Ein weiterer KHV-Ausbruch wurde 2004 in einer Teichanlage in Thüringen festgestellt. Die Gesamtverluste betrugen 80 t Karpfen, mit einem direkten Schaden in Höhe von und Folgeschäden von insgesamt Nach bisherigen Kenntnissen können nur Nutzkarpfen und Koi-Karpfen an der KHV-I klinisch erkranken. Offensichtlich wird das KHV in weiteren Spezies, wie z.b. in Goldfischen, Schleien und Graskarpfen, vermehrt und weitere Fischarten stehen in Verdacht das Virus als Carrier zu beherbergen und an empfängliche Karpfen weiterzugeben Voraussetzungen für den Verdacht - gehäufte Todesfälle mit charakteristischen pathologisch-anatomischen Befunden - typische klinische Symptome - Todesfälle in Verbindung mit epidemiologischen Zusammenhängen zu einem labordiagnostisch bestätigten KHV-I-Fall Epidemiologischer Zusammenhang - Lebendfischbewegungen (u.a. Transporte, Zukäufe, Abgaben, Umsetzungen) - Kontakte (Personen, Geräte, Wasser) zu anderen Betrieben - Aussetzen KHV-infizierter Karpfen / Koi-Karpfen in Gewässer - weitere Spezies (u. a. Goldfische, Schleien, Graskarpfen) können Überträger des KHV sein, ohne selbst zu erkranken Zuständige Untersuchungseinrichtungen Die labordiagnostischen Untersuchungen (virologisch/molekularbiologisch) zum Nachweis der Freiheit der Fischbestände von diesen Krankheitserregern bzw. zur Überwachung der Seuchenfreiheit sowie zur Bestätigung von KHV-Verdachtsfällen werden in den zugelassenen und akkreditierten Laboren und Untersuchungseinrichtungen in den Bundesländern durchgeführt. Das Nationale Referenzlaboratorium für die KHV-I (NRL KHV-I) am Friedrich- Loeffler-Institut Insel Riems koordiniert die Diagnose auf der Grundlage der EU- und nationalen Gesetzgebung. Zur Klärung fraglicher / verdächtiger Befunde oder zur Bestätigung der Ergebnisse der regionalen Diagnoselaboratorien bei Ausbruch der KHV-I in einem bisher freien Gebiet sind die Virusisolate bzw. Amplifikate / Organmaterial / extrahierte DNA zur Identifizierung oder weiteren Charakterisierung an das NRL KHV einzusenden. Repräsentative Isolate oder Nukleinsäure-Präparationen werden dem EU-Referenzlaboratorium übergeben, das die Diagnostik der Fischseuchen auf EU-Ebene koordiniert. 167

168 Rechtsgrundlage Die neue Fischseuche wurde in Deutschland im Dezember 2005 in die Verordnung über anzeigepflichtige Krankheiten aufgenommen. Die Anzeigepflicht für die KHV-I wurde zunächst nur auf den Nachweis bei Nutzkarpfen beschränkt, aber 2006 auch auf Koi-Karpfen ausgedehnt. In der EU-Richtlinie 2006/88/EG ist die KHV-Infektion im Anhang IV in der Liste der nichtexotischen Krankheiten aufgeführt, für die bei Feststellung Mindestbekämpfungsmaßnahmen festgelegt wurden. Die Überführung der EU-Richtlinie in nationales Recht ist bis August 2008 abzuschließen. Seit Januar 2006 besteht auch Meldepflicht beim OIE. Es ist vorgesehen, dass die Diagnose und Bekämpfung der KHV-I auf der Grundlage der EU- Richtlinie 2006/88/EG in Deutschland durch die " Gesundheitsvorschriften für Tiere in Aquakultur und Aquakulturerzeugnisse und zur Verhütung und Bekämpfung bestimmter Wassertierkrankheiten (Aquakultur-Richtlinie)" geregelt wird. Eine Anleitung zur Diagnose der KHV-I und weiterer, gegebenenfalls differentialdiagnostisch abzugrenzender, Fischkrankheiten ist auch im "Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases" des Office International des Epizooties (O.I.E.) erschienen. Es wird erwartet, dass eine derartige Diagnose-Richtlinie auch für die Harmonisierung der KHV-Diagnostik in der EU erlassen wird Untersuchungsmaterial Zeitplan Der Betreiber eines Fischhaltungsbetriebes hat seinen Fischbestand mindestens einmal jährlich nach näherer Anweisung der zuständigen Behörde tierärztlich klinisch und virologisch untersuchen zu lassen. Es wird empfohlen, die Probenahme an Fischen, die mindestens 4 Monate alt sind, durchzuführen. Dabei sollte während einer Zeitspanne von wenigstens 4 Wochen eine Wassertemperatur von C oder höher gewährleistet sein. Wird als Ergebnis der klinischen und pathologisch-anatomischen Untersuchung oder aufgrund epizootiologischer Erhebungen der Verdacht des Ausbruchs einer KHV-I geäußert, sind Fische oder Organproben an die zuständige diagnostische Einrichtung zur labordiagnostischen Prüfung einzusenden Wahl und Entnahme der Proben Die Probenahme ist bei Nutzkarpfen und Koi-Karpfen und gegebenenfalls bei weiteren empfänglichen Arten durchzuführen. Alle Produktionseinheiten (Teiche, Rinnen, Behälter, Netzkäfige usw.) sind auf verendete, geschwächte oder verhaltensgestörte Fische zu kontrollieren. Proben sind je nach Fischalter und -herkunft gesondert zu entnehmen. Bei der Probeauswahl sind bevorzugt geschwächte, verhaltensgestörte, moribunde oder frisch verendete Fische (ohne Anzeichen der Zersetzung) zu berücksichtigen. Die zu untersuchende Probe sollte bei Brütlingen aus mindestens 20 (2 Pools à 10 Fische), bei Fischen über 5 cm Länge aus mindestens 10 Fischen (2 Pools à 5 Tiere) bestehen. Von den Fischen sind Organe bzw. Organteile (Kiementeile und Rumpfniere) zu entnehmen. Bei Laichfischen oder anderen Fischen, bei denen eine Tötung vermieden werden soll, kann sich die Probenahme auf Blutentnahme zur Leukozytenseparation beschränken, wenn die zuständige Behörde nichts anderes anordnet. 168

169 Kiemenabstriche Zur zusätzlichen Absicherung können Kiemeabstriche mit sterilen Ohrtupfern von gestressten Tieren (24 Stunden bis 7 Tage nach der Stressung) bzw. beim Ausbruch (Abb. 5 a) in Isopropanol (1ml Isopropanol in einem sterilen 2 ml Eppendorfgefäß, beide Enden des Ohrtupfers sind vom Isopropanol bedeckt) ungekühlt versandt werden. Auf den Tupfern muss Blut zu erkennen sein (Abb. 5 b) Abbildung 5a: Kiemenabstrich beim Karpfen Abbildung 5b: Blutiger Tupfer (Fotos: Bergmann, FLI, Insel Riems) Zum Ausschluss einer latenten / persistenten Infektion mit dem KHV sollten die Fische mittels eines simulierten (Abkeschern und für 30 sec bis 1 min an der Luft halten) oder eines tatsächlichen Transports dazu gebracht werden, das latente / persistente KHV zu reaktivieren. Die Probennahme soll frühestens nach 24 h, spätestens jedoch nach 7 Tagen nach dem Transport wie beschrieben erfolgen Aufbereitung und Einsendung der Proben Lebende Fische sind in geeigneten Transportbehältnissen gekühlt (mind. 10 C) und auf dem schnellsten Weg zur Untersuchungsstelle zu transportieren. Frisch-tote Fische können unzerteilt zum Labor gesandt werden, sofern die Temperaturanforderungen (Kühlung, mind. 10 C im Transportgefäß) während der Beförderung erfüllt werden können (nicht einfrieren). Organe/Organteile (Kieme und Niere) und/oder Blutproben (Gerinnungshemmer, z.b. Heparin) sind unter sterilen Kautelen zu entnehmen und in ein steriles Kunststoffröhrchen mit Transportmedium (z. B. Zellzuchtmedium mit 10-fachem Antibiotika-Zusatz) zu geben. Die Proben sind sofort auf unter 10 C zu kühlen. Während Blutproben von Einzeltieren einzusenden sind (keine Poolproben), können Organe als Sammelproben zur Untersuchung übergeben werden. Eine Sammelprobe kann Organteile von höchstens 5 Fischen über 5 cm (2 Pools a 5 Fische) und von höchstens 10 Brütlingen (2 Pools a 10 Fische, insgesamt mindestens 0,5 g) je Probengefäß beinhalten. Die Probengefäße sind in Isolierbehältern, gekühlt zum Labor zu transportieren. Der Einsendetermin soll mit der Untersuchungsstelle abgesprochen sein. Im Einvernehmen mit dem Diagnoselaboratorium kann weiteres Probenmaterial entnommen und für weitere Untersuchungen aufbereitet werden. Für den Versand von Probenmaterial in Alkohol, wenn nicht innerhalb von 48 h untersucht werden kann, wird Isopropanol (100 %) empfohlen. Ethanol in jeglicher Konzentration er- 169

170 scheint ungeeignet zu sein und kann nach einer längeren Lagerungszeit der Proben zu falsch negativen Ergebnissen führen Untersuchungsgang Aufbereitung der Proben für die Untersuchung Die Methode der Wahl ist die molekularbiologische Untersuchung mittels PCR (Genomnachweis). Organteile sind zu entnehmen, anzureiben und nach Extraktion (mindestens 4 h bei 15 C oder über Nacht bei 4 C) zu zentrifugieren. Der Überstand kann für die virologische Untersuchung und das Zentrifugat (Pellet) für den Genomnachweis verwendet werden. Die DNA ist sofort z.b. mit der DNAzol -Methode (Invitrogen) oder mittels Silikatsäulchen (Qiagen) zu extrahieren. Die extrahierte DNA kann bei 20 C für mindestens drei Monate eingefroren bleiben. Für den Genomnachweis können bei Fischen über 5 cm Länge die Organe von bis zu 5 Fischen (insbesondere Kieme und Niere) zusammen bearbeitet werden. Brütlinge können zu je 10 Exemplaren zusammen bearbeitet werden. Von den heparinisierten Blutproben ist für den Virusgenom-Nachweis die Leukozytenfraktion unter Verwendung von Histopaque 1077 (Sigma), Percoll (Sigma) oder Lympho-Prep (AXIS-SHIELD PoC AS, Dänemark) nach Angaben der Hersteller zu gewinnen Gewinnung der Leukozytenfraktion aus heparinisiertem Blut Fische werden betäubt und aus der Schwanzvene oder dem Herzen wird Blut mit einer passenden Spritze (je kleiner die Fische, desto kleiner die Spritze und die Kanüle) gewonnen. Mengen zwischen 0,5 und 1 ml sind optimal für die Fraktionierung. Es können aber auch wesentlich kleinere Mengen (50 bis 200 µl Blut) verwendet werden. Das Blut wird sofort nach der Entnahme in ein isotonisches Medium, bestens geeignet ist Zellkulturmedium, im Verhältnis 1:3 bis 1:4 gegeben, geringere Mengen sind möglich. Die Suspension ist sofort auf unter 10 C zu kühlen. Die weitere Bearbeitung sollte spätestens nach 30 min bis maximal 1 h erfolgen, da das Blut gerinnen könnte. Die Suspension wird auf 3 ml z.b. Histopaque 1077 überschichtet und danach für 40 min bei 800g und 4 C zentrifugiert. Die Leukozytenfraktion befindet sich i.d.r. deutlich sichtbar im klaren Überstand. Nach Abnahme der Leukozyten (ca. 1 bis 2 ml) mit einer Pipette sind diese mit 10 ml PBS- zu waschen. Nach vorsichtiger Mischung wird erneut zentrifugiert (10 min, 900 bis 1000 g, 4 C). Gegebenenfalls ist dieser Waschvorgang zu wiederholen. Das entstehende Pellet wird in 1 ml PBS- aufgenommen und es erfolgt eine Zählung der weißen Blutzellen. Zur weiteren Untersuchung bzw. zur Verwendung in der PCR bzw. der Zellkultivierung werden die Leukozyten auf 1x10 7 Zellen / ml eingestellt. Geringere Zellzahlen sind möglich, bei höheren Zellzahlen kann z.b. die PCR inhibiert werden. Für die PCR wird anschließend 1 ml mit eingestellter Zellzahl abgenommen, die Zellen wiederum pelletiert (1000 g, 10 min, 4 C), der Überstand entfernt und das Pellet in 200 µl PBS - resuspendiert. Diese Leukozyten-Präparation kann für die IFT, die in situ Hybridisierung (ISH) und für die PCR verwendet werden. 170

171 Abbildung 6: Blutentnahme aus der Schwanzvene eines Koi (Foto Kleingeld, LAVES Hannover) Leukozytenproben müssen einzeln bearbeitet werden. Es wird empfohlen, die Leukozyten auf maximal 1 x 10 7 Zellen/ml einzustellen. Wurde die Probe nicht in einem antibiotikahaltigen Medium versandt, ist die Anreibung bei der Extraktion (4 Stunden bei 15 C oder über Nacht bei 10 C) mit antibiotikahaltigem Medium durchzuführen Genomnachweis in Organanreibungen und in Leukozyten- Präparationen Empfohlen wird die Aufarbeitung von 25 bis 50 mg Organmaterial oder 1x 10 7 Leukozyten / ml von einem Fisch. Die DNA wird mittels DNAzol -Methode (Invitrogen) bzw. Silikatsäulen (Qiagen) gewonnen. Bei der Extraktion ist darauf zu achten, dass es, entsprechend der Herstellerangaben, zu keiner Überladung mit DNA kommt, dies besonders bei Poolproben. Die sensitivsten genomischen Methoden zum KHV-Nachweis sind: 1. die realtime PCR nach Gilad et al. (2004) 2. die PCR nach Gilad et al. (2002) und 3. die nested PCR (Bergmann et al. 2006) mit den Primerpaaren KHV-1Fn-1Rn nach der Gilad-PCR durchzuführen. Neue in Europa auftretende KHV reagieren nicht in der PCR nach Bercovier et al. (2005). Diese wird daher nicht zur Diagnostik empfohlen PCR zum KHV-Genomnachweis Neben der empfohlenen realtime PCR (Gilad et al. 2004) kann die Untersuchung auch entsprechend der Empfehlungen des OIE-Referenzlabors in Weymouth (UK) auch mit einer konventionellen PCR, der sich eine nested PCR anschließt, durchgeführt werden. In diesem Untersuchungsgang besteht allerdings eine hohe Kontaminationsgefahr im Labor. Vom OIE-Referenzlabor wird weiterhin die Verwendung der GoTaq DNA-Polymerase (Promega) empfohlen. Als Mastermix für die PCR kann folgende Reaktionsmischung verwendet werden: 171

172 25 µl PCR-Ansatz mit verschiedenen DNA-Template-Volumina (Angaben in µl) PCR- Wasser 5x buffer MgCl 2 dntp s Primer (s+) (50 pmol / µl) Primer (s-) (50 pmol / µl) GoTaq DNA- Template 1 x 13,7 5* 2,5* 0,25* 0,5 0,5 0,125* 2,5 µl 1x 11,2 5* 2,5* 0,25* 0,5 0,5 0,125* 5,0 µl * im GoTaq Flexi-Kit (Promega) enthalten Folgende Primerpaare werden für die PCR empfohlen: Gen des KHV Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer Referenz / Fragmentgröße Fragment (ORF 89-90) 5 -GAC GAC GCC GGA GAC CTT GTG CAC AAG TTC AGT CTG TTC CTC AAC-3 Gilad et al. (2002) / 484 bp Thymidinkinase 5` GGG TTA CCT GTA CGA G-3` 5`-CAC CCA GTA GAT TAT GC-3` Bercovier et al. (2005) / 409 bp Für die nested PCR im Anschluss an die PCR nach Gilad et al. 2002werden folgende Primer empfohlen (Bergmann et al. 2006): Gen des KHV Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer Referenz Fragment 5 -CTC GCC GAG CAG 5 -TCA TGC TCT CCG Bergmann et al. (ORF 89-90) AGG AAG CGC-3 AGG CCA GCG G-3 (2006) / 392 bp Um eine Vergleichbarkeit der Reaktionen zu gewährleisten, wurde die PCRs so adaptiert, dass sie nur ein Programm benötigen. Als PCR-Programm wird empfohlen: PCR nested PCR Initiale Denaturierung 5 min, 95 C 5 min, 95 C Denaturierung 1 min, 95 C 30 sec, 95 C Annealing 1 min, 55 C 34 Zyklen 30 sec, 55 C 30 Zyklen Polymerisation 1 min, 72 C 30 sec, 72 C Finale Polymerisation 7 min, 72 C 7 min, 72 C Virologische Untersuchung und Isolierung der KHV in Zellen Virologische Nachweise in Zellkulturen sind zum Nachweis und Charakterisierung von KHV ungeeignet, da sich das Virus selten in den zur Verfügung stehenden Zelllinien KF-1 und CCB isolieren lässt. 172

173 Antigen- und Erregernachweis Der Antigennachweis und die Identifizierung des Virus kann nach erfolgreicher Isolierung in der Zellkultur mittels Immunfluoreszenztest erfolgen. Es wird die Verwendung monoklonaler Antikörper gegen das KHV empfohlen. Virus-Antigen kann bei akuten Ausbrüchen mit einem kommerziellen KHV-Antigen-ELISA (Kovax, Israel) nachgewiesen werden. Der ELISA benötigt für einen positiven Nachweis jedoch große Mengen an KHV im Organ bzw. den Fäces. Die zum Nachweis verwendeten Diagnostika müssen zugelassen und vom nationalen Referenzlaboratorium geprüft sein Weitere Angaben zum Genom-, Virus- und Antikörpernachweis: 1. anonym 2005: Änderung VO anzeigepflichtige Krankheiten 2. anonym 2006a: Richtlinie 2006/88/EG des Rates vom 24. Oktober 2006 mit Gesundheits- und Hygienevorschriften für Tiere in Aquakultur und Aquakulturerzeugnisse und zur Verhütung und Bekämpfung bestimmter Wassertierkrankheiten. Amtsblatt der EU Nr. L 328 vom , S anonym, 2006b: OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Fifth Edition 2006, World Organisation for Animal Health, Paris. 4. Gilad, O., Yun, S., Andree, K.B., Adkinson, M.A., Zlotkin, A., Bercovier, H., Eldar, A. and Hedrick, R.P. (2002). Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis. Aquat. Org. 48: Gray, W., Mullis, L., LaPatra, S., Groff, J., Goodwin, A. (2002). Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish. Journal of Fish Diseases. 25: S.M. Bergmann, J. Kempter, J. Sadowski and D. Fichtner (2006). First detection, confirmation and isolation of koi herpesvirus (KHV) in cultured common carp (Cyprinus carpio L.) in Poland. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 26(2): Ronen, A., Perelberg, A., Abramowitz, J., Hutoran, M., Tinman, S., Bejerano, I., Steinitz, M., Kotler, M. (2003). Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio. Vaccine 21: Hutoran, M., Ronen, A., Perelberg, A., Dishon, A., Bejerano, I. Chen, N. and Kotler, M. (2005) Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species. J Virol79(4): Oren Gilad, Susan 9. Yun, Francisco J. Zagmutt-Vergara, Christian M Leutenegger, Herve Bercovier, Ronald P. Hedrick (2004). Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) intissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis. Aquat. Org. 60: Abkürzungen PCR Polymerase-Kettenreaktion PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung CCB common carp brain cells KF-1 koi fin-1 cells CPE Cytopathischer Effekt 173

174 Bezugsquellen für diagnostische Reagenzien und Zellkulturen Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Insel Riems Institut für Infektionsmedizin Nationales Referenzlaboratorium für die KHV-I: KHV-Referenzvirus (KHV-I, USA) KHV-Nukleinsäure-Präparation KHV-Antiserum (vom Kaninchen) Anti-KHV monoklonaler Antikörper Kommerziell erhältliche Diagnostika Monoklonale Antikörper Anti-KHV (BioX Belgien) Monoklonale Antikörper Anti-KHV (Aquadiagnostics, ADL, UK) 174

175 23. Klassische Schweinepest Charakterisierung der Infektion Erreger Der Erreger der Klassischen Schweinepest (KSP) ist ein lipidumhülltes RNA-Virus des Genus Pestivirus der Familie Flaviviridae. Er ist verwandt mit den für die Virusdiarrhoe des Rindes (BVD) und die Border Disease des Schafes (BD) verantwortlichen Pestiviren. Diese Verwandtschaft ist für die KSP-Diagnostik insofern bedeutsam, als Kreuzreaktionen auftreten, die zu falsch-positiven Laborbefunden führen können. Das KSP-Virus ist in Exkreten infizierter Schweine, in Schlachtkörpern, frischem Schweinefleisch und bestimmten Schweinefleischerzeugnissen relativ stabil. Es lässt sich durch Detergentien, flüssige Lösemittel, Proteasen und gängige Desinfektionsmittel wirksam abtöten Klinische SymptomatiK Die KSP ist eine seuchenhaft verlaufende Infektionskrankheit der Haus- und Wildschweine und kann - abhängig von Wirts- bzw. Erregereigenschaften sowie des Infektionszeitpunktes (prä- oder postnatal) - in der akuten, chronischen oder "late onset" Verlaufsform auftreten. Besonders die letzteren beiden Formen bereiten Schwierigkeiten bei der klinischen Diagnose und tragen so in besonderem Maße zur Verbreitung des Virus bei. Die meisten Schweine in einer Herde erkranken an der akuten Form der KSP. Je nach Alter des Tieres, seiner Konstitution und Kondition, kann die akute Infektion entweder transient oder letal verlaufen. Bei der akut-letalen Form sind die Symptome in der Regel ausgeprägter als bei der transienten Form, die mild oder sogar subklinisch verläuft. Die Mortalität ist bei Jungtieren wesentlich höher als bei adulten Schweinen. Die Inkubationszeit der KSP beträgt etwa eine Woche. Die frühen Symptome, besonders der akut-letal infizierten Schweine, bestehen in hohem Fieber, Appetitlosigkeit, Somnolenz, Konjunktivitis und Nasenausfluss (Abb. 1). 175

176 Im weiteren Verlauf zeigen die kranken Tiere unsichere Bewegungen, Zittern und schließlich eine Hinterhandparese. Charakteristisch ist das hämorrhagische Syndrom: Cyanotische Verfärbungen des Abdomens, der Schnauze und der Ohren sowie der medialen Teile der Gliedmaßen, petechiale bishin zu landkartenähnliche Blutungen in äußerer Haut und Schleimhäuten. Labordiagnostisch sind eine Leukopenie und Thrombozytopenie feststellbar, die bei den akut erkrankten Schweinen bis zum Tode bestehen bleiben. Wenige Schweine, die nach der akuten Infektionsphase weder genesen noch sterben, entwickeln die chronische Form der KSP (Abb. 2). Dieser Krankheitsverlauf ist durch einen protrahierten Verlauf gekennzeichnet. Die klinischen Erscheinungen ähneln denen der akuten Infektion, treten jedoch schwächer in Erscheinung. Die betroffenen Tiere bleiben bis zu ihrem Tode über einen Zeitraum von mehreren Monaten virämisch. Es kommt abwechselnd zu Phasen klinischer Besserung mit nachlassendem Fieber gefolgt von erneuten Krankheitsschüben mit Symptomen wie Anorexie, Fieber, Durchfall, Alopezie und Dermatitis. Die Tiere zeigen deutliche Entwicklungsrückstände und kümmern. In einer betroffenen Herde sind sowohl die akut-letale, als auch die transiente Form der KSP zu beobachten. Chronische Formen sind nur selten zu beobachten, wenn eine Infektion in einer Herde lange unerkannt bleibt. Das KSP-Virus kann in tragenden Tieren, die nur transient (milde Verlaufsform) erkranken, die Plazentaschranke überwinden und die Feten infizieren (carrier sow syndrome). Abhängig vom Trächtigkeitsstadium kommt es zu embryonalem bzw. fetalem Tod, zu teratogenen Veränderungen unterschiedlichster Art, zur Geburt moribunder oder toter Ferkel, oder zur Geburt gesunder, persistent virämischer Ferkel (Abb. 3). Diese zuletzt genannten Ferkel können über einen Zeitraum von Wochen oder Monaten klinisch unauffällig bleiben, bis sie die Spätform ( late onset disease") der Schweinepest entwickeln. Als einziger klinischer Hinweis wäre ein Wachstumsrückstand (kümmern) gegenüber den Wurfgeschwistern zu nennen. Sie sind gegen das KSP-Virus immuntolerant, bilden keine homologen Antikörper und scheiden permanent KSP-Virus aus. Somit stellen sie eine dauernde Infektionsquelle dar und sorgen für die Verbreitung des Erregers innerhalb der Population. Nach mehreren Wochen oder Monaten verschlechtert sich der Gesundheitszustand solcher Tiere und sie sterben. Die längste 176

177 Überlebenszeit für persistent infizierte Ferkel ist mit 11 Monaten angegeben worden. Das carrier sow syndrome mit der Folge eines late onset Verlaufes sind zwar seltene Ereignisse, spielen aber in der Epidemiologie der KSP eine Schlüsselrolle, die häufig unterschätzt wird. Abb. 3 Intrauterine Infektion Monate vor Geburt Monate nach Geburt Persistent-virämische Nachkommen Virämie...11 Ak. Aborte Totgeburten Frühsterblichkeit Leitlinien für die Erkennung KSP-verdächtiger Betriebe Die Entscheidung über die Ausweisung eines Betriebs als KSP-verdächtig wird auf der Grundlage folgender Feststellungen, Kriterien und Argumente getroffen: a) klinische Symptome und pathologische Veränderungen bei Schweinen, wobei im Wesentlichen folgende Befunde berücksichtigt werden: Fieber, einhergehend mit erhöhter Morbidität und Mortalität, Fieber, einhergehend mit hämorrhagischem Syndrom, Fieber, einhergehend mit neurologischen Symptomen Fieber mit unbekannter Ursache, wobei sich der Gesundheitszustand nach antibiotischer Behandlung nicht gebessert hat Aborte und zunehmende Fruchtbarkeitsstörungen in den letzten drei Monaten kongenitaler Tremor bei Ferkeln, chronisch kranke Tiere Jungtiere mit Wachstumsstörungen (Kümmern), petechiale und ecchymatöse Blutungen, vor allem in Lymphknoten, Nieren, Milz, Harnblase und am Kehlkopf, Infarkt oder Hämatome, vor allem in der Milz, diphteroide Ulcera ( button ulcera ), vor allem nahe der Ileozäkalklappe; 177

178 b) epidemiologische Befunde, wobei im Wesentlichen die Fälle berücksichtigt werden, in denen: Schweine direkt oder indirekt mit einem Schweinehaltungsbetrieb in Berührung gekommen sind, der nachweislich KSPV-infiziert war, ein Betrieb Schweine geliefert hat, die sich anschließend als KSPV-infiziert herausgestellt haben, Sauen mit Sperma KSP-verdächtiger Eber künstlich besamt wurden, Schweine direkt oder indirekt mit Wildschweinen einer KSP-infizierten Population in Berührung gekommen sind, Schweine in einer Region im Freien gehalten werden, in der die Schwarzwildpopulation mit KSPV infiziert ist, Schweine mit Küchenabfällen gefüttert wurden und der Verdacht besteht, dass diese Abfälle keiner KSPV-abtötenden Behandlung unterzogen wurden, Schweine möglicherweise durch Personen, Fahrzeuge mit Betriebszugang usw. gefährdet wurden; c) serologische Befunde, wobei im Wesentlichen folgende Befunde berücksichtigt werden: serologische Reaktionen infolge einer latenten KSPV-Infektion oder Impfung, Kreuzreaktionen zwischen KSPV- und anderen Pestivirus-Antikörpern, Einzelreagenten Differentialdiagnostik Der Nachweis der Klassischen Schweinepest kann sich vor allem in Zuchtbeständen als schwierig erweisen, in denen die Seuche möglicherweise sehr mild verläuft und daher mit vielen anderen pathologischen Zuständen verwechselt werden kann. Fruchtbarkeitsstörungen und Aborte können sowohl durch Klassische Schweinepest als auch durch Parvovirus- Infektionen, CBPP, Leptospirose und Aujeszky-Krankheit hervorgerufen werden. KSP- bedingtes Abortmaterial lässt sich von abortierten Föten infolge anderer Krankheiten pathologisch nicht unterscheiden. Bei Verdacht auf Infektion des Reproduktionstraktes muss sofort auf Klassische Schweinepest untersucht werden, wenn der betroffene Betrieb (z. B. aufgrund seines Standorts in einem Gebiet mit Schweinepestvorkommen in der Schwarzwildpopulation) seuchengefährdet ist. Die Untersuchung auf Schweinepest muss jedoch in jedem Fall erfolgen, wenn gängige Infektionen des Reproduktionstraktes ausgeschlossen wurden. Abhängig vom Zeitpunkt der Infektion des Tieres (pränatal oder postnatal), vom Alter und von der Nutzungsrichtung sind die Folgen und Erscheinungen der KSP unterschiedlich. Diese Unterschiede drücken sich auch in dem differentialdiagnostisch zu berücksichtigenden Spektrum anderer Erkrankungen bei Schweinen aus: 1) Intrauterine Infektionen mit/ohne Mißbildungen, Mumifikation, Totgeburt Aujeszkysche Krankheit Parvovirus-Infektion (SMEDI-Syndrom) Cytomegalievirus-Infektion PRRS 2) Zentralnervöse Erscheinungen Aujeszkysche Krankheit Teschen-Talfan-Virusinfektion Tollwut Listeriose 178

179 3) Hämorrhagisches Syndrom, Zyanose und/oder Nekrose Afrikanische Schweinepest Porzines Circovirus Typ 2-Infektion PRRS Rotlauf Eperythrozoon-Infektion Pasteurellose Dicumarol-Vergiftung Vitamin K-Mangel 4) Gastrointestinale Erscheinungen bei Ferkeln Transmissible Gastroenteritis Vomiting-and-Wasting-Disease Rotavirus- E. coli-infektion Salmonellosen 5) Bronchopneumonische Erscheinungen Aujeszkysche Krankheit Schweineinfluenza PRRS 6) Apoplektiforme Todesfälle (perakut) Afrikanische Schweinepest Vergiftungen Rotlauf Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinär- und Lebensmitteluntersuchungsämter der Länder Virustypisierung durch das Friedrich-Loeffler-Institut (Nationales Referenzlabor für Klassische Schweinepest), Südufer 10, D Greifswald-Insel Riems Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die Schweinepest und die Afrikanische Schweinepest (Schweinepest-Verordnung) Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen Richtlinie 2001/89/EG KSP-Diagnosehandbuch (2002/106/EG) Untersuchungsmaterial Bevor mit der Probennahme in einem seuchenverdächtigen Betrieb begonnen wird, ist ein Grundriss des Betriebs anzufertigen, auf dem die epidemiologischen Untereinheiten eingezeichnet sind. Wenn zu erwarten ist, dass eine Zweitbeprobung notwendig werden könnte, sind die betreffenden Schweine unverwechselbar in einer Weise zu kennzeichnen, dass sie leicht erneut beprobt werden können. Allen Proben müssen bei der Beförderung zum Labor die von der zuständigen Behörde vorgegebenen Formulare beiliegen, die Angaben zur Krankheitsgeschichte der beprobten Schweine sowie über die klinischen Symptome bzw. Sektionsbefunde enthalten. Es sind genaue Angaben über Alter, Kategorie und Herkunftsbetrieb der 179

180 beprobten Tiere zu machen. Es wird empfohlen, den Standort jedes beprobten Schweins, zusammen mit seinem Einzelkennzeichen zu erfassen Untersuchungsmaterial für den Erregernachweis Der Erregernachweis (virologische Untersuchungen) wird im Falle kranker Tiere empfohlen. Ihr Wert ist in der Regel begrenzt, wenn sie zur Überwachung von Tieren ohne klinische Krankheitsanzeichen angewandt werden. Besteht das Ziel einer umfangreichen Stichprobenuntersuchung jedoch darin, den KSP-Erreger schon in der Inkubationszeit nachzuweisen, so sind Blutproben mit Gerinnungshemmer (z.b. EDTA-Blut) oder Tonsillen das geeignetste Probenmaterial. Zum Nachweis des KSP-Virus, KSPV-Antigens oder KSPV-Genoms bei toten oder schmerzlos getöteten Schweinen sind Proben von Tonsillen, Milz und Lymphknoten (z.b. Ln. retropharyngeum, Ln. parotideum, Ln. mandibulare oder Ln. mesentericum) am besten geeignet. Ferner wird empfohlen, Proben von Niere und Ileum zu entnehmen. Im Falle autolytischer Tierkörper sind ein Röhrenknochen oder das Sternum das geeignetste Probenmaterial. Blutproben sowohl mit als auch ohne Gerinnungshemmer sind in jedem Falle von Schweinen zu entnehmen, die Anzeichen von Fieber oder sonstige Krankheitsanzeichen zeigen Untersuchungsmaterial für den Antikörpernachweis Für den Antikörpernachweis werden Blutproben ohne Gerinnungshemmer (Serumproben) benötigt. In Ausnahmefällen können auch Blutproben mit Gerinnungshemmer (Plasmaproben) untersucht werden Beförderung der Proben Es wird empfohlen, sämtliches Probenmaterial in auslaufsicheren Behältnissen zu transportieren und zu lagern; nicht einzufrieren, sondern bei Kühlschranktemperatur zu kühlen; dem Labor so schnell wie möglich anzuliefern; in einem Paket zu befördern, in dem zur Kühlung des Probenmaterials Kühlelemente verwendet werden. Im Falle von Gewebe- oder Organproben wird empfohlen: separat in verschlossenen ordnungsgemäß etikettierten Kunststoffbeuteln zu befördern, die wiederum in größere, feste Behältnisse gepackt werden, die zum Schutz vor Beschädigung und zum Aufsaugen etwa ausfließenden Beutelinhalts mit ausreichend saugfähigem Material ausgekleidet sind; im Interesse des sicheren und schnellen Transports soweit möglich von Fachleuten auf direktem Wege zum Labor befördern zu lassen. Das Äußere der Verpackung muss mit der Anschrift des Empfängerlabors und deutlich sichtbar mit folgendem Vermerk gekennzeichnet sein: Diagnostisches Untersuchungsmaterial. Verderblich. Zerbrechlich. Darf nur im KSP-Diagnoselabor geöffnet werden. Das Empfängerlabor ist im Voraus über den Zeitpunkt und die Art der Probensendung zu informieren. 180

181 23.3. Untersuchungsgang Erregernachweis Für den Erregernachweis stehen zur Verfügung die zellkulturelle Virusisolierung zum Nachweis von KSP-Virus, die real-time Polymerase-Ketten-Reaktion (real-time RT-PCR) zum Nachweis von KSP-Virusgenom, der Immunfluoreszenztest (IFT), auch Fluorezenzantikörpertet (FAT) bezeichnet, zum Nachweis von KSP-Virusantigen, der Antigen-ELISA zum Nachweis von KSP-Virusantigen (Methode, die nicht mehr empfohlen wird). Qualität und Effizienz der von den Untersuchungseinrichtungen angewandten Diagnosemethoden müssen im Rahmen der laborübergreifenden Vergleichtests (KSP-Ringtest), die das Referenzlabor jährlich durchführt, kontrolliert werden Zellkulturelle Virusisolierung Die zellkulturelle Virusisolierung wird zum qualitativen Nachweis von Pestiviren in Untersuchungsmaterial (Leukozyten, Serum, Vollblut, Organanreibungen) eingesetzt und gilt als der Goldstandard der direkten Nachweisverfahren. Das zu untersuchende Material wird auf empfängliche Zellkulturen verimpft. Im positiven Falle vermehrt sich das Pestivirus in der Zellkultur und wird durch eine Immunfärbung nachgewiesen. Die Virusisolierung, die hauptsächlich die Rolle eines Bestätigungstest darstellt, ist am besten zur Untersuchung von Proben kleiner Tiergruppen und weniger zur Überwachung großer Bestände geeignet. Die Virusisolierung ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig (Ergebnisse liegen frühestens nach drei Tagen vor). Zwei weitere Zellkulturpassagen können erforderlich sein, um eine kleine Virusmenge in der Probe nachweisen zu können. Bis ein Endergebnis vorliegt, können durchaus 10 Tage vergehen. Autolytische Proben können einen zytotoxischen Effekt auf die Zellkultur haben und den Test entsprechend beeinträchtigen. Bei Primärausbrüchen ist die zellkulturelle Virusisolierung als Referenzmethode zur Bestätigung von Positivbefunden früherer Antigen-ELISA-, PCR- oder IFT-Tests obligatorisch. Alle KSPV-Isolate aus Primärausbrüchen bzw. Primärfällen in der Wildschweinpopulation müssen im nationalen Referenzlabor einer genetischen Typisierung unterzogen werden. In jedem Falle sind diese Virusisolate für die Virussammlung unverzüglich an das Referenzlabor weiterzuleiten. Ein Arbeitsprotokoll für die zellkulturelle Virusisolierung befindet sich im Anhang I Immunfluoreszenztest (IFT) / Fluoreszenzantikörpertest (FAT) Testprinzip ist der Nachweis von Virusantigen in dünnen Kryostatschnitten von Organproben KSP-verdächtiger Schweine. Das intrazelluläre Antigen wird entweder direkt oder indirekt mit Hilfe eines spezifischen KSP-Antikörpers nachgewiesen. Die im direkten IFT anzuwendenden polyklonalen KSP-Konjugate können mit Unzulänglichkeiten behaftet sein, wie Kreuzreaktionen mit anderen Pestiviren oder zusätzlichem Gehalt an markierten Antikörpern gegen andere Virusarten. Dies erschwert die Diagnosestellung oder kann zu Fehldiagnosen führen. Deshalb sollte nach Möglichkeit auf die Verwendung polyklonaler Konjugate verzich- 181

182 tet werden. Als die bessere Alternative bietet sich für die Routinediagnostik die Anwendung des indirekten IFT mit kommerziell verfügbaren und behördlich zugelassenen Anti-KSPVmonoklonalen Antikörpern an, zumal ein mit polyklonalem Konjugat erhobener Positivbefund ohnehin durch erneutes Anfärben mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper zu bestätigen ist. Als Organproben eignen sich Tonsillen, Nieren, Milz, diverse Lymphknoten und Ileum. Bei Wildschweinen kann auch ein Knochenmarkabstrich verwendet werden, falls Organmaterial nicht erhältlich oder autolytisch ist. Der Test lässt sich innerhalb eines Tages durchführen. Da Organproben nur von toten Tieren entnommen werden können, ist der Test für Screeningzwecke nur begrenzt geeignet. Die Zuverlässigkeit der Testergebnisse kann durch unklare Immunreaktionen beeinträchtigt werden, insbesondere, wenn die Erfahrung des Untersuchers noch begrenzt ist oder das Ausgangsmaterial autolytisch war. Ein Arbeitsprotokoll für den IFT befindet sich im Anhang II Real-time Polymerase-Ketten-Reaktion (real-time RT-PCR) Die PCR dient dem Nachweis von Virusgenom in Blut- oder Organproben. Kleine Fragmente viraler RNA werden in DNA-Fragmente transkribiert, die sich durch die PCR zu nachweisbaren Mengen amplifizieren. Da sich mit diesen Tests nur eine Genomsequenz des Virus nachweisen lässt, kann die PCR auch einen Positivbefund ergeben, wenn kein lebensfähiger Infektionserreger mehr vorhanden ist (z.b.in autolytischen Geweben oder Proben von rekonvaleszenten Schweinen). Aufgrund der hohen Sensitivität dieses Verfahrens können mehrere Proben (z.b. 10) gepoolt werden. Die real-time RT-PCR eignet sich sehr gut zur Routineuntersuchung bei einem hohen Probenaufkommen (Massendiagnostik). Zum Erregernachweis in Probenmaterial von Wildschweinen könnte sie die Vorzugsmethode sein, wenn das Material autolytisch ist und die Virusisolierung wegen Zytotoxizität nicht mehr möglich ist. Die real-time RT-PCR lässt sich innerhalb eines Tages durchführen. Sie setzt eine geeignete Laborausrüstung, spezielle Räumlichkeiten und erfahrenes Laborpersonal voraus. Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, dass infektiöse Viruspartikel nicht im Labor repliziert werden müssen. Der Test ist hochempfindlich, allerdings kann es auch zu Kontaminationen kommen, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Strenge Qualitätskontrollen sind daher unerlässlich. Einige real-time RT-PCR-Protokolle sind pestivirus- spezifisch und machen weitere Bestätigungstests, wie beispielsweise die Sequenzierung des PCR-Produkts, erforderlich. Für die real-time RT-PCR gibt es mehrere adäquate Arbeitsprotokolle, die im Referenzlabor erhältlich sind ELISA zum Antigennachweis KSP-Virusantigen lässt sich mit verschiedener kommerziell erhältlicher ELISA-Kits bei klinisch kranken Tieren nachweisen. Es dürfen nur vom Referenzlabor geprüfte Chargen zugelassener Antigen-ELISA verwendet werden. Die Sensitivität aller derzeit im Handel erhältlichen Testkits liegt unterhalb der zellkulturellen Virusisolierung. Sie ist höher bei Ferkelblutproben als bei Blutproben adulter Schweine. Wegen der niedrigen Empfindlichkeit sollten nur Proben von verdächtigen Tieren mit klinischen Symptomen oder pathologischen Veränderungen untersucht werden. Der Test ist zur Untersuchung von Tieren ohne klinische oder pathomorphologische Veränderungen ungeeignet. Aufgrund der geringen Sensitivität wird der Antigen-ELISA zum Nachwaeis von KSP-Virusantigen nicht empfohlen. 182

183 Auswertung der Ergebnisse virologischer Untersuchungen Ein Positivbefund im Antigen- oder Genomtest (PCR, IFT, ELISA) setzt voraus, dass der betreffende Test mit KSP-Virusspezifischen Antikörpern oder spezifischen Primern durchgeführt wurde. War der angewandte Test nicht KSPV-, sondern lediglich Pestivirusspezifisch, so muss er mit KSPV-spezifischen Reagenzien wiederholt werden. Bei Primärausbrüchen ist die zellkulturelle Virusisolierung als Referenzmethode obligatorisch. Die Virusisolierung ist auch im Falle positiver IFT-, ELISA- oder PCR-Befunde, die nicht mit klinischen Symptomen oder Läsionen assoziiert sind, sowie in anderen Zweifelsfällen erforderlich. Sekundärausbrüche können bestätigt werden, wenn bei den betreffenden Tieren zusätzlich zu einem epidemiologischen Zusammenhang mit einem bestätigten Seuchenherd oder Seuchenfall klinische Symptome oder Läsionen nachgewiesen wurden und für einen Antigen- oder Genomtest (PCR, IFT, ELISA) ein Positivbefund vorliegt. Ein Primärherd in der Wildschweinpopulation kann nach der Virusisolierung bestätigt werden oder wenn für mindestens zwei Antigen- oder Genomtests ein Positivbefund vorliegt. Jedoch kann die Feststellung von KSP-Virusantigen mittels IFT allein zu einer Bestätigung führen, wenn für KSP sprechende klinische Befunde und Läsionen vorliegen. Weitere KSP-Fälle bei Wildschweinen, bei denen ein epidemiologischer Zusammenhang mit zuvor bestätigten Fällen nachgewiesen wurde, können bestätigt werden, wenn für einen Antigen- oder Genomtest ein Positivbefund vorliegt Antikörpernachweis Bei rekonvaleszenten Schweinen lassen sich schützende neutralisierende Antikörper ab der zweiten Woche post infectionem noch mehrere Jahre nach der Infektion oder sogar lebenslang nachweisen. Antikörper werden sporadisch auch bei moribunden Tieren in der Endphase der Erkrankung festgestellt. Bei einigen chronisch KSP-kranken Schweinen sind Antikörper möglicherweise für einige Tage am Ende des ersten Monats post infectionem nachweisbar. Die Halbwertszeit maternaler Antikörper beträgt ungefähr zwei Wochen. Daher sind maternale Antikörper ab dem 3. Lebensmonat in der Regel nicht mehr nachweisbar. Das bedeutet, dass KSPV-Antikörper in über 3 Monate alten Ferkeln auf einen aktiven Immunschutz hinweisen. Der Nachweis von KSPV-Antikörpern in Serum-oder Plasmaproben dient der Untermauerung der KSP-Diagnose in seuchenverdächtigen Betrieben, der Bestimmung der Infektionsdauer bei bestätigten Ausbrüchen sowie der Seuchenüberwachung. Bei erst seit kurzem bestehenden Infektionen sind serologische Nachweisverfahren jedoch nur von begrenztem Wert. Eine geringe Anzahl seropositiver Schweine mit niedrigem Neutralisationstiter deutet auf eine junge Infektion hin (die erst seit zwei bis vier Wochen besteht). Viele Tiere mit hohem Neutralisationstiter legen den Schluss nahe, dass das Virus schon vor über einem Monat in den Betrieb eingeschleppt wurde. Der Standort seropositiver Schweine im Haltungsbetrieb kann ein wichtiger Anhaltspunkt für den Einschleppungsweg sein. Die Befunde der serologischen Untersuchungen müssen jedoch sorgfältig ausgewertet werden, wobei allen Ergebnissen der klinischen, virologischen und epidemiologischen Untersuchungen Rechnung zu tragen ist. In seltenen Fällen können Einzelreagenten zu falsch-positiven serologischen Reaktionen führen. Einzelreagenten können virusneutralisierende Antikörpertiter aufweisen, die vom Grenzfall (die Regel) bis zu stark positiven Befunden reichen. Bei Wiederholungsuntersuchungen können Einzelreagenten einen abnehmenden oder konstanten Titerwert zeigen. Im Allgemeinen manifestieren sich diese falsch-positiven Reaktionen nur bei wenigen, in der Regel älteren Tieren eines Bestands. Die Ursache für diese Reaktionen ist unbekannt. 183

