Nachweis versteckter Allergene und Strategien zur Risikominimierung

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1 Nachweis versteckter Allergene und Strategien zur Risikominimierung Stefan Vieths Paul-Ehrlich-Institut Abteilung Allergologie

2 Das Team Paul-Ehrlich-Institut: Martin Röder Annabella Janise Oliver Stephan Dr Thomas Holzhauser Projektbegleitender Ausschuss DrAnja Ibach Fr Iris Baltruweit Herr Helwig Gruyters Dr Markus Straubinger Dr Ingo Mücke Prof Dr Reinhard Matissek Fr Sabine Brandherm Bundesverband der deutschen Süßwarenindustrie ev Fachsparte Feine Backwaren (BDSI) Fr Beate Olzem Zentralfachschule der deutschen Süßwarenwirtschaft ev Dr Carola Suwelack Gefördert mit Mitteln im Rahmen der industriellen Gemeinschaftsforschung (BMWA /AiF N / Forschungskreis der Ernährungsindustrie ev)

deutschen Süßwarenindustrie ev Fachsparte Feine Backwaren (BDSI) Fr Beate Olzem Zentralfachschule der deutschen Süßwarenwirtschaft ev Dr

3 Versteckte Allergene in Lebensmitteln Lebensmittelallergie und versteckte Allergene Analytik Modelluntersuchungen und Untersuchungen in Lebensmittelbetrieben Schlussfolgerung und Ausblick

4 Allergie Betrifft ca 25 % der Bevölkerung in Industrieländern Sozio-Ökonomische Kosten in der EU geschätzt auf auf 29 Mrd pa Weissbuch Allergie in Deutschland 2004

5 Mechanismus allergen Sensibiliserung: Prozessierung des Allergens Stimulation von T Zellen Auslösung: Kreuzvernetzung von von IgE IgEauf Mastzell- Rezeptoren modification APC MHCII CD3 TCR TH0 CD4+ TH1 T reg? IL-2 IFNγ B cell IgE Mast cell Fc ε RI B7 CD28 TH2 IL-4, IL-13 mediator release

Mastzell- Rezeptoren modification APC MHCII CD3 TCR TH0 CD4+ TH1 T reg?

6 Häufigkeit der Lebensmittelallergie Kinder: 8 % Erwachsene: 4 % Birkenpollenallergiker: ~ 50-70%

7 Anaphylaxie durch Lebensmittel Lebensbedrohliche, generalisierte Überempfindlichkeitsreaktion 150 Todesfälle pa geschätzt für USA 29,000 Fälle anaphylaktischer Reaktionen pa Bock et al, JACI 2001

8 Symptome der Lebensmittelallergie Haut Atemwege Gastrointestinal Kreislauf 60 % 40 % 60 % (20 %) 10 % Jäger und Wüthrich, 2002

9 Lebensmittelallergie ist dosisabhängig Cumulative proportion of responses Log (threshold dose (mg)) Subjektive Symptome nach Lebensmittelprovokation mit Soja (Ballmer-Weber et al JACI 2007)

2 3 4 5 6 Log (threshold dose (mg)) Subjektive Symptome nach

10 Lowest Provoking Dose Milde Reaktion Systemische Reaktion 02mg 05mg 10mg 50mg 50mg 100mg 400mg 1 Erdnusskern in 2000 Tafeln Schokolade Nachweis von < 0001% im Lebensmittel

11 Wieviel Allergen ist zuviel? Einschätzung der AG Nahrungsmittelallergie der Deutschen Gesellschaft für Allergologie und klinische Immunologie (DGAKI): Unterschreiten von 1-10 mg Protein aus allergenem Lebensmittel pro kg Gesamt-LM Wird die große Mehrzahl der Allergiker vor schweren Reaktionen schützen Vieths et al Allergo J 2006

Allergologie und klinische Immunologie (DGAKI): Unterschreiten von 1-10 mg Protein

12 Diskrepanz zwischen Kennzeichnung und Anwesenheit von Allergenen Milchschokolade mit Karamel: Karamel, Milchschokolade Kann Nussspuren enthalten Analytik: Haselnuss/Erdnuss nicht nachweisbar Mandel-Nougat Creme: Zucker, Pflanzenöl, Mandel, Kakaopulver, Laktose, Trockenmilchpulver, Lezithin, Vanillin Analytik: ~1 % Haselnuss