184 Der Antikörpernachweis kann entweder mit dem Neutralisationstest oder mit dem Antikörper- ELISA durchgeführt werden. Qualität und Effizienz der von den Untersuchungseinrichtungen angewandten serologischen Diagnosemethoden müssen im Rahmen der laborübergreifenden Vergleichtests (KSP-Ringtest), die das Referenzlabor durchführt, regelmäßig kontrolliert werden Neutralisationstest (NT) Der NT dient der Bestimmung der virusneutralisierenden Aktivität der Serumantikörper. Für Screeningzwecke werden die zu untersuchenden Seren zunächst 1:10 verdünnt. Ist eine vollständige Titration zur Bestimmung des Antikörpertiters erforderlich, müssen Serumverdünnungen beginnend mit 1:2 oder 1:5 angesetzt werden. Der NT ist die empfindlichste und zuverlässigste Methode zum Nachweis von KSPV- Antikörpern und wird daher für die serologische Untersuchung sowohl einzelner Tiere als auch ganzer Bestände empfohlen. Mit diesem Test können jedoch auch kreuzneutralisierende Antikörper festgestellt werden, die bei Infektionen mit ruminanten Pestiviren auftreten können. Der NT zum Nachweis von BVDV- und BDV-Antikörpern folgt denselben Prinzipien und wird zur serologischen Differentialdiagnose der KSP angewandt. Pestivirus-Stämme, die in Neutralisationstests verwendet werden, müssen der Empfehlung des Referenzlabors entsprechen. Ein Arbeitsprotokoll für den NT befindet sich im Anhang III Antikörper-ELISA Für den Antikörpernachweis mittels ELISA dürfen nur vom Referenzlabor geprüfte Chargen zugelassener ELISA verwendet werden. Der ELISA gilt als weniger empfindlich als der NT und sollte daher nur zum Screening auf Herdenbasis eingesetzt werden. Nicht alle zugelassenen und im Handel erhältlichen ELISA können zwischen KSP-Virus und anderen Pestiviren unterscheiden. Daher müssen in Zweifelsfällen, positive serologische Befunde im NT abgeklärt werden. Der ELISA muss gewährleisten, dass alle KSP-Infektionen im Rekonvaleszenzstadium (nach Tag 21 post infectionem) erkannt werden, und es sollte möglichst nicht zu Interferenzen durch kreuzreagierende Antikörper gegen Wiederkäuer-Pestiviren kommen Auslegung serologischer Testergebnisse und Differentialdiagnose zur Abgrenzung von Wiederkäuer-Pestivirus-Infektionen (BVD und BD) a. Bei Nachweis eines KSPV-Neutralisationstiters von gleich oder höher als 10 ND 50 oder bei einem positiven ELISA-Befund muss eine differentialdiagnostische Abklärung erfolgen, wenn die KSP nicht schon mit anderen Nachweisverfahren (Erregernachweis) nachgewiesen wurde. Die Proben sind in einem zweiten Untersuchungsgang auf neutralisierenden Antikörper gegen das KSP-Virus und gegen Wiederkäuer-Pestiviren (vergleichende Endpunkt-Titrationen) erneut zu testen. b. Zeigen die vergleichenden Neutralisationstests Antikörper gegen Wiederkäuer- Pestiviren und keine oder weniger als das Dreifache (oder zwei Titerstufen) Antikörper gegen das KSP-Virus, so gilt der KSP-Verdacht als entkräftet, es sei denn, es existieren andere Gründe, die für KSP sprechen. Zeigen die vergleichenden 184

185 Tests einen Virusneutralisationstiter von gleich oder höher als 10 ND 50 und ist dieser Titer gleich oder höher als die Titer gegen andere Pestiviren, kann die KSP bestätigt werden, vorausgesetzt, in dem betreffenden Betrieb liegen entsprechende epidemiologische Befunde vor. c. Wenn die epidemiologische Untersuchung keinen Seuchenbefund ergab oder wenn die serologischen Ergebnisse unschlüssig sind, müssen so schnell wie möglich weitere serologische und virologische Untersuchungen durchgeführt werden, um den KSP-Verdacht zu bestätigen oder zu entkräften. Kann der KSP-Verdacht mit weiteren Untersuchungen jedoch nicht entkräftet werden (unklare serologische Befunde, negativer Erregernachweis), so werden frühestens zwei Wochen nach den letzten Untersuchungen in dem betreffenden Betrieb weitere Blutproben für serologische Untersuchungen entnommen d. Im Rahmen dieser weiteren Untersuchungen werden die bereits untersuchten Schweine, d.h. deren zuvor entnommene Proben, erneut einer vergleichenden serologischen Untersuchung unterzogen (Probenpaare), um eine etwaige Serokonversion in Bezug auf KSP oder Wiederkäuer-Pestiviren festzustellen. Lässt sich die KSP aufgrund dieser Untersuchungen nicht bestätigen, so gilt der Verdacht als entkräftet. 185

186 23.4. ANHANG Im Anhang befinden sich die Arbeitsprotokolle der im Referenzlabor durchgeführten Tests, die nicht kommerziell erhältlich sind. Es handelt sich um Protokollvorschläge, die entweder so in die Routinediagnostik übernommen werden können oder als Referenzmethode zur Validierung der eigenen Hausmethoden geeignet sind. Sollte mit den Hausmethoden unbefriedigende Ergebnisse in dem jährlich durchgeführten KSP-Ringtest erzielt werden, wird empfohlen, die hier aufgezeigten Arbeitsprotokolle zu übernehmen. Für Fragen und Hilfestellung bei der KSP-Dignostik steht das Referenzlabor jederzeit zur Verfügung. Anhang I Zellkulturelle Virusisolierung Die zellkulturelle Virusisolierung wird zum qualitativen Nachweis von Pestiviren in Untersuchungsmaterial (Leukozyten, Serum, Vollblut, Organanreibungen) eingesetzt. Das zu untersuchende Material wird auf empfängliche Zellkulturen verimpft. Im positiven Falle vermehrt sich das Pestivirus in der Zellkultur und wird durch eine Immunfärbung nachgewiesen. Probenaufarbeitung Gewinnung von Leukozyten Die Leukozytenfraktion wird bevorzugt aus EDTA-Blutproben gewonnen. Dafür wird wie folgt verfahren: EDTA-Blutprobe (5 bis 10 ml) mit 1 ml Dextransulfatlösung versetzen und nach vorsichtigem Schwenken etwa 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur (alternativ 30 Minuten bei 37 C) stehen lassen. In dieser Zeit setzen sich die Erythrozyten ab. Den leukozytenhaltigen milchig-trüben Überstand absaugen und für 10 Minuten bei 2000g zentrifugieren. Das Sediment wird nach zweimaligem Waschen in je 5 ml Ca-Mg-freier phosphatgepufferter Salzlösung (PBS-minus) in 2 ml Kulturmedium aufgenommen. (Jedem Waschschritt folgt ein Zentrifugationsschritt für 10 Minuten bei 2000g.) Die konzentrierte Leukozytensuspension dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Material bei 70 C gelagert werden. Herstellung von Organhomogenisaten (Organanreibungen) Circa 1 g schwere Organteilchen (z.b. aus Milz, Lymphknoten, Tonsille, Niere etc.) werden mit der Schere fein zerkleinert und mit der neunfachen Menge Kulturmedium und dem Zehnfachen der üblichen Konzentration an Antibiotika in einem Mörser zusammen mit sterilem Seesand verrieben. Nach einstündiger Einwirkung des Antibiotikums bei Raumtemperatur wird die Organsuspension für 15 Minuten bei 2500 g zentrifugiert. Der Überstand dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Material bei 70 C gelagert werden. Serumgewinnung Blutproben ohne gerinnungshemmenden Zusatz werden für 15 Minuten bei 1300g zentrifugiert. Das Serum dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Serum bei 20 C gelagert werden. 186

187 Inokulation der Zellkulturen Jeweils 0,1 bis 0,3 ml des zu untersuchenden Materials (Leukozytensuspension, Organanreibung, Serum) wird auf eine ein bis zwei Tage alte PK15-Zellkultur im Doppelansatz inokuliert (1. Passage). Die Zellen können in Makrotiterplatten, Kulturflaschen oder Kulturröhrchen gezüchtet werden. In jedem Test wird zusätzlich eine Zellkontrolle mitgeführt. Bei der Zellkontrolle wird statt Untersuchungsmaterial Kulturmedium eingesetzt. Vor der Inokulation der Zellkulturen wird das Kulturmedium verworfen. Nach der Inokulation bildet das Inokulum einen dünnen Film auf dem Zellrasen. Nach einer ein- bis zweistündigen Adsorptionszeit wird das Inokulum verworfen, der Zellrasen einmal mit Medium oder PBS-minus gewaschen und anschließend mit Kulturmedium versorgt. Die Zellkulturen werden mindestens 2 maximal 5 Tage bei 37 C inkubiert. Während dieser Zeit werden die Zellkulturen regelmäßig mikroskopiert um auftretende zytopathische oder zelltoxische Effekte zu beobachten. Die Makrotiterplatten können anschließend einer Immunfärbung unterzogen werden, die Kulturflaschen bzw. Kulturröhrchen werden bei -70 C eingefroren, um eine weitere Passage durchzuführen. Für die zweite Passage werden tiefgefrorene Kulturröhrchen zügig aufgetaut und für 5 Minuten bei 500g zentrifugiert. Je 0.2 ml des Überstandes werden in 2 Vertiefungen einer 48-Loch-Makrotiterplatte mit einen Tag alten Zellkulturen inokuliert (am Vortag die Platte vorbereiten!). Vor der Inokulation der Makrotiterplatte wird das Kulturmedium verworfen. Nach der Inokulation bildet das Inokulum einen dünnen Film auf dem Zellrasen. Nach einer ein- bis zweistündigen Adsorptionszeit wird das Inokulum verworfen, der Zellrasen einmal mit PBS-minus oder Zellkulturmedium gewaschen und anschließend mit Kulturmedium versorgt. Die Platten werden 2 bis 4 Tage im CO 2 -Schrank bei 37 C inkubiert. Immunreaktion Fixation Das Kulturmedium wird abgesaugt und der Zellrasen einmal mit 1/3 PBS-minus gewaschen. Flüssigkeitsreste müssen gründlich abgesaugt werden. Durch Inkubation für 2h in einem Trockenschrank bei 80 C wird der Zellrasen fixiert. Nach dem Abkühlen der Platten erfolgt die Immunfärbung. Wenn die zu untersuchenden Platten nicht sofort weiter bearbeitet werden können, besteht die Möglichkeit sie kurzfristig (<1 Woche) bei 4 C und längerfristig (>1 Woche) bei 20 C zu lagern. Immunfärbung Die Immunfärbung kann direkt mit einem geprüften Pestiviruskonjugat durchgeführt werden. Alternativ besteht die Möglichkeit, indirekt mit einem monoklonalen Antikörper, der an das KSP-Virus bindet und einem Anti-Maus-Peroxidase-Konjugat, das an den monoklonalen Antikörper bindet, zu arbeiten. Die fixierten Platten werden vor der Zugabe des Konjugates oder des monoklonalen Antikörpers mit 1/3 PBS-minus angefeuchtet und anschließend ausgeklopft. a) Direkte Methode Zugabe von 150µl pro Vertiefung (48-Loch-Platte) eines KSP-Konjugates in der entsprechenden Gebrauchsverdünnung. Inkubation für 1 Stunde bei 37 C in einer feuchten Kammer. Die Gebrauchsverdünnung des Konjugates wird vom Hersteller mitgeteilt. 187

188 b) Indirekte Methode Pro Vertiefung (48-Loch-Platte) 150µl eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, in der Gebrauchsverdünnung zugeben und 1 Stunde bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren. Der Antikörper wird in Waschpuffer verdünnt. Anschließend 3x mit Waschpuffer waschen. Danach erfolgt die Zugabe von 150µl eines vorab getesteten Anti-Maus-Peroxidase-Konjugates und die Inkubation für 1h bei 37 C. Das Konjugat wird in Waschpuffer verdünnt. Anschließend 3x mit Waschpuffer und danach 1x mit Aqua bidest waschen. Farbreaktion Nach der Immunreaktion erfolgt die eigentliche Färbung der Zellen mittels Chromogen/Substratlösung. Es werden 150µl Chromogen/Substratlösung pro Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur im Dunkeln für ca. 15 bis 25 Minuten inkubiert, danach entfernt und ca. 300µl Aqua bidest zugegeben. Die Chromogen/Substratlösung muss immer frisch aus Stammlösungen hergestellt werden Auswertung Das Zytoplasma antigenhaltiger Zellen färbt sich braunrot an. Jede einzelne Kavität der Platte wird mittels Umkehrmikroskop ausgewertet. Dabei gilt eine Kavität bereits als infiziert, wenn das Zytoplasma nur einer Zelle spezifisch gefärbt ist Anhang II Immunfluoreszenztest (IFT) Methodische Empfehlungen Es wird empfohlen, in der Labordiagnostik der KSP nach Möglichkeit auf die Verwendung polyklonaler Konjugate zu verzichten und solange monoklonale Konjugate nicht auf dem Markt sind - den indirekten IFT mit monoklonalen Antikörper (mak) anzuwenden. Organproben Organproben (Tonsille, Milz, Lymphknoten, Niere, Ileum) werden in einer Größe von ca. 10 mm x 10 mm x 5 mm in flüssigem Stickstoff oder in auf ca. -70 C herabgekühltem n-heptan schockgefrostet. Die Lagerung der Organproben erfolgt bei ca. -70 C. Fixierung der Kryostatschnitte Etwa 5 µm dicke Kryostatschnitte werden luftgetrocknet (ca. 30 min). Die Fixierung erfolgt in auf ca. -20 C vorgekühltem Azeton für 15 bis 20 min bei ca. -20 C. Fixierte Kryostatschnitte können mehrere Monate bei ca. -20 C gelagert werden. Nachweis des KSP-Virusantigens mit dem indirekten IFT In einem Prüfansatz werden bearbeitet: 1. Schnitte von verdächtigen Organproben, 2. Schnitte von Organproben eines KSPV-freien Schweines ( = negative Kontrollen), 3. Schnitte von KSPV-positiven Organproben ( = positive Kontrollen). 188

189 In jedem Prüfansatz kommen zur Anwendung: 1. Anti-KSPV-mAk, 2. irrelevanter mak. Protokoll Alle folgenden Schritte erfolgen bei Raumtemperatur. Waschen der fixierten Kryostatschnitte in PBS für 5 min Blockierung mit 5 % bovinem Serumalbumin (BSA) in PBS für 30 min Kurz waschen in PBS Inkubation mit mak in vom Hersteller empfohlener Arbeitsverdünnung in PBS für 60 min Waschen in PBS: 3 x 5 min Inkubation mit FITC-markiertem Sekundärantikörper (Anti-Maus-Ig-FITC-Konjugat) in empfohlener Arbeitsverdünnung für 60 min: Verdünnung in PBS und Zusatz des Kontrastfarbstoffes Evans blue (3 Teile Konjugat- Arbeitsverdünnung + 1 Teil 0,005 % Evans blue in PBS). Waschen in PBS: 3 x 5 min Waschen in A. dest. für mindestens 5 min Lufttrocknung bis zum feuchten Glanz Eindecken der noch leicht feuchten Schnitte mit PPBS-Glycerol-Gemisch (1 Teil PBS + 9 Teile Glycerol) oder DABCO-Fluoreszenzerhaltungs-Puffer Mikroskopische Beurteilung der Schnitte Für die mikroskopische Beurteilung der Schnitte ist ein aufrechtes Mikroskop mit Auflichtfluoreszenz erforderlich. Die Fluoreszenzeinrichtung sollte mit einer Quecksilberdampf- Kurzbogenlampe HBO 100 W ausgerüstet sein. Die Beurteilung der Schnitte erfolgt im exakten Vergleich mit den negativen und positiven Kontrollschnitten. KSP-Virusantigen-positive Zellen zeigen zytoplasmatische, weitgehend homogene, leuchtende hellgrüne Fluoreszenz. Die Zellkerne bleiben dunkel ausgespart. Virusantigen kann in verschiedenen Zellarten vorliegen, insbesondere in Zellen der lymphatischen Gewebe (lymphatische Keimzentren, diffuses lymphatisches Gewebe, außerdem im Kryptenepithel der Tonsillen, weiße und rote Milzpulpa), in Epithelzellen, in Zellen des roten Knochenmarkes. Je nach Intensität des Befalls und dem Stadium der Infektion findet man entweder nur einzelne, im Gewebsverband eingestreute oder zahlreiche bis sehr viele Zellen mit spezifischer Fluoreszenz. Im positiven Fall können alle untersuchten Organproben oder nur einzelne Proben befallen sein. Die Kontrastfärbung mit Evans blue führt zu einer allgemeinen rötlich-bräunlichen Färbung und überdeckt geringe unspezifische Fluoreszenzerscheinunngen. Nicht-zytoplasmatische Fluoreszenzen oder gelbgrün- und gelb-granuläre, zellgebundene Fluoreszenzerscheinungen sind als unspezifisch zu betrachten. Degenerierte Zellen und Zelltrümmer zeigen oft hellgrüne bis gelbgrüne unspezifische Fluoreszenz. 189

190 Anhang III Neutralisationstest Der Neutralisationtest (NT) wird zum qualitativen und quantitativen Nachweis von neutralisierenden Antikörpern gegen Pestiviren (KSPV, BVDV, BDV) durchgeführt. Probenaufarbeitung Der Neutralisationstest wird routinemäßig mit Serum durchgeführt. In Ausnahmefällen, wenn kein Serum zur Verfügung steht oder wenn spezielle Fragestellungen zu beantworten sind, kann der Test auch mit Plasma, Fleischsaft, Körperhöhlenexudaten durchgeführt werden. Serum wird aus Blutproben ohne gerinnungshemmenden Zusatz gewonnen. Dafür werden die Blutröhrchen für 15 Minuten bei 1300 g zentrifugiert. Das Serum, das sich oberhalb des Blutkuchens absetzt, wird abpipettiert und portioniert (1 bis 2 ml Portionen). Wenn die zu untersuchende Serumprobe nicht sofort verarbeitet werden kann, wird sie kurzfristig (<1 Woche) bei 4 C und längerfristig (>1 Woche) bei -20 C gelagert. Plasma wird auf gleiche Weise aus Blutproben mit gerinnungshemmenden Zusätzen gewonnen und bearbeitet. Neutralisationsschritt Verdünnungsreihen Der Test wird in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte unter Verwendung von Zellkulturmedium mit Antibiotikazusatz durchgeführt. Es wird eine Serumverdünnungsreihe in 2-er-Stufen (z.b. von 1:5 bis 1:640) mit je einem Volumen von 50 µl pro Kavität hergestellt. Pro Serumverdünnungsstufe werden zwei Kavitäten (Doppelansatz) nebeneinander beschickt. Die Verdünnung von 1:5 erhält man, indem man 80 µl Kulturmedium mit 20 µl Serumprobe in der ersten Vertiefungsreihe mischt. In alle anderen Kavitäten werden 50 µl Kulturmedium vorgelegt. Mit einer Multikanalpipette werden aus der ersten Verdünnungsstufe (1:5 Verdünnung) 50 µl aufgenommen, in die nächste Reihe gegeben, durchmischt, und die Verdünnungsreihe fortgesetzt (8 bis 12 Verdünnungsstufen). Die letzten 50 µl werden verworfen. Jede Kavität enthält jetzt 50 µl einer Serum-Medium-Verdünnung. Mindestens zwei positive Referenzseren (Seren mit bekanntem Titer) werden in gleicher Weise als Kontrollen mitgeführt (positive Serumkontrollen). Die Neutralisationstiter der Kontrollseren sollten bei einem Serum unter 100 ND 50 und bei dem anderen über100 ND 50 liegen Testvirus In jede Kavität werden danach 50 µl mit 100 KID 50 der Testvirussuspension gegeben. Die Testvirussuspension muss unmittelbar vor Gebrauch mit Kulturmedium auf 100 KID 50 /50µl (2000 KID 50 /ml) eingestellt werden. Die benötigte Menge an Testvirus (ca. 5 ml pro Mikrotiterplatte) ist in einem Ansatz herzustellen. Der Verdünnungsfaktor um die Testvirussuspension auf 100 KID 50 /50 µl einzustellen wird rechnerisch ermittelt. Ein Rechenbeispiel ist im Anhang IV zu finden. Kontrollen Neben den schon erwähnten positiven Serumkontrollen werden eine Zellkontrolle, eine Viruskontrolle und eine Rücktitration des Testvirus mitgeführt. Als Zellkontrolle werden mindestens 6 Kavitäten mit 100 µl Kulturmedium beschickt. Sie enthalten kein Serum und kein Virus. Im weiteren Verlauf werden sie mit Zellen beschickt. In jedem Test wird außerdem 190

191 eine Rücktitration des Testvirus zur Bestimmung der eingesetzten KID 50 durchgeführt. Mit der Rücktitratrion kontrolliert man den tatsächlichen Virusgehalt im Test. Hierbei wird die im Test eingesetzte Virusverdünnung in Log-2-Schritten beginnend bei 1:10 bis 1:1280 ausverdünnt. Die Verfahrensweise ist wie bei der Serumverdünnung. 180µl Kulturmedium werden vorgelegt, 20 µl Testvirussuspension dazugegeben (1:10) und anschließend ausverdünnt. Pro Verdünnungsstufe werden vier Kavitäten nebeneinander mit 100 µl Virusverdünnung beschickt. Neutralisation Die Mikrotiterplatte inkubiert daraufhin für mindestens 1 bis maximal 2 Stunden bei 37 C in einer feuchten Umgebung in einem CO 2 -Schrank (5 % CO 2 ). Während dieser Zeit findet der Neutralisationsprozess statt. Nach der Inkubationszeit werden in jede Kavität 100 µl der entsprechenden Zellsuspension hinzugefügt. Die Zelldichte muss so eingestellt sein, dass nach 24 Stunden ein konfluenter Zellrasen entsteht. Die Mikrotiterplatte verbleibt für 72 bis 96 Stunden zur Inkubation bei 37 C in einer feuchten Umgebung im CO 2 -Schrank (5 % CO 2 ). Die weiteren Schritte der Immunreaktion (Fixation, Immunfärbung, Farbreaktion) erfolgen wie bei der zellkulturellen Virusisolierung beschrieben. Auswertung Das Zytoplasma antigenhaltiger Zellen färbt sich braunrot an. Jede einzelne Kavität der Mikrotiterplatte wird mittels Umkehrmikroskop ausgewertet. Dabei gilt eine Kavität bereits als infiziert, wenn das Zytoplasma nur einer Zelle spezifisch gefärbt ist. Falls in allen Verdünnungsstufen das Virus neutralisiert wurde und so der Neutralisationstiter nicht errechnet werden kann, wird von dem Ausgangsserum eine 1:100-Verdünnung hergestellt und der Neutralisationstest in 2-er-Verdünnungstufen von 1:100 bis 1:12800 wiederholt. Der Rücktitrationstiter des Testvirus sollte idealerweise 100 KID 50 betragen, mit einer Schwankungsbreite zwischen 40 und 660 KID 50. Der Titer der mitgeführten Kontrollseren sollte nicht mehr als eine Verdünnungsstufe ober- oder unterhalb des Erwartungswertes liegen. Die Zellkontrolle muss negativ sein. Der Neutralisationstiter wird als der Kehrwert der Serumverdünnung bestimmt, bei der in einer von zwei Vertiefungen (50 %) das Virus neutralisiert wurde. Der Titer wird als neutralisierende Dosis 50 (ND 50 ) angegeben. Ein Titer, der zwischen zwei Verdünnungsstufen liegt, wird als der Durchschnittswert zwischen diesen zwei Stufen angegeben. 191

192 Anhang IV Geräte und Materialien Makrotiterplatten (24- oder 48-Loch-Platten) Mikrotiterplatten (96-Loch-Platten) Kulturröhrchen oder Kulturflaschen Mehrkanalpipetten, Pipetten, sterile Plastikspitzen Empfängliche Zelllinien vom Schwein für die zellkulturelle Virusisolierung (z.b. PK15 Zellen, Bezugsquelle Zellbank der BFAV) Zellkulturen für den Neutralisationstest, z.b.: PK15 Zellen für den KSP-NT; MDBK Zellen für den BVD-NT; SFT Zellen für den BD-NT (Bezugsquelle: Zellbank der BFAV) Zellkulturmedien (Bezugsquelle: kommerzielle Hersteller) Testviren für den Neutralisationstest (Bezugsquelle: Referenzlabor) Spezifische monoklonale Antikörper gegen Pestiviren (Bezugsquelle: kommerzielle Hersteller) Peroxidasemarkierte Anti-Maus-Antikörper (Bezugsquelle: kommerzielle Hersteller) Positive Kontrollseren (Bezugsquelle: Referenzlabor) Standardmäßige Laborausstattung für ein Viruslabor (Sterilwerkbank, Umkehrmikroskop, CO 2 -Schrank (37 C), Zentrifuge, Inkubator (80 C), Kühlschrank, Kühltruhe (-20 C, -70 C). Reagenzien Antibiotikalösung 1,25 g Penicillin 2g Streptomycin In 20 ml sterilem Aqua bidest lösen, portionieren und bei 20 C einfrieren 1 ml Konzentrat reicht für 1 L Medium Zehnfache Menge Konzentrat für Organanreibungen Waschlösung: PBS-minus/Tween (Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne Calcium- und Magnesium-Ionen mit Tween) ph 7,0-7,2 nach Dulbecco u. Vogt (1954): 80,00 g NaCl 2,00 g KCl 14,24 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 2,00 g KH 2 PO 4 ad 10,0 L Aqua bidest. 0,1 ml Tween-20 pro 1000 ml PBS-minus 1/3PBS-minus 1 Teil PBS-minus Gebrauchslösung, 2 Teile Aqua bidest 192

193 Dextransulfatlösung 7,5 g NaCl 15 g EDTA 300 mg Streptomycin 200 mg Penicillin ad 1000 ml Aqua bidest. In 100 ml dieser Lösung werden 5 g Dextransulfat (Mol.-Gew ) gelöst Chromogen/Substratlösung Angaben für 2 Mikrotiterplatten Angaben für 2 Mikrotiterplatten: 9,00 ml 0,05 mol/l Natriumazetatpuffer, ph 5,0 1 ml AEC-Lösung (3-Amino-9-Ethylcarbazol) 0,10 ml H 2 O 2 3%-ig Herstellung der AEC-Lösung 6 mg AEC in 1,5 ml DMF (Dimethylformamid) langsam lösen, nicht schütteln (Menge reicht für 3 Mikrotiterplatten). Die AEC-Lösung kann in dunklen Flaschen bei Kühlschranktemperatur mehrere Monate gelagert werden. Achtung, AEC ist kanzerogen! (Laborhandschuhe tragen, nicht mit Metallspatel abwiegen!) Rechenbeispiel zur Berechnung des Verdünnungsfaktors für das Testvirus: Die im Neutralisationstest zum Einsatz kommende Virussuspension (Testvirus) soll einen Titer von 100 KID 50 /50µl haben. Folglich muss das hochtitrigere Ausgangsvirus entsprechend verdünnt werden. Die Berechnung des Verdünnungsfaktors erfolgt nach der Formel: Titer log 10 KID 50 /0,1ml Ausgangsvirus minus * = log 10 Virusverdünnung; entlogarithmieren! Reziproker Wert = Virusverdünnung. Beispiel: Der Titer des Ausgangsvirus beträgt 10 6,3 KID 50 / ml. Das sind 10 5,3 KID 50 /0,1ml. Berechnung: 10 5,3-10 2,3 = 10 3 Entlogarithmierung 3,0 log 10 = 1000 Das Ausgangsvirus muss 1 : 1000 in Kulturmedium verdünnt werden. (* 10 2,3 = 200 KID 50 pro 0,1 ml) 193

194 24. Lumpy skin disease (Dermatitis nodularis) Die Lumpy skin Erkrankung wird durch das Capripoxvirus bovis nodularisaus der Gattung- Capripoxvirusverursacht. Das Virus gehört zu den Pockenviren und ist mit den Erregern der Schaf- und Ziegenpocken nah verwandt. Für weitere Informationen siehe auch die Mitteilungen bei Schaf und Ziegenpocken. In Deutschland anzeigepflichtig seit: Nationales Referenzlabor: FLI, Insel Riems Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann Telefon: Telefax

195 25. Lungenseuche der Rinder Charakterisierung der Infektion Erreger Mycoplasma mycoides subspecies mycoides Small Colony Type (MmmSC). Es handelt sich dabei um die kleinsten auf zellfreiem Medium wachsenden Bakterien (0,3 bis 0,8 µm), die zur Klasse Mollicutes gehören. Sie besitzen keine Zellwand und bilden auf festem Nährmedium typische spiegeleiförmige Kolonien Klinische Symptomatik Die Lungenseuche ist eine hochkontagiöse bakterielle Erkrankung der Rindergattung, bei der erwachsene Tiere in erster Linie am Atmungsapparat und Kälber vor allem an den Gelenken erkranken. Außer beim Hausrind kommt die Lungenseuche auch beim Büffel, Yak und Bison vor. Die Lungenseuche ist weit verbreitet in Afrika und einigen Ländern Asiens (aktuelles Vorkommen der Krankheit siehe unter ). In Europa traten die letzten Fälle 1999 in Portugal auf. Weitere Ausbrüche gab bis in den 90er Jahren in Spanien und Italien. Deutschland ist seit vielen Jahren frei von Lungenseuche. Der letzte Fall in Deutschland stammt aus dem Jahre Aufgrund des verbreiteten Tierhandels besteht allerdings jederzeit Einschleppungsgefahr für Deutschland. Der Erreger der Lungenseuche wird primär über ausgehustetes Sekret (aerogene Infektion) übertragen. Während der Inkubationszeit von 2 bis 6 Wochen (teilweise bis zu 6 Monate) wird der Erreger von den gesund erscheinenden Tieren bereits ausgeschieden. Die Krankheit beginnt mit trockenem, kurzem Husten und Fieber. Nach weiteren Wochen zeigen sich deutliche Atembeschwerden gekennzeichnet durch schmerzhaften Husten, Auswurf, schleimig-serumhaltigen Nasenausfluss, hohe Pulsfrequenz, Verstopfung und Durchfall im Wechsel, Abmagerung, geringe Harnausscheidung (dunkelgelb bis braun). Die Futteraufnahme, das Wiederkauen sowie die Milchleistung gehen zurück. Bei jungen Tieren verläuft die Krankheit oft schnell, bei älteren Tieren häufig langsamer. 50 bis 80 % der Fälle enden tödlich, wobei die Mortalitätsrate in neu infizierten Beständen höher ist als in Herden, in denen die Lungenseuche bereits vorher auftrat. Die Seuche breitet sich innerhalb eines Bestandes relativ langsam aus. Genesene chronisch infizierte Tiere bleiben jahrelang Ausscheider und sind eine ständige Ansteckungsquelle. Bei Kälbern bis zu einem Alter von ca. 6 Monaten stehen meistens Polyarthritiden im Vordergrund. Bei ihnen führt die Krankheit schnell zu schmerzhaften und heißen Umfangsvermehrungen der Gelenke an den Gliedmaßen verbunden mit Lahmheiten (besonders Karpalund Tarsalgelenke). Gleichzeitiges Auftreten von Pneumonie-Symptomen bei erwachsenen Rindern und Arthritiden bei Kälbern geben einen wichtigen Hinweis auf das Vorliegen von Lungenseuche bei der klinischen Verdachtsdiagnose. Grundsätzlich kann zwischen akuten und chronischen Verläufen unterschieden werden, wobei die klinische Diagnose bei chronischem Verlauf ungleich schwieriger ist als bei akuter Lungenseuche. Allerdings gibt es hier viele Übergangsformen. 195

196 Differentialdiagnostik Für die Differentialdiagnostik relevant sind unspezifische katarrhalische und fibrinöse Pneumonien, Wurmbefall, Rinderpest, Tuberkulose und die pektorale Form der Pasteurellose Diagnostische Indikation Die Einleitung diagnostischer Untersuchungen wird auf der Grundlage folgender Feststellungen getroffen: a. klinische Symptome b. pathologische Veränderungen c. serologische Befunde d. epidemiologische Befunde Zuständige Untersuchungeinrichtungen benannte Veterinär- und Lebensmitteluntersuchungsämter der Länder (siehe Anhang 1) Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit (Nationales Referenzlabor für die Lungenseuche der Rinder) Naumburger Str. 96a Jena Telefon: 03641/8040 Telefax: 03641/ Rechtsgrundlagen Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen Untersuchungsmaterial Von lebenden Tieren ca. 10 ml Nativblut zur Serumgewinnung oder 5 ml Serum, 5 ml Pleuralexsudat (Entnahme zwischen 7. und 8. Rippe im unteren Brustbereich), Nasenabstriche (mit sterilen Nasentupfern) Von getöteten oder verendeten Tieren verändertes Lungengewebe am Übergang zum gesunden Gewebe (ca. 4 x 4 x 4 cm), Lnn. mediastinalis in toto, tributäre Lymphknoten, 5 bis 10 ml Brusthöhlenexsudat, 10 ml Blut (Herzblut), von Kälbern auch Gelenkflüssigkeit 196

197 Transport Die Proben sind schnellstmöglich in gekühltem, nicht gefrorenem Zustand an die untersuchende Stelle zu senden. Das Untersuchungsmaterial muss vorschriftsmäßig in dicht schließenden Behältnissen verpackt und zusammen mit dem Vorbericht und dem Untersuchungsantrag an die zuständige Untersuchungseinrichtung geschickt werden. Versandbehältnis und Probengefäße müssen eindeutig beschriftet sein. Dabei sind folgende Vorschriften einzuhalten: Gefahrgutverordnung für den Transport auf der Straße bzw. mit der Eisenbahn Infektionsschutzgesetz IATA-DGR in der jeweils gültigen Fassung für den Transport auf dem Luftweg DIN EN 829 Wegen möglicher Gefährdungen während des Transportes sollte das Untersuchungsgut durch einen Kurier übermittelt werden. Der Einsender sollte zum frühstmöglichen Zeitpunkt das Untersuchungslaboratorium von der bevorstehenden Sendung in Kenntnis setzen Untersuchungsgang Die Lungenseuche gilt als nachgewiesen, wenn der Erreger in der zuständigen Untersuchungseinrichtung zweifelfrei identifiziert wurde. Die zuständige Unersuchungseinrichtung ist das nationale Referenzlabor für die Lungenseuche der Rinder in Jena. Serologische Reaktionen in Verbindung mit einem epidemiologischem Kontakt zu einem Lungeseuche-Ausbruch oder mehrere serologisch positive Befunde in einer Rinderherde führen, unabhängig vom Vorliegen klinischer bzw. pathologisch-anatomischer Befunde, zu einem Lungeseuche-Verdacht. Der Verdacht kann nur durch den Amtstierarzt ausgesprochen werden. Dies gilt ebenfalls für die amtliche Feststellung eines Lungenseuche-Ausbruchs. Die Komplementbindungsreaktion (KBR) ist laut OIE das vorgeschriebene serologische Testverfahren. Alternativ kann ein kommerziell verfügbarer kompetetiver ELISA nach den Vorgaben der OIE angewendet werden. Dieser ist allerdings für Deutschland nicht zugelassen und somit nur im nationalen Referenzlabor Jena bzw. nur nach Ausnahmegenehmigung in den entsprechenden Landesbehörden anwendbar. Erregernachweis bei Verdacht auf Lungenseuche Die Anzucht von Mykoplasmen ist in den meisten Untersuchungsämtern möglich und dauert im Durchschnitt 5 bis 7 Tage, die darauf folgende Erregerdifferenzierung noch weitere 10 bis 12 Tage. Ein negatives Ergebnis wird innerhalb von 10 Tagen ausgewiesen. Der positive Nachweis kann bis zu 20 Tagen in Anspruch nehmen. Wichtiger Hinweis: Bei Verdacht eines Erstausbruchs ist Organmaterial einschließlich evtl. vorhandener oder verdächtiger bereits isolierter Kulturen, verdächtige Seren bzw. Blutproben parallel direkt an das Referenzlabor für die Lungenseuche der Rinder zu senden (Friedrich-Loeffler-Institut, Standort Jena, Naumburger Str. 96a, Jena, Tel ). Die Proben sind vorher telefonisch anzumelden (siehe auch unter Untersuchungsmaterial). 197

198 Im positiven Fall ist mittels PCR ein sicherer Nachweis innerhalb von 48 Stunden möglich. Die PCR wird im nationalen Referenzlabor für Lungenseuche durchgeführt. Werden in den Untersuchungsämtern bei der serologischen Untersuchung auf Lungenseuche mittels KBR positive Proben festgestellt, so sind diese Tiere bis zur Abklärung im nationalen Referenzlabor als Verdachtsfälle einzustufen und der entsprechende Bestand ebenfalls als verdächtig für die Lungenseuche zu behandeln, auch wenn keine weiteren Hinweise für das Vorliegen eines Lungenseucheausbruchs sprechen. Dem Referenzlabor sind in diesem Fall neue Blutproben (ohne Gerinnungshemmer) sowie Nasentupfer der entsprechenden Tiere zuzuleiten Erregernachweis Anzüchtung mit anschließender Immunfluoreszenz Anzüchtung: Als Mykoplasmen-Nährmedien werden Medium B-Bouillon (Anhang 2) und -Agar (Anhang 3) verwendet. Zur Unterdrückung der bakteriellen Begleitflora muss bei der Primärisolierung dem flüssigen Nährmedium unmittelbar vor der Beimpfung Penicillin (1000 IE/ml) zugesetzt werden. Zur Beimpfung sind möglichst kleine Stücke des Untersuchungsmaterials in das flüssige Nährmedium einzubringen, d.h. je ein stecknadelkopfgroßes Organstückchen (Die Ausgangsproben sollten vor dem Zerkleinern zwecks Beseitigung von Begleitflora kurz abgeflammt werden.) Das beimpfte flüssige Nährmedium wird 4 bis 5 Tage bei 37 C bebrütet. Danach wird die Kultur auf Medium B-Agar übertragen und anschließend 2 bis 4 Tage bei 37 C in feuchter Umgebung und bei 3 bis 5 % CO 2 inkubiert. Das Mykoplasmenwachstum kann auf der Agarplatte mikroskopisch mit einer Lupenvergrößerung bei leicht dezentriertem grünem Licht beurteilt werden. MmmSC entwickelt auf festen Nährmedien durchscheinende Kolonien von 0,1 bis 1 mm Durchmesser, welche meist als raue, vakuolisierende granuläre Formen erscheinen. Immunfluoreszenztechnik (IFT): In der Regel wird die IFT dem nationalen Referenzlabor vorbehalten bleiben, da den meisten Untersuchungsämtern nicht alle notwendigen Antiseren und Mykoplasmenstämme zur Verfügung stehen und das Referenzlabor diese Seren und Bakterienstämme nicht zur Verfügung stellen kann. Geräte/Gebrauchsmaterialien Brutschrank 37 C 2 C und 3 bis 5 % CO 2, Fluoreszenzmikroskop Spezialküvette, Spatel, Skalpell, Meßpipetten 10 ml; Ampullensäge 198

199 Rezepturen/Reagenten lyophilisierte Stämme: - die Ampulle mit dem lyophilisierten Stamm mit einer vorher 1 min mit Sterillium desinfizierten Ampullensäge öffnen, in die Ampulle 0,5 ml Bouillon (Medium B) pipettieren - nachdem sich der Inhalt der Ampulle gelöst hat: a) - eine Platte davon ausstreichen, Inkubation 2 bis 4 Tage bei 37 C und 5 % CO 2 und b) - den Rest der Ampulle in ein Röhrchen mit Bouillon geben, Inkubation 2 bis 4 Tage bei 37 C, weiter wie a) eingefrorene Stämme: - Kryo-Röhrchen auftauen lassen, und je nach Bedarf auf Platte ausstreichen und Bouillon beimpfen, Inkubation 2 bis 4 Tage bei 37 C und 5 % CO 2 Antiglobulin: - Es handelt sich um mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konugierte Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper von der Ziege. - nur nach vorheriger Austestung der jeweiligen Gebrauchsverdünnung bei jeder neuen Charge (wenn es optimal leuchtet) den Inhalt des Fläschchens entsprechend mit Aqua dest. verdünnen 1: 5 0,2 ml konz. A.-Glob. + 0,8 ml PBS 1:10 0,5 ml 1: 5 A.-Glob. + 0,5 ml PBS 1:20 0,5 ml 1:10 A.-Glob. + 0,5 ml PBS usw. bis 1:80 - Kontrollstämme zur Ermittlung der optimalen Verdünnung des Antikaninchenglobulins: M. bovis und M. arginini PBS: NaCl 8 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 2,9 g KH 2 PO 4 0,2 g KCL 0,2 g Aqua dest. ad 1000 ml auf ph 7,2 einstellen. NaCl - Puffer: Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 1,72 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 3,46 g KH 2 PO 4 0,50 g NaCl 7,20 g Aqua dest. ad 1000 ml auf ph 7,1 einstellen Medium B: siehe Anhang 2 und 3 199

200 Durchführung zu testende Stämme auf Platten ausstreichen (neben der eigentlichen Probe auch eine Positivkontroll- und Negativkontrollstämme) Positivkontrolle: ein -Stamm Negativkontrolle: hierzu eignen sich beispielsweise Stämme von Mycoplasma arginini oder Mycoplasma bovis Inkubation ca. 2 Tage bei 37 C und 5 % CO 2 gut bewachsene Agarblöckchen (ca. 1,5 x 0,5 cm) mit Skalpell ausschneiden, und zur Kennzeichnung obere linke Ecke abschneiden Blöckchen in je einen Einsatz der Spezialküvette legen (Kolonien nach oben!) auf jedes Blöckchen 1 Tropfen Antiserum eines bekannten Stammes pro Spezialküvette, bzw. bei Negativ-Kontrollen 1 Tropfen NaCl-Lösung bringen zu jedem bekannten Antiserum entsprechenden Stamm als Positivkontrolle mitführen in feuchter Kammer 30 min bei 37 C inkubieren 2 x 10 min mit unsterilem NaCl-Puffer (ph 7,1) waschen auf jedes Blöckchen 1 Tropfen Anti-Kaninchen-Globulin, FITC-markiert geben in feuchter Kammer 30 min bei 37 C inkubieren 2 x 10 min mit NaCl-Puffer (ph 7,1) waschen und mit Aqua dest. spülen nach Beschriftung der Objektträger die Blöckchen auflegen Ergebnis und Kontrolle Mikroskop: Fluoreszenzeinrichtung (Blaulicht, UV-Anregung) im Auflicht Positiv: Kolonien, die bei normalem Licht gut zu erkennen sind und nach dem Umschalten auf Fluoreszenz in apfelgrüner Farbe leuchten, schwache Eigenfluoreszenzen lassen sich durch Positivkontrollen als Störfaktoren ausschließen Negativ: Kolonien, die bei normalem Licht gut zu erkennen sind und nach dem Umschalten auf Fluoreszenz nicht leuchten Durch Mitführen einer Positiv- sowie Negativkontrolle können falsch- positive sowie falsch - negative Ergebnisse ausgeschlossen werden. Bei jeder neuen Charge eines Reaktionspartners wird das Testsystem mit Positivkontrolle und Negativkontrolle neu geeicht. Differentialdiagnostisch sollten im Immunfluoreszenztest die angezüchteten Erreger neben dem MmmSC-Antiserum gegen folgende weitere Antiseren getestet werden: M. mycoides ssp. mycoides LC M. bovis M. bovirhinis M. gatae M. Gruppe 7 (Leach) A. laidlawii A. modicum A. axanthum M. arginini M. bovigenitalium M. alkalescens M. canadense M. californicum M. gallinarum 200

201 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Der Nachweis wird nur im nationalen Referenzlabor durchgeführt. DNA-Isolierung Geräte, Materialien und Reagenzien Eppendorf-Zentrifuge (wenn möglich mit Kühlung) Vortexer Eppendorf BioPhotometer Präzisionspipetten, verschiedene Größen passende Tips, steril und DNase-frei (PCR-clean), z.b. Eppendorf Handschuhe Eppendorf-Tubes, 1,5 ml, 2 ml, steril und DNase-frei (PCR-clean) High Pure PCR Template Preparation Kit von Roche oder äquivalente Kits Zellpuffer, steril (ph 7,4): 1000 ml 0,1M Na 2 HPO 4 -Lösung ml 0,1M KH 2 PO 4 -Lösung DEPC-Wasser Durchführung Vorbereitungsschritte für alle Isolierungen: mit Handschuhen arbeiten Proteinase K (Gefäß 3 aus Roche-Kit) in 4,5 ml bidest. H 2 O aufnehmen, aliquotieren und bei -20 C lagen vor Erstgebrauch 80 ml Ethanol p.a. zu dem Waschpuffer (Gefäß 4, blauer Deckel) geben bei Beginn der DNA-Isolierung den Elutionspuffer (Gefäß 5) auf 70 C vorwärmen a) DNA-Isolierung aus Gewebe 25 bis 50 mg Gewebe im 1,5-ml-Tube einwiegen und mit der Schere soweit wie möglich zerkleinern 200 µl Gewebe-Lysepuffer (Gefäß 1, weißer Deckel) und 40 µl Proteinase K-Lösung zugeben mindestens 1 h bei 55 C inkubieren (eventuell auch 2 bis 3 h oder bei 37 C über Nacht) 200 µl Bindungspuffer (Gefäß 2, grüner Deckel) zugeben, mischen und 10min bei 72 C inkubieren (Elutionspuffer 5 kann dabei mit vorgewärmt werden) mit 100 µl Isopropanol vermischen nicht lösliche Gewebestücke mittels einer Pipettenspitze entfernen, restliche Flüssigkeit mittels einer 1ml-Pipette in das zusammengesetzte Filter-Tube ( Säule auf Sammelbehälter setzen) geben 1min bei 8000 rpm zentrifugieren (eventuell auch länger und bei höherer Drehzahl, falls der Filter vom Gewebe verstopft wird) Durchlauf verwerfen, Sammelbehälter wiederverwenden 201

202 500 µl Waschpuffer in das Filter-Tube pipettieren (Gefäß 4, blauer Deckel) 1min bei 8000rpm zentrifugieren anschließend 10 s bei max. Geschwindigkeit (13000rpm) zentrifugieren Filter-Tube in ein sauberes 1,5 ml-tube einsetzen Zur Elution der Nukleinsäuren 200 µl des auf 70 C vorgewärmten Elutionspuffers in das Filter-Tube pipettieren 1 min bei 8000rpm zentrifugieren die Nukleinsäuren sind stabil und können direkt in der PCR analysiert oder bei 4 C gelagert werden b) DNA-Isolierung aus Körperflüssigkeit 200 µl Körperflüssigkeit (bei weniger Volumen mit Zellpuffer auffüllen) in ein 1,5ml- Tube pipettieren 200 µl Bindungspuffer (Gefäß 2, grüner Deckel) und 40 µl Proteinase K-Lösung zugeben nach Proteinase K-Zugabe sofort gut mischen und 10 min bei 72 C inkubieren (Elutionspuffer 5 kann dabei mit vorgewärmt werden) mit 100 µl Isopropanol vermischen in das zusammengesetzte Filter-Tube ( Säule auf Sammelbehälter setzen) geben weiter wie bei DNA-Isolierung aus Gewebe c) DNA-Isolierung aus Nasentupfern Tupferprobe in einem 2ml-Tube mit je 500 µl Bindungspuffer (Gefäß 2, grüner Deckel) versetzen und 30 s bei 1200rpm zentrifugieren 1ml-Pipettenspitze zur Hälfte abschneiden, in dieser halben Spitze im Tube Tupfer nochmals 2 min bei 1200rpm zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit aus dem Tupfer zu gewinnen Probenflüssigkeit vereinigen und 15 min bei 14000rpm (höchste Drehzahl) zentrifugieren Pellet in 200 µl Zellpuffer aufnehmen 200 µl Bindungspuffer (Gefäß 2, grüner Deckel) und 40µl Proteinase K-Lösung zugeben nach Proteinase K-Zugabe sofort gut mischen und 10 min bei 72 C inkubieren (Elutionspuffer 5 kann dabei mit vorgewärmt werden) mit 100 µl Isopropanol vermischen in das zusammengesetzte Filter-Tube ( Säule auf Sammelbehälter setzen) geben weiter wie bei DNA-Isolierung aus Gewebe Photometrische Messung: erfolgt zur Überprüfung der Reinheit und zur Einstellung eines definierten DNA-Gehaltes bei 260 nm gegen Leerwert Aqua dest. am Eppendorf-BioPhotometer in den dazugehörigen Einweg-Küvetten die Probe wird 1:10 verdünnt (6 µl Probe + 54 µl DEPC- Wasser) die Absorption von 1 OD entspricht ca. 50 µl/ml DNA mit dem Verhältnis A 260 /A 280 kann die Reinheit der DNA abgeschätzt werden, dieser Wert sollte zwischen 1,6 und 1,8 liegen 202

203 PCR Geräte, Materialien und Reagenzien Thermocycler (z.b. Biometra) Eppendorf-Zentrifuge (wenn möglich mit Kühlung) Vortexer Präzisionspipetten, verschiedene Größen passende Tips, steril und DNase-frei (PCR-clean), z.b. Eppendorf Handschuhe Eppendorf-Tubes, 0,2 ml, steril HotStarTaq Master Mix (Qiagen) oder dntp-mix, Taq-Polymerase, 10 x Taq-Polymerase-Puffer (z.b. Boehringer Mannheim) oder äquivalente Reagenzien anderer Firmen DEPC-H 2 O Primer: MW 28/29 und SC3NEST1-L/R Sequenzen: s. Tabelle 1 Tabelle 1: Primersysteme zur Untersuchung von Lungenseucheproben Primer Sequenz Spezifität MW 28 5`-CCA GAC TCC TAC GGG AGG CA-3 Klasse Mollicutes MW TGC GAG CAT ACT ACT CAG GC-3 SC3NEST1-L 5 -ACA AAA AGA AGA TAT GGT GTT GG-3 MmmSC SC3NEST1-R 5 -ATC AGG TTT ATC CAT TGG TTG G-3 Durchführung mit Handschuhen arbeiten Primer vorverdünnen: Stammlösung 100pmol/µl, Verdünnung 1:5 auf 20pmol/µl mit DEPC-Wasser DNA vorverdünnen: entsprechend der photometrischen Messung auf 5ng DNA/µl einstellen a) Durchführung mit HotStarTaq Master Mix (Qiagen): jeweils 25 µl HotStarTaq Master Mix in PCR-Tubes vorlegen, 20 µl des vorverdünnten Primerpaares hinzugeben Zugabe von jeweils 5 µl DNA alle Schritte können bei Raumtemperatur stattfinden, weil die Polymerase bei dieser nicht aktiv ist 203

204 b) Durchführung mit selbst hergestelltem Mastermix mit einfacher Taq-Polymerase (z.b. Boehringer Mannheim): Herstellung des Mastermix (Angaben für eine Probe): 10 x Taq-Polymerase-Puffer 5 µl dntp - Mix 2 µl Primer 1 1 µl Primer 2 1 µl Taq-Polymerase 0,2 µl DEPC-Wasser 39,8 µl nach Zusammengabe aller Substanzen in jedes Reaktionsgefäß 45 µl Mastermix und 5 µl DNA-Extrakt der Probe pipettieren wurde die DNA nicht gemessen und auf 5 ng/µl eingestellt, werden 49 µl Mastermix und 1 µl DNA-Extrakt pipettiert Kontrollen mitführen: als Negativkontrolle wird einem Ansatz statt DNA 5 bzw. 1 µl DEPC-Wasser zugesetzt als Positivkontrolle dient für das Primersystem 1 (MW28/29) 5 bzw.1 µl DNA- Extrakt eines Typenstammes von M. bovis (Donetta PG 45) und für das System 2 (SC3NEST1-L/R) 5 bzw. 1 µl DNA-Extrakt eines Typenstammes von MmmSC (PG 1) - vortexen, kurz abzentrifugieren und in den vorprogrammierten Cycler stellen, Zyklus: Primersystem 1-MW 28/29 2-SC3NEST1-L/R Aktivierung der HotStarTaq 15min, 95 C 15 min, 95 C Polymerase dieser Schritt entfällt bei b) 3-Schritt-Zyklus: - Denaturierung: 80 s, 94 C 30 s, 94 C Annealing: 80 s, 55 C 30 s, 52 C Extension: 150 s, 72 C 30 s, 72 C Zyklenzahl : Finale Extension 5 min, 72 C - Amplikon ca. 560 bp ca. 717bp Proben anschließend auf Agarose-Gel auftragen Agarose-Gelelektrophorese Geräte, Materialien und Reagenzien Elektrophoresekammer (z.b. Biometra, Biozym) Stromversorgungsgerät Mikrowelle Gel-Auswertesystem ( z.b. Bio Imaging System von Syngene) Maßkolben (1l) 204

205 Erlenmeyerkolben ( 300ml, 500ml) Meßzylinder (25ml, 100ml) Parafilm Präzisionspipetten, verschiedene Größen passende Tips, steril und DNase-frei (PCR-clean), z.b. Eppendorf Handschuhe (Nitrilhandschuhe beständig gegenüber Ethidiumbromid) Agarose (PeqGold Universal Agarose von Peqlab) 10x TBE-Puffer dest. H 2 O Ethidiumbromid (Tropfflasche, z.b. Eurobio) Molekulargewichtsmarker: peqgold Low Range DNA-Leiter, bp, gebrauchsfertig DEPC-H 2 O Ansetzen der Lösungen Herstellung des Laufpuffers (1x TBE-Puffer): 100ml 10x TBE-Puffer ad 1000ml dest. Wasser Zusammensetzung des Agarose-Gels: Gelkonzentration 1 % Volumen 50ml 100ml Agarose 0,5g 1g dest. Wasser 45ml 90ml 10x TBE-Puffer 5ml 10ml Ethidiumbromid 1 Tr. 2 Tr. Durchführung Elektrophoresekammer zusammensetzen, passenden Kamm auswählen Agarose einwiegen, mit dest. Wasser im Erlenmeyerkolben lösen in der Mikrowelle bei 600 W zum Kochen bringen, ca. 30 s kochen 10x TBE-Puffer und Ethidiumbromid zugeben, Kolben vorsichtig schwenken zügig und luftblasenfrei in die Elektrophoresekammer gießen mind. 1 h polymerisieren lassen Kamm herausziehen, Laufpuffer in die Elektrophoresekammer füllen, bis der Puffer ca. 1cm über dem Gel steht Proben bzw. Marker wie folgt auf Parafilm mischen und in die Slots pipettieren: Marker PCR-Proben 2 µl Probenpuffer 2 µl Probenpuffer 9 µl DEPC-Wasser 10 µl Probe 1 µl Marker 10 µl/slot auftragen 10 µl/slot auftragen Laufdauer und einzustellende Spannung sind abhängig von Größe und Dicke des Gels und der Beschaffenheit der Kammer Hinweise des Herstellers beachten Spannung liegt zwischen 80 und 150 V, die Dauer des Laufes zwischen 30 und 120 min Faustregel für einzustellende Spannung: 5 V/cm Elektrodenabstand 205

206 die Bromphenolblau-Front sollte mindestens zur Hälfte des Gels gewandert sein; bei schlechtem Trennergebnis kann das Gel nochmals in die Kammer gelegt und die Proben weiter getrennt werden um eine gleichmäßige Verteilung des Ethidiumbromids im Gel zu erreichen (wandert entgegengesetzt zur DNA), kann dem Laufpuffer 0,5 mg/l Ethidiumbromid zugesetzt werden (für einen gleichmäßigen und klaren Hintergrund auf dem Gel) - das Gel wird unter UV-Licht mit Hilfe eines geeigneten Gel-Auswertesystems analysiert und dokumentiert Ergebnis und Kontrolle Im UV-Licht ist bei einer positiven Reaktion eine deutliche Bande bei beiden PCR-Ansätzen (im System 1 bei ca. 560 bp und bei ca. 717 bp im System 2) zu erkennen. Bei jedem Probenlauf darf die Negativkontrolle keine Bande und muss die Positivkontrolle eine deutliche Bande zeigen Antikörpernachweis durch Komplementbindungsreaktion (KBR) Die KBR für die Lungeseuche wird in der Regel zuerst von den Landesbehörden festgelegten staatlichen Untersuchungsämtern durchgeführt werden (Anhang 1). Die notwendigen Reagenzien (Antigen, positive und negative Kontrollseren) werden vom nationalen Referenzlabor in Jena für die aufgeführten Untersuchungsämter zur Verfügung gestellt. Zur Feststellung des Verdachts eines Lungenseucheausbruchs bzw. zur Eingrenzung des Kreises verdächtiger Tiere kann die jeweilige hauseigene Arbeitsvorschrift verwendet werden. Nachfolgend wird der prinzipielle Ablauf am Beispiel der von der OIE empfohlenen Mikromethode dargelegt, welche auf das Verfahren nach Campbell und Turner (1953) zurückgeht. Geräte/Gebrauchsmaterialien Zentrifuge, Wasserbad 37 C 1 C; Wasserbad 58 C 1 C; Waage; heizbarer Magnetrührer; Kühlschrank 6 C 2 C; Gefrierschrank -20 C 3 C Ablesespiegel für Mikrotiterplatten; Bechergläser (30 ml bis 800 ml); Messzylinder (50 bis 250 ml); Kulturröhrchen (12ml); Zentrifugenröhrchen (12 ml); Ständer für Röhrchen, Klebefolie zum Abkleben der Mikrotiterplatten, Messpipetten (1, 5 und 10 ml), Kolbenhubpipetten (10 bis 1000 µl), entsprechende Pipettenspitzen, Transferpette 8-Kanal ( µl), Multistepper 8-Kanal µl, Pipettierhilfe Erlenmeyerkolben, Stehkolben, Bechergläser, Mikrotiterplatten (U-Form, 8x12 Cups), feuchte Kammer Reagenzien/Rezepturen Alseverlösung für Hammelerythrozyten: Dextrose NaCl Natriumcitrat 18,66 g 4,18 g 8,00 g 206

207 Aqua bidest ml nach gründlichem Mischen für 20 min in den Dampftopf geben Veronal - Puffer (Veronal - buffered diluent = VBD): 2000 ml Konzentrat, 5:1 NaCl 83,00 g 5,5 - Diäthylbarbitursäure Natriumsalz 10,19 g Aqua bidest. 800 ml Aqua bidest. zum Kochen bringen und mit beheizbaren Magnetrührer Substanzen darin lösen 34,58 ml 1n HCl über einen Scheidetrichter oder langsam mit einer Pipette tropfenweise hinzugeben, bei Ausfall von Salzen noch etwas Aqua bidest. zugeben tropfenweise 5 ml Stammlösung hinzugeben Stammlösung: MgCl 2 x 6 H 2 O CaCl 2 x 2 H 2 O in Aqua bidest. 20,3 g 4,4 g 100 ml 10 ml der konzentrierten VBD werden 1:5 mit Aqua bidest. verdünnt und auf einen ph- Wert zwischen 7,3 bis 7,5 überprüft. Sollte der ph-wert außerhalb dieser Grenzen liegen, muss ein Neuansatz erfolgen. Die konzentrierte Lösung wird in 200 ml Portionen abgefüllt und bei -20 C aufbewahrt, die bei Bedarf 1:5 verdünnt werden können. Komplement: (z. B. Fa. Virion), jede Charge ist vor erstmaligem Gebrauch auszuwerten (siehe dort) Ambozeptor: (z. B. Fa. Virion), jede Charge ist vor erstmaligem Gebrauch auszuwerten (siehe dort). Bei Titerverlust empfiehlt sich eine erneute Auswertung. Antigene sowie negative und positive Kontrollseren: werden im nationalen Referenzlabor hergestellt und den Untersuchungsämtern kostenlos zur Verfügung gestellt Hammelblut: Hammelblut Alseverlösung 37,5 ml 62,5 ml Eine sterilisierte Schraubflasche mit einer Markierung bei 100 ml wird mit Alseverlösung befüllt und mit Hammelblut direkt aus der Kanüle auf 100 ml aufgefüllt. Das Blut wird aus der Vena jugularis gewonnen. Um Kontaminationen vorzubeugen, gibt man Internat. Einheiten/l Penicillin G hinzu. Das so gewonnene Hammelblut hält sich bei Kühlschranktemperatur etwa 10 bis 14 Tage. Für den Einsatz im Hämolytischen System muss es jedoch mindestens 24 h alt sein. 207

208 Alternativ kann eine 1%ige Erythrozytensuspension der Firma VIRION/SERION verwendet werden. Hämolytisches System (HS): Hammelblut in Alseverlösung bei 900 x g für 10 Minuten zentrifugieren 3-5 x waschen in VBD (bis Überstand wasserklar ist), dazwischen jeweils 10 min zentrifugieren bei 900 x g herstellen einer 2%igen Hammelerythrozytensuspension mit VBD zum Gebrauch wird diese mit gleichem Volumen der Ambozeptor-Gebrauchsverdünnung gemischt und 15 min bei 37 C 1 C stehen gelassen (Sensibilisierung) Bei getrennter Aufbewahrung von Erythrozytensuspension und Ambozeptorverdünnung können diese bis zu 48 h nach Herstellung verwendet werden. Durchführung Anmerkung: Alle Reagenzien sind vor der Verwendung auf Raumtemperatur zu erwärmen. Ampozeptorauswertung Die Ambozeptorauswertung sollte bei Bedarf durchgeführt werden, zumindest bei Verwendung einer neuen Charge von Ambozeptor. Ansatz folgender geometrischer Verdünnungsreihen des Ambozeptors: Röhrchen : : : n Reihe A 1:500 1:1000 1:2000 : : : 1:32000 Reihe B 1:750 1:1500 1:3000 : : : 1:24000 Ausgangsverdünnung 1:500 (z. B. 0.1 ml Ambozeptor + 49,9 ml VBD) herstellen Vorlage von 5 ml VBD für die Reihe A ab Röhrchen 2, für Reihe B ab Röhrchen 1 für die Reihe A dem 1. und 2. Röhrchen 5 ml Ambozeptorverdünnung 1:500 zufügen und ab Röhrchen 2 durch fortlaufendes Überpipettieren von jeweils 5 ml die weiteren Verdünnungen anlegen für Reihe B dem 1. Röhrchen 10 ml Ambozeptorverdünnung 1:500 zufügen und durch fortlaufendes Überpipettieren von jeweils 5 ml weitere Verdünnungen anlegen beide Titrationsreihen zu einer Verdünnungsreihe zusammenfügen Ansatzschema der Ambozeptorauswertung Röhrchen Amb.-Verd. (0,5 ml) VBD (ml) Erythr.-Susp. (ml) Kompl. Verd. 1:20 (ml) 1 1:500 1,0 0,5 0,5 2 1:750 1,0 0,5 0,5 3 1:1000 1,0 0,5 0,5 : : : : : : : : : : : : : : : n 1: ,0 0,5 0,5 208

209 Kontrollen a) Erythrozytenkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,2 ml VBD b) Komplementkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,5 ml Komplement 1:20 1,5 ml VBD c) Ambozeptorkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,5 ml Ambozeptorverdünnung 1,5 ml VBD schütteln, Inkubation 30 Minuten bei 37 C ± 1 C im Wasserbad Auswertung Ermittelt wird die höchste Ambozeptorverdünnung, die noch eine komplette Hämolyse bewirkt. Sie gilt als Ambozeptoreinheit. Die Gebrauchsverdünnung beträgt 4 Einheiten, also die 4-fache Konzentration. Beispiel: 1 Ambozeptoreinheit = 1:6000 Gebrauchsverdünnung = 1:1500 Die Kontrollen dürfen keine Hämolyse aufweisen. Komplementauswertung Die Komplementauswertung dient der Feststellung der Komplementgebrauchsdosis für den Hauptversuch in Gegenwart der entsprechenden Antigengebrauchsverdünnung. Zum Vergleich wird eine zweite Reihe angesetzt, bei der das Antigenvolumen durch VBD ersetzt ist. Das Komplement wird in 8 Konzentrationsstufen in der Wärmebindung geprüft. In der folgenden Tabelle ist die Herstellung der 8 Verdünnungsstufen dargestellt: Komplementkonzentration (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 2,5 4,0 Kompl. 1:10 (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 VBD (ml) 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 Die weiteren Arbeitsschritte sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Reihe 1 Reihe 2 Komplement je Verd.-Stufe (ml) 0,5 0,5 Antigenverdünnung (ml) - 0,5 VBD (ml) 1,0 0,5 - schütteln, Wasserbad 60 min bei 37 C 1 C HS (ml) 1,0 1,0 -schütteln, Wasserbad 30 min bei 37 C 1 C 209

210 Auswertung Es wird das Röhrchen mit der niedrigsten Komplementkonzentration bestimmt, das eine komplette Hämolyse aufweist. Die Gebrauchsverdünnung für den Hauptversuch ist die folgende höhere Konzentration Beispiel komplette Hämolyse = 2,0 % Gebrauchskonzentration = 2,5 % Hauptversuch Kontroll- und Probandenseren in einer Verdünnung von 1:5 im Wasserbad bei 58 C 1 C inaktivieren (30 bis 50 min) Trennlinie zwischen Cup 10 und 11 von A bis H ziehen In der folgenden Tabelle sind die einzelnen Arbeitsschritte aufgeführt: Cup Arbeitsschritte : : : VBD (µl) : : : Serum (µl) : : : Titration des Serums von 1 nach 10 und von 11 nach 12 durch Übertragung von 25 µl und verwerfen von 25 µl aus den Cups 10 und 12 Titration der Komplementkontrollen (siehe bei Kontrollen) beim Titrieren mind. 3 x mischen durch Aufziehen und Abgeben mit der Pipette! 4. VBD : : : Antigen (µl) : : : Kompl. (µl) : : : schütteln und abgedeckte Platte 18 bis 24 h bei 5 C 3 C inkubieren (Kältebindung), danach die Platte wieder auf Raumtemperatur erwärmen oder für 60 min bei 37 C 1 C im Wasserbad oder im Brutschrank in einer feuchten Kammer inkubieren (Wärmebindung) Achtung: auf dem Antigen ist vermerkt, welche Inkubationsvariante anzuwenden ist 8. HS (µl) : : : Schütteln, abdecken und Inkubation min bei 37 C1 C im Wasserbad oder im Brutschrank in einer feuchten Kammer. Hinweis: Für die Bestimmung der optimalen Inkubationsdauer muss man die Hämolyse in den Komplementkontrollen verfolgen. Die Inkubation wird nur solange fortgesetzt, bis die Cups mit 2 und 1 Komplementeinheiten 100 % Hämolyse zeigen, bei 0,5 und 0,25 Komplementeinheiten darf keine Hämolyse auftreten. 10. Platte entweder 30 min bis 1 h bei Raumtemperatur stehen lassen oder für 5 min bei 900 x g abzentrifugieren (Erythrozytensedimentation) 11. Auswertung mit Spiegel 210

211 Kontrollsystem und Interpretation der Ergebnisse Das Ablesen der Reaktionsstärke je Verdünnungsstufe erfolgt nach dem Grad der Hämolyse und der Größe des Erythrozytensedimentes (Knopfbildung) im Vergleich zur Kontrolle des Hämolytischen Systems: 100 % Hämolyse = negativ = 0 % Erythrozytensediment 75 % Hämolyse = + = 25 % Erythrozytensediment 50 % Hämolyse = ++ = 50 % Erythrozytensediment 25 % Hämolyse = +++ = 75 % Erythrozytensediment 0 % Hämolyse = ++++ = 100 % Erythrozytensediment Bei der Durchführung des Hauptversuches sind jeweils folgende Kontrollansätze mitzuführen: Kontrolle der antikomplementären Wirkung (Eigenhemmung) jedes Serums (Serumkontrolle) Serumverdünnung 25 µl VBD 25 µl Komplement 25 µl HS 50 µl Soll-Ergebnis 100 % Hämolyse, 0 % Erythrozytensediment Von Eigenhemmung spricht man bei fehlender Hämolyse (mit Erythrozytensediment). Bei Auftreten von Eigenhemmung empfiehlt sich folgende Vorbehandlung der entsprechenden Seren mit Komplement: Serum (unverdünnt) 75 µl Komplement (unverdünnt) 25 µl 30 min bei 37 C1 C im Wasserbad inkubieren VBD 900 µl 30 min bei 58 C im Wasserbad inkubieren Hinweis: nicht bei allen Seren kann durch diese Vorbehandlung Eigenhemmung vermieden werden. In solchen Fällen muss die Untersuchung mit einem erneut von diesem Tier gewonnenen Serum wiederholt werden. Antigenkontrolle (AG) VBD 25 µl Antigen 25 µl Komplement 25 µl HS 50 µl Soll-Ergebnis 100 % Hämolyse, 0 % Erythrozytensediment 211

212 Komplementkontrolle Für die Komplementkontrolle werden folgende Konzentrationen verwendet: die 2-fache, die einfache, die 0,5-fache und die 0,25-fache Konzentration der in der Komplementauswertung ermittelten Konzentration ( Komplementeinheiten von 2; 1; 0,5 und 0,25). Die entsprechenden Verdünnungen können auch auf der Platte durch Überpipettieren von jeweils 25 µl erzeugt werden (siehe 3. Titration des Serums). VBD 50 µl Komplementverd. 25 µl HS 50 µl Soll-Ergebnis bei Komplementeinheiten von 2 und 1 = 100 % Hämolyse, 0 % Erythrozytensediment bei 0,5 und 0,25 Komplementeinheiten = 0 % Hämolyse (100 % Erythrozytensediment) Kontrolle des Hämolytischen Systems (HS) VBD 75 µl HS 50 µl Soll-Ergebnis 0 % Hämolyse, 100 % Erythrozytensediment Positives Kontrollserum (pos. KS) Serumverdünnung 25 µl Antigen 25 µl Komplement 25 µl HS 50 µl Soll-Ergebnis Der ermittelte Titer muss dem für das positive Kontrollserum angegebenen Titer entsprechen. Negatives Kontrollserum (neg. KS) Serumverdünnung 25 µl Antigen 25 µl Komplement 25 µl HS 50 µl Soll-Ergebnis 100 % Hämolyse, 0 % Erythrozytensediment 212

213 Beispiel für Plattenbelegung Reihe Spalte Serumkontrollen Probenverdünnung Probenbezeichng. 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5 1:10 A a B b C c D d E e F pos. KS G neg. KS H Kontrollen AG AG HS HS 2 1 0,5 0,25 Komplementeinheiten Laut OIE-Manual ist ein Ergebnis bei 1:10 (++++) als positiv zu betrachten. 1:10+ bis 1:10+++ gelten als fraglich. Das negative Serum darf in der Verdünnung 1:5 keine Reaktion zeigen. Das Ergebnis ist umgehend dem zuständigen Veterinäramt zu melden. Hinweise: Alternativ können weitere kommerziell verfügbare Reagenzien verwendet werden (Hammelerythrozyten, VBD). Das nationale Referenzlabor organisiert regelmäßig Ringtests für die KBR. Die durch die Bundesländer ausgewählten staatlichen Untersuchungsämter (Anhang 1) sind verpflichtet, an diesen Ringtests teilzunehmen. Das Referenzlabor teilt die Ergebnisse den teilnehmenden Labors mit und führt eine Wertung durch. Bei unvertretbaren Abweichungen ist den entsprechenden Landesbehörden darüber Mitteilung zu machen. Die Ursachen für die entstandenen Abweichungen sind gemeinsam mit dem Referenzlabor abzuklären und abzustellen. Der KBR-Ringversuch muss anschließend vom entsprechenden Labor wiederholt werden. Literatur O.I.E. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 5th Edition (2004): Chapter Contagious Bovine Pleuropneumonia. Office International des Epizooties, Paris ( Campbell, A.D. und Turner A.W. (1953): Studies on contagious bovine pleuropneumonia of cattle. IV. An improved complement-fixation test. Austral. Vet. J. 29, Hotzel, H. und Sachse, K. (1998): Verbesserung und Beschleunigung der Rinderlungenseuche-Diagnostik durch Direktnachweis des Erregers mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). BMTW 111,

214 Anhang 1. Liste der von den Landes-Veterinärbehörden festgelegten Untersuchungsämter für die Lungenseuche-KBR Bundesland Baden-Württemberg Untersuchungsämter Staatliches Tierärztliches Untersuchungsamt Aulendorf - Diagnostikzentrum - Löwenbreitestr. 18/ Aulendorf Tel.: (07525) Fax: (07525) Poststelle@stuaau.bwl.de Chemisches- und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart Schaflandstr. 3/3 Sitz Fellbach Fellbach Telefon (07 11) Fax: (0711) Poststelle@CVUAS.BWL.DE Bayern Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit - Dienststelle Oberschleißheim Veterinärstr Oberschleißheim Tel.: (089) Fax: (089) poststelle@lgl.bayern.de Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Dienststelle Erlangen Eggenreuther Weg Erlangen Tel.: (09131) Fax: (09131) poststelle@lgl.bayern.de Berlin Berliner Betrieb für Zentrale Gesundheitliche Aufgaben, Institut für Lebensmittel, Arzneimittel und Tierseuchen Berlin (ILAT) Invalidenstr Berlin Tel. 030 / Fax 030 / mail@bbges.de Brandenburg Landeslabor Brandenburg Ringstraße Frankfurt (Oder) Tel.: (0335) Fax: (0335) poststelle@llb.brandenburg.de Postanschrift: Landeslabor Brandenburg, Postfach 1469, Frankfurt (Oder) 214

215 Hessen Landesbetrieb Hessisches Landeslabor Marburger Str Gießen Tel.: (0641) Fax: (0641) Mecklenburg- Vorpommern Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V) Thierfelder Str. 18/ Rostock Tel.: (0381) Fax: (0381) Postanschrift: Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt Mecklenburg- Vorpommern, Postfach ,18003 Rostock Niedersachsen Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), Veterinärinstitut Hannover Eintrachtweg Hannover Tel.: 05 11/ Fax: 05 11/ poststelle.vi-h@laves.niedersachsen.de Nordrhein-Westfalen Staatliches Veterinäruntersuchungsamt Deutscher Ring Krefeld Tel.: (02151) Fax: (02151) poststelle@svua-krefeld.nrw.de Postanschrift: Staatliches Veterinäruntersuchungsamt, Postfach: Krefeld Rheinland-Pfalz Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz Institut für Tierseuchendiagnostik Blücherstr Koblenz Tel.: 0261/ Fax: 0261/ poststelle@lua.rlp.de Saarland Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz Abteilung Verbraucherschutz, Veterinärmedizin Hochstr Saarbrücken Tel.: (0681) Fax: (0681) poststelle@lsgv.saarland.de 215

216 Sachsen Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und Veterinärwesen Sachsen (LUA) Standort Leipzig, Außenstelle Wiederitzsch Beethovenstraße Leipzig Tel: (0341) Fax: (0341) Sachsen-Anhalt Landesamt für Verbraucherschutz des Landes Sachsen-Anhalt Fachbereich 4, Veterinärmedizin Haferbreiter Weg Stendal Tel.: (03931) Fax: (03931) Schleswig-Holstein Landeslabor des Landes Schleswig-Holstein, Lebensmittel-, Veterinär- und Umweltuntersuchungsamt Max-Eyth-Str Neumünster Tel.: (04321) Fax: (04321) Info@lvua-sh.de Thüringen Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (TLLV), Abteilung 5 Veterinäruntersuchung Standort Bad Langensalza Tennstedter Str Bad Langensalza Tel.: Fax: Medium B-Bouillon 2,45 g Heart infusion broth (Difco) + 90,0 ml Aqua bidest. Autoklavieren 20 min bei 121 C steril filtriert aseptisch hinzugeben: 20,0 ml Pferdeserum 10,0 ml Frischhefeextrakt*, 25%ig 1,2 ml Calf thymus DNA (von Sigma oder Difco), 0,2%ig 1,0 ml Thalliumacetat, 1%ige Lösung ph-wert 7,8 einstellen 3. Medium B-Agar 3,60 g Heart infusion agar (von Difco) + 90,0 ml Aqua bidest. Autoklavieren 20 min bei 121 C nach Abkühlung auf 50 C steril filtriert aseptisch hinzufügen: 20,0 ml Pferdeserum 216

217 10,0 ml Frischhefeextrakt *, 25%ig 1,2 ml Calf thymus DNA (von Sigma oder Difco), 0,2%ig ph-wert 7,8 einstellen * Frischhefeextrakt: 250 g frische Bäckerhefe ml Aqua bidest. Suspension für 15 min kochen Zentrifugieren 15 min bei 250 x g Sterilfiltrieren zu 10 ml-mengen abfüllen Aufbewahrung bei -20 C (maximal 2 Monate) 217

218 26. Maul- und Klauenseuche (MKS) Charakterisierung der Infektion Die Maul- und Klauenseuche (MKS) ist eine fieberhafte Allgemeinerkrankung der Klauentiere, die zur Bildung von Bläschen (Aphthen) und Erosionen an kutanen Schleimhäuten und unbehaarten Teilen der Haut führt, insbesondere im Bereich des Maules und der Klauen. Sie verläuft bei erwachsenen Tieren meist nicht letal, führt aber bei Rindern zu einem lang anhaltenden Leistungsabfall. Bei Jungtieren können hohe Verluste durch Schädigung des Herzmuskels auftreten. Die MKS gehört wegen ihrer potentiell katastrophalen Auswirkungen auch heute noch zu den wirtschaftlich bedeutsamsten Tierseuchen. Ihre besondere Bedeutung beruht auf ihrer hohen Kontagiosität sowie auf den wirtschaftlichen Verlusten infolge der zu ihrer Bekämpfung erforderlichen drastischen Sperr- und Kontrollmaßnahmen. Durch die Zunahme, Beschleunigung und Liberalisierung des internationalen Handels und Reiseverkehrs und die große Zahl der potentiellen Kontaktbetriebe bei der heutigen Struktur der Landwirtschaft sind die Bedingungen für eine Einschleppung und explosive Ausbreitung in Europa und damit auch in Deutschland jederzeit gegeben Erreger Genus Aphthovirus der Familie Picornaviridae, 7 Serotypen (O, A, C, ASIA, SAT1, SAT2, SAT3), ca. 60 Subtypen Klinische Symptomatik Beim Rind ist Fieber das erste Krankheitszeichen nach meist 2 bis 7 Tagen Inkubationszeit. Es hält i.d.r. nur 1 bis 3 Tage bis zum Auftreten der Sekundäraphthen an, kann aber aufgrund von Sekundärinfektionen später wieder ansteigen. Als weiteres Frühsymptom ist ggf. ein Abfall der Milchleistung zu beobachten. Die Tiere speicheln, die Maulschleimhaut ist gerötet und die Futteraufnahme geht zurück. Dann treten auf der Maulschleimhaut und den Klauen, u.u. auch am Euter, Aphthen auf, die nach dem Platzen rasch abheilen. Beim Schaf fallen nach einer Inkubationszeit von meist 2 bis 14 Tagen vorwiegend Lahmheiten aufgrund von Klauenaphthen auf. Die Veränderungen der Maulschleimhaut sind schwächer ausgeprägt als beim Rind oder fehlen ganz. Die meist kleinen Schleimhautläsionen konfluieren nicht. Wegen der meist langsamen und unvollständigen Durchseuchung des Schafsbestandes sind möglichst viele Tiere oberhalb des Ballenhorns, am Kronensaum und im Zwischenklauenspalt zu untersuchen. Zu achten ist auch auf Fieber, Inappetenz, Aborte und Verluste bei Lämmern (myotrope Form). Bei der Ziege verläuft die MKS i.d.r. gutartig und ohne Allgemeinstörungen. Es finden sich schnell zerplatzende Blasen in der Mundschleimhaut (Stomatitis erosiva) und eine Rhinitis. Die Klauen nur selten mitbetroffen. Beim Schwein treten nach einer Inkubationszeit von meist 1 bis 3, selten 12 Tagen Aphthen vorwiegend an den Sohlenballen, im Klauenspalt und am Kronensaum auf. Häufig sind die Aphthen zum Zeitpunkt der Untersuchung nur noch als Schorf erkennbar. Die Tiere zeigen einen "klammen Gang" oder bewegen sich bei starken Schmerzen nur noch rutschend auf den Karpalgelenken. Am Rüssel und an der Gesäugeleiste säugender Sauen können Aphthen auftreten; im Vordergrund stehen jedoch die Klauenveränderungen. Für meist 3 bis 4 Tage tritt 218

219 Fieber zwischen 40 bis 41 C auf. Häufig werden schwere Verluste unter Saugferkeln (myotrope Komponente) ohne Veränderungen an den Schleimhäuten beobachtet. Betroffen sind häufig nur wenige Tiere eines Bestandes, daher ist eine intensive Bestandskontrolle erforderlich Wirtsspektrum natürlicherweise Klauentiere (Rind, Schaf, Ziege, Büffel, Wildwiederkäuer, Schwein) u.u. Giraffen, Elefanten und Kamele, selten andere Spezies, experimentell insbesondere Meerschweinchen und Mäuse. Mensch nur in seltenen Ausnahmefällen bei starker Exposition; unter mitteleuropäischen Bedingungen besteht auch im Falle eines Seuchenzuges keine Gefahr für den Verbraucher Differentialdiagnostik Infektionen des Vesikulärkrankheitenkomplexes (Stomatitis vesicularis, vesikuläre Schweinekrankheit); Infektionen des Mucosal-Disease-Komplexes (keine typischen Blasen, eher herdförmige Ulzerationen, Durchfall), Rinderpest (keine Klauenveränderungen), Bösartiges Katarrhalfieber (Erosionen, Geschwüre im Maul, hohes Fieber); Krankheiten des Pocken- Herpes-Komplexes Diagnostische Indikation Seuchenverdacht, Export-/Importuntersuchungen Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, Südufer 10, Greifswald Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die Maul- und Klauenseuche (MKS-Verordnung) in der jeweils gültigen Fassung, Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der jeweils gültigen Fassung, Richtlinie 2003/85/EG Untersuchungsmaterial Der Nachweis von infektiösem MKS-Virus bzw. MKSV-Antigen und virus-spezifischer Nukleinsäure gelingt am sichersten in Aphthenlymphe sowie Aphthendeckenmaterial frischer Aphthen. Sind keine Aphthen vorhanden, ist Material am Übergang zum gesunden Gewebe zu entnehmen. Tritt der Verdacht bei Tieren nach Schlachtung, Tötung oder Verenden auf, können auch Organe (veränderte Teile von Zunge, Maulschleimhaut, Klauen, Euter, Herz, Pansenpfeiler) in dicht verschlossenen Behältnissen und gekühlt direkt zum FLI, Insel Riems gesandt werden. Beim Fehlen von Aphthen kann versucht werden, MKSV auch aus Nasentupferproben zu isolieren. Rachenschleimproben (Probang) sind dann zu nehmen, wenn die Aphthen bereits abgeheilt sind. Sie dienen der Erkennung klinisch gesunder Virusträger (Carriere), bei denen das MKSV in der Schleimhaut von Pharynx und Oesophagus persistiert (beim Rind bis zu 3 Jahren, bei kleinen Wiederkäuern bis zu 9 Monaten). Schafe und Ziegen zeigen vielfach keine typischen MKS-Symptome. Bei diesen Tieren sind daher auch stets Blutproben und Nasentupferproben (oder Probangproben) einzusenden. Blutproben dienen 219

220 insbesondere dem Nachweis von Antikörpern. Diese sind im Serum frühestens ab dem 5. bis 7. Tag nachweisbar und erreichen bei Rindern rasch hohe Titer. Wird der Verdacht aufgrund klinischer Symptome festgestellt, sind mehrere seuchenverdächtige Tiere mit frischen Veränderungen zu beproben (Aphthen, Schleimhautfetzen). Blutproben zum Nachweis von Antikörpern sind wenn möglich, von Tieren mit älteren Veränderungen zu nehmen. Bezüglich der Probenziehung aus symptomlosen Beständen wird auf die Angaben in der Entscheidung 200/85/EG und der MKS-Verordnung verwiesen. Den dort genannten Stichprobenschlüsseln liegt meist eine 95 % Sicherheit bei der Erkennung einer 5 % Prävalenz zugrunde. Generell sind Proben möglichst sauber zu gewinnen und nicht mit Desinfektionsmitteln und Säuren in Kontakt zu bringen. Die Probenverpackung muss den ADR-Vorschriften entsprechen, auf jeden Fall aber flüssigkeitsdicht sein und äußerlich gut desinfiziert werden (z. B. mit 2 % NaOH). Sie darf außerhalb des zuständigen Labors nicht mehr geöffnet werden. Die Proben sind möglichst per Kurier zur Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, Südufer 10, Greifswald zu senden. Proben sind telefonisch anzukündigen ( ). Im Anschreiben ist anzugeben: Wer sendet ein? (Veterinäramt, Bearbeiter; incl. dienstlicher und eventuell privater Telefon- und Fax-Nummer) Was wird eingesandt? (Art des Materials, von welchen Tieren, Anzahl etc.) Aus welchem Bestand stammen die Proben? Was wurde wann in dem Bestand festgestellt - anamnestischer Kurzbericht. Zusätzliche Angaben, soweit möglich: o Wie groß ist der Bestand? Tierarten? o Art des Bestandes (Zucht-, Mast-, Händlerbestand etc.)? Wurden in den letzten 6 Wochen Klauentiere neu eingestallt, wenn ja, woher (Ausland)? Bemerkungen Untersuchungsgang Untersuchungen auf MKS erfolgen am FLI, Insel Riems. Im Ausbruchsfall würden jedoch die serologischen Untersuchungen von Proben aus symptomfreien Beständen in Untersuchungsämtern durchgeführt Erregernachweis Der Nachweis virusspezifischer Nukleinsäure mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist möglich insbesondere aus Aphthenmaterial, Nasentupfer, Probangproben und Blut. Er wird am FLI in der Regel als real-time PCR durchgeführt und dauert einen Tag. Durch die Sequenzierung von Produkten weiterer, spezieller PCR-Verfahren können epidemiologische Aussagen auf molekularer Grundlage getroffen werden. Der Virusnachweis dient zu Abklärung klinischer Verdachtsfälle. Im Rahmen von Aufhebungsuntersuchungen kann er zur Abklärung auffälliger serologischer Befunde eingesetzt werden. Geeignete Proben sind insbesondere Aphthenmaterial, Nasentupfer, Probangproben und Blut (insbesondere bei Schafen und Ziegen in der Phase der Virämie). Der Zeitbedarf beträgt mindestens 1 bis 3 Tage bis zum Auftreten von Plaques oder CPE, dann folgt bei Primärausbrüchen die nähere Charakterisierung des Isolates um Aussagen über einen möglichen Impfstoff und die Einschleppungsquelle machen zu können. 220

221 Der Antigen-ELISA kann durchgeführt werden mit Aphthenmaterial und Zellkultur- überständen. Das Ergebnis liegt in der Regel am gleichen Tag vor. Der ELISA ist die schnellste Methode zur MKS-Diagnostik. Er wird in Verdachtsfällen stets mit anderen Verfahren kombiniert Antikörpernachweis Der Antikörper-ELISA wird mit Serum (falls keines zur Verfügung steht, notfalls ersatzweise gerinnungsgehemmtem Blut) durchgeführt und benötigt 1 bis 2 Tage. Man unterscheidet Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Strukturproteine (serotyp-spezifisch) und gegen Nichtstrukturproteine (NSP) (serotyp-übergreifend). Letztere Tests sind auch geeignet, infizierte Tiere in einer geimpften Population zu erkennen, da die Impfung nur Antikörper gegen Strukturproteine induziert (DIVA-Konzept). Im Ausbruchsfall würden Proben aus symptomlosen Beständen in Untersuchungsämtern mit kommerziell hergestellten ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen NSP durchgeführt werden. Zurzeit wird hierzu vom FLI der PrioCHECK FMDV NS (früher: Ceditest FMDV NS) empfohlen. Er ist nach den Angaben des Herstellers durchzuführen. (Web-Adresse: Bei Auftreten positiver Einzeltierreaktionen in Antikörper-ELISAs mit Proben aus ansonsten unverdächtigen Betrieben sind Nachuntersuchung, insbesondere mit dem Virus- Neutralisationstest (NT) erforderlich. Dieser dauert in der Regel 4 Tage. 221

222 27. Milzbrand Charakterisierung der Infektion Erreger Bacillus (B.) anthracis ist der Erreger des Milzbrandes, einer meist akut und oft tödlich verlaufenden Infektionskrankheit mit septikämischem Charakter. Haus- und Wildwiederkäuer sind hochempfindlich für Milzbrand, Schweine, Fleischfresser und auch Menschen (eher mäßig) und Vögel (Ausnahme Strauß) gelten als fast resistent. Die Krankheit ist weltweit verbreitet und kommt am häufigsten in Asien (Naher und Ferner Osten, Indien), Afrika und Südamerika vor; in Europa sind der mediterrane Raum und Osteuropa am stärksten betroffen. Die Ansteckung erfolgt gewöhnlich durch die Aufnahme von Milzbrandsporen mit dem Futter oder Trinkwasser. Nur in Ausnahmefällen wird die Krankheit von Tier zu Tier übertragen. Auch eine Ansteckung über Milzbrandsporen enthaltende Stäube und Aerosole ist möglich. Der Milzbranderreger bildet Sporen als Dauerformen, die sich über Jahrzehnte im Erdboden als ansteckungsfähig erhalten können. Milzbrandsporen werden weder durch Fäulnis noch durch Eintrocknen oder beim Gerben der Häute vernichtet Klinische Symptomatik Milzbrand ist am lebenden Tier selten mit Sicherheit festzustellen. Beim Rind und Schaf treten meist plötzliche Todesfälle auf. Aus den Körperöffnungen (Anus, Vulva, Mund, Nase) tritt dunkles, schlecht gerinnendes Blut. Erst bei der Zerlegung ist ein Verdacht auf Milzbrand festzustellen. Wenn weitere Tiere mit hohem Fieber, unregelmäßigem Puls, beschleunigter Atmung und evtl. Kolikerscheinungen erkranken, liegt der Verdacht auf Milzbrand nahe. Tierärztliche Behandlung ist nur dann Erfolg versprechend, wenn sie frühzeitig einsetzen kann. Beim Pferd: plötzlich hochfieberhafte Erkrankung mit Kolik, Schling- und Atembeschwerden, Atemnot wegen Schwellung im Kehlgangsbereich, auch scheinbare Besserung und Tod nach mehreren Tagen. Beim Schwein können Krankheitserscheinungen am lebenden Tier fehlen, in vereinzelten Fällen sind Atembeschwerden infolge Rachenentzündung sowie Verfärbung und Schwellung im Bereich des Kehlkopfes (Milzbrandbräune) zu beobachten. Die größte Zahl der Milzbrandfälle wird erst bei der Fleischbeschau oder in der Tierkörperbeseitigungsanstalt festgestellt Differentialdiagnostik Pasteurellose, Rauschbrand, Pararauschbrand, Vergiftungen Diagnostische Indikation gemäß Milzbrand-Rauschbrand-VO s

223 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Zuständige Veterinäruntersuchungsämter Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Standort Jena, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit (Nationales Referenzlabor) Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen den Milzbrand und den Rauschbrand vom 23. Mai 1991 (BGBl. I S. 1172) in der jeweils geltenden Fassung Untersuchungsmaterial Gewinnung Zur Untersuchung sollte nur frisch entnommenes Material verwendet werden. Vom lebenden Tier: Blut aus der Ohrvene (B. anthracis ist nur 16 bis 18 h vor dem Tod im Blut nachweisbar) Vom toten Tier: Aus der Umwelt: Ganze Kadaver, Sektionsmaterial, aber auch Blutausstriche und tierische Produkte wie Häute, Haare, Wolle, Tierkörpermehle Boden, Ziegelschutt u. ähnliche organische Materialien Transport und Lagerung Während des Transportes und evtl. notwendig werdender kurzzeitiger Lagerung ist das Material kühl bei +7 C ± 3 C aufzubewahren. Untersuchungsmaterial umgehend vorschriftsmäßig in dicht schließenden Behältnissen verpackt, gekennzeichnet gemäß der entsprechenden Gefahrgutverordnung Straße (ADR) und Eisenbahn (RID), Luftverkehr (IATA-DGR), DIN EN 829, Infektionsschutzgesetz, in der jeweils geltenden Fassung, zusammen mit Vorbericht und Untersuchungsantrag nach vorheriger telefonischer Absprache schicken. Wegen möglicher Gefährdungen während des Transportes sollte Milzbrandverdächtiges Untersuchungsgut durch Kurier übermittelt werden Untersuchungsgang Allgemeines Der Umgang mit potentiell B.-anthracis-haltigem Material und Kulturen ist genehmigungspflichtig und darf nur in einem Labor der Sicherheitsklasse 3 vorgenommen werden. Vor Beginn der Arbeiten ist das Material einem Tierarzt zur Beurteilung vorzulegen. 223

224 Bei Milzbrandverdacht ist folgende Reihenfolge der Laboruntersuchungen einzuhalten: Beim lebenden Tier zuerst Blut aus der Ohrvene entnehmen, Ausstrich anfertigen nach Färbung mikroskopieren Beim toten Tier zuerst ebenfalls Blut aus der Ohrvene entnehmen, Ausstrich anfertigen und mikroskopieren. Bei Öffnung des Kadavers auf mögliche Sporenbildung achten, um Infektionen zu vermeiden. Wenn weiterhin fragliche Diagnose: Präzipitation nach Ascoli und kulturelle Untersuchung einleiten. Bei tierischen Rohstoffen zuerst Präzipitation nach Ascoli, dann kulturelle Untersuchung und evtl. Tierversuch. Stärker verunreinigtes Untersuchungsmaterial kann zur Verbesserung der diagnostischen Sicherheit vorbehandelt werden. Empfohlen wird, die Probe in Wasser auszuschwemmen, zu schütteln und durch Glaswolle zu filtrieren und dann das Sediment weiter zu bearbeiten. Stark fauliges, verunreinigtes Material kann zur Unterdrückung der vegetativen Nichtsporenbildner etwa 20 min auf 80 C erhitzt werden Erregernachweis Mikroskopischer Nachweis Von den oben genannten veränderten Organen bzw. vom Blut werden Ausstrich- und/oder Abklatschpräparate gefertigt, getrocknet und hitzefixiert. Färbungen sind in Schalen durchzuführen, die mit geeigneten Desinfektionsmitteln gefüllt sind, damit abtropfende Flüssigkeiten aufgefangen werden. Übersichtsfärbungen: Gramfärbung: Die stäbchenförmigen (1,0 bis 1,25 x 5 bis 10 µm), plumpen, zylindrischen Grampositiven Milzbranderreger liegen in Organ- und Blutausstrichen einzeln oder in kurzen Ketten von 2 bis 4 Bazillen vor. Die Enden der einzelnen Zelle sind durch die Fixierung scharf rechteckig abgegrenzt, in Ketten sieht man gerade oder doppelt konvexe helle Zwischenräume. Die Längsseiten sind mitunter durch stärkere Hitzefixierung etwas konkav eingezogen (sog. Bambusstockform ). Der Erreger ist etwas Gram-labil, daher sollten die Färbungen innerhalb 24 h nach Ausstreichen von isolierten Bazillen und Inkubation auf Blutagar erfolgen. Sporenfärbung nach Rakette: Bacillus-spp.-Sporen lassen sich gut mit dieser Färbemethode nachweisen. Die Sporulation kann bei Anwendung von Nutrient Agar (am besten eignet sich Glucose-haltiger Nähragar wie Standard I-Nähragar von Merck) mit 0,01 % MnSO 4 gefördert werden. Die Sporen bilden sich hier am besten beim Bebrüten auf trockenen Nährböden. Kapselfärbung nach Foth: Die Kapselfärbung nach Foth erlaubt eine relativ spezifische Diagnostik. Im Tierkörper oder bei Isolierung aus frischem Organmaterial lässt sich eine deutliche Kapsel erkennen, welche aber nach Kultivierung auf künstlichen Nährmedien rasch verloren gehen kann oder nur noch schwach ausgebildet wird. 224

225 Da die Kapseln gegenüber äußeren Einflüssen widerstandsfähiger als die vegetativen Zellen sind, findet man in Kadaver-Ausstrichen bzw. Abklatschpräparaten oft leere Kapseln. Der Kapselnachweis in Kulturen sollte erfolgen, wenn diese auf bikarbonathaltigen Nährböden unter 5- bis 7%iger CO 2 -Atmosphäre bzw. auf Nähragar mit 0,7 % Natriumbicarbonat kultiviert wurden. Differentialdiagnose: Andere Bacillus spp, wie z. B. B. subtilis, B. mesentericus, B. cereus u.ä., die in den Übersichtsfärbungen B. anthracis sehr ähnlich sind, lassen sich durch den Nachweis der Kapselbildung abgrenzen Kultuereller Nachweis Die kulturelle Anzüchtung gilt als sehr sichere Nachweismethode. Als Ausgangsmaterial werden o. g. Materialien und Vorbehandlungsarten empfohlen. Anreicherung: Ist üblich besonders bei der Untersuchung von Futtermitteln, die Tierkörpermehle enthalten, aber auch bei Häuten, Haaren, Wolle, Oberflächentupfern und Bodenproben. Beimpfung einer Nährbouillon, die mindestens 18 h bei 37 C aerob bebrütet wird. In der Bouillonkultur wird dabei ein feinflockiger Bodensatz gebildet. Es kommt weder zu einer Trübung des Überstandes noch zu einer Häutchenbildung (Tab. 1). Kontaminiertes Material sollte mit der selektiven Anreicherungsbouillon für B.-anthracis/B.- cereus-sporen (Anhang Pkt. 2) angereichert werden. Schon nach 6 h Schütteln bei 37 C wird die exponentielle Wachstumsphase erreicht und man kann auf Selektivnährmedien (s. u.) überimpfen. Zur Sicherheit sollte die angesetzte Bouillonkultur bis 18 h bei 37 C weiter bebrütet und danach auf Selektivnährmedien ausgestrichen werden. Wird das Untersuchungsmaterial zur Ausschaltung der vegetativen Kontaminanten für 20 min bei 80 C erhitzt, kann die angegebene Anreicherungsbouillon für B. anthracis/b. cereus auch ohne Hemmstoffe verwendet werden. Dadurch verkürzt sich die Anreicherungszeit auf 4 h Schütteln bei 37 C (Reissbrodt, 2004). Direktkultur: Diese erfolgt auf festen Nährmedien wie Blutagar oder den unten angeführten Selektivnährmedien. Hierbei sind stets mehrere Platten zu verwenden. Die Beimpfung erfolgt direkt oder nach Vorbehandlung und/oder Anreicherung (s. o.). Die Platten werden mindestens 18 h bei 37 C aerob bebrütet. Nach 18- bis 24-stündiger Bebrütung sind Kolonien von B. anthracis mittelgroß bis groß (etwa 0,5 cm Durchmesser), mattglänzend oder trocken, flach, nicht pigmentiert, mit flockigspiraliger Oberfläche und von butterartiger Konsistenz. Bei längerer Bebrütung werden am Kolonierand fransige Ausläufer sichtbar, die durch parallele Bakterienfäden entstehen und die bogenartig zur Kolonie zurücklaufen (sog. "Medusenhauptform"). Es entstehen oft Tochterkolonien. Auf Blutagar tritt keine Hämolyse auf. Im Grampräparat lassen sich Gram-positive plumpe Stäbchen mit mittelständigen ovalen Sporen nachweisen, wobei die Sporulation bei Anwendung von Nutrient Agar mit 0,01 % MnSO 4 gefördert wird (3.2.1). Infolge morphologischer Ähnlichkeiten kommt der Abgrenzung zwischen B. anthracis und seinen taxonomisch nächsten Verwandten B. cereus, B. thuringiensis und B. mycoides (B.-cereus Gruppe) besondere praktische Bedeutung zu. 225

226 Weiterhin sind differentialdiagnostisch einige Antibiotika bildende Arten von Interesse, wie z. B. B. polymyxa (Polymyxin B), B. brevis (Tyrothricin), B. subtilis bzw. B. licheniformis (Bacitracin) von Interesse. Auch B. megaterium (Erdbazillus) kann im Rahmen der Differentialdiagnostik eine Rolle spielen. Zur Identifizierung von B. anthracis sollten bereits beim Anlegen von Organproben Selektivnährmedien eingesetzt werden. Anthrax-Blutagar: Auf diesem speziell für die Anthraxdiagnostik entwickelten Nährboden finden Bacillus spp. eine gute Nährstoffbasis, um schnell zu charakteristischen großen Kolonien auszuwachsen. Das Selektivsupplement hemmt B. subtilis und B. megaterium vollständig, ebenso ist das Wachstum von Staphylokokken, von Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa und Enterokokken entweder vollständig gehemmt oder stark reduziert. Der Zusatz von Schafblut unterstützt das Wachstum, gleichzeitig ist das Auftreten einer starken Hämolyse um die Kolonien der anderen Bacillus spp. wie B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. licheniformis ein hervorragendes Differenzierungsmerkmal zu B. anthracis. B.-anthracis-Stämme wachsen als weiße, große Kolonien (2 bis 6 mm im Durchmesser) mit charakteristischer stumpfer Oberfläche ohne Hämolyse (Tab. 2). Chromogene Selektivnährmedien Zur weiteren Differenzierung der Bacillus spp. wird das beschriebene BCM B.-cereus/B.- thuringiensis-plating-medium auch als Fertigplatte Cereus-Ident-Agar erhältlich, empfohlen. Dieses ursprünglich im Rahmen der B.-cereus-/B.-thuringiensis-Diagnostik eingesetzte Nährmedium ermöglicht eine optisch klare Differentialdiagnostik innerhalb der Bacillus spp. Alle Spezies, welche die Phosphatidylinositol-Phospholipase C (PI-PLC) enthalten und in der Lage sind, das chromogene Substrat X-myoinositol-1-phosphat zu spalten, wachsen als türkise Kolonien (z. B. B. cereus, B. thuringiensis). B. anthracis wächst mit einem Durchmesser wie B. cereus (ca. 4 mm), aber als stumpfe, weiße Kolonie (Tab. 2). Eine Gram-positive oder Gram-negative Begleitflora wird dabei weitgehend oder vollständig gehemmt (Reissbrodt et al., 2004). Die isolierten verdächtigen Kolonien müssen unbedingt und in jedem Fall mit einer geeigneten Methode der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) als B. anthracis bestätigt und hinsichtlich der vorhandenen Virulenzplasmide charakterisiert werden (z. B. Beyer et al., 1995) Antigennachweis Thermopräzipitation (nach Ascoli und Valente) Dieses Verfahren zum Antigennachweis bei Milzbrand kann bei perakut verlaufendem oder lokalisiertem Milzbrand (Rachen-, Darm-, Hautmilzbrand) wegen zu geringer Antigenmengen im Probenmaterial bis zu 40 % falsch-negative Ergebnisse liefern. Andererseits können Verunreinigungen mit anderen aeroben Bazillen auch zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Aus diesem Grunde sind Knochenmehl, Futtermittel und Bodenproben zur Ascolireaktion (Anhang Pkt. 6) ungeeignet. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Diese sehr spezifische und sensitive Methode steht in konventioneller Form und als Realtime- PCR zur Verfügung. 226

227 Der Nachweis dreier charakteristischer genetischer Marker (Plasmid px01 kodierend für protektives Antigen, Plasmid px02 kodierend für Kapselantigen sowie ein genomischer Marker, z. B. rpob-gen oder vrra-gen) in verdächtigen Kulturen bestätigt das Vorhandensein von virulenten B.-anthracis-Stämmen im Untersuchungsmaterial Serologische Diagnostik In der Veterinärmedizin ist der Antikörpernachweis bei Milzbrand nicht üblich. Für Menschen sind mehrere Tests beschrieben (Agar-Gel-Präzipitation, Indirekte Hämagglutination, ELISA, Immunoblot), von denen bisher keiner als Standardmethode akzeptiert worden ist Phagentest Der Phagentest wird unter Anwendung des für B. anthracis spezifischen g-phagen durchgeführt. Als Ausgangskultur kann einerseits eine 3- bis 4-stündige Nährbouillonkultur oder eine leicht trübe Suspension des verdächtigen Koloniematerials in steriler physiologischer Kochsalzlösung oder auch mit dem resuspendierten Koloniematerial direkt verwendet werden. Stets sollte als Positivkontrolle ein gut charakterisierter Milzbrandstamm und als Negativkontrolle ein B.-cereus-Stamm bei gleicher Präparationstechnik in die Untersuchung einbezogen werden. Durchführung: Auf Blutagar wird auf der Rückseite der Petrischale mit Schablone eine kreisrunde Fläche (Ø 2 cm) markiert. Auf dieser Fläche wird das Probenmaterial verteilt. Den Inhalt einer Öse mit Phagensuspension (Titer ca. 1:10 000) exzentrisch auf diesen Bereich auslaufen lassen, (Flüssigkulturen müssen vorher erst eintrocknen), Bebrütung 7 bis 8 h bei 37 C, danach Ablesung. Positiver Befund: an der Stelle, wo die Phagensuspension aufgetropft wurde, ist ein Phagenloch (bakterienfreier Bereich) zu sehen. Kultureller B.-anthracis-Schnelltest Als besonders schnelle Methode des kulturellen B.-anthracis-Nachweises sollte aus der Anreicherungskultur auf die beschriebenen Selektivnährmedien (Anthrax-Blutagar oder TMSP- Agar und ein chromogenes Selektivnährmedium) ausgeimpft und anschließend der g-phage wie beschrieben aufgesetzt werden. Im günstigen Falle erkennt man schon nach 4 bis 6 Std. Bebrütung bei 37 C zartes Wachstum und das typische Phagenloch. Nach weiterer Bebrütung bei 37 C für 18 h ist das Phagenloch gut sichtbar, gleichzeitig kann man die Kolonieformen und biochemischen Reaktionen (Hämolyse, PI-PLC) ablesen. Die Differenzierungsmerkmale zwischen B. anthracis und anderen Sporenbildnern sind in Tabelle 1 und 2 im Anhang zusammengefasst. 227

228 Anhang 1. Mikroskopische Färbemethoden 1.1. Sporenfärbung nach Rakette Durchführung: fixieren des luftgetrockneten Präparates: 6- bis 8-mal mit einer Halteklammer durch die Flamme ziehen Präparat mit 5%iger wässriger Malachitgrünlösung vollständig bedecken, 20 sec über Flamme aufkochen und weitere 30 sec einwirken lassen kräftig mit Leitungswasser spülen Nachfärbung: 1 min das Präparat mit 2,5%iger Eosinlösung oder mit 3%iger Safraninlösung vollständig bedecken Abspülen mit Leitungswasser und anschließend zwischen Filterpapier trocknen mikroskopische Beurteilung (bei 100-facher Vergrößerung) Ergebnis: Sporen = grün, übrige Zellbestandteile = rot 1.2. Kapselfärbung n. Foth (Giemsa-Schnellfärbung) Durchführung: Objektträgerausstrich lufttrocknen, aber nicht fixieren bedecken mit zwei Tropfen Giemsa-Stammlösung für 1 bis 2 min dann 20 Tropfen (= 1 ml) Aqua dest. zusetzen und durch leichtes Schwenken mit der Giemsa-Lösung mischen, Einwirkungszeit 2 bis 5 min abspülen und trocknen Ergebnis: Bakterienkapsel = rosarot, Bakterienzelle = blauviolett 2. Nährmedien 2.1 Anreicherungsbouillon für B.-anthracis/B.-cereus-Sporen (Reissbrodt, 2002) Basis Nutrient Broth (Difco, BD) für 1 l Tryptone (Difco,BD) 5,0g NaCl 5,0g K 2 HPO 4 4,0g Sterilisation 15 min 121 C ph 7,3 ± 0,1 Supplemente (als sterile Lösungen zugeben) D-Glucose 2,0g Trimethoprim 0,0032g Sulfamethoxazol 0,016g Polymyxin B 0,020g Cycloheximid 0,200g 228

229 2.2. Blutagar Brucella-Agar (oder andere Blutagarbasis, s. z. B. die folgende Rezeptur) mit Zusatz von 5 % defibriniertem Blut von Schafen, Pferden, Rindern oder Kaninchen. Weiter wird empfohlen: Bacto-Pepton Natriumchlorid Na 2 HPO 4 x 12H 2 O Fleischextrakt Aqua dest. ad ph = 7,2 ±0,2 10,0 g 5,0 g 2,0 g 6,0 g 1000,0 ml 2.3. Anthrax-Blutagar Caseinpepton Fleischpepton Hefeextrakt NaCl Agar Schafblut Trimethoprim Sulfamethoxazol Polymyxin B Aqua dest. ad ph 7,3 ± 0,2 14,0 g 4,5 g 4,5 g 5,0 g 16,0 g 50 ml 3,2 mg 16,0 mg 20 mg 1000,0 ml 2.4. TMSP-Agar Standard-Agar Trimethoprimlactat Salz Sulfamethoxazol Polymyxin B Schafblut Aqua dest. ad ph 7,3 ± 0,2 40,0 g 13,1 mg 20,0 mg Einheiten 50,0 ml 1000,0 ml Die Zusätze werden als Sterilfiltrate präpariert und nach Abkühlung des autoklavierten Agarmediums auf 50 C zugesetzt. Trimethoprim kann als 100fache Stammlösung in Wasser angesetzt und bei -20 C in Aliquots gelagert werden. Eine 100fache Lösung von Sulfamethoxazol kann durch Zusatz von 600 µl 10 % NaOH zu 100 ml Wasser und Erhitzung der Lösung auf 80 C hergestellt werden Chromogene B.-cereus-Selektivnährmedien BCM Bacillus-cereus/Bacillus-thuringiensis Plating-Medium (Pulver) Catalog-Nr. C

230 BCM Bacillus-cereus/Bacillus-thuringiensis-Supplement Catalog-Nr. C-0712 Zur Herstellung der Platten wird das Basismedium (Pulver) gelöst und autoklaviert, das chromogene Substrat und die Hemmstoffe werden als sterile Supplementlösung vor dem Ausgießen zugesetzt. Das BCM Bacillus-cereus/Bacillus-thuringiensis-Plating-Medium (Biosynth) steht leicht variiert als Fertigplatte unter dem Namen Cereus-Ident -Agar(Heipha Art.-Nr. 174e) zur Verfügung. Cereus-Ident-Agar Columbia-Agar Wachstumssupplement Chromogenes Selektivsupplement Aqua dest. ad ph 7,3 ± 0,1 42,5 g 4,0 g 2,45 g 1000,0 ml 2.6. Halbfestes Nährmedium zur Beweglichkeitsprüfung Tetrazoliumsalze sind farblos, werden aber bei Bakteriumwachstum in die Zellen aufgenommen und zu einem roten Farbstoff (Formazan) reduziert. Die Beweglichkeit kann damit durch Ausschwärmen der Bakterien auf dem Nährmedium sichtbar gemacht werden. NB I- Bouillon für 1 L Standard-Agar 2,5 g lösen, autoklavieren (15 min bei 121 C) 2,3,5,-triphenyltetrazolium chlorid 0,05 g (steril zusetzen) Aqua dest. ad 1000,0 ml 3. Beweglichkeitstest Die Prüfung der Beweglichkeit eines Bakteriums erfolgt entweder nach der Technik des Hängenden Tropfens oder mit einer Wachstumsprüfung auf halbfestem Agar. Bouillonkulturen verdächtiger Kolonien eignen sich gut als Ausgangsmaterial für die Beweglichkeitsprüfung im Hängenden Tropfen. 4. Perlschnurtest Seine Bedeutung für die Diagnostik ist umstritten. Der Test beruht darauf, dass auf Penicillinhaltigen Nährböden Milzbrandbazillen zu kugeligen Formen degenerieren, die wie eine Perlschnur aussehen. Es gibt mehrere Varianten bei der Durchführung dieses Tests (Dedié, et al., 1993), meist führt man die Kultivierung als Agar-Deckglaskultur (Hallmann, 1961) oder zur Verminderung der Infektionsgefährdung die Kultivierung auf einem ausgestanzten Agarstück durch. 230

231 Durchführung: Nähragar mit einem Penicillingehalt von 0,5 IE/ml wird in 1 bis 2 mm Schichtdicke in Petrischalen ausgegossen, nach dem Erstarren wird ein Agarplättchen von ca. 1 mm Durchmesser steril ausgestanzt, auf einen sterilen Objektträger gelegt und mit der fraglichen, 6-stündigen geschüttelten Bouillonkultur beimpft. Bebrütung: 6 h in feuchter Kammer Beurteilung: in der Direktmikroskopie. Milzbrand zeigt perlschnurartige Deformation der Stäbchen. 5. Tierversuch Ein Tierversuch ist behördlich genehmigungspflichtig. Er wird nur durchgeführt, wenn durch andere Diagnostik keine eindeutige Abklärung möglich ist. Durchführung: In der Regel werden weiße Mäuse benutzt, mitunter auch Meerschweinchen. Vom Probenmaterial werden 0,5 ml subkutan oberhalb der Schwanzwurzel verabreicht. Das Material wird zuvor ggf. zerkleinert (Mörser), filtriert und kurz erhitzt (10 bis 30 min, 80 C). Kulturen werden mit physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt. Beurteilung: Beim Vorliegen von Milzbrand zeigen die Tiere zuerst ein sulziges Ödem an der Injektionsstelle, dann eine Septikämie, durch die der Tod nach 1 bis 3 Tagen eintritt. 6. Thermopräzipitation nach Ascoli u. Valente 6.1. Besondere Gebrauchsmaterialien Uhlenhutröhrchen oder enge Reagenzgläser (Innendurchmesser 2 bis 3 mm, Länge ca. 3 cm) Milzbrand-Antigen, positiv- zugel. nach 17 TierSG Milzbrand-Antigen, negativ Milzbrand-Kontrollserum, positiv - zugel. nach 17 TierSG Milzbrand-Kontrollserum, negativ Physiologische Kochsalzlösung mit Phenol - Natriumchlorid p. A 8,9 g - Aqua bidest ad ml 2 min bei 121 C autoklavieren - Phenol p. A. 0,5 g 6.2. Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Untersuchungsmaterial: Gewebe, Organteile, Häute, Pelze, Haare, Wolle, fragliche Kultur Aufbereitung des Untersuchungsmaterials Untersuchungsmaterial mit Schere zerkleinern Mit 5- bis 10-facher Menge Phenol-NaCl-Lösung aufkochen (30 min bei 90 bis 100 C) 231

232 Nach dem Abkühlen Klärung durch Filtration (Spritzenvorsatzfilter, 045µm) Stärker verunreinigtes Untersuchungsmaterial kann zur Verbesserung der diagnostischen Sicherheit vorbehandelt werden. Empfohlen wird, die Probe in Wasser aufzuschwemmen, zu schütteln, durch Glaswolle zu filtrieren und das Sediment weiter zu bearbeiten. Stark fauliges, verunreinigtes Material kann auch zur Unterdrückung der Nichtsporenbildner etwa 20 min auf 80 C erhitzt werden. Bei fraglichen Kulturen wird ein Schrägagarröhrchen mit 10 ml physiologischer NaCl-Lösung abgeschwemmt, die Abschwemmung ebenfalls 30 min bei 90 bis 100 C erhitzt und filtriert Durchführung Kontrollsystem Serum-Kontrollen: Positives Kontrollserum (+Ko) + Positives Milzbrand-Antigen (+Ag) Positives Kontrollserum (+Ko) + Negatives Milzbrand-Antigen (Ag) Antigen-Kontrollen: Negatives Kontrollserum (Ko) + Extrakt (fragliches Ag) Negatives Kontrollserum (Ko) + Positives Milzbrand-Antigen (+Ag) Negatives Kontrollserum (Ko) + Negatives Milzbrand-Antigen (Ag) Resuspendierte Seren können portioniert entsprechend Herstellervorschrift aufbewahrt werden. Seren und Antigen auf Raumtemperatur erwärmen Ansatz und Bewertung In engen Röhrchen werden mit einer Kapillarpipette ca. 50 µl entsprechender Kontrollseren mit ca. 50 µl entsprechendem Antigen vorsichtig überschichtet. Die Flüssigkeiten dürfen sich nicht mischen Die Ablesung erfolgt nach 15 min Bei positiver Reaktion bildet sich innerhalb der Beobachtungszeit an der Berührungsstelle ein Präzipitationsring Ausschluss evtl. Kreuzreaktionen mit anderen Bacillus spp.!!! Die folgende Tabelle stellt ein Ansatzschema für die Untersuchung einer Probe und deren Bewertung dar. Diagn. Reaktion Serumkontrollen Antigenkontrollen Röhrchen Ko +Ko +Ko Ko Ko Ko fragliches Ag +Ag Ag fragliches Ag +Ag Ag Bewertung + oder + 232

233 7. Allgemeiner Untersuchungsgang bei Milzbrandverdacht (Organproben) Färbungen von Abklatschpräparaten Färbungen: Gramfärbung,Sporenfärbung, Kapselfärbung (Ascoli Reaktion) Kulturelle Untersuchung (evtl. Organmaterial zusätzlich auch hitzebehandelt untersuchen): Anreicherungskultur Direktkultur (Selektivnährmedien) Phagenlysis Beurteilung Koloniemorphologie, Hämolysebildungsvermögen, Beweglichkeit PCR von verdächtigen Kolonien bzw. von der Anreicherungskultur---Endbefund 8. Literatur BEYER, W., P. GLÖCKNER, J. OTTO and R. BÖHM (1995): A nested PCR method for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples collected from former tannery sites. Microbiol. Res., 150, BROWN, E. R. and Cherry, W. B. (1955): Specific identification of Bacillus anthracis by means of a variant bacteriophage. J. infect. Dis. 96, DEDIÉ, K., BOCKEMÜHL, J., KÜHN, H., VOLKMER, K.-J. und WEINKE, TH. (1993): Epidemiologie, Pathologie, Klinik, Diagnostik und Bekämpfung. In: Bakterielle Zoonosen bei Mensch und Tier, Kapitel 12 Milzbrand. Ferdinand Enke Verlag Stuttgart, S HALLMANN, L. (1961):Ausgewählte Untersuchungsmethoden für das bakteriologische und serologische Laboratorium. In: Bakteriologie und Serologie. Georg Thieme Verlag Stuttgart, 3. Aufl. REISSBRODT, R, A. RASSBACH, B.BURGHARDT,I. RIENÄCKER, H. MIETKE, J. SCHLEIF, H. TSCHÄPE, M. LYTE, AND P.H.WILLIAMS (2004): Assessment of a New Selective Chromogenic Bacillus cereus Group Plating medium and Use of Enterobacterial Autoinducer of Growth for Cultural Identification of Bacillus Species. Journal of Clinical Microbiology, Verordnung zum Schutz gegen Milzbrand und Rauschbrand vom 23. Mai 1991 (BGBl. I S. 1172). OIE (2004): Anthrax. In: Manuel of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. List A and B diseases of mammals, birds and bees, Office International des Epizooties, World organisation for animal health. Fifth Edition 233

234 Tabelle 1: Differenzierungsmerkmale zwischen B. anthracis und anderen Bacillus spp. (nach Dedie et al. 1993, mod.) B. anthracis s p e z i f i s c h e T e s t s Hämolyse Phagenlysis - keine Hämolyse (selten späte Vergrünung) B. cereus + (90 %*) meist starke b- Hämolyse B. mycoides B. megaterium - (meist) ± (positiv: Pferdeblut; variabel: Schafblut) ± (meist schwach beweglich) b- Hämolyse + + (bekapselte Stämme) w e n i g e r s p e z i f i s c h e T e s t s Kolonie- Wachstum Form in Bouil- Beweglichkeit Mäusepathogenität Ascoli- Reaktion + kräftige Reaktion bei ca. 40 % der Fälle gewölbt, schleimig glänzend - ± (25 bis 80 %*) flach, rau, rhizoid - - (10 %*) ± (15 bis 40 % *) schwache Reaktion Oberfläche stumpf - - (0 %*) rund, glattrandig * Zahl in Klammern: Prozentsatz der Stämme mit positiven Reaktionen trübe mit Sediment klar, anfangs mit Häutchen, das absinkt lon klar mit feinflockigem Bodensatz Perlschnurtest + für Penicillinresistente Stämme Oxacillin verwenden - - trübe - Tabelle 2: Wachstum und Koloniemorphologie von Bacillus spp. auf verschiedenen Nährmedien (37 C, 24 h) Nährmedien Blutagar Anthrax-Blutagar BCM Bacilluscereus-/Bacillusthuringiensis- Plating-Medium Spezies Wachstum Hämolyse Wachstum, Hämolyse Wachstum, Koloniefarbe Koloniefarbe Cereus-Ident- Agar Wachstum, Koloniefarbe B. anthracis weiß ø groß, weiß ø groß, weiß groß, weiß B.-cereus- weiß + groß, weiß + groß, türkis* groß, türkis* Wildstämme B.-cereusprobiotische Stämme weiß + groß, weiß + groß, helltürkis groß, türkis B. thuringiensis weiß + groß, weiß + groß, türkis * groß, türkis* B. subtilis weiß + kein - kein kein B. mycoides weiß + groß, weiß + kein groß, türkises Zentrum B. lichenformis hell ø kein - klein, hell kein B. megaterium weiß ø kein - kein kein *teilweise türkiser Hof um Kolonien 234

235 28. Newcastle Disease (ND) Charakterisierung der Infektion Erreger Der Erreger der Newcastle Krankheit (Newcastle Disease - ND) war der erste Vertreter der Gattung Paramyxovirus (PMV), der von Vögeln isoliert wurde. Als in den vergangenen Jahren weitere, serologisch vom Newcastle Disease Virus (NDV) unterscheidbare aviäre PMV entdeckt wurden, bezeichnete man NDV als APMV-1 und ordnete die übrigen in die Serogruppen APMV-2 bis APMV-9. Im Gegensatz zum NDV haben APMV-2 bis APMV-9 eine geringere Bedeutung als Krankheitserreger Klinische Symptomatik APMV-1 (oder NDV) ist weltweit verbreitet und konnte bisher von mehr als 240 Vogelarten isoliert werden. Die Schwere der hervorgerufenen Erkrankung hängt ab von der Pathogenität des Virusstammes, der Wirtsspezies sowie von der Immunkompetenz der betroffenen Tiere. Beim Haushuhn kann die Erkrankung in Abhängigkeit vom Virusstamm vom plötzlichen Tod mit 100 % Mortalität bis zur subklinischen Erkrankung variieren. Virus, das bei Hühnern und Puten zu hoher Morbidität und Mortalität führt, kann z. B. bei Enten oder Gänsen nur eine inapparente Erkrankung auslösen. Andererseits führt Virus von schwer erkrankten Tauben meist nur zur leichten Erkrankung mit einem vorübergehenden Legeleistungsabfall bei Hühnern. Bei ND sind bei perakuten Verläufen plötzlich auftretende Todesfälle ohne vorherige Krankheitszeichen zu beobachten. Darüber hinaus können folgende Symptome auftreten: Legeleistungsabfall, Depressionen, Ödeme an Kopf und Kehllappen, respiratorische Störungen, Durchfall und nervale Symptome. Bei Tauben dominieren Polyurie und ZNS Störungen das klinische Bild. Bei der Sektion können hämorrhagische Veränderungen festgestellt werden, insbesondere an Drüsenmagen, Darm, Serosa und Epikard. Manchmal bestehen entzündliche Veränderungen am Respirationstrakt und histologisch eine nichteitrige Enzephalitis, bei Legehennen Follikelruptur Diagnose und Differentialdiagnostik Für die Diagnosestellung ist immer der Erregernachweis erforderlich. Wegen der großen Variationsbreite in der Virulenz wird nicht jede APMV-1-Infektion als seuchenrechtlich zu maßregelnde ND angesehen, sondern nur die durch mittelgradig virulente (mesogene) und hochvirulente (velogene) Virusstämme bedingten Erkrankungen. Der gesetzlich vorgesehene Standardtest für die Bestimmung der Virulenz ist die Ermittlung des intracerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) an SPF-Eintagsküken. Bis zu einem ICPI von 0.7 gilt ein Virus als lentogen, von 0.7 bis 1.5 als mesogen und über 1.5 als velogen. Der höchstmögliche ICPI ist

236 In der Richtlinie 92/66/EWG vom 14. Juli 1992 ist für die diagnostischen Verfahren zur Bestätigung und Differentialdiagnose folgende Definition gegeben: Die ND ist eine Infektion des Geflügels, verursacht durch ein aviäres Paramyxovirus 1 mit einem intracerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) in Eintagsküken von über 0.7. Diese Definition gilt auch für die Geflügelpest-Verordnung in der Fassung vom 20. Dezember Diagnostische Indikation Bei Anstieg der Mortalität, bei Auftreten respiratorischer und oder nervaler Symptome, bei Legeleistungsabfall, Reduktion der zu erwartenden Gewichtszunahme sowie bei Feststellung petechialer Blutungen auf Serosen ist eine Untersuchung auf ND einzuleiten (Gefl 8.1) Zuständige Untersuchungseinrichtungen staatlich autorisierte Veterinäruntersuchungsämter bzw. Staatliche Lebensmittel- und Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald - Insel Riems (O.I.E und Nationales Referenzlabor für Newcastle Disease), Tel Rechtsgrundlagen Richtlinie 92/66/EWG vom 14. Juli 1992, in der Fassung vom 01. Mai 2005 Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest und die Newcastle Krankheit (Geflügelpest-VO) in der Fassung vom 20. Dezember Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 20. Dezember Untersuchungsmaterial Erregernachweis Von lebenden Vögeln: Kloakenabstriche oder Fäzes sowie Luftröhrenabstriche. Probenmaterial von kürzlich verendeten oder getöteten Tieren: Luftröhre, Lunge, Niere, Milz, Leber, Pankreas, Darm mit Inhalt, Hirngewebe, sowie andere befallene Organe oder Fäzes. Fäkalmaterial ist von anderen Proben getrennt zu halten. Alle Probenmaterialien sind während des Transportes gekühlt zu halten. Abstriche sollten ganz in antibiotisches Medium eingetaucht werden bzw. es sind kommerzielle Tupferentnahmesysteme zu empfehlen Antikörpernachweis Blutproben, von denen Plasma oder nach Gerinnung das Serum für die Untersuchung gewonnen wird. 20 Proben pro Bestand, bei kleineren Beständen Proben von allen Tieren. Anstelle von Serum kann auch Eidotter untersucht werden. 236

237 28.3. Untersuchungsgang Direkter Erregernachweis Probenaufbereitung Organe und Gewebe können gepoolt werden, nur Fäkalmaterial ist gesondert zu behandeln. Abstriche sollten ganz in antibiotisches Medium getaucht werden. Aus Fäzes und Organen sind 10- bis 20%ige Suspensionen herzustellen. Zur Entfaltung der antibiotischen Wirkung sind die Suspensionen für etwa 2 Stunden bei Umgebungstemperatur (bei 4 C entsprechend länger) stehen zu lassen und danach durch Zentrifugieren zu klären (z.b. 800 bis 1000 g für 10 Minuten). Virusisolierung in embryonierten Hühnereiern Pro Probe sind mindestens 4 embryonierte, 8 bis 10 Tage vorbebrütete Hühnereier mit je 0,1 bis 0,2 ml des geklärten Überstandes in die Allantoishöhle zu beimpfen. Die Eier sollten aus einer spezifiziert pathogenfreien (SPF) Herde stammen; im Notfall können auch Eier aus einem Bestand verwendet werden, der nachweislich frei von NDV-Antikörpern ist. Die beimpften Eier werden bei 37,0 bis 37,8 C weiterbebrütet und täglich durchleuchtet. Eier mit toten oder absterbenden Embryonen sind auf 4 C abzukühlen, ebenso alle verbliebenen Eier 6 Tage nach der Beimpfung. Die Allantois/Amnionflüssigkeiten (AF) sind auf Hämagglutination zu untersuchen. Lässt sich keine Hämagglutination feststellen, wird die unverdünnte AF erneut auf Eier verimpft (2. Eipassage). Wird Hämagglutination festgestellt, sollte eine bakterielle Kontamination ausgeschlossen werden. Sind Bakterien vorhanden, so können die AF durch 450 nm-membranfilter gegeben werden und nach Zugabe weiterer Antibiotika erneut auf embryonierte Eier verimpft werden. Virusisolierung in Zellkulturen Obwohl embryonierte SPF-Hühnereier das empfänglichste Vermehrungssubstrat für APMV-1 sind, kann die Virusisolierung auch in verschiedenen Zellkulturen erfolgen. Dabei sind primäre Hühnerembryozellen, insbesondere Leberzellen wegen der höheren Empfänglichkeit permanenten Zelllinien vorzuziehen. Nicht alle APMV-1 verursachen einen CPE. Sie lassen sich nachweisen durch Hämagglutination des Zellkulturüberstandes, Hämadsorption von Hühnererythrozyten an den Zellrasen oder spezifische Immunfluoreszenz mit Anti-PMV-1-Konjugat. Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR Aus Kloaken- und Rachentupferproben, aus Organ- und Fäzesmaterial kann virale RNA mittels RT-PCR nachgewiesen werden. Das kann vor der Virusisolierung, parallel dazu oder als Bestätigungstest aus infizierter Allantoisflüssigkeit geschehen. Für den Ja-/Nein-Nachweis von APMV-1-RNA wird eine real time RT-PCR durchgeführt, die einen Teil des für das Matrixprotein (M) kodierenden Gens amplifiziert. Mittels einer zweiten real time RT-PCR die ein Genfragment des Fusionsproteins (einschließlich der F 0 -Spaltstelle) detektiert generiert Hinweise auf die Virulenz des auftretenden APMV-1 Typs. Bei den jetzt zur Verfügung stehenden Methoden sind falsch negative Reaktionen nicht auszuschließen. Methodische Hinweise und Primersequenzen können vom NRL abgefordert werden. 237

238 Vorläufige Virusdifferenzierung Wird aus Geflügel ein hämagglutinierendes Virus isoliert, kann es außer APMV-1(NDV) auch ein anderes der 9 aviären PMV-Serotypen oder ein Influenzavirus sein. Die Identifizierung als APMV-1 erfolgt mit APMV-1-spezifischen polyklonalem Serum mittels Hämagglutinations-Hemmungstest (HAH), bzw. mittels real time RT-PCR. Hämagglutinations(HA)-Test (Arbeitsvorschrift) Reagenzien Phosphatgepufferte isotonische Kochsalzlösung (PBS), ph 7,1 bis 7,3 Hühnererythrozyten-Suspension, 1%ig dreimal gewaschen in PBS zu untersuchende Virussuspension Ei- oder Zellkulturflüssigkeit oder Überstände von Organanreibungen, als Standardantigen für Hämagglutinationshemmungsteste wird Allantoisflüssigkeit mit NDV Stamm La Sota empfohlen Arbeitsschritte 0,025 ml PBS in alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit U- oder V-Boden einfüllen. 0,025 ml Virussuspension in die erste Vertiefung geben. Eine 2er-Verdünnungsreihe des Virus über die gesamte Platte herstellen. Nochmals 0,025 ml PBS in jede Vertiefung füllen. 0,025 ml 1%ige Erythrozytensuspension in jede Vertiefung hinzugeben. Durch vorsichtiges seitliches Antippen oder Rütteln der Platten mischen. Nach 30 bis 40 Minuten bei Zimmertemperatur, wenn sich die Erythrozyten in der Erythrozytenkontrolle (ohne Virussuspension) abgesetzt haben, ist der Test abzulesen. Die Platte schräg halten und beurteilen, ob die sedimentierten Erythrozyten ablaufen. Zeigen die Erythrozyten die gleiche Strömungsrate wie die in den nichtvirushaltigen Kontrollen, liegt keine HA vor. Der HA-Titer ist die höchste Verdünnung, die Agglutination verursacht. Diese Verdünnung enthält 1 HA-Einheit (HAE). Für eine genauere HA-Titer-Bestimmung als Vortest für HAH muss bei der Virusverdünnung neben 1:2 auch von einer Anfangsverdünnung 1:3 ausgegangen werden. Hämagglutinations-Hemmungs(HAH)-Test (Arbeitsvorschrift) Reagenzien Phosphatgepufferte isotonische Kochsalzlösung (PBS), ph 7,1 bis 7,3 Virus- bzw. Antigensuspension, mit PBS verdünnt auf 4 HAE pro 0,025 ml Hühnererythrozyten-Suspension, 1%ig negatives Kontrollserum positives Kontrollserum positives Kontrollantigen zu untersuchendes Serum 238

239 Arbeitsschritte 0,025 ml PBS in alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit U- oder V-Boden einfüllen. 0,025 ml Serum in die erste Vertiefung geben. Eine 2er-Verdünnungsreihe des Serums über die gesamte Platte herstellen. 0,025 ml verdünnte Virussuspension, die 4 HAE enthält, in jede Vertiefung geben. Durch vorsichtiges seitliches Antippen oder Rütteln der Platten mischen. Die Platten für 45 Minuten bei Zimmertemperatur stehenlassen. 0,025 ml 1%ige Erythrozytensuspension in jede Vertiefung zugeben. Durch vorsichtiges Antippen oder Rütteln mischen. Nach 30 bis 40 Minuten bei Zimmertemperatur, wenn sich die Erythrozyten abgesetzt haben, ist der Test auszuwerten. Die Platte schräg halten und beurteilen, ob die sedimentierten Erythrozyten ablaufen. Bei gleicher Strömungsrate wie in den nichtvirushaltigen Kontrollen liegt keine HA vor. Der HAH-Titer ist die höchste Serumverdünnung, die eine HA komplett hemmt. Die weitere Charakterisierung von Virusisolaten erfolgt im Nationalen Referenzlabor für ND im FLI Insel Riems. Gemäß Richtlinie 92/66/EWG werden folgende Untersuchungen durchgeführt: Endgültige Differenzierung des Erregers Sie erfolgt durch HAH-Tests mit spezifischen polyklonalen Seren gegen die aviären Paramyxovirus-Serotypen 1 bis 9 sowie mittels monoklonalen Antikörpern (mak). Durch mak ist zudem eine Identifikation des Taubentyp des NDV (PPMV-1) möglich sowie Hinweise auf das Vorliegen des Vakzinevirus La Sota. Bestimmung der Pathogenität Die Bestimmung der Pathogenität des Erregers erfolgt im Tierversuch durch Ermittlung des ICPI an SPF-Eintagsküken. Als Alternative zum Tierversuch kann die Spaltstelle des F-Gens des Virus sequenziert werden. Bei Nachweis von mehreren basischen Aminosäuren (mindestens 3 Arginin- und/oder Lysinreste zwischen Position 113 und 116) am C-Terminus des F2-Proteins und Phenylalanin auf Position 117, dem N-Terminus des F1-Proteins, gilt das Virus auch als ND-Seuchenvirus. Gelingt der Nachweis von multiplen basischen Aminosäuren in diesem Bereich nicht, muss bei entsprechendem Verdacht zum Ausschluss von ND-Seuchenvirus der ICPI bestimmt werden. Vereinfachtes Verfahren der Bestimmung der Absterbezeit von Hühnerembryonen zur Anwendung in regionalen Untersuchungsämtern Nach Bundesmaßnahmenkatalog Tierseuchen, Teil VI Newcastle Krankheit, kann bei vermehrten Seuchenfällen die Diagnose ND nach Zustimmung der Landesbehörden auch ohne Bestimmung des ICPI gestellt werden, wenn das Virusisolat im zuständigen Untersuchungsamt eindeutig als velogenes NDV erkannt wird. Dafür eignet sich folgendes vereinfachtes Verfahren der Bestimmung der Absterbezeit von Hühnerembryonen: 239

240 Ausgangsmaterial: Bakterienfreie PMV-1-haltige AF oder Zellkulturüberstand Verfahren: 10-2 verdünnt je 0,2 ml auf 6 vorbebrütete SPF-Eier verimpfen zweimal täglich durchleuchten, abgestorbene Eier kühlen AF ernten, auf HA und bakterielle Verunreinigung prüfen Bewertung: Sind alle Embryonen bis zum Ende des 2. Tages p.i. durch die APMV-1-Infektion abgestorben und eine bakterielle Kontamination ist ausgeschlossen, liegt der ICPI des geprüften Virus mit Sicherheit über 0.7. Achtung! Mit diesem Test werden nur velogene Virusisolate erkannt, nicht aber mesogene Virusstämme, deren ICPI jedoch auch über 0.7 liegt. Aus diesem Grunde ist immer nur eine positive Testaussage möglich. Bei negativem Ergebnis muss der ICPI bestimmt werden. Untersuchungsdauer Anzüchtung, Virusvermehrung und Identifizierung des APMV-1 dauert 3 bis 7 Tage, längere Zeitdauer möglich; APMV-1-Nachweis mittels real time RT-PCR 2 Tage, negative Ergebnisse sind durch Erregeranzucht abzuklären Schätzung der Pathogenität im regionalen Untersuchungsamt (führt nur zur Erkennung von velogenen Virusisolaten) 3 Tage Bestimmung des Pathotypen mittels Tierversuch und Typisierung im Nationalen Referenzlabor 3 bis 9 Tage bei velogenem Virus 3 bis 14 Tage bei mesogenem Virus 14 bis 16 Tage bei lentogenem Virus mit ICPI < 0.7 (Ausschluss von Seuchenvirus) Bestimmung des Pathotypen mittels Sequenzierung: 3 bis 10 Tage; differenziert nicht zwischen velogenen und mesogenen Isolaten Indirekter Erregernachweis Ist für die Seuchen-Diagnostik von untergeordneter Bedeutung, da gemäß Geflügelpest- Verordnung Impfpflicht für alle Hühner und Puten besteht und sich die Antikörper gegen Feld- und Impfvirus nicht unterscheiden lassen. Die Standardmethode für den Antikörpernachweis ist der Hämagglutinations-Hemmungstest (HAH) nach der oben beschriebenen Methode. Bei nicht immunisierten oder nicht infizierten Tieren können unspezifische HAH-Titer bis 1: 8 auftreten. Für den Antikörpernachweis als Impfkontrolle kann auch der ELISA genutzt werden. Kommerzielle Test-Kits mit amtlicher Zulassung sind erhältlich und werden nach den Empfehlungen des jeweiligen Herstellers angewendet. 240

241 Anlage Antibiotisches Medium für Kloakenabstriche oder Fäzes-Material: PBS mit Einheiten/ml Penizillin 10 mg/ml Streptomycin 0,25 mg/ml Gentamycin Einheiten/ml Mykostatin Für Gewebeproben und Trachealabstriche wird nur 1/5 der Antibiotikakonzentration benötigt. Anstelle von Penizillin, Streptomycin und Gentamycin können auch 0,5 bzw. 0,1 mg/ml Enrofloxacin (Baytril) zugesetzt werden. Achtung! Nach der Zugabe der Antibiotika muss der ph-wert des Mediums wieder auf 7.0 bis 7.4 eingestellt werden. NDV positives Kontrollserum für die Identifizierung von Virusisolaten mittels HAH Ist z. B. erhältlich bei C.C. pro GmbH, Moltkestr. 3, Neustadt/W. Tel.: Fax: Oder bei GD Gezondheidsdienst voor Dieren, Arnsbergstraat 7, 7419 EZ Deventer Niederlande Tel.: Fax: NDV Antigen für Hämagglutinationstest Anbieter wie bei ND-Serum FITC-markierte Antikörper gegen NDV Anbieter wie bei ND-Serum Die aufgeführten kommerziell erhältlichen Diagnostika sind nicht amtlich zugelassen. 241

242 29. Psittakose Charakterisierung der Infektion Erreger Der Erreger der Psittakose/Ornithose gehört zur Familie der Chlamydiaceae, zum Genus Chlamydophila und zur Spezies Chlamydophila (C.) psittaci. Bei den Aves wurden ursprünglich sechs verschiedene Serovare unterschieden (A und F = Psittaziden-Serovare I und II, B und E = Tauben-Serovare I und II, C = Enten- und D = Puten-Serovar; nach ANDERSEN, ). In einer Vergleichsstudie konnte gezeigt werden, dass den Serovaren äquivalente Genotypen zugeordnet werden können, die über die variablen Domänen II und IV des ompa- Gens definiert sind (VANROMPAY, ). Mittlerweile wurden noch ein weiterer aviärer Genotyp (EB; Geens, ) und zwei nicht-aviäre Genotypen eingeführt. Tabelle 1 fasst die gegenwärtig akzeptierten Typen zusammen, wobei anzumerken ist, dass die Wirtsspezifität nicht hoch ist und mit steigenden Untersuchungszahlen das Spektrum der genannten Wirtstierarten noch erweitert werden wird. Schon jetzt ist bekannt, dass aviäre Serovare/Genotypen auch bei anderen Tierarten wie z. B. Schwein, Rind und Schaf vorkommen. Prinzipiell sind alle aviären C.-psittaci-Serovare humanpathogen. Tabelle 1: Einteilung der Serovare bzw. Genotypen von Chlamydophila psittaci Serovar / Genotyp Vorkommen Humanpathogenität / Anmerkungen A Psittaciformes, Taube, Kanarienvogel, Pute hoch (insbesondere bei virulenten Stämmen) B Taube, Kanarienvogel, Küken, Fasan, Pute mittel C Ente, Schwan, Gans hoch (insbesondere in Farmen, Schlacht- und Federverarbeitungsbetrieben) D Pute hoch (insbesondere in Farmen, Schlacht- und Federverarbeitungsbetrieben) E Taube, Ente Pute, Strauß, Nandu hoch (identisch mit humanem Isolat von 1934; Tauben sind Reservoir; 20% der Taubenisolate gehören zum Serovar II; eng verwandt mit A und B) F Sittich (bisher ein Isolat) nicht bekannt (evtl. neuere Mutation; evtl. Vorkommen in noch wenig untersuchten Vogelpopulationen) EB Ente vorhanden (genaue Abschätzung noch nicht möglich) WC Rind nicht bekannt M 56 Nager (Bisamratte) nicht bekannt 242

243 Chlamydien gehören weltweit zu den am meisten verbreiteten pathogenen Mikroorganismen. Das Wirtsspektrum von C. psittaci umfasst Arthropoden, Mollusken, Vögel (bei ca. 140 Arten nachgewiesen), eine Vielzahl von Säugetieren und den Menschen. Psittakose wird als Infektionskrankheit bezeichnet, die bei Psittaciformes (Papageien und Sittichen) vorkommt. Sie ist anzeigepflichtig 4. Die Ornithose definiert der Gesetzgeber als eine Infektionskrankheit, die bei Nutzgeflügel sowie bei Wild- und Ziervögeln vorkommt. Sie ist meldepflichtig 5. Allerdings handelt es sich vom wissenschaftlichen Standpunkt bei den historisch entstandenen Begriffen Psittakose und Ornithose um ein und dieselbe Krankheit mit dem gleichen Erreger. Man verwendet daher in der neueren Fachliteratur den übergreifenden Terminus aviäre Chlamydiose. Morphologisch gesehen erscheinen Chlamydien als unbewegliche kokkoide Bakterien. Die Zellwand enthält nur Spuren von Muraminsäure und ähnelt der Zellwand gramnegativer Bakterien. Der zweiphasige Entwicklungszyklus kennzeichnet sie als obligat intrazelluläre Mikroorganismen. Man unterscheidet zwei unterschiedliche Chlamydienformen: die 0,2 bis 0,3 m großen infektiösen Elementarkörperchen (EK), die extrazellulär überleben können. Sie enthalten das Genom und die Ribosomen. Für das Eindringen in die Wirtszelle sind spezifische Wirtszell- und Erregerrezeptoren verantwortlich. Unterschiede in Größe und Struktur der antigenwirksamen EK-Oberflächenproteine (Major Outer Membrane Protein - MOMP) sind verantwortlich für Wirtsspezifität, Organotropismus und Virulenzverhalten. Nach Adsorption der EK an die Zellmembran der Wirtszelle gelangen diese durch Endozytose in die Zelle. die 0,8 bis 1,5 m großen Retikularkörperchen (RK) entstehen durch Reorganisation der EK und vermehren sich durch binäre Teilung in den endozytoplasmatischen Vakuolen (Einschlusskörperchen). Eine Interaktion mit extrazellulären Abwehrmechanismen ist dadurch erschwert. Die RK reifen über sog. "kondensierte Formen" zu den infektiösen EK. Diese können durch Lysis der Zelle (Krankheit) oder durch kontinuierliches Ausschleusen aus der Zelle (klinisch inapparente Form) freigesetzt bzw. in der Zelle zurückgehalten werden (latente Verlaufsform) Klinische Symptomatik Die Psittakose/Ornithose verläuft beim Vogel akut, subakut bis protrahiert oder chronisch in Abhängigkeit von Infektionsdosis, Virulenz der Chlamydienstämme, Empfänglichkeit und Immunstatus des Wirtes sowie von Umwelteinflüssen. Die häufigste Form ist die subklinischpersistierende Verlaufsform bei adulten Vögeln. Sie verläuft ohne klinische Symptome (siehe Tabelle 2). Nach einer Chlamydieninfektion kann zwischen perakutem Verlauf und völliger Unauffälligkeit klinisch gesunder Tiere eine breite Palette an mehr oder weniger unspezifischen Symptomen beobachtet werden. Das artspezifische Verhalten kann sich bei chlamydieninfizierten Vögeln verändern. Apathie, Schwäche, Schläfrigkeit, Hängenlassen der Flügel, Appetitlosigkeit, anfallartiges Zittern, tonisch-klonische Krämpfe und Lähmungserscheinungen können beobachtet werden. 243

244 Die ältere Bezeichnung "Pneumo-Enteritis" für Psittakose/Ornithose weist darauf hin, dass Respirations- und Verdauungstrakt gleichzeitig betroffen sind. Es wird hellgrün- oder grauwässriger Kot abgesetzt. In Verbindung mit Nasenausfluss wird angestrengte Atmung beobachtet. Konjunktivitis und Keratokonjunktivitis treten bei manchen Vogelarten nicht auf, bei anderen (Tauben, Neophemaarten, Enten) sind es oft die einzigen auf Psittakose deutenden Befunde. Das unspezifische klinische Bild wird häufig durch die Symptome struppiges Gefieder und Abmagerung ergänzt. Tabelle 2: Verlaufsformen der aviären Chlamydiosen (zit. nach KALETA, ) Verlaufsform Inkubations- Krankheits- Symptome, Bemerkungen zeit in Tagen dauer Akute, letale systemische Form Tage Anorexie, Apathie, Diarrhoe; junge Vögel Subakute bis protrahierte Form 7-14 > 3 Wochen Anorexie, Apathie, Diarrhoe; adulte Vögel Chronische Form > 2 Monate Apathie, Kachexie, Diarrhoe, Atemnot; adulte Vögel Subklinische persistierende Form keine ohne Häufigste Form, ohne Symptome; adulte Vögel Aktivierte persistierende Form > 3 Monate bis Jahre > 2 Monate Aktivierung durch endogene u. exogene Faktoren, dann Apathie, Anorexie, Diarrhoe, Kachexie, respiratorische Symptome Vögel mit chronischer Psittakose sind meistens anämisch. Das Serum-Gesamtprotein bewegt sich, bedingt durch Dehydration und Anstieg von - und -Globulinen, an der Obergrenze der Norm oder ist leicht erhöht. Bei infizierten Vögeln können Leukozytenzahlen von über /mm 3 festgestellt werden. Erhöhte Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Aspartat- Aminotransferase (AST) Serumwerte weisen auf eine Schädigung der Leber hin, erhöhte Harnsäure- und Kreatininwerte auf eine renale Dysfunktion (zit. nach JANECZEK, ) Differentialdiagnose Differentialdiagnostisch ist bei Durchfall an Salmonellose, bei Schnupfen an Mykoplasmeninfektionen zu denken Diagnostische Indikation Klinischer oder epidemiologisch begründeter Verdacht Einfuhruntersuchungen siehe auch Zuständige Untersuchungseinrichtungen Staatliche Veterinäruntersuchungsämter Friedrich-Loeffler-Institut (Nationales Referenzlabor für Psittakose) 244

245 Rechtsgrundlagen (siehe auch NÜCHTER et al ) Tierseuchengesetz in der Fassung der Bekanntmachung vom 22. Juni 2004 (BGBl. I S. 1260; 3588), zuletzt geändert durch Artikel 3 des Gesetzes vom 21. Dezember 2006 (BGBl. I S. 3294) Stand: Neu gefasst durch Bek. v I 1260; 3588; zuletzt geändert durch Art. 3 G v I 3294 Verordnung über das innergemeinschaftliche Verbringen sowie die Einfuhr und Durchfuhr von Tieren und Waren (Binnenmarkt-Tierseuchenschutzverordnung - BmTierSSchV). In der Fassung der Bekanntmachung vom 6. April 2005 (BGBl. I S. 997) zuletzt geändert durch: Artikel 1 der Verordnung vom 11. Dezember 2006 (BGBl. I S. 2921) Verordnung zum Schutz gegen die Psittakose und Ornithose-Psittakose vom 20. Dezember 2005 (BGBl. I Nr. 74 vom S. 3532) Gl.-Nr.: Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten vom 20. Dezember 2005 (BGBl. I Nr. 74 vom , S ) Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten vom 11. April 2001, Bundesgesetzblatt 2001 Teil I Nr. 16 S. 540, vom 20. April 2001, geändert durch Bundesgesetzblatt 2001 Teil I Nr. 55 S vom 06. November 2001, durch Bundesgesetzblatt 2004 Teil I Nr. 58 S. 2791, vom 12. November 2004, zuletzt geändert am durch Bundesgesetzblatt 2005 Teil I Nr. 74, S. 3499, Art. 3 vom 23. Dezember Bekanntmachung der Neufassung: Bundesgesetzblatt 2005 Teil I Nr. 74, S vom 23. Dezember Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial für direkten Antigennachweis und Chlamydienanzüchtung Verendete Vögel bzw. deren Organe (Milz, Lunge, Leber, Niere, Luftsäcke, Herzbeutel) Möglichst zellreiche Tupferproben 9 (okulo-nasale, tracheale Tupfer oder Kloakentupfer), Kotproben (ca. 2 bis 5 g/vogel), Sammelkotproben von bis zu 20 Vögeln Tupferproben sollten für den Nachweis von C. psittaci mittels Zellkulturmethode möglichst frisch entnommen werden. Probenmaterial jeder Art sollte gekühlt und auf dem schnellsten Weg zum Untersuchungsort transportiert werden. Zusätzlich können kommerziell verfügbare Transportmedien 10 bzw. das in der Anlage 1 angegebene Medium verwendet werden. Können die Proben nicht innerhalb von 24 h aufgearbeitet werden, müssen sie bei < -76 C eingefroren werden (ohne Transportmedium!) Untersuchungsmaterial für den Antikörpernachweis Nativblutproben 11 (Blut ohne Stabilisator), Serum 245

246 29.3. Untersuchung Beachte: Alle Laborarbeiten zum Erregernachweis sind mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen (Biohazard-Werkbänke bzw. L3-Laboratorien) vorzunehmen. Aufgrund der aerogenen Übertragbarkeit der Erreger haben Ultraschallarbeiten, Zentrifugationsschritte u.a. grundsätzlich im geschlossenen System zu erfolgen Antigennachweismethoden Für den Nachweis von Chlamydophila psittaci-antigen werden folgende drei Labormethoden beschrieben: Direktnachweis 12 von C.-psittaci-Einschlusskörperchen durch histologische Färbemethoden bzw. von C.-psittaci-Antigen mittels Immunfluoreszenz Herstellung der Abklatsch bzw. Tupferpräparate Bewährt hat sich folgendes Verfahren: Herstellung von Abklatschpräparaten auf fettfreien Objektträgern (Organe, Tupfer). Bei Einsendung von Tupfern ohne Transportmedium sind die Tupfer direkt auf die Objektträger auszustreichen. Werden diese mit Transportmedium eingesandt, so sind sie 15 s auf einem Vortex-Schüttler zu mischen, die Suspension ist nach Entfernen des Tupfers für 5 bis 10 min bei 800 x g zu zentrifugieren und nach vorsichtigem Abhebern des Mediums das Sediment z.b. mit einer Platinöse auf Objektträger auszustreichen. Präparate lufttrocknen Präparate fixieren: Fixierung für Giménez-Färbung: 30 min in 96%igem Ethanol p.a., lufttrocknen; Fixierung für Immunfluoreszenz: 10 min Aceton p.a., lufttrocknen bzw. nach Anweisung des Konjugatherstellers verfahren Färbung nach Giménez Fixierte Präparate gründlich mit A. dest spülen und 6 min mit Karbolfuchsin- Gebrauchslösung färben Farblösung abgießen und 2mal in A. dest. spülen mit 0,8%iger Malachitgrün-Lösung 30 bis 60 s gegenfärben Malachitgrünlösung abgießen 2mal in A. dest. spülen Färbung mit Malachitgrün-Lösung wiederholen Malachitgrünlösung abgießen mit A. dest. spülen zwischen Fließpapier unter mäßigem Druck trocknen lichtmikroskopische Beurteilung bei 400- bis 1000-facher Vergrößerung Beurteilung: Als positiv werden eindeutig im Zellplasma liegende Einschlusskörperchen gewertet. Die unterschiedlich großen Einschlusskörperchen (Elementarkörperchen: 0,2 bis 0,3 m; Retikularkörperchen: 0,8 bis 1,5 m) färben sich intensiv rot an. Der Hintergrund zeigt eine grünliche Färbung. Die Einschlusskörperchen sind von Artefakten einmal durch 246

247 ihre Lage in der Zelle und zum anderen durch ihre Form und Anordnung zu unterscheiden. Eine negative Färbung schließt nicht aus, dass eine Chlamydieninfektion vorliegt, da die Erregermenge zu gering sein kann bzw. die Erreger in anderen Organen lokalisiert sein können. Bei negativen Ergebnissen ist zum sicheren Ausschluss einer Chlamydien- Infektion ein Zellkulturverfahren durchzuführen Antigennachweis mittels direkter Immunfluoreszenz (DIF) Für den Nachweis von Chlamydienantigen mittels Immunfluoreszenz stehen verschiedene kommerzielle Konjugate zur Verfügung. Die Durchführung ist nach der entsprechenden Produktinformation durchzuführen. Der Test ist valide, wenn chlamydienhaltige Kontrollpräparate spezifische Fluoreszenz und negative Kontrollpräparate keine Fluoreszenz aufweisen. Beurteilung: Die Auswertung erfolgt unter einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop bei 400- bis 1000-facher Vergrößerung. In positiven Präparaten sind vorwiegend apfelgrüne, extrazellulär liegende Elementarkörperchen mit einem Durchmesser von ca. 300 nm. Nicht infizierte Zellen und Zelltrümmer zeigen eine leicht rötliche Anfärbung, falls die Konjugate Evans Blue zur Gegenfärbung enthalten. Gelegentlich können auch die 2- bis 3-mal größeren intrazellular liegenden Retikularkörper oder die um ein Vielfaches größeren Einschlusskörper zu sehen sein. Die Intensität ist bei allen Erscheinungsformen gleichermaßen intensiv. Ein negatives Immunfluoreszenz-Ergebnis schließt eine Chlamydieninfektion nicht mit Sicherheit aus. Bei negativen fluoreszenzserologischen Ergebnissen ist zum sicheren Ausschluss einer Chlamydien-Infektion ein Zellkulturverfahren durchzuführen Anzüchtung und Vermehrung von C. psittaci mittels Zellkulturmethode und Nachweis mittels histologischer Färbung bzw. Immunfluoreszenz Beachte: Alle Laborarbeiten zum Erregernachweis sind mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen (Biohazard-Werkbänke bzw. L3-Laboratorien) vorzunehmen. Bei Ultraschallarbeiten sind zusätzlich Atemschutzmasken zu tragen Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Tupferproben Tupfer mit Transportmedium 10 für 15 s auf einem Vortex-Schüttler homogenisieren Suspension zur sicheren Freisetzung der Chlamydien aus den Zellen mit Ultraschall (Becherresonator z.b. Fa. Branson, Amplitude 80 %, 8 s mit 10 Schlägen und 0,2 s Pause) behandeln. Tupfer ausdrücken und entsorgen 247

248 Tupfer ohne Transportmedium Röhrchen mit 2 ml Transportmedium auffüllen, 10 min bei Zimmertemperatur stehen lassen und anschließend wie die mit Transportmedium versandten Tupfer behandeln Organmaterialien Ca. 1 g Organmaterial im Mörser unter Zusatz von sterilem Seesand oder mit einem Ultraturrax homogenisieren, in 10 ml Transportmedium aufnehmen und in 15-ml- Zentrifugenröhrchen überführen. Zur sicheren Freisetzung der Chlamydien aus den Zellen die Proben 3-mal mit Ultraschall behandeln. ca. 10 min stehen lassen (Sedimentation der "groben" Bestandteile) und Überstand in ein Zentrifugenröhrchen (mit Schraubverschluss) überführen Zentrifugation der Organanreibung bei 500 x g für 15 min bei 18 C Überstand zum Beimpfen der vorbereiteten Zellkulturen verwenden Hinweis: Zellkultur möglichst gleich beimpfen; bei Leberanreibungen Vorverdünnung von 1:10 vornehmen (Material sehr aggressiv für Zellen) Einzel- und Sammelkotproben 1 g Kot im Mörser unter Zusatz von sterilem Seesand oder mit einem Ultraturrax homogenisieren; Herstellung einer 10%igen Suspension mit Transportmedium Homogenisate ca. 10 min stehen lassen (Sedimentation der "groben" Bestandteile) und Überstand in ein Zentrifugenröhrchen (möglichst mit Schraubverschluss) überführen Zentrifugation bei 500 x g für 15 min bei 18 C Probe möglichst gleich auf die Zellkultur bringen Kotproben sind oftmals so stark kontaminiert, dass auch die obligat zugesetzten Antibiotika eine Verunreinigung der Zellkultur nicht verhindern können. Eine vorherige Filtration durch einen Spritzenfilter der Porengröße 0,45 µm ist deshalb zu empfehlen Einzel- und Sammelkotproben in Transportmedium Homogenisierung der im Transportmedium eingesandten Kotmaterialien mit einem Vortexschüttler Herstellung einer 10%igen Lösung mit Transportmedium Homogenisate ca. 10 min stehen lassen (Sedimentation der "groben" Bestandteile) Überstand in ein Zentrifugenröhrchen (mit Schraubverschluss) überführen weiteres Vorgehen wie oben beschrieben 248

249 Beimpfung der Zellkulturen Vorbereitung der Zellkultur Verwendet wird die permanente Buffalo-Green-Monkey (BGM)-Zelllinie (siehe Anhang 2). Die Zellen werden bei 37 C bebrütet und ein- bis zweimal wöchentlich im Verhältnis 1:3 bis 1:10 gesplittet. Es empfiehlt sich, die Zellen einmal pro Monat auf Mykoplasmen zu untersuchen. Für die Isolierung der Chlamydien in Zellkulturen können verschiedene Kultursysteme verwendet werden (z.b. sterile Flachbodenröhrchen mit Deckgläschen oder 24-Loch- Gewebekulturplatten, in die sterile Deckgläschen mit entsprechendem Durchmesser gegeben werden). Die Zelldichte wird auf die gewünschte Zellzahl (z.b. 1x10 5 Zellen/ml) eingestellt. Nach Aussaat werden die Kulturen bis zur Beimpfung mindestens 24 Stunden bei 37 C im CO 2 -Brutschrank bebrütet. Der Zellrasen wird mikroskopisch auf Konfluenz geprüft (evtl. erst nach 2 Tagen konfluenter Zellrasen erreicht) Beimpfung der Zellkulturen im ersten Ansatz je Probe mindestens vier Röhrchen der vorbereiteten BGM- Zellkulturen (Deckglasröhrchen mit jeweils 1 ml Zellsuspension von 1x10 5 ml) entsprechend folgendem Schema beimpfen: 1 Rö: 30 µl Überstand 2 Rö: 100 µl Überstand 1 Rö: 300 µl Überstand Aufzentrifugation des Überstandes auf die Zellen zur Unterstützung der Anheftung von Chlamydien an die Zellen bei 3,400 x g für 1 h bei 37 C im geschlossenem System, dafür z.b. Zentrifuge Rotanta 96 RS mit ausschwingbarem Rotor verwenden Inkubation für zwei Stunden bei 37 C und 5 % CO 2 (Deckel für Gasaustausch etwas aufschrauben) Mediumwechsel: Überstand absaugen, je nach Bedarf mit PBS (mit Ca und Mg-Ionen) waschen, je Röhrchen 2 ml Medium einfüllen, Zusätze zur Unterdrückung der Begleitflora (siehe Anhang 1) Inkubation der beimpften Zellkulturen bei 37 C und 5 % CO 2 Nächster Mediumwechsel nach 18 h Nach weiteren 48 h Zellrasen mikroskopisch beurteilen: wenn Zellrasen bei allen drei Beimpfungsmengen noch fest ist, Deckgläschen von Röhrchen mit 100 µl Überstand anfärben Bei positivem Nachweis: Anreicherung der Chlamydien durch Anlegen einer Passage ausgehend vom Röhrchen mit der größten Beimpfungsmenge bei intaktem Zellrasen; dafür Zellen durch Ultraschallbehandlung im Becherresonator (Fa. Branson) ablösen bei einer Amplitude von 80 %, 8 s mit 10 Schlägen und 0,2 s Pause, Ultraschallbehandlung wiederholen bis Zellrasen abgelöst ist, mit je 200 µl Zellsuspension die gewünschte Anzahl Röhrchen beimpfen, Inkubation und Nachweis wie beschrieben (außer Mediumwechsel nach 18 h), Chlamydiensuspension zum Typisieren geben, chlamydieninfizierte Zellkulturröhrchen bei -76 C lagern und gegebenenfalls als Vorkultur für eine Stammkonservierung einsetzen 249

250 Bei negativem Nachweis: Anlegen einer Passage ausgehend vom Röhrchen mit der größten Beimpfungsmenge bei intaktem Zellrasen, dafür Zellen im Becherresonator (Fa. Branson) ablösen bei einer Amplitude von 80 %, 8 s mit 10 Schlägen und 0,2 s Pause, Ultraschallbehandlung wiederholen bis Zellrasen abgelöst ist, mit 200 µl Zellsuspension je drei Röhrchen beimpfen, alle Passageröhrchen nach der Beimpfung weiterbearbeiten wie beim ersten Ansatz beschrieben (außer Medienwechsel nach 18 h), nach zwei erfolglosen Passagen Isolierungsversuch beenden Kontrollen Bei allen Anzuchtversuchen wird als Positivkontrolle ein Zellkulturröhrchen mit einem Chlamydienstamm infiziert (definierte Infektionsdosis) und als Negativkontrolle ein unbeimpftes Zellkulturröhrchen mitgeführt Nachweis der Chlamydien in Zellkulturen Infizierten Überstand aus den Röhrchen pipettieren und für Passagierung in sterile Röhrchen überführen bzw. direkt auf vorbereitete BGM-Zellen geben einmal kurz mit Methanol spülen und anschließend 10 min mit Methanol fixieren Zellen vor dem Fixieren nicht trocken werden lassen, da sonst Ruptur der Einschlüsse möglich Deckglaskulturen im Röhrchen fixieren Färbung nach Giménez - siehe auch Der Test ist valide, wenn Negativ- und Positiv-Kontrollen entsprechend ausgewertet werden können Nachweis mittels Immunfluoreszenz Für den Immunfluoreszenz-Nachweis von Chlamydienantigen stehen verschiedene kommerzielle Konjugate zur Verfügung. Die Durchführung ist nach der entsprechenden Produktinformation durchzuführen 13. Test der Firma Dako: Der Fluoresceinisothiocyanat (FITC) - konjugierte, gattungsspezifische monoklonale Antikörper richtet sich gegen das auf der Oberfläche aller bekannten Chlamydienstämme vorkommende Lipopolysaccharid (LPS). Deckgläser mit Pinzette dem Röhrchen entnehmen, mit Mikroskopierkleber (Entellan) auf dem Objektträger befestigen (Zellschicht nach oben) und trocknen lassen. Probe mit 25 µl Testreagenz überschichten - in feuchter Kammer 15 min bei 37 o C inkubieren - Objektträger mit PBS abspülen und anschließend 5 min im PBS- Schüttelbad waschen - Flüssigkeit auf Fließpapier etwas ablaufen lassen - einen Tropfen IMAGEN TM - Eindeckmedium auf Probe geben - mit Deckglas eindecken - Auswertung unter einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop bei 400- bis 1000-facher Vergrößerung Der Test ist valide, wenn Negativ- und Positiv-Kontrollen entsprechend ausgewertet werden können. 250

251 Nachweis Chlamydophila-psittaci-spezifischer DNA mittels Real-Time-PCR Grundlagen Das nachstehende Verfahren wurde am CVLUA Stuttgart in Zusammenarbeit mit dem nationalen Referenzlabor für Psittakose (NRL) entwickelt und beruht auf der Amplifikation eines spezifischen Fragments aus dem ompa-gen von C. psittaci. Es stellt eine Duplex-PCR mit interner Amplifikationskontrolle (IC2) dar und wurde im NRL bei einer Vielzahl von Untersuchungen eingesetzt. Die bei der internen Validierung erzielten Ergebnisse weisen es als spezifische, sensitive und reproduzierbare Methode aus. Darüber hinaus hat sich diese Methode in einem bundesweiten Ringversuch des NRL Psittakose im Jahre 2006 als sehr zuverlässig erwiesen. Benötigte Reagenzien und Geräte sind dem Anhang 3 zu entnehmen Probenaufarbeitung (DNA-Extraktion) a) INFIZIERTE ZELLKULTUREN: 1ml Kultur werden in einem Eppendorf-Tube 10 min bei 14,000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 200 µl PBS-Puffer (10 mm Na 2 HPO 4, 10 mm NaH 2 PO 4, 0,145 M NaCl, ph 7,0) resuspendiert. Zur DNA-Extraktion verwendet man das High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche), bei welchem die DNA nach der Zelllyse über eine Minisäule gereinigt wird, oder vergleichbare Erzeugnisse anderer Hersteller, wie das QIAamp DNA Mini Kit. Nach Abarbeitung des mitgelieferten Protokolls erhält man ein Eluat von 200 µl, welches zur Aufkonzentrierung der DNA mit 0,6 VT Isopropanol (30 min, RT) gefällt werden kann. Das durch Zentrifugation (mind. 12,000 g, 10 min) gesammelte Präzipitat löst man dann in 20 µl Tris-Puffer (10 mm) und setzt davon 1 µl direkt in der PCR ein. b) KLINISCHES MATERIAL: Ein Gewebestück von ca. 25 mg wird in 200 µl Lysepuffer des High Pure PCR Template Preparation Kit suspendiert und nach dem Protokoll des Herstellers verarbeitet. Nach Abarbeitung dieses Protokolls erhält man ein Eluat von 200µl, welches zwecks Aufkonzentrierung der DNA mit 0,6 VT Isopropanol (30 min, RT) gefällt werden kann. Das durch Zentrifugation (mind. 12,000 g, 10 min) gesammelte Präzipitat löst man dann in 20 µl Tris-Puffer (10 mm) und setzt davon 1 µl direkt in der PCR ein. Tupferproben können nach einem alternativen Verfahren aufgearbeitet werden. Dazu vermischt man die Tupfer mittels Vortex-Schüttler in einem 2ml-Eppendorf-Reagenzröhrchen mit 500 µl Lysepuffer (100 mm Tris, ph 8.5, 0.05 % Tween 20) und zentrifugiert 30 s bei 12,000 rpm. Um sämtliche Flüssigkeit aus dem Tupfer zu gewinnen, wird dieser in einer halb abgeschnittenen 1-ml-Pipettenspitze in einem zweiten Röhrchen nochmals 2 min zentrifugiert. Die Probenflüssigkeit wird vereinigt und 15 min bei 14,000 rpm zentrifugiert. Das Pellet ist in 50 µl Lysepuffer aufzunehmen und mit 20 µl 1%iger Proteinase K zu verdauen (2h bei 60 C, dann Inaktivierung 15 min bei 97 C). Nach 5-minütiger Zentrifugation wird 1 µl des Überstandes als Template eingesetzt. Eine Aufarbeitung des Pellets mit einem kommerziellen DNA-Präparationskit ist ebenfalls möglich. 251

252 Amplifikation Folgende Primer und Sonden kommen zum Einsatz: Tabelle 3: Chlamydophila-psittaci-spezifische Primer und Sonde Primer Sonde Nukleotidsequenz (5'-3') Cpps-F Cpps-R Cpps-S Amplikonlänge: 76 bp CAC TAT GTG GGA AGG TGC TTC A CTG CGC GGA TGC TAA TGG FAM-CGC TAC TTG GTG TGA C-BHQ1 (MGB-Sonde) Tabelle 4: Primer und Sonde für die interne Amplifikationskontrolle Template-DNA* IC2 Dosierung 0,25 µl je Reaktion (2500 Kopien) Primer 1 EGFP-1-F GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC Primer 2 EGFP-10-R CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC Sonde EGFP-HEX HEX-AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A-BHQ1 Amplikonlänge: 177 bp * Kloniert und präpariert von Dr. Bernd Hoffmann, FLI Insel Riems Die Amplifikation wird in für Real-Time-PCR geeigneten 96-Well-Platten in 25µl-Ansätzen durchgeführt. Ein Reaktionsansatz enthält: 12,5 µl rtpcr Mastermix 2X (enthält Taq DNA-Polymerase, dntps, MgCl 2, Enhancer u.a.) je 2,0 µl Primerlösung Cpps-F/R (Endkonzentration 800 nm) 1,0 µl Sonde Cpps-S (Endkonzentration 200 nm) 2 µl IC2-Primer-Sonden-Mix (F:R:S=1:1:2; Endkonz. 400 nm:400 nm:200 nm) 0.25 µl IC2 DNA-Template (enthält 250 Kopien) 2,0 µl Proben-DNA 3,25 µl H 2 O entionisiert Für jede Probe sind mindestens zwei Wells vorzusehen (Doppelbestimmung). Nach erfolgter Pipettierung werden die Platten an der Oberseite mit Plastikfolie versiegelt und 30 s bei 1000 rpm zentrifugiert. Als Kopienstandards benutzt man die Verdünnungsreihe eines DNA-Extraktes aus der Zellkultur eines bekannten Chlamydienstammes mit definiertem Gehalt an Einschluss-bildenden Einheiten (EBE). Wenn eine quantitative Auswertung beabsichtigt ist, werden Konzentrationen von 10 4 bis 10-1 Kopien pro µl jeweils doppelt aufgetragen. Die Reagenzienkontrollen (NTC, non-template controls) enthalten die gleichen Volumina an universellem Master Mix, Primern und Sonde, aber 1 µl Wasser anstelle des DNA-Templates. 252

253 Folgendes Temperatur-Zeit-Profil wird gefahren (Standardprogramm des Cyclers): 2 min 50 C 10 min 95 C 45 Zyklen: 15 s 95 C 60 s 60 C Auswertung Als positives Ergebnis gilt, wenn eine Probe in beiden Ansätzen einen Ct-Wert (Schnittpunkt der Amplifikationskurve mit dem Schwellenwert) von unter 36 erreicht. Werden höhere Ct- Werte erreicht (36,0 bis 40,0), gilt das Ergebnis als fraglich und die jeweilige Probe muss nochmals gefahren werden. Falls die NTC-Kontrollen in mindestens einem Falle einen Ct-Wert unter 40 zeigen, ist die betreffende Probenserie zu wiederholen. Die Ct-Werte der internen Amplifikationskontrolle (IC, Signal HEX) sollen sich in einem Bereich von 26,0 bis 32,0 bewegen und untereinander relativ einheitlich sein (Variationsbreite unter den Proben eines Laufes max. 2 Ct-Einheiten). Sobald eine als Chlamydien-negativ beurteilte Probe einen stark abweichenden Ct-Wert der IC zeigt, ist diese zu wiederholen. Tabelle 5: Richtlinie für die Bewertung Ct-Wert des spezifischen Signals (hier: Bewertung FAM) 2x <36 2x >36 1x <36, 1x kein Ct 1x 36-40, 1x kein Ct 2x kein Ct positiv fraglich positiv (Wiederholung) fraglich positiv (Wiederholung) fraglich negativ (Wiederholung) negativ Chlamydophila psittaci-antigennachweis mittels Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) Weiterhin ist der Nachweis von C.-psittaci-Antigen mittels Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) möglich. Hier müssen bei der Durchführung die Vorgaben der jeweiligen Anbieter beachtet werden (Antigen-ELISAs 14 ). Der Einsatz dieser Testsysteme, insbesondere zur Diagnose der anzeigepflichtigen Psittakose, kann nur unter Vorbehalt empfohlen werden, da infolge der gegenüber anderen Methoden eingeschränkten Spezifität falsch-positive Reaktionen auftreten können 15, Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Die Vorbereitung von Tupferproben ohne Transportmedium, Organmaterialien und Kotproben entspricht den unter beschriebenen Arbeitsschritten (dem Transportmedium wird 0,1 % Tween 20 zugefügt, es enthält keine Antibiotika und Antimykotica). Proben sind in hitzebeständige Röhrchen zu überführen. 253

254 Bei Tupferproben mit Transportmedium erfolgt keine weitere Aufarbeitung. Die Proben können bis zu 7 Tage bei 2 bis 8 C aufbewahrt werden. Bei längeren Aufbewahrungszeiten empfiehlt es sich, die Proben bei -20 C einzufrieren Antigen-ELISA-Testdurchführung Die Testdurchführung ist nach der Gebrauchsinformation des Herstellers durchzuführen. Einige wichtige Punkte bei der Durchführung des IDEIA Chlamydia Tests 14 : tiefgefrorene Proben auftauen Proben 15 Min bei 100 C in Wasserbad erhitzen (dabei ist sicherzustellen, dass kein Wasser in die Probenröhrchen gelangen kann) Proben auf Zimmertemperatur abkühlen vor Einfüllen in die ELISA-Platten die vorbereiteten Proben für 15 s, die Positiv- Kontrolle für 1 min auf einem Vortexschüttler gut mischen (gleichmäßige Verteilung von Antigenkonglomeraten) beim Waschen der ELISA-Platten nach der 2. Inkubation bei jedem der 4 Waschschritte eine Standzeit von jeweils 2 min einhalten in Abweichung zur Gebrauchsinformation errechnet sich der Grenzwert aus dem Extinktionsmittelwert der Negativ-Kontrollen zuzüglich des Wertes von JANECZEK 7 (1998) konnte aufgrund epidemiologischer Untersuchungen, in denen Antikörperstatus und Antigenausscheidung von Psittaciformes analysiert wurden, zeigen, dass die Grenzwertberechnung, wie sie laut Produktinformation zur Ermittlung von Chlamydia trachomatis-infektionen herangezogen wird, für die Diagnose von Chlamydophila psittaci- Infektionen nicht geeignet ist. Aufgrund dieser Grenzwert-Erhöhung konnte die Anzahl falsch positiv befundeter Chlamydien-Aussscheider von 6,4 % auf 1,6 % reduziert werden. Insbesondere bei Kotmaterialien sind aufgrund evtl. Kreuzreaktionen mit Bakterien- LPS Probenextinktionen bis OD über dem Grenzwert vorsichtig zu interpretieren. Dagegen können Probenextinktionen von OD über dem Grenzwert als sicher positive Chlamydienbefunde gewertet werden (siehe AVID-Mitteilung II/1997, Anlage 8) Chlamydophila psittaci-antikörpernachweise Serologische Untersuchungen dienen vor allem zur Diagnose von subklinischen persistierenden Chlamydieninfektionen, da bei dieser Verlaufsform i.d.r. keine Erreger ausgeschieden werden. Sie ist die häufigste Form bei adulten Vögeln. Zum Nachweis von Antikörpern gegen C. psittaci dienen die Komplementbindungsreaktion (KBR) oder ELISA-Verfahren. Lange Zeit stellte die KBR den einzigen Test zum Nachweis von Antikörpern dar. Da bei Vögeln nach einer Chlamydieninfektion nur geringe Mengen an komplementbindenden Antikörpern gebildet werden, ist die Methode allerdings wenig sensitiv. Sie erlaubt weder eine Speziesunterscheidung noch eine Differenzierung zwischen den Antikörperklassen. Positive serologische Befunde besitzen keine seuchenrechtliche Relevanz und dienen nicht zur Seuchenfeststellung. 254

255 Anhang 1 1 Medien, Puffer, Chemikalien 1.1 Transportmedien (SPGA-Stabilisator) Bovarnick, M.R.; Miller, J.C., and Snyder, J.C. (1950) Journal of Bacteriology, 59, Medium zum Transport von Tupfern, Herstellen von Organanreibungen und Kryokonservieren von Chlamydienstämmen Saccharose KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 L-Glutaminsäure (Na-Salz) bovines Albumin, Fraktion V Aqua bidest 74,60 g 0,52 g 1,25 g 0,92 g 1,00 g ad 1000 ml Substanzen in angegebener Reihenfolge in A.bidest. lösen (außer bovines Albumin) bis zum Eichstrich auffüllen, danach bovines Albumin zugeben und lösen sterilfiltrieren, portionieren und bei -20 C lagern - Bevorratung ohne antibiotische und antimykotische Zusätze - Zusätze frisch zugeben und Medium innerhalb von 24 h verbrauchen Nystatin-Stammlösung: 45 mg in 5 ml A. dest. lösen Endkonzentration im Medium 25 E/ml Gentamicin-Stammlösung: 400 mg in 10 ml A. dest. lösen Endkonzentration im Medium 40 µg/ml Vancomycin-HCL-Stammlösung: 250 mg in 10 ml PBS lösen Endkonzentration im Medium 25 µg/ml - Stammlösungen mischen und in Portionen zu je 250 µl abfüllen - Zugabe von 250 µl zu 100 ml Medium ergibt die gewünschte Endkonzentration 1.2 Karbolfuchsinlösung für Färbung nach Giménez Karbolfuchsin: Stammlösung 100 ml 10%ige Fuchsinlösung (10 g Fuchsin gelöst in 100 ml 95%igem Ethanol) ml A. dest ml 4%iges wässriges Phenol - vor Gebrauch 48 h bei 37 o C stehen lassen - Stammlösung 10 Monate haltbar 255

256 Gebrauchslösung 40 ml Stammlösung ml PBS ph-wert 7,2 - Haltbarkeit 40 h - direkt vor Gebrauch filtrieren 1.3 Malachitgrünlösung für Färbung nach Giménez Malachitgrünlösung (0,8%ig): 8 g Malachitgrünoxalat in 1000 ml A. dest. lösen - vor Gebrauch filtrieren 1.4 Medien für Zellkulturen, Suspensionsmedien und Puffer Zellkulturmedium EMEM 500 ml Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) mit Earle s Salzen und NaHCO 3 ohne L-Glutamin + 5 ml einer 200 mmol Glutaminstammlösung (siehe 1.4.2) Endkonz. 2 mmol/ml + 5 % fetales Kälberserum (FKS) (derzeit Fa. PAA) fest verschlossen im Kühlschrank bei 4 C 2 C lagern, nicht unnötig erwärmen und innerhalb von 4 Wochen nach Zugabe der Zusätze verbrauchen Glutaminstammlösung 2,922 g L-Glutamin (zellkulturgetestet) in 100 ml A.bidest. lösen, sterilfiltrieren, portionieren und bei -18 C einfrieren EMEM mit Zusätzen für Chlamydienanzüchtung - EMEM-Herstellung s. unter Zusätze frisch zugeben und Medium am Tag der Zugabe verbrauchen Amphotericin B-Stammlösung: 25 mg in 10 ml A.dest. lösen Endkonzentration im Medium 2,5 µg/ml Gentamicin-Stammlösung: 100 mg in 10 ml A.dest. lösen Endkonzentration im Medium 10 µg/ml Vancomycin-HCL-Stammlösung: 250 mg in 10 ml A.dest. lösen Endkonzentration im Medium 25 µg/ml - Stammlösungen mischen und in Portionen zu je 300 µl abfüllen und bei -18 C einfrieren - Zugabe von 300 µl zu 100 ml Medium ergibt die gewünschte Endkonzentration 256

257 1.4.4 Trypsin-EDTA-Lösung (ph-wert 7,2-7,3) NaCL KCL Glucose NaHCO 3 Trypsin EDTA Aqua bidest. 8,0 g 0,8 g 1,0 g 0,58 g 0,5 g 0,2 g ad 1000 ml Substanzen in angegebener Reihenfolge in A.bidest. lösen, dann ph-wert einstellen bis zum Eichstrich auffüllen, sterilfiltrieren, portionieren und bei -18 C einfrieren PBS (ph-wert 7,2-7,4) ohne Ca- und Mg-Ionen Puffer zum Waschen der Zellen vor dem Umsatz NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 2,31g KH 2 PO 4 0,2 g Aqua bidest. ad 1000 ml Substanzen in angegebener Reihenfolge in A.bidest. lösen, dann ph-wert einstellen bis zum Eichstrich auffüllen, sterilfiltrieren, portionieren und im Kühlschrank lagern PBS (ph-wert 7,2-7,4) mit Ca- und Mg-Ionen Puffer zum Waschen der Zellen ohne Umsatz NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 2,31 g KH 2 PO 4 0,2 g MgCl 2 0,0468 g CaCl 2 x 2 H 2 O 0,132 g Aqua bidest. ad 1000 ml Substanzen in angegebener Reihenfolge in A.bidest. lösen, dann ph-wert einstellen bis zum Eichstrich auffüllen, sterilfiltrieren, portionieren und im Kühlschrank lagern 1.5 Suspensionsmedium für Verreibungen (Antigen-ELISA) Basismedium mit 0.1 % Tween 20, jedoch ohne Zusatz von NEAA, Antibiotika und Antimycotika 257

258 Anhang 2 Zellkultur Verwendet wird die permanente Buffalo Green Monkey (BGM)-Zelllinie (ATCC CCL 26, BS-C-1 [Kidney, African Green Monkey, ceropithecus aethiops]) (Angaben in Klammern für Zellkulturflaschen T75) bewachsene Zellkulturflasche leicht schwenken, umdrehen und Medium absaugen 1x mit 5 ml (10 ml) PBS - Puffer waschen, um abgestorbene Zellen, Medienbestandteile und Stoffwechselprodukte zu entfernen absaugen 2 ml (5 ml) Trypsin-EDTA-Lösung auf Zellrasen geben und 5 bis 10 min bei 37 C einwirken lassen, gelegentlich schwenken und klopfen Zeitangabe nur Richtwert Einwirkzeit abhängig von dem Alter der Zellen und dem Alter der Trypsin-EDTA- Lösung Sichtkontrolle makroskopisch: Zellen fließen mit der Flüssigkeit am Flaschenboden herunter Sichtkontrolle mikroskopisch: Großteil der Zellen schwimmt in abgekugelter Form in der Flüssigkeit - 2 ml (5 ml) Zellkulturmedium zugeben - das im Medium enthaltene Serum neutralisiert sofort die Wirkung des Trypsins und teilweise den zytotoxischen Einfluss des EDTA) - Zellen mittels Pipette gründlich suspendieren und in Röhrchen geben - Suspension 12 min bei 1500 U/min und 18 o C zentrifugieren - Überstand sofort vorsichtig absaugen sonst Zellschädigung durch EDTA Anwesenheit von EDTA erschwert außerdem die erneute Anheftung der Zellen bei der Aussaat - 2 ml (4 ml) Kulturmedium auf Zellpellet geben und gründlich resuspendieren, um die Zellen zu vereinzeln - Zellen nach Umsatzrate (z.b. 1:5) umsetzen oder Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer bestimmen - Kulturmedium in Zellkulturflasche vorlegen und errechnete Menge Zellsuspension zugeben und durch Schwenken gleichmäßig verteilen Inkubation im Brutschrank bei 37 C und 5 % CO 2 - bei Zellkulturflaschen ohne Sterilfilter in der Verschlusskappe diese ca. eine halbe Umdrehung aufschrauben, um den Gasaustausch zu gewährleisten - nach zwei bis vier Tagen erfolgt die Ausbildung eines geschlossenen Zellrasens (abhängig von der Einsaatdichte der Zellen) 258

259 Anzucht in Röhrchen mit Deckglas - Zelle umsetzen wie oben beschrieben - nach Bedarf entsprechende Menge Zellsuspension mit einer Zelldichte von 1x10 5 /ml herstellen - 1ml / Röhrchen einfüllen auf gleichmäßige Durchmischung achten, da Zellen sich schnell absetzen - Röhrchendeckel etwas aufschrauben, um Gasaustausch zu gewährleisten - Inkubation bei 37 C und 5 % CO 2 - nach 1h kontrollieren, ob noch alle Deckel locker sind Bei festgesaugtem Deckel und dadurch verhindertem Gasaustausch bleibt die Mediumfarbe unverändert, während sich das Medium durch den Gasaustausch etwas orange verfärbt. - nach 2 bis 3 d Ausbildung eines geschlossenen Zellrasens (mikroskopische Kontrolle) ANHANG 3 Materialien und Geräte für die Real-Time-PCR Verzeichnis der Reagenzien PBS-Puffer (10 mm Na 2 HPO 4, 10 mm NaH 2 PO 4, 0,145 M NaCl, ph 7,0) High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Diagnostics) od. vergleichbares Produkt zur DNA-Extraktion aus klinischen Proben Isopropanol z.a. Tris-Puffer 10 mm Lysepuffer (100 mm Tris, ph 8.5, 0.05 % Tween 20) Proteinase K (1%ige Lösung, w/v) Reinstwasser TaqMan Universal MasterMix (Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) od. gleichwertiges Produkt eines anderen Herstellers, enthält Hot-Start Taq-DNA-Polymerase, Reaktionspuffer, dntps und Farbstoffe Primer: Stammlösung 100 pmol/µl, Arbeitsverdünnung 1:20, ergibt Arbeitskonzentration 5 pmol/µl) (Sequenzen und andere Angaben s. Tabellen 3 und 4) Sonde: lösen in 1mM Tris-HCl ph 8.0/0,01mM EDTA, so dass sich eine Konzentration von 5 pmol/µl bzw. 5 µm ergibt; in Portionen zu je 200µl einfrieren. (Sequenzen und andere Angaben s. Tabellen 3 und 4) Es handelt sich um eine MGB -Sonde. Verzeichnis der Geräte GeneAmp 7700 (oder 5700) Sequence Detection System (Applied Biosystems) oder Mx3000 Real-Time PCR System (Stratagene, Amsterdam) Vortexschüttler Tischzentrifuge Laborzentrifuge mit Rotor für Mikrotiterplatten, z.b.biofuge Stratos (Kendro Laboratory Products, Langenselbold) 259

260 Automatische Pipetten, 0,1-2,5 µl, 0,5-10µl, 2-20 µl, µl, µl und µl Mehrkanalpipette, z.b. 8-Kanalpipette µl Verzeichnis der Verbrauchsmaterialien MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plates (Applied Biosystems) oder andere für Real- Time-PCR geeignete Mikrotiterplatten Thermische Verschließfolie, z.b. MicroAmp Clear Adhesive Films (Appl. Biosystems) od. Adhesive Plate Seal (Biodeal, Markkleeberg) Filterspitzen für o.g. automatische Pipetten Reaktionsgefäße 0,2 ml, dünnwandig (für PCR) Reaktionsgefäße 1,65 ml und 2,0 ml (für Probenaufbereitung) Einmalhandschuhe (bei allen Arbeitsschritten zu tragen) Literatur (siehe Fußnoten) ANDERSEN, A.A (1997): Two new serovars of Chlamydia psittaci from North American birds. J Vet Diagn Invest 9: VANROMPAY, D., BUTAYE, P., SAYADA, C., DUCATELLE, R., HAESE- BROUCK, F. (1997): Characterization of avian Chlamydia psittaci strains using omp1 restriction mapping and serovar-specific monoclonal antibodies. Res Microbiol 148: GEENS, T., DESPLANQUES, A., VAN LOOCK, M., BÖNNER, B.M., KALETA, E.F., MAGNINO, S., ANDERSEN, A.A., EVERETT, K.D.E., VANROMPAY, D. (2005): Chlamydophila psittaci ompa sequencing reveals the new genotype E/B and the need for a rapid discriminatory genotyping method. J Clin Microbiol 43: Verordnung zum Schutz gegen die Psittakose und Ornithose -Psittakose-Verordnung vom 20. Dezember 2005 (BGBl. I Nr. 74 vom S ) Gl.-Nr.: Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten vom 20. Dezember 2005 (BGBl. I Nr. 74 vom , S ) KALETA E.F. (1997): Aktuelle Fragen der Diagnose und Bekämpfung der Psittakose. Tierärztl Umschau 52, JANECZEK, F. (1989): Chlamydia psittaci - Diagnostik bei Psittaciformes: Vergleichendes Untersuchungen zum Antigennachweis in der Zellkultur und im ELISA sowie zum Antikörpernachweis in der Komplementbindungsreaktion und im Blocking ELI- SA. Vet Diss München NÜCHTER, H., SACHSE, K., KALETA, E.F. (2004) Die aviäre Chlamydiose und ihre Bekämpfung in der Europäischen Union. Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle, 11, (Teil 1) und (Teil 2) 260

261 Bei der Gewinnung der Tupferproben ist darauf zu achten, dass möglichst viele Epithelzellen gewonnen werden. ACHTUNG: Baumwolltupfer mit HOLZSCHAFT sind UNGEEIGNET, da das nachzuweisende Antigen an Holz adsorbiert und dadurch Ergebnisse verfälscht werden. z.b. IDEIA Chlamydia-Probenentnahmeset (2 unterschiedlich große Tupfer und Transportmedium in Schraubflasche) der Fa. DAKO Diagnostika, Hamburg. Kommerziell verfügbare Transportmedien, z.b. von Dako oder SPGA-Stabilisator, siehe Anhang 1 (1.1) Blut ist aus der Vena jugularis zu entnehmen. Bei kleineren Vögeln (z.b. Wellensittiche) können etwa 0,5 ml und bei größeren Vögeln bis zu 1,5 ml Blut entnommen werden (Kanüle 0,70 x 30 mm). Blutproben möglichst nicht aus der Vena ulnaris entnehmen, da es häufig zu Hämatombildung kommt. Bedingung für den direkten Nachweis von Chlamydienantigen mittels histologischer bzw. fluoreszenzserologischer Methoden ist eine ausreichende Anzahl von Zellen. Da bei negativem Ergebnis weitere Untersuchungen (Zellkulturmethode bzw. Antigen- ELISA) durchzuführen sind, sollten die ohne Medium eingesandten Tupfer in geeignetes Medium verbracht werden. Bei den mit Transportmedium zu untersuchenden Tupfer, sollte das restliche Zellpellet im abgesaugten Transportmedium wieder resuspendiert werden. Bei den Konjugaten z.b. der Fa. Medac, Hamburg bzw. DAKO, Hamburg handelt es sich um FITC (Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat)-gebundene, monoklonale Antikörper gegen ein allen Chlamydienarten gemeinsames, genus-spezifisches Lipopolysaccharid (LPS). ELISA Erfahrungen liegen für den IDEIA Chlamydia Test der Fa. DAKO, Hamburg, vor. Die Ausführungen gelten nur für diesen Test. Siehe dazu AVID-Mitteilung II/1997, Anlagen 8 bis 10 SACHSE, K., GROSSMANN, E., JÄGER, C., DILLER, R., HOTZEL, H. (2003): Detection of Chlamydia suis from clinical specimens: Comparison of PCR, antigen ELISA and culture. J Microbiol Meth 54:

262 30. Q-Fieber (meldepflichtig) Charakterisierung der Infektion Erreger Der Erreger des Q-Fiebers, Coxiella burnetii, ist ein sehr kleines, gramnegatives, obligat intrazelluläres Bakterium Klinische Symptomatik Die Krankheitserscheinungen beim Tier sind meistens gering. Seine Hauptbedeutung hat der Erreger als Auslöser vom Unfruchtbarkeit und Aborten beim Wiederkäuer (Schaf, Ziege, Rind; auch Wildwiederkäuer, z.b. Damwild) sowie als Zoonosenerreger. Besonders reichlich ist der Erreger im Fruchtwasser, in den Nachgeburten und den Lochien enthalten. Die Übertragung erfolgt kongenital, oral oder aerogen. Ferner werden Coxiellen auch durch Zecken übertragen. In Deutschland spielt hierbei insbesondere die Schafzecke Dermacentor marginatus eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des sogenannten Wildtierzyklus. Neben der kutanen Übertragung der Coxiellen durch den Saugakt kann der Erreger auch durch Inhalation erregerhaltigen Zeckenkotes übertragen werden Differentialdiagnose Als Differentialdiagnose kommen andere Abortursachen, insbesondere durch Chlamydien bedingte Aborte, in Betracht Diagnostische Indikation Ungeklärte Aborte und Fruchtbarkeitsstörungen Zuständige Untersuchungseinrichtungen Friedrich-Loeffler-Institut, Seestraße 55, Wusterhausen, Tel Rechtsgrundlagen Grundlage für die Bekämpfung des Q-Fiebers ist in Deutschland das Tierseuchengesetz in der Fassung der Bekanntmachung vom 22. Juni 2004 in der jeweils geltenden Fassung. Des Weiteren ist das Q-Fieber aufgeführt in der Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten in der Fassung der Bekanntmachung vom 11. April 2001 Bekanntmachung der Neufassung: BGBl Teil I Nr. 74, S vom 23. Dezember 2005.

263 30.2. Untersuchungsmaterial Der Nachweis einer Q-Fieber-Infektion erfolgt durch den Erreger-Nachweis. Serologische Befunde allein gelten als nicht beweisend für ein akutes Infektionsgeschehen. Geeignetes Untersuchungsmaterial stellen Feten bzw. Fetusteile (Lunge, Leber, Niere, Milz, Labmagen) sowie die Eihäute und Teile der Nachgeburten dar. Des Weiteren können Milchproben, Vaginaltupferproben sowie abgesammelte Zecken eingeschickt werden. Tupferproben sollten mit Hilfe einer kleinen Menge physiologischer Kochsalzlösung vor dem Austrocknen geschützt werden. Wegen der Infektionsgefahr für den Menschen (Zoonoseerreger) ist der Versand mit besonderer Vorsicht gemäß der geltenden Vorschriften durchzuführen. Das Material kann gefroren oder gekühlt versandt werden. Die Proben sind an das Friedrich-Loeffler-Institut, Seestraße 55, Wusterhausen zu schicken. Sie sind in jedem Fall telefonisch anzukündigen ( ). Im Anschreiben ist anzugeben: Wer sendet ein? (Veterinäramt, Bearbeiter; incl. dienstlicher und eventuell privater Telefon- und Fax-Nummer) Was wird eingesandt? (Art des Materials, von welchen Tieren, Anzahl etc.) Aus welchem Bestand stammen die Proben? Untersuchungsgang Erregernachweis Anzucht Versuche zur Isolierung von Coxiellen erfordern ein S3-Labor. Die Methode ist bei Henning und Sting (2000) beschriebenen. Sie erfolgt mittels Buffalo Green Monkey (BGM)-Zellen in 75 cm 2 Plastikflaschen. Als Medium dient z.b. antibiotikumfreies Minimal Essential Medium (MEM) Eagle mit Earle s Salzen und Zusatz von 5 % neonatalem Kälberserum (NKS), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren 100x, 1 % Vitaminen 100x sowie 2 mmol L-Glutamin. Nach Anreibung der Proben werden diese in MEM aufgeschwemmt und anschließend durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,45 µm (z.b. Minisart, Fa. Sartorius, Göttingen) filtriert. Dieses Filtrat dient als Inokulum für eine BGM-Zellkultur, die über einen Zeitraum von 6 Wochen auf das Auftreten von für Coxiellen typische Vakuolen beobachtet wird Färberischer Nachweis Die Coxiellen können mit Hilfe von nach Gieménez gefärbten Ausstrichpräparaten nachgewiesen werden (Abb. 1). 263

264 Abbildung 1: Coxiella burnetii in BGM-Zellkultur (Giménez-Färbung) Polymerase Kettenreaktion (PCR) Nähere Angaben zur Probenaufbereitung sowie zu den PCR-Methoden sind bei Henning et al. (2007) zu finden. Nachfolgend wird als Beispiel eine der Möglichkeiten beschrieben. Die Aufreinigung der DNS erfolgt mit Hilfe eines kommerziellen DNS-Isolierungskits (z.b. Puregene DNA Isolierungskit GW, Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf) gemäß der Anleitung des Herstellers. Die PCR zum Nachweis von Coxiellen erfolgt gemäß einer modifizierten Arbeitsvorschrift von Schrader et al. (2000). Als Primer werden CoxP4 (5 -TTA AGG TGG GCT GCG TGG TGA TGG-3 ) und CoxM9 (5 -GCT TCG TCC CGG TTC AAC AAT TCG-3 ) (z.b. Fa. TIB MOLBIOL, Berlin) verwendet. Der Reaktionsansatz besteht aus 1 x PCR-Puffer, 2 mm MgCl 2, 0,5 U Taq DNA Polymerase, 0,2 mm dntps (alle Fa. Bioline, Luckenwalde), jeweils 0,5 µm beider Primer und 2 µl DNA-Extrakt. Die PCR-Bedingungen sind der Tab. 1 zu entnehmen. Die Darstellung der Amplifikate erfolgt im Agarose-Gel (1 % oder 1,5 %) mittels Ethidiumbromidfärbung unter UV-Licht. Als positiver Befund gilt das Erscheinen eines 448 bp-großen PCR-Produktes als Bande im Agarose-Gel, unter der Bedingung, dass alle mitgeführten Negativkontrollen negativ sind und in der Referenzstamm-Probe ein Amplifikat der korrekten Größe gebildet wurde Antikörpernachweis Die serologischen Tests können mittels KBR oder kommerziell erhältlicher Antikörper- ELISA (z.b. Fa. Bommeli) durchgeführt werden Literatur Henning, K. und Sting, R.: Die Isolierung und Kultivierung des Q-Fieber-Erregers (Coxiella burnetii) mittels Zellkulturen. Tierärztl. Umschau 55, , Henning, K., Kilwinski, J., Hotzel, H., Panning, M.: Nachweis des Q-Fieber-Erregers Coxiella burnetii in Milch. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 2 (2) : , Schrader, C., D. Protz und J. Süss (2000): Coxiella burnetii. In: Sachse, K. und Gallien, P. Molekularbiologische Nachweismethoden ausgewählter Zoonoseerreger. BgVV-Hefte 2/2000, Berlin. 264

265 31. Rauschbrand Charakterisierung der Infektion Erreger Clostridium (C.) chauvoei (manchmal auch als C. feseri bezeichnet) ist der Erreger des Rauschbrandes. Der Rauschbrand ist eine seuchenhaft und akut verlaufende, infektiöse, aber nicht kontagiöse Gasödemkrankheit, die meist junge Rinder sowie gelegentlich Schafe bzw. Ziegen befällt und durch die metastatische Bildung von Gasödemen in den großen Muskelpartien gekennzeichnet ist. Die Infektion des Rindes erfolgt meist über den Verdauungstrakt, die C.-chauvoei-Infektion des Schafes ist dagegen eine Wundinfektion. Der seuchenhafte Verlauf beim Rind macht die vorrangige Bekämpfung des Rauschbrandes gegenüber den anderen Clostridieninfektionen erforderlich Klinische Symptomatik Gasig-knisternde, "rauschende" Schwellungen an Hals, Schulter, Rücken, Oberschenkel, zugleich schwere Allgemeinstörungen. Tod meist schon nach mehreren Stunden, Krankheit dann erst feststellbar. Bei Schafen tritt Rauschbrand vorwiegend als reine Wundinfektionskrankheit auf, z. B. nach Verletzungen, bei Geburten, als Folge von Hundebissen oder nach dem Scheren. Auch hier die knisternden Anschwellungen Differentialdiagnostik C. chauvoei muss von anderen Gasödemerregern, insbesondere von C. septicum, dem Erreger des Pararauschbrandes, abgegrenzt werden. C. septicum verursacht bei Schafen Wund- und Geburtspararauschbrand, tritt aber auch bei anderen Tieren als Gasödemerreger in Erscheinung. Bei den Gasödeminfektionen sind weitere Clostridienspezies, besonders C. novyi, C. perfringens, C. histolyticum, C. sordellii und C. fallax differentialdiagnostisch zu berücksichtigen. Des Weiteren ist Milzbrand auszuschließen Diagnostische Indikation siehe Zuständige Untersuchungseinrichtungen Staatliche Veterinäruntersuchungsämter FLI,,Standort Jena (nationales Referenzlabor) Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen den Milzbrand und den Rauschbrand vom 23. Mai 1991 (BGBl. I S. 1172) in der jeweils geltenden Fassung 265

266 31.2. Untersuchungsmaterial Aufgrund des schnellen und meist letalen Krankheitsverlaufes konzentriert sich die Diagnose fast ausschließlich auf postmortale Nachweisverfahren. Bei Tieren, die später als 24 h post mortem zur Sektion gelangen, ist eine exakte Diagnosestellung infolge der schnellen postmortalen Zersetzung des Gewebes und verschiedener Clostridientoxine erschwert. Bei Gasödeminfektionen sind typisch veränderte Gewebeproben und Exsudat steril zu entnehmen. Die Aufbewahrung der Proben erfolgt bei 4 C Untersuchungsgang Clostridien haben die Fähigkeit zur Bildung von Endosporen, die im Direkt- (Original-) Präparat mittels Gram-Färbung oder Sporen-Färbung (z.b. nach Rakette, Anhang 1) nachweisbar sind und bereits wichtige Orientierungen geben können. Die primäre Anzucht von Clostridien aus Untersuchungsmaterial erfolgt vorwiegend auf festen Nährböden als anaerobe Oberflächenkultur sowie parallel in flüssigen Anreicherungskulturen, die nach erfolgtem Wachstum zur Bakterienisolierung auf feste Medien ausgeimpft werden. Eine selektive Anzüchtung von Clostridien, die in flüssigem Untersuchungsmaterial bzw. Aufschwemmung von festem Material in Sporenform vorkommen, kann nach Erhitzen der Proben für 15 min bei 75 C erfolgen Kulturmedien Für die Basisdiagnostik werden Nährmedien verwendet, auf denen Clostridien optimal wachsen und charakteristische Wuchseigenschaften zeigen: Blutagar: zur Beurteilung der Hämolyse Blut-Glukose-Agar nach Zeissler (Anhang 2): zur Beurteilung der Wuchsform Glukose-Hefeextrakt-Cystein-Agar (Anhang 3) Laktose-Eigelb-Agar (Anhang 4): zur Beurteilung wichtiger Identifizierungsmerkmale, wie Laktosespaltung, Lecithinase- und Lipasebildung. Selektivmedien sind im Handel erhältlich, haben sich aber nur für wenige Clostridien-Spezies bewährt, da durch die Empfindlichkeit der meisten Clostridien gegenüber den in den Nährböden befindlichen Hemmstoffen die Keimzahl stark reduziert wird. Geeignete flüssige Kulturmedien sind: Anaerobier-TVLS-Medium (Merck Art.-Nr ) Leber-Leberbouillon nach Tarozzi (Anhang 5) Hirnbreisuspension nach Hibler (Anhang 6): für indirekten Sporennachweis und Stammhaltung Kulturbedingungen Die Bebrütung erfolgt unter anaeroben Verhältnissen, d.h. in Anaerobiertöpfen (Gas Pak [ BBL], Anaerocult A [ Merck], AnaeroGen [ Oxoid] ) unter Einsatz von Gas-Entwickler-Kits oder der Gasaustauschtechnik bzw. in Anaerobier-Brutschränken. Es empfiehlt sich, die Anaerobiose im Kulturgefäß durch Mitführen eines Redoxindikators (Anhang 7.1. u. 7.2.) zu prüfen. Eine Vorreduzierung der Agarplatten im Anaerobiergefäß verbessert das Wachstum und damit die Isolierungsrate. Die flüssigen Nährmedien sollen vor der Verwendung 15 min ausgekocht werden und nach dem Beimpfen entweder mit flüssigem sterilem Paraffin (Merck 7162) überschichtet oder 266

267 anaerob bebrütet werden. Ein geringer Agarzusatz (0,1-0,5 %) in den Bouillons verlangsamt das Wiedereindringen des Sauerstoffs aus der Atmosphäre. Da die meisten Clostridien-Spezies relativ schnell wachsen, kann die Ablesung der Kulturplatten bzw. Kontrolle der Bouillonkulturen nach einer anaeroben Bebrütung von 1-3 Tagen bei 37 C erfolgen Identifizierung Ausgangspunkt für die Identifizierung sind morphologische Kriterien. Die Zuordnung der Isolate zur Gattung Clostridien erfolgt durch: Anfertigung eines Grampräparates: Clostridien sind grampositiv (Ausnahmen: C. clostridioforme, C. indolis, C. sphenoides). In älteren Kulturen treten häufig gramlabile Stäbchen auf. Prüfung des Wachstums unter aeroben Bedingungen: Clostridien wachsen nicht auf aerob bebrüteten Nährböden (Ausnahme: wenige aerotolerante Arten, z.b. C. histolyticum, C. tertium, C. ramosum, C. durum, C. carnis). Nachweis von Sporen: Die meisten Clostridien bilden auf festen Nährböden oder in flüssigen Medien Sporen, die im Phasenkontrastmikroskop oder mittels Gram- bzw. Sporenfärbung nachgewiesen werden. Die Lokalisation der Spore in der Zelle ist ein Identifizierungsmerkmal (Tab. 1). Der indirekte Sporennachweis (Hitzetest) erfolgt dann, wenn im Präparat keine Sporen zu sehen sind. Hierzu wird das zu prüfende Material bzw. die Kultur 15 min auf 75 C erhitzt und in ein flüssiges Medium überimpft. Tritt nach 48 h Bebrütung bei 37 C Wachstum auf, beweist dies, dass Sporen vorhanden waren. Keine Sporen werden bei C. perfringens, selten bei C. ramosum und C. clostridioforme gefunden Differenzierung Grampositive oder gramlabile Stäbchen mit Sporenbildung werden zur biochemischen Prüfung auf Laktose-Eigelb-Agar (Anhang 4) ausgestrichen und in ein Fermentationsmedium (Anhang 8) für die Bunte Reihe überimpft. Auf Laktose-Eigelb-Agar können folgende differentialdiagnostisch wichtige Merkmale beurteilt werden, die eine erste orientierende Identifizierung medizinisch bedeutsamer Clostridien- Spezies ermöglichen: Laktosefermentation, Lecithinase- und Lipasebildung (Abb. 1, Tab. 1). Die Kolonien laktosespaltender Spezies sind gelb gefärbt. Die Fähigkeit zur Lecithinasebildung ist an einer opaken Präzipitationszone um die Kolonie zu erkennen. Lipasebildende Spezies weisen dagegen eine perlmuttartig schillernde Glanzzone um die Kolonie auf. Außerdem werden auch proteolytische Eigenschaften durch eine Klärungszone um die Kolonie angezeigt. Die weitere biochemische Prüfung erfolgt in einem Fermentations-Basis-Medium mit Zuckerzusatz (Anhang 8). Die Bebrütung erfolgt mindestens 3 bis 5 Tage anaerob bei 37 C. 267

268 Abgrenzung von C. chauvoei und C. septicum: Die beiden Erreger gleichen sich in vielen Eigenschaften. Eine Differenzierung ist durch die in Tabelle 2 zusammengefassten Merkmale möglich. Nach Bergey's Manual of Systematic Bacteriology lässt sich C. chauvoei am einfachsten durch die Fermentation von Saccarose und die ausbleibende Verstoffwechselung von Cellobiose und Trehalose von C. septicum unterscheiden. C. septicum und C. chauvoei besitzen ein gemeinsames Letaltoxin. Zusätzlich wird von C. septicum ein zweites Letaltoxin gebildet. Dadurch kann mit C.-septicum-Antitoxin die toxische Wirkung von C. chauvoei neutralisiert werden, aber nicht umgekehrt. Der Meerschweincheninfektionsversuch liefert unsichere Ergebnisse und sollte nur noch in Ausnahmefällen vorgenommen werden. In der Routinediagnostik gewinnt der direkte Fluoreszenztest zunehmend an Bedeutung, für welchen entsprechende Antiseren angeboten werden Anhang 9). Bezüglich der Durchführung dieser Untersuchungsverfahren wird auf die Angaben des Herstellers verwiesen. Hinweis: Da die diese Diagnostika bisher nicht zugelassen sind, ist eine Ausnahmegenehmigung der zuständigen obersten Landesbehörde notwendig. Abgrenzung von C. chauvoei von weiteren Gasödemerregern Weitere, differentialdiagnostisch bedeutsame Clostridienspezies sind C. novyi, C. perfringens, C. histolyticum, C. sordellii und C. fallax. Sie können durch das Wachstum auf Laktose- Eigelb-Agar (Abb. 1) und die Reaktionen in der Bunten Reihe (Tab. 1) abgegrenzt werden. Identifikation und Differenzierung durch PCR: Die Identifikation und Differenzierung von C. chauvoei kann auch durch PCR erfolgen. Ratsam ist die Anzucht bzw. Isolation verdächtiger Kolonien, aus denen dann die DNA extrahiert werden kann. Bezüglich der Durchführung dieser Untersuchungsverfahren wird auf die Angaben der Autoren verwiesen (Kuhnert et al. 1996, 1997). Nach der Amplifikation mit dem Primerpaar 16S UNI-L/R (Kuhnert et al. 1996, 1997) erhält man ein Amplifikat von etwa 1400 bp. Dieses Amplifikat wird mit SspI verdaut, um zwischen C. chauvoei und C. septicum unterscheiden zu können. Im Fall von C. chauvoei Isolaten erhält man 3 Restriktionsprodukte von 1020, 186 und 171 bp, während sich bei C. septicum nur 2 Fragmente nachweisen lassen (1020 und 357 bp). Mit dem Primerpaar CC 16S-L/R erhält man von C. chauvoei und C. septicum (C. septicum meist schwach oder nicht nachweisbar) ein 960 bp Amplifikat, während andere nahe verwandte Spezies wie C. carnis nicht reagieren. Durch den Verdau mit SspI kann das Vorliegen von C. chauvoei DNA (118 bp, 186 bp, 655 bp) verifiziert werden (C. septicum: 304 bp, 655 bp) (Kuhnert et al. 1996, 1997) Validierung Offizielle Methoden der Validierung stehen derzeit nicht zur Verfügung. 268

269 Literatur Al-Khatib, G. (1969): Beiträge zur Clostridiendifferenzierung VI. Zur Differenzierung von Cl. septicum und Cl. chauvoei. Arch. exper. Vet. med. 23, Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 2 / Peter H. A. Sneath [Hrsg.]; Mair, Nicholas S. David Hendricks Bergey [Begr.] Baltimore [u.a.] : Williams & Wilkins, ISBN: Köhler, B. (1987): Clostridien-Infektionen und -Intoxikationen. In: Beer, J.: Infektionskrankheiten der Haustiere, 3. Aufl., Teil II, S , VEB Gustav Fischer Verlag, Jena. Kuhnert P, Capaul SE, Nicolet J, Frey J (1996): Phylogenetic positions of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum based on 16S rrna gene sequences. Int J Syst Bacteriol. 46(4): Kuhnert P, Krampe M, Capaul SE, Frey J, Nicolet J (1997): Identification of Clostridium chauvoei in cultures and clinical material from blackleg using PCR. Vet Microbiol. 57 (2-3): Schallehn, G. (1990): Isolierung und Identifizierung von Clostridien. Zbl. Bakt. 274, Schau, H.-P. (1988): Clostridium. In: Bernhardt, H. u. Knoke, M.: Humanpathogene Anaerobier 1. Aufl., S , VEB Gustav Fischer Verlag, Jena. 269

270 Tabelle 1: Differenzierung von C. chauvoei und C. septicum (modif. nach Al-Khatib, 1969) Merkmale C. chauvoei C. septicum Wuchsform auf Traubenzucker-Blutagar (Zeissler-Agar) Biochemie perlmuttartige, graue weinblattförmige Kolonien mit Hämolysezone Saccharose + - Cellobiose - + Trehalose - + Salicin - +/- Äskulin - + Immunfluoreszenz C. chauvoei + - C. septicum - + Rasenbildung, Hämolyse Meerschweinchenversuch Leberabklatschpräparat meist einzeln liegende kurze Stäbchen meist lange Ketten Neutralisation der Letaltoxine mit Antitoxinen von C. chauvoei + - C. septicum

271 Abbildung 1: Differenzierung der Spezies Clostridium auf Laktose-Eigelb-Agar 271

272 ANHANG 1. Sporenfärbung nach Rakette 1. Präparat lufttrocknen 2. Fixieren, indem das Präparat sechsmal durch die Flamme gezogen wird 3. Objektträger mit 5%iger, wässriger Malachitgrünlösung bedecken Sekunden aufkochen und weitere 30 Sekunden stehen lassen 5. Kräftig abspülen 6. 1 Minute mit 2,5%iger, wässriger Eosinlösung nachfärben 7. Abspülen und abtrocknen Ergebnis: Sporen grün, Bakterienleib rosa 2. Glukose-Blutagar nach Zeissler Nähragar (z.b. Merck, Art. Nr. 5450) mit 2 % Glukose und 10 % Schaf- oder Rinderblut, ph- Wert 7,4 3. Glukose-Hefeextrakt-Cystein-Schafblutagar nach Werner Pepton, tryptisch verdaut NaCl Fleischextrakt (Difco) Hefeextrakt (Difco) Cystein-HCl Glukose Bacto-Agar (Difco) 10,0 g 5,0 g 2,0 g 5,0 g 0,3 g 2,0 g 20,0 g Aqua dest. ad 1000,0 ml ph-wert 7,2-7,4 Aufkochen, autoklavieren, 10 % defibriniertes Schaf- oder Pferdeblut zusetzen. Gleichfalls geeignet ist Schaedler-Agar (Becton Dickinson, Bio-Merieux), dem die entsprechende Blutmenge zugesetzt wird. 4. Laktose-Eigelb-Agar Zu 500 ml fertig zubereitetem Columbia-Agar (Oxoid) werden 5 g Laktose zugegeben. Nach Lösen im Dampftopf Abkühlung auf 50 C. Danach Zugabe von 5 ml einer 0,4%igen Bromkresolpurpurlösung und 50 ml Eigelb- Emulsion (Oxoid). Einstellen auf einen ph-wert von 7,4. 272

273 5. Leber-Leberbouillon nach Tarozzi Frische Leber von Meerschweinchen, Schwein oder Rind, die von Bindegewebe befreit wurde, in bohnengroße Stücke schneiden, mit der zwei- bis dreifachen Menge Bouillon 30 min im Dampftopf kochen. Nach dem Abkühlen durch Faltenfilter bis zur völligen Klarheit filtrieren. Die zurückbleibenden Leberstückchen spült man unter der Wasserleitung kräftig ab, verteilt sie zu je 2 bis 3 Stück auf Reagenzgläser, übergießt sie mit der dreifachen Menge (8 bis 10 ml) der filtrierten Bouillon (ph-wert 7,4 bis 7,8) und autoklaviert 15 min bei 120 C. 6. Hirnbreisuspension nach Hibler Frisches Rinder- (Schweine-) Hirn wird von Blut und Hirnhaut befreit. 2 Teile Hirn mit einem Teil physiologischer NaCl-Lösung durch ein Sieb passieren. In Röhrchen zu 8 ml abfüllen. Sterilisieren: 2x30 min bei 100 C im Dampftopf Methylenblau-Indikator 60%ige Tris-Lösung 4%ige Glukose-Lösung 0,02%ige Methylenblau-Lösung Jeweils als wässrige Lösung, kühl und dunkel aufbewahren. Zum Gebrauch gleiche Teile mischen Resazurin-Indikator 25 mg Resazurin ad 100 ml Aqua dest., 15 min bei 120 C autoklavieren, 3 Monate haltbar. 8. Fermentations-Basis-Medium (Schau, 1988) Trypticase Hefeextrakt NaCl Na-thioglykolat Cystein-Hydrochlorid Na 2 SO 3 20,0 g 2,0 g 2,5 g 0,5 g 0,25 g 0,1 g Aqua dest. ad 1000,0 ml ph-wert 7,2 Jedem Röhrchen mit 5 ml Medium werden 0,5 ml einer 10%igen sterilfiltrierten Lösung des jeweils zu prüfenden Zuckers zugegeben. Nach Beimpfen werden im Anschluss an die Bebrütung 0,1 ml Indikatorlösung hinzugegeben. Indikator: Methylrot 0,1 g, Bromthymolblau 0,3 g, 96%iger Äthylalkohol 300 ml, Aqua dest. 300 ml. Der Farbumschlag des Indikators von Grünblau nach Gelb bzw. Rot zeigt eine Fermentierung des betreffenden Zuckers an. 273

274 9. FITC Konjugate für direkten FA-Nachweis von C. chauvoei und C. septicum Bestellung bei: VMRD, Inc. P.O. Box 502 NW 115 State St. Pullman, WAY Tel. (800) Fax (509) Katalog-Er. C. chauvoei FA Konjugat 1 ml CC C. septicum FA Konjugat 1 ml CS 274

275 32. Rifttal-Fieber Zum Nachweis von Rift Valley Fever Virus (Bunyaviridae) sind am FLI keine Reagenzien vorhanden. Bislang wurden keine Anfragen zum Nachweis dieses Erregers oder von Antikörpern gegen RVFV an das FLI herangetragen. In Deutschland anzeigepflichtig seit: Nationales Referenzlabor: FLI, Insel Riems Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer Insel Riems Leiter und/oder Ansprechpartner: Dr. B. Hoffmann Telefon: Telefax Juni 2008 (Bearbeitungstand) 275

276 33. Rinderpest (analog Pest der kleinen Wiederkäuer) Charakterisierung der Infektion Erreger Die Erreger sind in beiden Fällen Vertreter des Genus Morbillivirus der Familie Paramyxoviridae Klinische Symptomatik Rinderpest (RP) und Pest der kleinen Wiederkäuer (Peste des Petits Ruminants - PPR) sind fatal verlaufende Allgemeinerkrankungen der Hausrinder und -büffel sowie der Schafe und Ziegen. Nach zweiwöchiger Inkubationszeit folgt eine akute Fieberphase während der eine Prodromal- und eine Erosivphase unterschieden werden können. Die Prodromalphase kann 3 Tage dauern, wobei die befallenen Tiere Fieber zw. 40 und 41,5 C zeigen sowie Anorexie, Verstopfung und seröse Schleimhaut-Hypersekretion. Zu Beginn der erosiven Phase kommt es zur Entwicklung nekrotischer Maulschleimhautläsionen, die eine spezifische klinische Diagnose der Rinderpest bzw. PPR erlauben. Bei hoch empfänglichen Tieren (z.b. Importtiere) kommen perakute Verlaufsformen vor, die kurz nach der Prodromalphase sofort zum Tod führen. Umgekehrt gibt es schwach virulentes Virus, das nur kurz dauernde und kaum sichtbare Läsionen im Maulbereich verursacht. Hier ist auf keinen Fall eine rein klinische Diagnose möglich Differentialdiagnostik Alle erosiven oder vesikulären Haut- und Schleimhauterkrankungen der Wiederkäuer mit schwerer Störung des Allgemeinbefindens (z.b. hohes Fieber, Festliegen) Diagnostische Indikation Richtlinie 92/119/EWG Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, Insel Riems Rechtsgrundlagen Richtlinie 92/119/EWG Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 23. Mai

277 33.2. Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial Erregernachweis Gerinnungsgehemmtes Blut eignet sich am besten zur Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion. Post mortem sind am besten zur Virusisolierung lymphatische Organe wie Milz oder Lymphknoten geeignet. Transport und Kurzzeitlagerung bei +4 o C, Lagerung über lange Zeit bei -70 o C Untersuchungsmaterial Antikörpernachweis Nativblut, Serum, mind. 500 µl Untersuchungsgang (NUR DURCH DAS FLI DURCHZUFÜHREN) Erregernachweis Eine Virusanzucht erfolgt am besten in primären Rinder- oder Schafzellen oder in Vero- Zellen. Es entwickelt sich ein typischer zytopathogener Effekt (zpe) wobei das Virus spezifisch und am besten durch Immunfluoreszenz nachgewiesen wird. Zum Nachweis spezifischer Präzipitate kann der Agargel Immundiffusionstest (AGIDT) mit Kaninchen- Hyperimmunserum als Schnelltest empfohlen werden. Zur Unterscheidung zwischen RP und PPR wird der differenzierende Immunocapture Test angegeben. Hier werden spezifische monokolonale Antikörper (mab) gegen das N-Protein beider Viren eingesetzt. Es handelt sich um ein publiziertes ELISA-Verfahren (Vet. Rec. 134, (1994)). Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum universellen Rinderpest/ PPR-Nachweis und zur Differenzierung von RPV- und PPRV-RNA wurde am Institute for Animal Health, Pirbright, U.K., entwickelt. Die Protokolle und Primer sind am FLI, Insel Riems verfügbar. Rinderpestvirus und PPRV werden am FLI bis auf weiteres nicht vorrätig gehalten Antikörpernachweis Antikörperuntersuchungen im Rahmen von Importanfragen werden vom FLI durchgeführt. Dafür stehen ein Kompetitions-ELISA sowohl zum Nachweis von RPV-spezifischen, als auch zum Nachweis von PPRV-spezifischen Antikörpern zur Verfügung. Daneben ist der Neutralisationstest (NT) mit Impfvirus möglich (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 1996). 277

278 34. Rotz (Malleus) Charakterisierung der Infektion Erreger Burkholderia (B.) mallei ist der Erreger des Rotz (Malleus, engl. Glanders), einer oft chronisch und seuchenhaft verlaufenden Infektionskrankheit primär der Einhufer. Esel, Maulesel und Maultiere sind am empfänglichsten, Pferde, Hunde, Katzen, Kamele und auch Menschen gelten als mittelgradig prädisponiert, Rinder und Schweine sind schwer zu infizieren und Ratten sowie Geflügel sollen praktisch resistent sein. Die Krankheit ist eine Kontaktzoonose und gilt als ansteckend für Menschen Klinische Symptomatik Rotz tritt in Form knotiger und geschwüriger Entzündungen in der Haut, in der Nasenschleimhaut und in den Lungen auf. Der Erreger wird von Tier zu Tier oder durch Zwischenträger (Futter, Streu, Putzzeug, Geschirr) übertragen. Die Eintrittspforte ist die unverletzte Schleimhaut. Rotz kommt bei Eseln und Maultieren überwiegend in der akuten, bei Pferden überwiegend in der chronischen Form vor. Beim Maultier beginnt der Rotz fast immer mit einer zeitweilig aussetzenden Lahmheit an einem der Hinterbeine. Die Inkubationszeit schwankt von wenigen Tagen bis zu mehreren Monaten. Bei der chronischen Form sind möglicherweise die Erscheinungen nicht erkennbar. Man unterscheidet: Nasenrotz mit geschwürigen Veränderungen auf der Nasenschleimhaut und grünlich-gelbem Ausfluss oft nur auf einer Seite, trotz beidseitiger Entzündung. Hautrotz mit Knoten in der Haut, die geschwürig aufbrechen. Außerdem: Husten und Atembeschwerden (Kehlkopf- und Lungenrotz), zeitweiliges Nasenbluten; der chronische Rotz kann jahrelang bestehen Differentialdiagnostik Bei Nasenrotz: Druse, Pocken, Tuberkulose, traumatische Geschwüre. Bei Hautrotz: Lymphangitis epizootica, Lymphangitis ulcerosa, Sporotrichose. Bei Lungenrotz: Tuberkulose, Nocardiose, Botryomykose, parasitäre Veränderungen Diagnostische Indikation klinisch oder epidemiologisch begründeter Verdacht Zuständige Untersuchungseinrichtung Staatliche Veterinäruntersuchungsämter Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Institut für Bakterielle Infektionen und Zoonosen, Jena, Nationales Referenzlabor für Rotz 278

279 Rechtsgrundlagen Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der jeweils gültigen Fassung Untersuchungsmaterial Gewinnung Vom lebenden Tier wird die Untersuchung von Nasensekret, Lungenauswurf und Hauteiter empfohlen, weniger geeignet sind Kot, Genitalausfluss, Harn, Milch, Augensekret, Speichel und Blut. Von frisch verendeten Tieren sollten pathologisch veränderte Organe, besonders mit eitrigen Geschwüren und/oder bindegewebigen Knoten sowie die zugehörigen regionalen Lymphknoten untersucht werden Transport und Lagerung Untersuchungsmaterial umgehend vorschriftsmäßig in dicht schließenden Behältnissen entsprechend den Gefahrgutvorschriften für Straße und Eisenbahn (ADR), bzw. im Luftverkehr (IATA-DGR) in der jeweils gültigen Fassung verpacken und kennzeichnen und mit Vorbericht und Untersuchungsantrag an die Untersuchungseinrichtung schicken. Wegen möglicher Gefährdungen sollte Rotz-verdächtiges Untersuchungsgut durch Kurier übermittelt werden. Während des Transportes und evtl. notwendig werdender kurzzeitiger Lagerung ist das Material bei Zimmertemperatur aufzubewahren. Bei kontaminiertem Untersuchungsmaterial soll sich eine dreistündige Aufbewahrung dieses Materials in PBS, dem 1000 IE Penicillin/ml zugesetzt wurde, bei 37 C günstig auf die Nachweissicherheit auswirken Untersuchungsgang Vorsichtsmaßnahmen Burholderia mallei ist ein Erreger der Risikogruppe 3. Das Arbeiten mit potentiell B. mallei - infiziertem Material und mit B. mallei -Kulturen in einer Untersuchungseinrichtung ist genehmigungspflichtig und kann nur in Laboratorien der Sicherheitsklasse 3 durchgeführt werden Erregernachweis Für die Diagnose von Rotz sollten immer die Ergebnisse mehrerer Untersuchungsverfahren herangezogen werden Mikroskopischer Nachweis Von den genannten Tierkörperteilen werden Objektträger-Ausstrich- und/oder Abklatschpräparate angefertigt und nach Gram und mit Löfflers Methylenblau (s. Anhang 1.1) gefärbt. B. mallei ist ein kleines stäbchenförmiges Bakterium, 0,5 x 1,5 (bis 4) µm groß, meist mit 279

280 abgerundeten Enden und gramnegativ. An den Polen fällt eine intensivere Anfärbung auf. Dieses Phaenomen wird bei Färbung mit Löfflers Methylenblau viel deutlicher sichtbar. Bewertung: der alleinige mikroskopische Nachweis von Bakterien, die wie B. mallei aussehen, ist als verdächtig zu bewerten Kulturelle Untersuchung Die kulturelle Anzüchtung kann auf flüssigen und festen Nährmedien erfolgen, wobei meist letztere verwandt werden. Zur Direktkultur werden folgende empfohlen: 1. Nähragar mit 3 % Glycerinzusatz (s. Anhang 1.2) 2. Blutagar ( 5 % Hammelblut) (s. Anhang 1.3) 3. Pferde- oder Hammelserum 4. flüssiges Blutkulturmedium (kommerziell, verschiedene Anbieter) Zur Hemmung von Verunreinigungen können den Nährböden Kristallviolett (1:200000/ml), Malachitgrün oder Brillantgrün (1:100000/ml) zugesetzt werden. Bebrütung: Dauer 44 bis 48 Std. bei 37 C ± 1 C, aerob Identifizierung und Differenzierung: B. mallei bildet tautropfenförmige, glatte, durchscheinende runde Kolonien, die bei weiterer Bebrütung einen leicht grau-gelblichen, schleimig-fadenziehenden Belag bilden. Hämolyse und Pigmentbildung werden nicht beobachtet. In Bouillon bildet sich zuerst eine diffuse Trübung, dann ein schleimiger Bodensatz. B. mallei in Kultur ist relativ pleomorph, je nach Alter der Kultur variiert seine Größe und Lagerung, in ganz frischen Kulturen ist es kokkoid. Bakterien aus älteren Kulturen sind mitunter keulen- oder knospenförmig und können durch Vakuolen ein körniges Aussehen haben. Sie sind meist einzeln gelagert, in älteren Kulturen sind die Stäbchen länger und täuschen aneinandergelagert mitunter fädige Strukturen vor. B. mallei bildet Kapseln, aber keine Sporen und färbt sich, besonders mit Löfflers Methylenblau (Anhang 1), bipolar an. Säurefestigkeit besteht nicht. Verdächtige Kolonien können wie folgt geprüft werden: Wachstum auf Thioninagar (Anhang 1.4): Entfärbung des Nährbodens. Wachstumsprüfung auf McConkey-Agar mit 0,5 % Gallensalzen: B. mallei wächst nicht. Wachstumsprüfung auf Ashdown-Agar (B. mallei wächst nicht, im Gegensatz zu B. pseudomallei (Anhang 5) Beweglichkeitsprüfung: B. mallei ist unbeweglich, B. pseudomallei ist beweglich. Eine Alternative zum hängenden Tropfen ist das Überimpfen auf halbfeste Nährmedien. Die biochemische Aktivität von B. mallei ist relativ gering. Gelatine wird verflüssigt, Nitrat reduziert, Xylose, Glycin und Arabinose werden hydrolysiert. Bei längerer Kultivierung können sich diese Eigenschaften durch die Bildung von Rauformen eventuell verändern. 280

281 Eine Übersicht über die wichtigsten kulturellen und biochemischen Eigenschaften von B. mallei zur Unterscheidung von verwandten Bakterienarten gibt Tabelle 1. Tabelle 1: Die wichtigsten kulturellen und biochemischen Eigenschaften von B. mallei und anderen verwandten Bakterienarten (nach Jabuuchi, E.; 1992) B. mallei B. pseudom. B. cepacia Ps. aeruginosa Cytochromoxidase Wachstum bei 41 C - Pigment blau Pigment gelb NaCl 3 % NaCl 5 % Gelatin H2S (Papier) Katalase Glucose Arginin Lysin Lactose Nitratreduktion Sucrose Indol D-Xylose Maltose Mannitol Phenylalanin Harnstoff Citrat n. Simmons = positiv - = negativ Molekulare Nachweisverfahren Eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von B. mallei ist mit einem 5`-Nuclease Real- Time-PCR-Verfahren möglich (Tomaso et al., 2006). Ebenso wurde eine spezifische konventionelle PCR beschrieben (Scholz et al., 2006). Diese Methoden ermöglichen auch die sichere Unterscheidung von B. mallei und B. pseudomallei, das bei Pferden eine dem Rotz sehr ähnliche Erkrankung (sog. Pseudorotz) hervorrufen kann Histopathologie Als Ergänzung zum kulturellen Erregernachweis werden pathohistologische Untersuchungen empfohlen Serologische Diagnostik Bereits der klinische Rotzverdacht ist in Deutschland anzeigepflichtig und muss unverzüglich dem zuständigen Veterinäramt gemeldet werden. Die Feststellung einer Infektion beim Pferd erfolgt in Deutschland nach den Richtlinien zur Feststellung von Rotz (Malleus) bei Einhufern durch serologische und allergologische Untersuchungsverfahren (momentan gültig ist die geänderte Fassung von 1979). 281

282 Bei der Einfuhr von Equiden nach Deutschland gilt die Binnenmarkt-Tierseuchenschutz- Verordnung (BmTierSSchV) in der Fassung der Bekanntmachung vom (BGBl. I S.1820) in der jeweils geltenden Fassung, zuletzt geändert durch Verordnung vom (BAnz S.8385). In dieser Verordnung wird u. a. die Einfuhr von Tieren und Waren nach gemeinschaftlich festgelegten Anforderungen geregelt. Beim Verbringen innerhalb der EU sind die Richtlinien 90/426/EWG und 90/425/EWG in der jeweils geltenden Fassung zu beachten. Im internationalen Verkehr mit Drittländern gelten die Einfuhrbestimmungen des jeweiligen Landes. Im Manual of Standards For Diagnostic Tests and Vaccines, sind die gültigen Testmethoden für den internationalen Handel beschrieben (OIE, 2005). Das Auftreten von Antikörpern im Serum erkrankter Menschen und Tiere gilt als fundierter Hinweis auf die Auseinandersetzung mit dem Erreger. Das quantitative Verhalten spezifischer B. mallei- Antikörper ist vielfachen Schwankungen unterworfen und unterliegt im Verlaufe einer Rotz-Erkrankung keiner deutlichen Gesetzmäßigkeit. Aus diesem Grunde sind mehrere zeitlich versetzte serologische Untersuchungen zur Diagnosefindung angebracht Komplementbindungsreaktion (Anhang 2) Die KBR sie ist eine sehr sensible und spezifische Nachweismethode für Rotz, ihre Ergebnisse stimmen zu 99 % mit den Ergebnissen der pathologischen Untersuchungen überein. Bei einer Erkrankung treten ab 12. bis 14. Tag p.i. positive Titer auf Weitere serologische Untersuchungsverfahren Weitere Untersuchungsverfahren, die gegenwärtig jedoch wenig angewandt werden, sind die Präzipitation, die Konglutination, die Immunodiffusion und die Hämagglutination. Mehrere ELISA-Tests wurden für die Rotz-Diagnostik bereits entwickelt, sind wegen mangelnder Spezifität jedoch für die Routineanwendung nicht zu empfehlen Bewertung der Ergebnisse Die Bewertung der Ergebnisse aller dieser serologischen Untersuchungsverfahren zur Malleus-Diagnostik wird durch eine Reihe von serologischen Kreuzreaktionen erschwert. Die wichtigsten Ursachen dieser unspezifischen serologischen Reaktionen sind: Kreuzreaktionen mit anderen Mikroorganismen: Infektionen mit Pseudomonaden, besonders mit B. pseudomallei, sind serologisch nicht von B. mallei-infektionen zu trennen. Auch Infektionen mit Actinobacillus lignieresi sowie Streptococcus equi oder andere Infektionen führen zu serologischen Kreuzreaktionen. Malleinprobe: Trächtigkeit: Tierartspezifische Besonderheiten: Eine ordnungsgemäß durchgeführte Malleinprobe ergibt 30 bis 60 Tage lang eine positive Reaktion in der Komplementbindungsreaktion. Tragende Stuten können positive KBR-Titer aufweisen Esel- und Maultierseren zeigen evtl. unspezifische Titer und reagieren oft antikomplementär Allergische Diagnostik ( Malleinprobe ) Es wird die Verwendung eines allergenfreien Malleins oder Mallein-PPD (purified protein derivative) empfohlen, um eine Sensibilisierung zu vermeiden. Bei ausgezehrten Pferden kann die Mallein-Probe infolge Anergie auch falsch negativ sein. 282

283 Anhang 1 1. Methylenblau - Färbung nach Löffler Ausstrich hitzefixieren Ausstrich mit Löfflers Methylenblaulösung* 1 bis 2 min. bedecken Abspülen mit Wasser und Präparat trocknen lassen Bakterien erscheinen blau, B. mallei ist oft granuliert, gut erkennbar oft die typische bipolare Färbbarkeit * Löfflers Methylenblaulösung nach Winkle (1979): gesättigte alkoholische Methylenblaulösung Kalilauge, 1%ig Aqua dest. 30 ml 1 ml 100 ml 2. Nähragar mit Glycerinzusatz Basisagar (z.b. Nutrient Agar, Brucella-Agar, Trypticase-Soy-Agar, Standard-Agar II oder Pseudomonas Agar P) versetzen mit 3 % oder 4 % Glycerin ph = 6,6 bis 6,8 3. Blut - Agar Brucella-Agar mit Zusatz von 5 bis 10 % defibriniertem Blut von Schafen, Pferden, Rindern oder Kaninchen oder: Bacto-Pepton Natriumchlorid Na2HPO4 x 12 H2O Fleischextrakt Aqua dest. ad 10.0 g 5.0 g 2.0 g 6.0 g ml ph = Thioninagar Glycerin Dextrose Thionin-Lösung, 1%ig Nähragar 4 ml 1 g 2,5 ml 100 ml Thionin-Lösung wird mit 50%igem Alkohol hergestellt ph = 6,0 283

284 5. Ashdown-Agar Trypticase Soy Agar Glycerol Kristallviolett Neutralrot Gentamicin Aqua dest. ad Für 1 Liter 40 ml 0,005 g 0,05 g 0,004 g ml Anhang 2 Empfehlung zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion in der Mikro- Methode 1. Spezielle Diagnostika Malleus- Antigen, zugel. nach 17c TierSG Kontrollserum, positiv, zugel. nach 17c TierSG Kontrollserum, negativ, zugel. nach 17c TierSG Ambozeptor, Komplement, Hammelblut 2. Rezepturen 2.1. Verdünnungslösung (VBD) Die Verdünnungsflüssigkeit für alle Reagenzien ist Veronal-Puffer-Lösung (veronal-buffereddiluent = VBD). Zur besseren Haltbarkeit wird ein VBD-Konzentrat im Verhältnis 5:1 hergestellt und portioniert bei +5 C ± 3 C gelagert. Vor Gebrauch ist es 1:5 mit Aqua bidest. zu verdünnen. VBD kann auch käuflich erworben werden (z.b. Institut Virion/ Serion GmbH, Würzburg) Herstellung des VBD-Konzentrates 5:1, 2000 ml a) Stammlösung 1 Natriumchlorid p.a. 5,5 Diethylbarbitursäure - Natrium-Salz Aqua bidest. (heiß) 83,00 g 10,19 g ca. 800,00 ml 284

285 b) Stammlösung 2 Magnesiumchlorid - 6H 2 O Calciumchlorid - 2H 2 O Aqua bidest. 20,30 g 4,40 g ad 100,00 ml Die Lösung kann bei +5 C ±3 C 6 Monate aufbewahrt werden. Substanzen der Stammlösung 1 in einen Erlenmeyerkolben durch Rühren auf dem Magnetrührer heiß lösen tropfenweise Zugabe von 34,58 ml 1n Salzsäure (HCL) evtl. ausfallende Salze durch Zugabe von Aqua bidest. in Lösung bringen tropfenweise Zugabe von 5 ml Stammlösung 2 nach Abkühlung der Lösung das Volumen mit Aqua bidest. auf 2000 ml auffüllen Überprüfung des ph-wertes ph 7,3 ±0,2 Verdünnung von 1 ml VBD-Konzentrates mit Aqua bidest. 1:5 Messung des ph-wertes 2.2. Alseverlösung zur Konservierung von Hammelbluterythrozyten Dextrose (Glucose) Natriumchlorid Natriumcitrat Aqua bidest. 18,66 g 4,18 g 8,00 g ad 1000,00 ml Lösen im Dampftopf für 20 Bei längerer Erhitzung karamelisiert Dextrose in der Lösung Hammelblut ("sheep red blood cells", SRBC) Das Blut wird vom Schaf unter sterilen Bedingungen durch Punktion der Vena jugularis entnommen und unter leichtem Schütteln zu gleichen Teilen mit Alseverlösung in einem sterilen Gefäß (im geschlossenen System) aufgefangen. Ein Zusatz von Penicillin ( IE/l) kann die Haltbarkeit erhöhen. Das konservierte Hammelblut ist bei +5 C ± 3 C ca. drei Wochen haltbar. Hammelbluterythrozyten können als stabilisierte Suspension auch käuflich erworben werden (z.b. Institut Virion/ Serion) Ambozeptor Der Ambozeptor wird käuflich erworben (z. B. Institut Virion/ Serion) und vor erstmaligem Gebrauch jeder Charge geprüft Komplement Das Komplement ist ein Mischserum von gesunden Meerschweinchen, die vor dem Entbluten 24 Stunden nicht gefüttert werden. Es kann portioniert bei -21 C ± 3 C aufbewahrt werden. Vor jeder KBR wird eine Komplementauswertung vorgenommen. 285

286 Witte-Lösung (Kalium-Borlösung) zur Konservierung von Meerschweinchenkomplement Kaliumsulfat Borsäure Aqua bidest. 10,0 g 4,0 g ad 100,00 ml 1 h bei 100 C im Dampftopf lösen, Komplement und Konservierungslösung werden zu gleichen Teilen gemischt. Der Verdünnungsfaktor des Komplements muss beim Ansatz (Komplementauswertung und Hauptversuch) berücksichtigt werden. Haltbarkeit bei geringem Titerabfall ca. acht Wochen. Komplement kann auch käuflich erworben werden (z. B. Institut Virion/ Serion). 3. Durchführung 3.1. Antigen Antigen für die KBR kann käuflich erworben werden und ist in der vom Hersteller angegebenen Gebrauchsverdünnung zu verwenden. (z. B. Fa. C.c.pro GmbH, Nachtweide, Zul.- Nr.BFAV-B349; 17 TierSG) 3.2. Kontrollsystem Kontrollseren: In jedem Ansatz wird ein dem Antigen homologes positives (mit definiertem Titer bzw. Angabe von Sens.E./ml) sowie ein antikörperfreies, d.h. negatives Kontrollserum mitgeführt. Resuspendierte Seren können portioniert bei -21 C ± 3 C gelagert werden. Serumkontrolle für jedes mitgeführte Serum (SK) Hämolytisches System-Kontrolle (HS-K) 3.3. Serumproben und Antigen auf Raumtemperatur erwärmen 3.4. Inaktivierung der Seren Vor der Untersuchung sind alle zu untersuchenden Proben einschließlich Kontrollseren im Wasserbad in entsprechender Verdünnung wie folgt zu inaktivieren: Serumverdünnung Tierart Temp. ( C) Zeit (min) 1:5 Pferd :5 Maultier, Maulesel, Esel Verunreinigte und hämolytische Seren sind zur Untersuchung nicht geeignet Hämolytisches System (HS) Das mit Alseverlösung versetzte Hammelblut wird 3- bis 5-mal in VBD gewaschen (bis die überstehende Flüssigkeit wasserklar ist), dazu jedes Mal 10 Minuten bei 1000 g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Erythrozytensediment mit VBD aufschwemmen. Aus dem gewaschenen Erythrozytensediment wird eine 1- bis 2%ige Suspension hergestellt. Zum Gebrauch wird diese mit gleichem Volumen eines gebrauchsfertig verdünnten Ambozeptors vermischt. 286

287 Bei getrennter Aufbewahrung von Erythrozytensuspension und Ambozeptorverdünnung können diese bis zu 48 h nach Herstellung verwendet werden. 4. Ambozeptorauswertung 4.1. Herstellung einer 2%igen Erythrozytensuspension (s. Pkt. 5.5.) 4.2. Ansatz folgender geometrischer Verdünnungsreihen des Ambozeptors: Röhrchen : : : n Reihe A) 1: : : : Reihe B) 1:750 1: : : : Ausgangsverdünnung 1:500 (z.b. 0,2 ml Ambozeptor + 99,8 ml VBD) Vorlage von 5 ml VBD für Reihe A ab Röhrchen 2, für Reihe B ab Röhrchen 1 für Reihe A dem 1. und 2. Röhrchen 5 ml Ambozeptorverdünnung zufügen und ab Röhrchen 2 durch fortlaufendes Überpipettieren von jeweils 5 ml die weiteren Verdünnungen anlegen für Reihe B dem 1. Röhrchen 10 ml Ambozeptorverdünnung zufügen und durch fortlaufendes Überpipettieren vom jeweils 5 ml weitere Verdünnungen anlegen beide Titrationsreihen zu einer Verdünnungsreihe zusammenfügen 4.3. Durchführung der Ambozeptorauswertung Tabelle 1: Ansatzschema der Ambozeptorauswertung Röhrchen Amb.-Verd. VBD Erythr.-Susp. Kompl. 1:20 (0,5 ml) (ml) (ml) (ml) 1 1:500 1,0 0,5 0,5 2 1:750 1,0 0,5 0,5 3 1:1000 1,0 0,5 0,5 : : : : : : : : : : : : : : : n 1: ,0 0,5 0,5 Kontrollen a) Erythrozytenkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 2,0 ml VBD b) Komplementkontrolle: 0,5 ml Erythrozytensuspension 0,5 ml Komplement 1:20 1,5 ml VBD c) Ambozeptorkontrolle: 0,5 ml Erythrozytenkontrolle 0,5 ml Ambozeptorverdünnung 1,5 ml VBD schütteln, Inkubation 30 bei +37 C ±1 C im Wasserbad 287

288 4.4. Bewertung Ermittelt wird die höchste Ambozeptorverdünnung, die noch eine komplette Hämolyse bewirkt. Sie gilt als Ambozeptoreinheit (AE). Die Gebrauchsverdünnung beträgt 4 Einheiten, also die 4-fache Konzentration. Beispiel: 1 AE = 1:6000 Gebrauchsverdünnung = 1:1500 Die Kontrollen dürfen keine Hämolyse aufweisen. 5. Komplementauswertung Die Komplementauswertung dient der Feststellung der Komplementgebrauchsdosis für den Hauptversuch in Gegenwart der entsprechenden Antigengebrauchsverdünnung. Zum Vergleich wird eine zweite Reihe angesetzt, bei der das Antigenvolumen durch VBD ersetzt ist Durchführung Das Komplement wird an jedem Untersuchungstag in 8 Konzentrationsstufen in der Wärmebindung geprüft. In der Tabelle 2, Teil 1, ist die Herstellung der 8 Verdünnungsstufen dargestellt. Tabelle 2: Komplementauswertung, Teil 1 Komplementkonzentration (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Kompl. 1:10 (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 VBD (ml) 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 Die weiteren Arbeitsschritte sind in der Tabelle 2, Teil 2, erklärt. Tabelle 2: Komplementauswertung, Teil 2 Reihe 1 Reihe 2 Komplement je Verd.-Stufe (ml) 0,5 0,5 Antigengebrauchsverdünnung (ml) - 0,5 VBD (ml) 1,0 0,5 schütteln, Wasserbad 60 bei +37 C ±1 C HS (ml) 1,0 1, Bewertung Es wird das Röhrchen mit der niedrigsten Komplementkonzentration bestimmt, das eine komplette Hämolyse aufweist. Die Gebrauchsverdünnung für den Hauptversuch ist die folgende höhere Konzentration. Beispiel: komplette Hämolyse = 2,0 % Gebrauchsdosis = 2,5 % 288

289 6. Hauptversuch 6.1. Ansatz In der Tabelle 3 werden die Arbeitsschritte für eine Probe und ein Antigen als Modell dargestellt. Tabelle 3: Hauptversuch Arbeitsschritte Cup : : : VBD (µl) : : : Serum (µl) : : : Titration des Serums von 1 nach 10 und von 11 nach 12 (verwerfen von 25µl aus den Cups 10 u. 12) 4. VBD (µl) : : : Antigen (µl) : : : Komplement (µl) : : : abgedeckte Platte 18 bis 24h bei +5 C ±3 C inkubieren und auf Raumtemperatur erwärmen 8. HS (µl) : : : Inkubation 30 bei +37 C ±1 C im Wasserbad oder im Brutschrank in einer feuchten Kammer 6.2. Kontrollen Bei der Durchführung des Hauptversuches sind jeweils folgende Kontrollansätze mitzuführen: a. Kontrolle der antikomplementären Wirkung des Serums (Serumkontrolle), angesetzt in den beiden Anfangsverdünnungen (Cup 11 und 12) Serumverdünnung: VBD: Komplement: HS: 25 µl 25 µl 25 µl 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse b. Kontrollen des Antigens VBD: Antigen: Komplement: HS: 25 µl 25 µl 25 µl 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse c. Kontrollen des Komplements VBD: Komplement: HS: 50 µl 25 µl 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse 289

290 d. Kontrolle des Hämolytischen Systems (HS) VBD: 75 µl HS: 50 µl Bewertung : 0 % Hämolyse e. Positives Kontrollserum Serumverdünnung: Antigen: Komplement: HS: Bewertung: 25 µl 25 µl 25 µl 50 µl definierter Titer ± 1 Titerstufe, bei standardisierten Seren = Berechnungsgrundlage für die Sensibilisierungseinheiten/ml f. Negatives Kontrollserum Serumverdünnung: 25 µl Antigen: 25 µl Komplement: 25 µl HS: 50 µl Bewertung : 100 % Hämolyse (jede Serumverdünnung) 7. Auswertung Bei der Ablesung wird unterschieden: 100 % Hämolysehemmung = 4 (++++) 75 % Hämolysehemmung = 3 (+++) 50 % Hämolysehemmung = 2 (++) 25 % Hämolysehemmung = 1 (+) keine Hämolysehemmung = negativ Titerbeurteilung: Gemäß O.I.E. werden die Titer wie folgt beurteilt: Eine Serumprobe in der Verdünnung von 1:5 mit 100 % Hämolyse ist negativ, mit % Hämolyse ist verdächtig ohne Hämolyse ist positiv. Leider können falsch-positive Ergebnisse auftreten und B. pseudomallei and B. mallei zeigen serologische Kreuzreaktionen. Außerdem können auch gesunde Pferde zeitweise nach einer Malleinisierung serologisch positiv sein. 290

291 Literatur OIE Manual of Standards For Diagnostic Tests and Vaccines, OIE, online-version. Scholz, H. C., M. Joseph, H. Tomaso, S. Al Dahouk, A. Witte, J. Kinne, R.M. Hagen, R. Wernery, U. Wernery und H. Neubauer Detection of the re-emerging agent Burkholderia mallei in a recent outbreak of glanders in the United Arabic Emirates by a newly developed flip-based PCR assay. Diag. Microbiol. Inf. Dis., 54, Tomaso, H., H.C. Scholz, S. Al Dahouk, M. Eickhoff, T.M. Treu, R. Wernery, U. Wernery und H. Neubauer Real-time identification of Burkholderia pseudomallei with a 5' nuclease real-time PCR assays using fluorescent hybridization probes. Clin. Chem., 52,

292 35. Salmonellose der Rinder Charakterisierung der Infektion Erreger Die Salmonellose ist eine durch bakterielle Erreger der Gattung Salmonella (S.) verursachte Infektionserkrankung. Sie tritt sowohl bei Tieren als auch beim Menschen auf und stellt weltweit eine der wichtigsten Zoonosen dar. Salmonellen gehören zur Familie der Enterobacteriaceae, der gramnegative, asporogene, peritrich begeißelte oder unbewegliche Arten angehören. Die Gattung Salmonella besteht aus der Spezies enterica und der Spezies bongori. Die Spezies Salmonella enterica wird in 6 Subspezies eingeteilt: S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae und S. enterica subsp. indica. Nur für Serovaren, die zu S. enterica subsp. enterica gehören, wurde ein Name festgelegt, der auf den Ort der erstmaligen Isolierung zurückzuführen ist. Der Name der Serovar wird mit großem Anfangsbuchstaben und nicht kursiv geschrieben. Der vollständige Name lautet dann z.b. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, als Kurzform wird Salmonella Typhimurium verwendet. Bei Serovaren anderer Subspezies wird nach der Subspezies die entsprechende Antigenformel angegeben. Die Antigenformeln aller Salmonella-Serovaren sind im Kauffmann-White-Schema aufgelistet, zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind mehr als 2500 verschiedene Serovaren enthalten. Die größte Bedeutung für die Salmonellose des Rindes in Deutschland besitzen die Salmonella-Serovaren Typhimurium und Typhimurium variatio copenhagen, die an das Rind adaptierte Serovar Dublin, Salmonella Abony (frühere Nomenklatur Salmonella Abortus-bovis) und Salmonella Enteritidis. Zahlreiche andere Serovaren können auch Salmonellosen bei Rindern verursachen, insgesamt ist ihr Anteil jedoch wesentlich geringer Klinische Symptomatik Salmonellosen der Rinder sind perakut bis chronisch oder symptomlos verlaufende zyklische Infektionskrankheiten, die überwiegend bei Kolostral- und Tränkmilchkälbern, bei Jungrindern aber auch bei Kühen um den Zeitraum des Abkalbens auftreten können. Klinische Symptome sind Durchfall, der blutig sein kann, Lungen- bzw. Gelenkentzündungen sowie Aborte ab 7. Trächtigkeitsmonat. Anhaltende latente Infektionen mit symptomloser intestinaler Besiedelung durch den Erreger sind möglich. Die Inkubationszeit variiert in Abhängigkeit vom Alter der Tiere, der Infektionsdosis und der Salmonella-Serovar zwischen 2 bis 8 Tagen Differentialdiagnostik Auszuschließen sind Kolisepsis und Koliruhr der Kälber, Clostridium-perfringens- Enterotoxämien, Pasteurellose, Rotavirus-Infektion der Saugkälber, Brucellose bei Aborten sowie Futtermittelintoxikationen. In allen Fällen sichern erst der Erregernachweis und der Ausschluss der möglichen anderen Ursachen die Diagnose endgültig Diagnostische Indikation (siehe 6.) Klinischer, pathologisch-anatomischer oder epidemiologisch begründeter Verdacht. 292

293 Zuständige Untersuchungseinrichtungen Staatliche Veterinäruntersuchungseinrichtungen Friedrich-Loeffler-Institut (Nationales Referenzlabor Salmonellose der Rinder) Rechtsgrundlagen Verordnung zum Schutz gegen die Salmonellose der Rinder (Rinder-Salmonellose- Verordnung) in der Fassung der Bek. vom 14. November 1991 (BGBl. I S. 2118) Untersuchungsmaterial Kotproben als Einzel- oder Sammelproben. Organproben von verendeten oder getöteten Tieren (Darminhalt, besonders Dickdarmabschnitte, Leber, Milz, Darmlymphknoten). Zur Abklärung von Eintragsquellen und insbesondere von Ausbreitungswegen sollten auch Umweltproben und Umgebungsproben aus dem Stallbereich (besonders geeignet sind dafür auch Sockentupferproben), Futtermittel, Kot oder Organe von anderen Tierarten (Nutztiere, Haustiere, Nagetiere, Wildvögel) untersucht werden. Zur Untersuchung sollte nur frisch entnommenes Material verwendet werden. Das Untersuchungsmaterial soll in einem sterilen und verschlossenen Probenbehälter transportiert werden. Bei der Entnahme sollen Kreuzkontaminationen vermieden werden. Der Probenbehälter muss so eindeutig beschriftet sein, dass die Herkunft und Identität der Proben jederzeit erkennbar ist. Die Transportdauer, d.h. die Zeit von der Gewinnung des Untersuchungsmaterials bis zum Eingang im mikrobiologischen Laboratorium, soll so kurz wie möglich sein und 48 Stunden nicht überschreiten. In Sonderfällen müssen sich Einsender und Laboratorien über den geeigneten Versand verständigen. Dem Untersuchungsmaterial soll ein schriftlicher, vom Einsender unterschriebener, Untersuchungsauftrag sowie Vorbericht beigefügt sein. Weitere Vorgaben zur Probenentnahme und zum Untersuchungsmaterial sind in den Ausführungshinweisen zur Verordnung zum Schutz gegen die Salmonellose der Rinder vom 1. Februar 1972 (B-21.2) enthalten (Nr. 5.1 bis 5.4 zu 3). 293

294 35.3. Untersuchungsgang Die bakteriologische Untersuchung von Kotproben auf Salmonellen im Rahmen der Rinder-Salmonellose-Bekämpfung soll auf Grundlage der Ausführungshinweise zur Salmonellose-Verordnung zum Schutz gegen die Salmonellose der Rinder vom 1. Februar 1972 (B-21.2, S. 7-15) erfolgen Bakteriologische Untersuchung von Kotproben (schematisch) Die Untersuchung hat grundsätzlich mittels Anreicherung zu erfolgen. Eine Voranreicherung ist nicht vorgeschrieben. Direktausstriche brauchen nur angelegt werden, wenn mit dem Vorkommen anreicherungsempfindlicher Salmonella-Serovaren zu rechnen ist. Als Anreicherungsmedien sind Tetrathionatanreicherungen (Tetrathionat-Brillantgrün- Galle-Bouillon nach Müller-Kauffmann/ Preuß) oder Selenit-Bouillon (nach Leifson) zu verwenden. Die Proben sollen in einem Verhältnis von 1:10 in die Anreicherungsmedien verbracht werden. Die Bebrütung soll bei 37 C über Stunden erfolgen und kann auf 48 Stunden ausgedehnt werden. Die Anreicherungsmedien sind auf je eine Brilliantgrün-Phenolrot-Laktose-Agar- Platte sowie ein weiteres festes Selektivmedium (z. B. Wasserblau-Metachromgelb- Laktose-Agar nach Gaßner, Bromkresolpurpur-Laktose-Agar u. a.) in der Weise auszustreichen, dass Einzelkolonien entstehen. Die Platten sind 18 bis 24 Stunden bei 37 C zu bebrüten; bei schwachem Wachstum ist in Verdachtsfällen die Bebrütung auf 48 Stunden auszudehnen. Ein erneutes Ausstreichen der 48 Stunden bebrüteten Anreicherungskultur kann ebenfalls von Vorteil sein. Von jeder Probe sind salmonellenverdächtige Kolonien mit polyvalenten Salmonella- Antiseren auf ihre Zugehörigkeit zur Salmonella-Gruppe zu untersuchen. Die serologische Untersuchung der isolierten Keime erfolgt mit Salmonella O- und H-Antiseren in der Objektträgeragglutination. Zur Bestimmung der H-Phasen empfiehlt sich die Anzüchtung auf 0,6- bis 0,8-prozentigem Agar. Die Umzüchtung der H-Phasen erfolgt nach dem Sven-Gard-Verfahren mit Schwärmseren. In allen Fällen, in denen durch die serologische Untersuchung der isolierten Keime keine endgültige Bestimmung der Salmonella-Serovar möglich ist, muss zusätzlich eine biochemische Untersuchung vorgenommen werden. Dazu müssen Einzelkolonien gewonnen werden, bei denen insbesondere die Reaktionen gegen Laktose, Harnstoff, Indol, Lysindecarboxylase sowie die Voges-Proskauer-Reaktion bei 22 C und 37 C getestet werden. Zur genaueren biochemischen Differenzierung der Salmonellen und anderer Genera der Familie der Enterobacteriaceen können weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Dazu gehören insbesondere Reaktionen gegen Methylrot, Ammonium-Citrat, Malonat und Dulzit sowie der Test auf Beweglichkeit. Die bakteriologische Untersuchung von anderen Proben auf Salmonellen im Rahmen der Rinder-Salmonellose-Bekämpfung soll ebenfalls auf Grundlage der Ausführungshinweise 294

295 zur Salmonellose-Verordnung zum Schutz gegen die Salmonellose der Rinder vom 1. Februar 1972 (B-21.2, S. 7-15) erfolgen Bakteriologische Untersuchung von anderen Proben (schematisch) Zur Untersuchung von Milch und Harn sind aus den eingesandten Proben nach gründlichem Umschütteln ca. 50 ml zu entnehmen und mit 50 ml doppelt konzentrierter Selenitbrühe zu vermischen. Bei Verwendung von Tetrathionat-Anreicherung sind etwa 20 ml in 180 ml einfach konzentrierte Anreicherungsflüssigkeit zu verbringen. Es empfiehlt sich, von Milch- und Harnproben zusätzlich einen Direktausstrich auf einem festen Differenzierungsnährboden anzulegen. Tränk- und Abwasserproben sind entweder mittels einfacher Papier- und/ oder Membranfilter zu filtrieren oder zu zentrifugieren. Der oder die Filter bzw. das Zentrifugat sind in ca. 50 ml einfach konzentrierte Selenitbouillon oder Tetrathionat-Anreicherung zu geben. Die Untersuchung von Schlammproben ist oftmals ergiebiger als die Untersuchung von Wasserproben. Sie sollten ebenso wie die eingesandten Futtermittelproben vor dem Anlegen gründlich gemischt werden, bevor je Probe etwa 20 bis 25 g in etwa 200 ml einfach konzentrierte Anreicherungsflüssigkeit eingebracht werden. Bei der Untersuchung des o. g. Untersuchungsmaterials bzw. bei Blut-, Sekret-, und Exkretproben ist darauf zu achten, dass auf 10 Teile Anreicherungsmedium nicht mehr als etwa ein Teil Untersuchungsmaterial kommt. Die weiteren Untersuchungsschritte erfolgen analog zu dem Untersuchungsverfahren bei Kotproben Bemerkungen zur Methodik der bakteriologischen Untersuchung Die bakteriologische Untersuchung von Kotproben des Rindes auf Salmonellen soll auf Grundlage der Ausführungshinweise zur Rinder-Salmonellose-Verordnung vom 1. Februar 1972 erfolgen. Ein wesentlicher Unterschied zwischen diesen Ausführungshinweisen und der Standard-Methode ISO 6579 für die Untersuchung von Lebensmitteln besteht darin, dass eine Voranreicherung unter Verwendung von gepuffertem Peptonwasser (BPW) nicht durchgeführt wird, da in Kot- und Umweltproben eine große Menge Begleitflora vorhanden sein kann, die den Nachweis von Salmonellen erschwert. Untersuchungen des EU-Referenzlabors für Salmonellen zur Entwicklung bzw. Verbesserung des bakteriologischen Nachweises von Salmonellen aus Kotproben vom Geflügel haben gezeigt, dass bei Verwendung einer Voranreicherung sehr gute Ergebnisse erzielt werden. Daher erfolgte eine Modifizierung der Methode ISO 6579 in die ISO 6579 Anhang 2, die für die Untersuchung von Probenmaterial tierischen Ursprungs angewandt werden soll. Der wesentliche Unterschied zur Methode ISO 6579 besteht darin, dass die beiden flüssigen Selektivanreicherungsmedien nach einer Voranreicherung (BPW) durch nur das modifizierte, halbfeste Rappaport-Vassiliadis-Medium (MSRV) ersetzt werden. Untersuchungsgang nach ISO 6579 Anhang 2: Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser (18 ±2 Stunden bei 37 C ±1 C) Selektive Anreicherung auf MSRV (2 mal 24 Stunden bei 41,5 C ±1 C) 295

296 Ausstreichen auf XLD (nach ISO 6579 Anhang 2) und zweites Medium nach Wahl Bestätigung nach ISO 6579 Selektivanreicherung: Die Selektivanreicherung mit den Hemmzusätzen unterdrückt das Wachstum der Begleitflora und ermöglicht die Vermehrung der Salmonellen. Die Wahl des flüssigen oder halbflüssigen Selektivmediums ist abhängig von der Menge der zu erwartenden Begleitflora. Bei Kotproben von Rindern muss insbesondere beachtet werden, dass der Hemmstoff Brillantgrün auf die an das Rind adaptierte und dort relativ häufig vorkommende Serovar Dublin toxisch wirkt. Auch bei Verwendung von Rappaport-Vassiliadis- und Tetrathionat-Anreicherungen bei Inkubationstemperaturen von 43 C wird diese Serovar gehemmt. Feste Selektivmedien: Zur Identifizierung der Salmonellen wird die flüssige Selektivanreicherung oder Material von der Schwärmzone (MSRV) auf festen Selektivmedien mit einer Impföse ausgestrichen. Dabei sollten auf einem Teil der Platten Einzelkolonien entstehen. Die Wahl des Agars hängt wesentlich vom Untersuchungsmaterial und daher von der zu erwartenden Begleitflora ab. Neben dem in der Anlage der Rinder-Salmonellose-Verordnung vorgegebenem Brillantgrün-Phenolrot-Laktose-Agar stehen zahlreiche verschiedene Medien als zweites festes Selektivmedium zur Verfügung (Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar [vorgeschrieben nach ISO 6579 Anhang 2], XLT4-Agar, Desoxycholat-Citrat-Lactose-Saccharose- Agar, Rambach-Agar). Die Bebrütung erfolgt bei 37 C für 24 bis 48 Stunden. Differenzierung Salmonella verdächtiger Kulturen: Salmonella-verdächtige Reinkulturen werden serologisch und biochemisch (s. o.) mit kommerziellen Salmonella-Antiseren bzw. kommerziellen Testkits weiter differenziert Molekularbiologische Nachweisverfahren Die konventionellen bakteriologischen Verfahren zum Nachweis von Salmonellen erfordern einen Zeitraum von drei bis vier Tagen. Daher wird versucht schnellere Nachweisverfahren zu entwickeln. Neben mikrobiologischen, immunologischen und physikalischen Verfahren stehen insbesondere molekularbiologische Nachweismethoden im Vordergrund. Dabei hat die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) in den letzten Jahren die größte Bedeutung erlangt und ist mittlerweile eine unverzichtbare Methode zum Nachweis von Salmonellen. Daher ist die Anzahl der veröffentlichten Salmonella-PCR-Methoden sehr hoch. Die Ziel-DNA-Sequenzen sind sehr vielfältig und gestatten entweder den Nachweis des gesamten Genus Salmonella oder den Nachweis bestimmter Salmonella-Gruppen. Zum Nachweis der Gattung Salmonella hat insbesondere das inva-gen als Ziel-DNA eine breite Anwendung gefunden. Die von Rahn et al. (1992) beschriebenen Primer-Sequenzen zum Nachweis der Gattung Salmonella waren Ausgangspunkt für zahlreiche Anwendungen, Modifikationen und Weiterentwicklungen zum PCR-Nachweis von Salmonellen (Rychlik et al., 1999, Malorny et al., 2003). Eigene Untersuchungen Da gegenwärtig keine Untersuchungsergebnisse zum Nachweis von Salmonellen aus Kotproben von Rindern mit der Methodik nach ISO 6579 Anhang 2 verfügbar sind, wurden die Salmonella-Nachweisraten aus Kotproben von Rindern bei festgestellten Ausbrüchen mit und ohne Voranreicherung sowie bei Verwendung unterschiedlicher Medien zur Selektivanreicherung verglichen. Darüber hinaus wurden Kotproben mit Wildstämmen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Dublin sowie mit Salmonella-Impfstämmen (Typhimurium und Dublin) in unterschiedlichen Konzentrationen artifiziell infiziert und in die Vergleiche einbezogen. 296

297 Bei den Kottupfern aus Rinderbeständen war die Salmonella-Nachweisrate nach Voranreicherung in BPW um ca. 20 % höher als nach direkter Anzucht in flüssigen Selektivmedien. Dieser Effekt ist umso größer, je geringer die Salmonella-Konzentration im Kot und je geringer die gewonnene Probenmenge (besonders bei Kottupfern) ist. Die Salmonella-Nachweisraten nach Voranreicherung in BPW und Selektivanreicherung auf MSRV waren höher als nach Voranreicherung in BPW und Selektivanreicherung in Rappaport-Vassiliadis- (RV) oder Müller-Kauffmann-Tetrathionat-Novobiocin-Bouillon (MKTTn). Daher ist MSRV auch bei Kotproben von Rindern ein geeignetes Selektivmedium. Eine direkte Überführung von Kottupfern in flüssiges RV unterdrückt wirksam die Begleitflora, reduziert aber auch die Vermehrungsfähigkeit von Salmonellen. RV-Medium reduziert erheblich die Nachweisraten von Salmonella-Lebendimpfstoffen (LI). Für den Nachweis von Salmonella-Lebendimpfstoffen sollte Tetrathionat- Brilliantgrün-Galle-Anreicherungsbouillon (TBG) verwendet werden. Die verringerten Nachweisraten von Salmonella-Lebendimpfstoffen bei Nutzung von MSRV sind auch auf die geringere (Salmonella-Typhimurium-LI) bzw. fehlende (Salmonella-Dublin-LI) Beweglichkeit dieser Stämme zurückzuführen. Da die Identifizierung der Salmonella-ausscheidenden Tiere und der Nachweis von Salmonellen in Umgebungsproben eine der wichtigsten Voraussetzungen für eine effektive Sanierung des Rinderbestandes sind, sollten die Möglichkeiten einer Modifizierung der gültigen Methodik nach Rinder-Salmonellose-Verordnung, insbesondere die Voranreicherung der Proben in gepuffertem Peptonwasser trotz des Mehraufwandes in Betracht gezogen werden. Literatur Rahn, K., De Grandis, S.A., Clarke, R.C., McEwen, S.A., Galan, J.E., Ginocchio, C., Curtiss III., R., Gyles, C.L. (1992): Amplification of an inva gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cell. Probes 6, Rychlik, I., van Kesteren, L., Cardova, L., Svestkova, A., Martinkova, R., Sisak, F. (1999): Rapid detection of Salmonella in field samples by nested polymerase chain reaction. Letters in Appl. Microbiology, 29, Malorny, B., Hoorfar, J., Hugas, M., Heuvelink, A., Fach, P., Ellerbroek, L., Bunge, C., Dorn, Chr., Helmuth, R. (2003): Interlaboratory diagnostic accuracy of a Salmonella specific PCRbased method. Int. J. of Food Microbiol., 89,

298 36. Schaf- und Ziegenpocken Charakterisierung der Infektion Erreger Schaf- und Ziegenpockenvirus gehören zum Genus Capripoxvirus (CPV) der Familie Poxviridae Klinische Symptomatik Schaf- und Ziegenpocken kommen in Zentral- und Nordafrika, im Nahen und Mittleren Osten sowie in Indien endemisch vor. Bei hoch empfänglichen Schaf- und Ziegenrassen ist die Krankheit geprägt von einem generalisierten Verlauf mit Hautläsionen. Jedoch sind, abhängig vom Virusisolat und der infizierten Tierrasse, milde bis subklinische Verlaufsformen möglich. Bei europäischen Schaf- (z. B. Soay) und Ziegenrassen können subakute Verlaufsformen auftreten, die schon vor der Entwicklung typischer Hautveränderungen (Papeln, verhärtete, knotenförmige Hautschwellungen von 0,5 bis 1 cm Durchmesser) zum Tod führen. Schwere Verlaufsformen sind gekennzeichnet durch hämorrhagische Vesikel, generalisierte Papelbildung, Lymphangitis und Lungenaffektion. Die Ziegenpocken-Stämme infizieren Ziegen und Schafe, obwohl die gravierenderen klinischen Erscheinungen immer beim homologen Wirt auftreten. Rekombinationen zwischen Schaf- und Ziegenpocken kommen vor und können zu einem ausgeglichenen Wirtsspektrum mit gleichem Krankheitsverlauf bei Schaf und Ziege führen. CPV hat das Potential sich auszubreiten und sich in Ländern außerhalb der Hauptverbreitungsgebiete zu etablieren. Europa gilt als frei von CPV, allerdings gab es auch in jüngster Zeit immer wieder Ausbrüche, hauptsächlich in Südosteuropa (Griechenland, Bulgarien) Differentialdiagnostik Alle Hautaffektionen bei Schaf und Ziege, insbesondere aber das Ecthyma contagiosum (Orf, Lippengrind) Diagnostische Indikation Seuchenverdacht Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, Südufer 10, Greifswald, Tel Rechtsgrundlagen Richtlinie 92/119/EWG Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 23. Mai

299 36.2. Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial Erregernachweis Am besten geeignet für die Virusisolierung sind Biopsiematerial aus frischen Hautläsionen und post mortem ebenfalls Hautveränderungen sowie befallene Lymphknoten und Lungengewebe Untersuchungsmaterial Antikörpernachweis Nativblutproben, Serum mind. 500 µl Untersuchungsgang Erregernachweis (NUR DURCH DAS FLI DURCHZUFÜHREN) Virusisolierung Am empfänglichsten für die Virusvermehrung sind primäre (bis max. 8 Passagen) Schaf- oder Ziegenzellen aus Hoden, Lunge und Niere. Die Gewebeverreibungen müssen mit Antibiotika versetzt werden, bei massiver Kontamination kann bei hohem Virusgehalt eine Filtration mit 0,45 µ Filtern empfohlen werden Elektronenmikroskopie Material aus der originalen Gewebesuspension wird kurz zentrifugiert (Beseitigung der groben Gewebetrümmer) und der Überstand wird mit dem negative Stainingverfahren untersucht. Die großen Viruspartikel (290 x 270 nm) sind backsteinförmig mit kurzen, unregelmäßig angeordneten, tubulären Hüllproteinen. Zur Differentialdiagnose wichtig ist das Aussehen der ovoiden, kleineren Parapockenpartikel (250 x 160 nm) mit regelmäßig angeordneten Hüllproteinfilamenten (Wollknäuel-ähnlich) Histologie Histologische Untersuchungen an Formalin-fixiertem Biopsiematerial zeigen an HE gefärbten Präparaten eosinophile Einschlusskörperchen und vakuolierte Zellkerne Immunfluoreszenz An fixierten Gewebeschnitten oder infizierten Zellen ist ein CPV-Nachweis mit Hilfe von Hyperimmunseren leicht möglich Polymerase Kettenreaktion (PCR) Zum Nachweis geringerer Virusmengen in Biopsiematerial wurde eine PCR basierend auf publizierten CPV-Sequenzen (TK-Gen) entwickelt (J. Gen. Virol. 70, (1989), Virology 209, (1995)). Die PCR konnte bislang nur mit Impfstoff-Zellkulturvirus geprüft und optimiert werden. Eine Parapoxvirus (PPV)-DNA differenzierende PCR ist ebenfalls etabliert Antikörpernachweis Zum Nachweis von Schafpocken-Antikörpern wurde am FLI ein SNT etabliert. 299

300 37. Stomatitis vesicularis Charakterisierung der Infektion Erreger Die Stomatitis vesicularis wird durch verschiedene Viren aus der Gruppe der Vesiculoviren der Familie Rhabdoviridae ausgelöst Klinische Symptomatik Es handelt sich um eine fieberhafte Allgemeinerkrankung der Pferde, Rinder und Schweine. Sie führt nach kurzer Inkubationszeit (ca. 1 Tag) zur Bildung von Bläschen (Aphthen) und Erosionen an kutanen Schleimhäuten und unbehaarten Teilen der Haut, insbesondere im Bereich des Maules und der Klauen, die nicht von denen bei der Maul- und Klauenseuche zu unterscheiden sind. Sie kommt nur auf dem amerikanischen Kontinent vor und verläuft meist gutartig, d.h. die Tiere genesen nach 3 bis 5 Tagen. Sie wird durch direkten Kontakt sowie Küchenabfälle und wahrscheinlich durch Insekten übertragen. Als Virusreservoire werden in den USA Wildtiere, Nager und Insekten vermutet. Es wurden Infektionen von Menschen mit grippeähnlichen Symptomen beschrieben Differentialdiagnostik Fieberhafte Allgemeinerkrankungen bei den empfänglichen Tieren, die mit der Bildung von Aphthen und Erosionen an kutanen Schleimhäuten und unbehaarten Teilen der Haut einhergehen, insbesondere Maul- und Klauenseuche und SVD Diagnostische Indikation Seuchenverdacht, Export-/Import-Untersuchungen Zuständige Untersuchungseinrichtung Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, Südufer 10, Greifswald, Tel Rechtsgrundlagen Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der jeweils gültigen Fassung 300

301 37.2. Untersuchungsmaterial Da die Diagnose außer beim Pferd stets als Differentialdiagnose zur Maul- und Klauenseuche gestellt werden muss, sind die für diese Krankheit genannten Proben zu ziehen. Beim Schwein sind ggf. zusätzlich die für die SVD relevanten Proben einzusenden. Der Nachweis von infektiösem VS-Virus (VSV) bzw. VSV-Antigen gelingt am sichersten in Aphthenlymphe sowie Aphthendeckenmaterial frischer Aphthen. Bei deren Fehlen können auch Probangproben oder Rachentupfer von Schweinen eingesandt werden. Außerdem sind Blutproben zur Untersuchung auf Antikörper einzusenden. Die Labordiagnose erfolgt wegen der Differentialdiagnose MKS stets am FLI, Insel Riems. Für die Einsendung gilt sinngemäß das für MKS beschriebene Verfahren Untersuchungsgang (NUR DURCH FLI DURCHZUFÜHREN) Erregernachweis Der Virusnachweis erfolgt in Zellkultur. VSV erzeugt einen CPE in VERO-Zellen, BHK- Zellen sowie IBRS2-Zellen. Der Antigen-ELISA (ELISA-Kit aus dem IAH, Pirbright) kann durchgeführt werden mit Aphthenflüssigkeit, Aphtendecken und Zellkulturüberständen. Er wird in Verdachtsfällen stets mit der Virusanzüchtung kombiniert Antikörpernachweis Der Antikörpernachweis wird mittels Neutralisationstest (NT) geführt und benötigt 3 Tage. 301

302 38. Tollwut Charakterisierung der Infektion Erreger Das Tollwutvirus gehört zur Familie der Rhabdoviridae, Gattung Lyssavirus und dort dem Genotyp 1(Tollwutvirus) an. Das Wirtsspektrum umfasst alle Säugetierarten und den Menschen. Als Hauptreservoire fungieren vor allem Wildtiere wie der Rotfuchs (Europa, Asien), der Polarfuchs (Europa, Asien, Nordamerika), das Stinktier (Nordamerika), der Waschbär (Nordamerika), der Mungo und der Schakal (Afrika), aber auch der Hund (Afrika, Asien). Als tollwutähnliche ('rabies related') Viren der Gattung Lyssavirus gelten die Genotypen 2 bis 6. Für das europäische Fledermausvirus werden die Genotypen EBL1 und EBL2 (European Bat Lyssavirus) unterschieden. Das Wirtsspektrum der European Bat Lyssaviren umfasst derzeit fast ausschließlich insektivore Fledermäuse (Europa). Spill-over Infektionen auf andere terrestrische Tierarten sind bislang sehr selten. Tollwutvirus-Isolate von drei Menschen und einem Steinmarder zeigten allerdings ein für EBL Viren typisches Muster bei der Charakterisierung mit monoklonalen Antikörpern sowie beim Vergleich Nucleoproteinspezifischer RNA-Sequenzen. Ein 1996 in australischen Flughunden isoliertes Virus (Pteropid Bat Virus) wurde als neuer Genotyp eingeordnet. Virus Serotyp Genotyp Wirtsspektrum Verbreitung Lyssavirus I I Wild- & Haustiere, hämatophage und insektenfressende Europa, Amerika, Asien, Afrika Fleder- mäuse (Nord-, Südamerika), Mensch Lagos Bat-Virus II II fruchtfleischfressende Afrika Fledermäuse Mokola-Virus III III Spitzmäuse, Katzen, Afrika Hunde, Mensch Duvenhage IV IV fruchtfleischfressende Afrika Fledermäuse EBL 1* V insektenfressende Fledermäuse Europa EBL 2* VI insektenfressende Fledermäuse Europa ABL** VII Insektenfressende Flughunde, Australien Mensch Legende: EBL = EBL = European Bat Lyssavirus, ABL = Australian Bat Lyssavirus Klinische Symptomatik Die Inkubationszeit variiert zwischen 3 Wochen bis mehreren Monaten. Bei der rasenden Wut zeigen sich folgende klinischen Symptome: Wesensveränderungen, Hypersensibilität, Aggressivität, Paralysen, Lähmungen, Speicheln, Unterkieferlähmung, Erstickungsanfälle, Festliegen. Bei der sogenannten stillen Wut gehen die Anfangssymptome schnell in Lähmungen über, ohne dass dabei Anzeichen von Hypersensibilität und Aggressivität auftreten. Die Tiere leiden unter Krämpfen und Lähmungen. Die Erkrankung führt immer zum Tod. Beim Men- 302

303 schen sind Aerophobie und Hydrophobie prognostisch. Bei Fledermäusen sind hauptsächlich Lähmungen und Orientierungslosigkeit beschrieben worden, aber auch aggressive Wut Differentialdiagnostik Es sind alle ZNS-Erkrankungen insbesondere Aujeszkysche Krankheit, Bornasche Krankheit, Toxoplasmose, Listeriose, Kochsalzvergiftung beim Schwein, Fuchsenzephalitis etc. einzubeziehen. Weitere möglichen Differentialdiagnosen finden sich in Beer, J. Infektionskrankheiten der Haustiere, 1987, Gustav Fischer Verlag Jena, 881 pp Diagnostische Indikation Differentialdiagnostische Abklärung bei Tieren mit zentralnervösen Störungen bei klinischem oder epidemiologisch begründetem Verdacht Anforderungen aus der Humanmedizin, z.b. Tierbisse, Kontakte im In- und Ausland, Verbringen von Tieren in bestimmte Länder, Ein- und Ausfuhr, Begleitung von Surveillance- und Bekämpfungsprogrammen Zuständige Untersuchungseinrichtungen Veterinäruntersuchungsämter der Bundesländer, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit (nationales Referenzzentrum für Tollwut, WHO Collaborating Centre for Rabies Surveillance and Research) Rechtsgrundlagen Tollwutverordnung vom 11. April /258/EG: Entscheidung des Rates vom 20. März 2000 zur Bestimmung eines spezifischen Instituts, das für die Aufstellung der Kriterien für die Normung der serologischen Tests zur Kontrolle der Wirksamkeit der Tollwutimpfstoffe verantwortlich ist Amtsblatt Nr. L 079 vom 30/03/2000 S BERICHTIGUNG FÜR: 2000/258/EG: Entscheidung des Rates vom 20. März 2000 zur Bestimmung eines spezifischen Instituts, das für die Aufstellung der Kriterien für die Normung der serologischen Tests zur Kontrolle der Wirksamkeit der Tollwutimpfstoffe verantwortlich ist Amtsblatt Nr. L 231 vom 13/09/2000 S

304 38.2. Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial Erregernachweis Gehirnmaterial (Ammonshorn, Cerebellum, Pons oder Medulla oblongata); Speicheldrüsen (Parotis) sind nur in Ausnahmefällen zu empfehlen (Fehlen von Gehirnmaterial) und bieten keine ausreichende diagnostische Sicherheit; Menge: ca. 1cm 3 Versand: Tierkörper, bei Organmaterial in 50 % Glycerin (Anlage) o. tiefgefroren (Trockeneis), (detaillierte Angaben in Ausführungshinweisen zur Tollwut- Verordnung vom 22. April 2001). Ca. 1,0 ml Serum; zur Kontrolle von Impfmaßnahmen bei Wildtieren (orale Immunisierung des Fuchses) mindestens 0,5 ml Brusthöhlen- u. Bauchhöhlentranssudat (nicht älter als 3 Tage post mortem) Untersuchungsgang Direkter Erregernachweis Antigennachweis mittels direkter Immunfluoreszenztest (IFT) Herstellung der Präparate Es ist darauf zu achten, dass soweit möglich, jeweils stets ein Gewebestück vom Ammonshorn, Cerebellum sowie Pons oder Medulla oblongata von einem Tier auf einem Objektträger (OT) untersucht wird!! gut Weizenkorn-großes Gewebestück mittels Skalpellspitze oder Pinzette entnehmen und unter leichtem Druck auf fett- und fluoreszenzfreien OT unter mäßigem Druck mehrmals tupfen, so dass ein etwa Pfennig-großes Präparat entsteht (vorgefertigte OT benutzen) Präparate lufttrocknen. Fixieren durch Hitze (1- bis 2-mal leicht durch die offenen Flamme eines Bunsenbrenners ziehen) oder 30 min in -20 C Aceton. Direkte Immunfluoreszenz Färben mit kommerziell erhältlichem FITC-Antitollwut-Konjugat (Gebrauchsverdünnung lt. Hersteller, vorzugsweise hergestellt mit polyklonalen Antikörpern und mit Zusatz von Evans Blue, Konjugate auf der Basis monoklonaler Antikörper können bei atypischen Tollwutvirusvarianten, wie sie in Deutschland nachgewiesen wurden, zu falsch negativen Ergebnissen führen!!) Inkubation lt. Gebrauchsanweisung des Herstellers, OT 2x 5 min mit Tollwut(TW)-Puffer, ph 7,8, bzw. mit dem vom Hersteller empfohlenen Puffer waschen, spülen in Aqua dest., Präparat lufttrocknen, Eindecken der Präparate in isotonischen Phosphatpuffer (IP) -Glycerol (9:1) Fluoreszenzmikroskopie bei mindestens 300-facher Vergrößerung, mäanderförmige Durchmusterung aller drei Gewebeproben. 304

305 Virusisolierung in der Zellkultur Die Virusisolierung in der Zellkultur sollte bei allen IFT-fraglichen Befunden sowie auch bei IFT-negativen Befunden mit humaner Exposition durchgeführt werden. Da die Virusisolierung in der Zellkultur eine gleiche bzw. höhere Sensitivität als der Mausinokulationstest aufweist, sollte dies die Methode der Wahl sein. Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Herstellung einer 20%igen Gehirnsuspension in Anzuchtmedium, 30 min bei 4 C absetzen lassen, zentrifugieren bei UpM für 10 min, Überstand kurzfristig bei 4 C aufbewahren, längere Lagerung bei -70 C, nicht bei -20 C! Zellen (Na42/13) in einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen/ml in Dextran- Gebrauchslösung, 0,5 ml Zellsuspension mit 0,5 ml Überstand mischen. 30 Minuten bei 37 C und 5 % CO 2 inkubieren, dazwischen 2- bis 3-mal die Zellen vorsichtig aufwirbeln, Zellsuspension abzentrifugieren, Zellpellet in 10 ml Anzuchtmedium aufnehmen und 8 ml in Gewebekulturflasche (T25) und 2 ml in 6er bzw. 24er-well-Platte für IFT- Kontrolle aussäen, Inkubation 3-4 Tage bei 37 C und 5 % CO 2, IFT-Kontrolle. Mitführen einer Negativ- und Positivkontrolle. Positive Kontrolle: Zellkultur, beimpft mit positivem Untersuchungsmaterial mit bekanntem Virusgehalt in einer Konzentration, die das Auszählen der fluoreszierenden Zellen bzw. Zellgruppen erlaubt (Sensitivitätskontrolle). Immunfluoreszenztechnik Medium absaugen, 2-mal mit TW-Puffer spülen, 1-mal mit 80%igem Aceton spülen, Fixierung in 80%igem Aceton für 30 min bei 4 o C, trocknen, Lage markieren, Färben mit kommerziell erhältlichem Konjugat, für 30 Minuten bei 37 C in feuchter Kammer, 2-mal mit TW-Puffer spülen, 1-mal mit Aqua bidest. erneute Zugabe von Bidest, 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen, Fluoreszenzmikroskopie bei ca. 300-facher, im Zweifelsfall bei 400-facher Vergrößerung, Auswertung des gesamtem markierten Bereiches Mausinokulationstest Der Mausinokulationstest (MIT) sollte aus Gründen des Tierschutzes in jedem Fall durch die Virusisolierung in der Zellkultur abgelöst werden. Die Virusisolierung in der Zellkultur bietet bei zumindest gleicher Sensitivität entscheidende arbeitstechnische Vorteile. Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Gehirne möglichst steril entnehmen, Herstellung einer 20%igen Gehirnsuspension unter Antibiotikazusatz, 30 min bei 4 C absetzen lassen, zentrifugieren bei UpM für 10 min, Überstand kurzfristig bei 4 C aufbewahren, längere Lagerung bei -70 C, nicht bei -20 C! 305

306 Tiermaterial Saugmäuse (z.b. NMRI) 1 bis 3 Tage alt (hochtragende Muttertiere sollen bis 48 h nach Aufstallung werfen, Wurfgröße i.d.r. 6 bis 12 Saugmäuse pro Muttertier). Applikation bis max. 3 Tage p.p. 0,03 ml pro Saugmaus i.c. nach beschriebener Methodik applizieren, bei wertvollem Untersuchungsmaterial auf 2 gleichstarke Würfe verteilen, separate Boxen je Wurf Applikation mit Tuberkulinspritze mit 1/100 Teilstrichen bzw. Kanülen von 0,5 x 16 mm Nach dem Auftreten von Krankheitssymptomen schmerzloses Töten aller Saugmäuse (Achtung arbeits- und Infektionsschutz!) Spezifitätskontrolle Die Diagnose Tollwut kann beim MIT nicht allein durch die Beobachtung klinischer Symptome gestellt werden! Sie muss durch die Untersuchung der Mäuse in mindestens einem der folgenden Tests ergänzt werden: Antigennachweis mittels direkter Immunfluoreszenz Virusisolierung in der Zellkultur Virustypisierung Die Virustypisierung kann sowohl anhand von Gehirnabklatschpräparaten als auch nach Anzucht in der Zellkultur erfolgen ( bzw ). Die Virustypisierung sollte aufgrund der Bekämpfungsfortschritte bei der Tollwut durch die orale Immunisierung der Füchse vorzugsweise am FLI durchgeführt werden Indirekte Immunfluoreszenz Abklatsch, fixieren 30 min in -20 C oder 4 C Aceton Auftragen von monoklonalen Antikörpern (mak1, mak2, mak4) 60 min bei 37 C in feuchter Kammer inkubieren, 2-mal 5 min mit Tollwut(TW)-Puffer waschen, spülen in Aqua dest., Färben mit kommerziell erhältlichem FITC-Anti-Maus-Konjugat (Gebrauchsverdünnung lt. Hersteller) 60 min bei 37 C in feuchter Kammer inkubieren, 2-mal 5 min mit Tollwut(TW)-Puffer, ph 7,8, bzw. mit dem vom Hersteller empfohlenen Puffer waschen, spülen in Aqua dest., Präparat lufttrocknen, Eindecken der Präparate in isotonischen Phosphatpuffer (IP) -Glycerol (9:1) Fluoreszenzmikroskopie bei mindestens 300-facher Vergrößerung Indirekter Erregernachweis Bei der Tollwut kann der indirekte (serologische) Erregernachweis allein nicht zur Diagnose Tollwut führen. Der Rapid Fluorescence Focus Inhibition Test (RFFIT) ist eine fluoreszenzserologische Methode zur Bestimmung von neutralisieren Antikörpern gegen Tollwut. Der Test wird im Zusammenhang mit der oralen Immunisierung der Füchse gegen Tollwut als eine Methode zur 306

307 Überprüfung des Impferfolges im Rahmen von Impfkampagnen in Fuchspopulationen benutzt. Seren von Füchsen sollten zur Verwendung im RFFIT nicht älter als 3 Tage sein! Der Fluorescence Antibody Virus Neutralization Test (FAVN) ist für die postvakzinale Bestimmung von neutralisierenden Antikörpern im Rahmen prophylaktischer Impfungen von Hunden bzw. Katzen gegen Tollwut bei der Einfuhr in tollwutfreie Länder (z.b. Skandinavien) von der O.I.E. vorgeschlagen RFFIT Ausführung (Kurzfassung): Virusvermehrung aus Masterstockvirus (Laborstamm CVS 11) auf BHK 21 C13 oder BHK 21-BSR/ P5 88-Zellen in Zellkulturflaschen (Dichte Zellen/ml), Virusernte erfolgt, wenn das Virus etwa zu 100 % abgegeben wurde (IFT-Kontrolle), Überstand abgießen, ph-wert auf 7,6 bis 7,8 einstellen, Zentrifugation bei UpM für ca. 10 Minuten, Titration des Arbeitsvirus auf Mikrotiterplatten (Vierfachansatz), Bestimmung des Virustiters nach Kärber, Portionierung zu 0,5 ml, Lagerung bei -80 C (Masterstock). Einstellen der Virusgebrauchsverdünnung auf 40 infizierte Zellen nach vorheriger Bestimmung, Serum von Nativblutproben (keine EDTA-Plasmaproben); Inaktivierung in Serumverdünnung (1:10 in EM) für 30 Minuten bei 56 C im Wasserbad oder Heizblock, Zentrifugation bei 3000 UpM für 10 min, Test- und Referenzseren (kalibriertes Positiv- Negativserum) in log2-schritten in Mikrotiterplatte oder Röhrchen im Doppelansatz weiterverdünnen (50 µl Endvolumen), Zugabe eines äquivalenten Volumens (50µl) der Virusgebrauchsverdünnung, Inkubation für 90 min bei 37 C und 5 % CO 2, Herstellen der Zellsuspension kurz vor Ablauf der Inkubationszeit (1x 10 6 Zellen/ml) in Anzuchtmedium (AZM), Zugabe von 100µl Zellsuspension/well, kurz schütteln. nach vorheriger guter Durchmischung (Plattenschüttler, 5 sec) 10 µl des Virus-Serum- Zell-Gemisches der Mikrotiter- oder Verdünnungsplatte auf die äquivalenten Vertiefungen einer Terasakiplatte übertragen, nach Übertragung einer Verdünnungsreihe erneut schütteln, Virus- und Zellkontrolle mitführen, Platten für 24 Stunden bei 37 C und 5 % CO 2 in einer feuchten Kammer inkubieren. Terasakiplatte 1x vorsichtig mit TW-Puffer spülen, anschließend mit Aceton (80 %) 30 min bei 4 C fixieren, trocknen, Zugabe von 10 µl eines FITC-Antitollwut-Konjugates (Gebrauchsverdünnung lt. Hersteller), 30 bis 60 min in feuchter Kammer inkubieren, anschließend 2-mal mit TW-Puffer und 1-mal mit Aqua dest spülen, fluoreszenzmikroskopische Ablesung des Tests, Bestimmung des nak-titers nach Kärber (Grenzwert > 1:60) oder Umrechnung in internationale Einheiten (Grenzwert > 0,5 IU/ml) 307

308 FAVN Ausführung (detaillierte Beschreibung im O.I.E. Manual of Standards): Virusvermehrung aus Masterstockvirus (Laborstamm CVS 11) auf BHK 21 C13 oder BHK21-BSR/P5 88-Zellen in Zellkulturflaschen (Dichte Zellen/ml), Virusernte erfolgt, wenn das Virus etwa zu 100 % abgegeben wurde (IFT-Kontrolle), Überstand abgießen, ph-wert auf 7,6 bis 7,8 einstellen, Zentrifugation bei UpM für ca. 10 Minuten, Titration des Arbeitsvirus auf Mikrotiterplatten (Vierfachansatz), Bestimmung des Virustiters nach Kärber, Portionierung zu 0,5 ml, Lagerung bei -80 C (Masterstock). Einstellen der Virussuspension auf 100 KID 50 /0,05 ml, Serum von Nativblutproben (keine EDTA-Plasmaproben); Inaktivierung unverdünnt oder in Serumverdünnung (1:3 in Medium, PBS) für 30 Minuten bei 56 C im Wasserbad oder Heizblock, Zentrifugation bei 3000 UpM für 10 min, Test- und Referenzseren (WHO-Standardserum, O.I.E.-Hundeserum, kalibriertes Positiv- Negativserum) in log3-schritten in Mikrotiterplatte im Vierfachansatz weiterverdünnen (50 µl Endvolumen) Zugabe der Virusgebrauchsverdünnung (50µl), Inkubation für 60 min bei 37 C und 5 % CO 2, Herstellen der Zellsuspension kurz vor Ablauf der Inkubationszeit (4x 10 5 Zellen/ml) in Anzuchtmedium, Zugabe von 50µl Zellsuspension/well, kurz schütteln, auf einer Mikrotiterplatte Virus- (Virustitration), Zell-, Positiv- und Negativkontrollen sowie Standardreferenzseren im Vierfachansatz mitführen, Platten für 48 Stunden bei 37 C und 5 % CO 2 inkubieren, Mikrotiterplatte vorsichtig spülen, anschließend mit Aceton (80 %) 30 min bei Raumtemperatur fixieren, trocknen 1 h bei RT, Zugabe von 50 µl eines Tollwut-Konjugates (Gebrauchsverdünnung lt. Hersteller), 30 bis 60 min inkubieren, anschließend 2x mit TW-Puffer und 1x mit Aqua dest spülen, fluoreszenzmikroskopische Ablesung des Tests (alles oder nichts), Bestimmung des nak-titers nach Kärber, Umrechnung in internationale Einheiten (Grenzwert > 0,5 IU/ml) ELISA Anmerkungen: Die bislang kommerziell erhältlichen ELISA-Tests sind ausschließlich für die Anwendung in der Humanmedizin entwickelt worden. Zwar können mit auf Staphylokokkenprotein A basierenden ELISA-Testsystemen in begrenztem Maße auch andere Tierarten auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen das Tollwutglycoprotein untersucht werden, bei bakterieller Kontamination kann es jedoch zu fehlerhaften Ergebnissen kommen. Für die postvakzinale Antikörperbestimmung (Hund, Katze,...) werden ELISA-Ergebnisse international nicht anerkannt. Für epidemiologische Fragestellungen bei Tieren (Begleituntersuchungen zur oralen Fuchsimpfung) stehen derzeit keine ELISA-Tests zur Verfügung. Die Benutzung kommerziell verfügbarer ELISA bedarf für derartige Zwecke vorab einer eingehenden Optimierung (Verwendung von Antispezies-Konjugaten) und Validierung des Testsystems. 308

309 Anlagen Zelllinien: Virusisolierung: Na42/13 (Mausneuroblastomzellen) RFFIT & FAVN: BHK 21 C13 (Baby Hamster kidney) BHK 21-BSR/P5 88 Bezugsquelle: FLI Insel Riems, Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin, Dr. Riebe Medien: Medien Zelllinie BHK 21 C13 (BHK21-BSR/P5 88) Anzuchtmedium: 90 % Dulbecco Eagle MEM w/l-glut. 10 % Fetales Kälberserum (FKS) 1 % Antibiotika Antibiotika: Amphotericin B (250 µg/ml) Penicillin ( IE/l), Streptomycin (100 mg/l) oder Gentamycin (50 mg/ml) Erhaltungsmedium: 98 % Dulbecco Eagle MEM w/l-glut. 1 % FKS 1 % Antibiotika Medien Zelllinie Na 42/13: Anzuchtmedium: 90 % Eagle MEM mit Earle s Salts 10 % Fetales Kälberserum (FKS) 1 % Antibiotika Antibiotika: Penicillin ( IE/l), Streptomycin (100 mg/l) oder 50 mg/l Gentamycin 309

310 Erhaltungsmedium: 98 % Eagle MEM mit Earle s Salts 1 % FKS 1 % Antibiotika Puffer, Lösungen, Reagenzien Dextran- 0,50 g DEAE-Dextran in 100 ml PBS (Hanks) lösen, sterilfiltrieren, Stammlösung: ca. 4 Wochen bei 4 C haltbar Dextran- 0,2 ml Dextr.-SL in 25 ml AZM Gebrauchslösung: Tollwut-Puffer: 1,72 g Na2HPO4 x 2 H 2 O + 0,50 g KH 2 PO 4 + 7,20 g NaCl ad ml Bidest, ph 7,8 PBS (Hanks ): 9,86 g Hanks + 0,35g NaHCO 3 ad ml Bidest, ph 7,2 Isotonischer Phosphatpuffer: 8,28g NaCl + 3,30g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 0 ad ml Bidest (IP) ph 7,8 IP-Glycerol: IP - Glycerol = 9 : 1 Anti- Centocor fitc anti-rabies [Centocor, Inc.(monoklonal-mix)] Tollwutkonjugate: Anti-Tollwut-Serum [Behring (polyklonal)] Anti-Tollwut [SIFIN (polyklonal)] Anti-Tollwut-FITC [Bioveta (polyklonal)] Diagnostic Pasteur mak1, 2, 4 über die BFAV zu beziehen 310

311 39. TSE bei kleinen Wiederkäuern Charakterisierung der Infektion Erreger Scrapie ist eine infektiöse neurodegenerative Erkrankung der Schafe. Sie wurde erstmals in England 1732 beschrieben und ist heute vermutlich weltweit verbreitet, lediglich Australien und Neuseeland gelten als Scrapie frei. Bei Ziegen sind ebenfalls Fälle von Scrapie bekannt. Ätiologisch wird sie der Gruppe der TSE/Prionenerkrankungen zugeordnet, die durch Ablagerungen des pathologischen Prion-Proteins im Zentralen Nervensystem erkrankter Tiere gekennzeichnet ist. Neben der klassischen Scrapie sind zudem atypische Scrapiefälle bekannt die vorwiegend Einzeltiere mit geringer genetischer Scrapie-Empfänglichkeit betrifft Klinische Symptomatik (Schafe, Ziegen) Klinische Symptome von Scrapie sind zu Beginn neurologische Veränderungen (verändertes Verhalten in der Herde, Angsterscheinungen, Hypermotorik), die im späteren Krankheitsverlauf zu Bewegungskoordinationsstörungen (Ataxie, stelziger Gang = Traberkrankheit) und Sensibilitätsstörungen (Pruritus, scrapie; engl. to scrapie= scheuern) führen. Das Scheuern aufgrund von Pruritus (Juckreiz) führt zu einem Verlust der Wolle und kann Hautabschürfungen verursachen. Ein feinschlägiger Tremor, Krampfanfälle und Blindheit können auftreten. In späteren Krankheitsstadien kommt es häufig zu einem Konditionsverlust. Der Krankheitsverlauf von Scrapie kann eine Woche bis mehrere Monate dauern. Die Scrapie-Erkrankung bei den kleinen Wiederkäuern entwickelt sich anfangs schleichend und unauffällig und kann bei oberflächlicher Betrachtung übersehen werden. Deshalb kann schon die kleinste Veränderung (s. o.) ein Hinweis auf eine sich entwickelnde Scrapie sein. Selbst im fortgeschrittenen Erkrankungsstadium sind oft nur einzelne Veränderungen und nur äußerst selten alle Symptome gleichzeitig bemerkbar Differentialdiagnosen: Als Differentialdiagnosen kommen in Betracht: bakterielle oder virale Infektionen des zentralen Nervensystems z.b. Listeriose, Bornasche Krankheit, Aujeszkysche Krankheit, Tollwut, Visna raumfordernde Prozesse im Zentralen Nervensystem z.b. Tumore, Parasiten (Coenurus), Abszesse Stoffwechselstörungen z.b. CCN, Hypomagnesämie, Hypokalzämie, Kupfermangel, Hepatoenzephalopathie Hautkrankheiten z.b. Räude, Ektoparasiten 311

312 TSE-Überwachung bei kleinen Wiederkäuern Die TSE-Überwachungsmaßnahmen umfassen die A B C amtliche Untersuchung aller über 18 Monate alten normalgeschlachteten kleinen Wiederkäuer mittels TSE-Schnelltest, ( Active surveillance ) Stichprobenartige Schnelltest-Untersuchungen bei über 18 Monate alten verendeten oder aus besonderem Anlass geschlachteten kleinen Wiederkäuer sowie von Tieren, die im Falle der amtlichen Feststellung der TSE bei einem kleinen Wiederkäuer sowie zum Zwecke der Bekämpfung anderer Tierseuchen, mit Ausnahme von epidemisch verlaufenden Tierseuchen, getötet worden sind, ( Active surveillance ) Abklärung klinischer Verdachtsfälle mittels OIE-Methoden ( Passive surveillance ) Ad A) und B) Zur Untersuchung kleiner Wiederkäuer dürfen nur solche Tests verwendet werden, die für die Untersuchung dieser Spezies zugelassen sind ( html?&no_cache=1). Je nach Schnelltest müssen gemäß der Gebrauchsinformation hierbei nur eine Probe aus dem Obexbereich oder zusätzlich eine Probe aus dem Kleinhirn untersucht werden. Wird bei der TSE-Schnelltest-Untersuchung entsprechend den Vorgaben der zugelassenen Gebrauchsanleitung ein reaktives Ergebnis festgestellt, so wird die Probe direkt zum NRL für BSE und Scrapie am FLI zur abschließenden Abklärung versandt. Ad C) Die Abklärung eines ausgesprochenen klinischen Verdachtsfalles darf ausschließlich mittels OIE-Methoden durchgeführt werden, d.h. nur ein negatives Ergebnis mit diesen Methoden im NRL kann einen klinischen Verdacht ausräumen. Um die umfangreiche Asservation von Proben (siehe Untersuchungsmaterial) sicherzustellen sollte das FLI in solchen Fällen frühzeitig benachrichtigt werden, so dass eine Überweisung des Tieres von den betroffenen Veterinärämtern/Landesuntersuchungsämtern durchgeführt werden kann. Alternativ ist auch eine Sektion vor Ort mit Unterstützung eines Mitarbeiters des FLI möglich. Sollten diese Maßnahmen nicht möglich sein, ist eine initiale Bewertung des klinischen Verdachtsfalles durch die Untersuchung mittels eines zugelassen TSE-Schnelltests in einer staatlichen Untersuchungsstelle durchführbar. Die Untersuchungsstelle hat das BMELV und das NRL am FLI bundeseinheitlich nach einem vorgegebenen Meldesystem (siehe Untersuchungsmaterial) über das Ergebnis der jeweiligen Untersuchungen zu informieren. Abschließende Falldefinition für TSE bei kleinen Wiederkäuern Ein TSE-Verdacht bei kleinen Wiederkäuern wird auf Grund klinischer Symptomatik oder eines in der Wiederholungsuntersuchung reaktiven Ergebnisses in einem der national und von der EU zugelassenen TSE-Schnelltests geäußert. Ein TSE-Fall ist nach Erhalt eines den Verdacht bestätigenden Befundes aus dem nationalen TSE-Referenzlabor am FLI festzustellen und in TSN einzustellen. 312

313 Zuständige Untersuchungseinrichtungen TSE-Untersuchungen bei kleinen Wiederkäuern werden ausschließlich durch die staatlichen Untersuchungsstellen durchgeführt. Bestätigungsuntersuchungen müssen durch das nationale Referenzlabor am FLI durchgeführt werden. Dies gilt für alle bei Tieren auftretenden TSE Erkrankungen (z.b. auch CWD, FSE) Rechtsgrundlagen EU: Anhang X der VO (EG) 999/2001 und alle Änderungen National: TSE Überwachungsverordnung Internationales Tierseuchenamt (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008) Untersuchungsmaterial Probennahme Probennahme und Beprobung erfolgen entsprechend Anhang X, Kapitel C der VO (EG) 999/2001 sowie den Vorgaben des Internationalen Tierseuchenamtes (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008) Entnahme des Hirnstammes Der Gehirnstamm ist durch Amtstierärzte, amtliche Tierärzte und Fleischkontrolleure oder durch eingewiesene Probenehmer unter direkter Aufsicht des amtlichen Tierarztes zu entnehmen. Die Proben sollten so frisch wie möglich sein und unverzüglich nach dem Tod des Tieres entnommen werden, um die fortschreitende Autolyse des Gewebes zu verhindern. Zur Entnahme des Hirnmaterials ist folgende Methode bekannt: Entnahmelöffel (scharfer Löffel) Methode ist eine geeignete Technik zur Entnahme von Hirnproben. Die Entnahme hat mit einem Entnahmelöffel durch das Foramen magnum zu erfolgen. Dabei hat die Entnahme so zu erfolgen, dass neben dem Hirnstamm (Obexregion) auch eine Probe aus dem Kleinhirn gewonnen wird. Spezielle gebogene Entnahmelöffel sind kommerziell erhältlich. Die Gehirnproben sind unversehrt in das mit der Untersuchung befasste Labor zu senden. Dort werden die für den jeweils verwendeten Test notwendigen Proben genommen und der Probenrest bis zum Abschluss der Untersuchung bei +4 C gelagert Probennahme im Rahmen der Schnelltestuntersuchungen Unabhängig von ihrem Zustand ist im Rahmen der aktiven Überwachung prinzipiell jede Probe mittels Schnelltest zu untersuchen. 313

314 Soweit es der Gewebezustand zulässt, ist dabei das Material aus der Obex-Region des Hirnstammes (Abb. 1 und 2) sowie, je nach angewandtem Testverfahren, zusätzlich aus dem Kleinhirn zu entnehmen. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit nicht nur frühe, präklinische Stadien sondern auch atypische Scrapie nachweisen zu können. Andere Hirnregionen und/oder das Rückenmark dürfen im Rahmen der Schnelltestuntersuchungen unter keinen Umständen verwendet werden. Ist die Obex-Region wegen fortgeschrittener Autolyse und Fäulnis des Gewebes nicht mehr auffindbar, muss in jedem Fall eine möglichst repräsentative Probe des Hirnstammes sowie des Kleinhirns entnommen werden. In solchen Fällen ist ein positives Ergebnis gültig. Ein negatives Ergebnis hingegen kann nur unter Vorbehalt verwendet werden. Vorgehensweise: Es sollte eine würfelförmige Gewebeprobe unilateral im Bereich des Obex sowie, je nach angewandten Testverfahren, aus dem Kleinhirn, unter Schonung der Gegenseite (Abb. 2), vorzugsweise mittels eines Skalpells entnommen werden; alternativ kann die Probe auch mittels spezieller Entnahmetechniken (Entnahmespritze o.ä.) gewonnen werden; näheres hierzu regeln die jeweils amtlich zugelassenen Gebrauchsanweisungen der TSE-Schnelltests. zusätzliche Kleinhirnprobe Probennahme für TSE-Schnelltest Abb. 1: Medianschnitt durch das Gehirn (nach Budras und Wünsche) 314

315 Entnahmestelle für Histopathologie/Immunhistologie (Formalinprobe des Stammhirns) Obex; Lokalisation für Schnelltestung zusätzliche Kleinhirnprobe: als Nativmaterial und Formalinprobe Medulla oblongata Reste des Kleinhirns Mittelhirn Abb. 2: Stammhirn von dorsal nach Abtragung des Kleinhirns Probennahme nach einem reaktiven Schnelltestergebnis (TSE-Verdacht) Reaktive TSE-Schnelltest-Ergebnisse führen zur weitergehenden Abklärung durch das nationale Referenzlabor am INNT des FLI, Insel Riems. Einzelheiten zum Versand der Proben siehe Kap. 3. Einsendungen an das NRL müssen telefonisch vorangemeldet werden. Zur Ankündigung der Einsendung ist zudem das FAX-Formular gemäß Anhang zu verwenden. Zur Untersuchung sind alle Vorergebnisse (Filme, ELISA-Werte der Probe - einschließlich des jeweiligen Cutoffs), sowie alle zur Verfügung stehenden Proben (auch Gewebeblöcke für die Histologie) einschließlich der Reste der ersten Homogenate einzusenden. Weiterhin sollte eine vollständige, transversale Scheibe (ca. 5 mm) aus der Region direkt kranial des Obex sowie eine Scheibe aus dem Kleinhirn entnommen werden (Abb. 2). Diese dienen der späteren histopathologischen sowie immunhistologischen Untersuchung. Um einerseits die Diagnostik beeinträchtigende morphologische Verluste zu vermeiden und andererseits eine schnellstmögliche diagnostische Untersuchung zu gewährleisten, sollten diese Proben unabhängig vom Autolysegrad bereits im Schnelltestlabor in neutral gepuffertes Formalin (4 %) fixiert werden. Ein Einfrieren des für die histomorphologische Untersuchung gedachten Gewebes sollte unbedingt vermieden werden. 315