Haselnuss/Erdnuss nicht nachweisbar Mandel-Nougat Creme: Zucker, Pflanzenöl,

13 Deklarationspflicht für allergene Zutaten Glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel)* Krebstiere* Eier* Fisch* Erdnüsse* Soja* Milch Schalenfrüchte (Mandel, Haselnuss, Walnuss, Kaschunuss, Pecannuss, Paranuss, Pistazie, Macadamianuss, Queenslandnuss)* Sellerie* Senf* Sesam* Lupine* Weichtiere* *und Erzeugnisse daraus (sowie Schwefeldioxid und Sulfite >10 ppm) Anhang IIIa: EU-Richtlinie 2003/89/EG zur Änderung 2000/13/EG und 2006/142/EG

Paranuss, Pistazie, Macadamianuss, Queenslandnuss)* Sellerie* Senf* Sesam* Lupine* Weichtiere* *und Erzeugnisse

14 Notwendigkeit des Allergennachweises in Lebensmitteln Überprüfung der Kennzeichnung Nachweis von unbeabsichtigten Einträgen (Cross-Contact, Rohstoffe) QM: Entwicklung und Überwachung von Allergen Management Plänen

unbeabsichtigten Einträgen (Cross-Contact, Rohstoffe)

15 Versteckte Allergene in Lebensmitteln Lebensmittelallergie und versteckte Allergene Analytik Modelluntersuchungen und Untersuchungen in Lebensmittelbetrieben Schlussfolgerung und Ausblick

16 Spurenanalytik versteckter Allergene PROTEIN-Nachweis Immunologische Methoden Proteomics DNA-Nachweis Polymerase Kettenreaktion (PCR) Stephan & Vieths, J Agric Food Chem 2004, 52: Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 2002, 50: Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 1999, 47: Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 1999, 47:

3754-3760 Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 2002, 50:5808-5815 Holzhauser & Vieths, J

17 Immunologische Methoden: Sandwich ELISA P S T Antigen Allergen Microtiter plateformat Lateral flow OD OD Log Conc log [Antigen] Dipstick-format

18 Dipstick-Test zum Nachweis von Erdnuss Roasted at 140 C Roasted at 160 C % Peanut in chocolate min: min: raw nuts 1- China 2- China/Jumbo 3- Nicaragua (Leon) 4- US Giant 5- US(New Orleans)/Virginia 6- US (Virginia)/Jumbo 7- US (Virginia)/Giant No % % % Stephan et al, Eur Food Res Technol 2002, 215:

3- Nicaragua (Leon) 4- US Giant 5- US(New Orleans)/Virginia 6- US (Virginia)/Jumbo 7- US

19 Methode: Enzyme-linked Immunosorbent Assay P S T OD OD Antigen Allergen ERDNUSS: Hefle et al, J Food Protection 1994; 57: Koppelman et al, World of Ingredients 1996; 19:35-8 Yeung & Collins; Food Composition and Additives 1996; JAOAC 79: Holzhauser & Vieths; J Agric Food Chem 1999; 47: HASELNUSS: Holzhauser & Vieths, J Agric Food Chem 1999; 47: Koppelman et al, J Immunol Methods 1999; 229: MANDEL: Hlywka et al, J Food Protection 2000; 63:252-7 EI: Yeung et al, JAOAC 2000; 83: MILCH, SOJA, LUPINE, ZEREALIEN, CRUSTACEEN, NÜSSE, diverse Log Konz log [Antigen] Eigenschaften: LOD < 10 ppm quantitativ schnell HTP-Technologie standardisierbar für Routine geeignet

Food Chem 1999; 47:4209-18 Koppelman et al, J Immunol Methods 1999; 229:107-20 MANDEL: Hlywka et al, J Food Protection 2000; 63:252-7 EI: Yeung et al, JAOAC 2000; 83:139-43

20 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 1 DNA-Extraktion 2 PCR Amplifikation 3 Detektion Agarosegel 40 cycles copies PCR-ELISA real-time PCR Sequenzverifizierung des Amplifikats erforderlich DIN 2001; CEN 2002; pren ISO 21569

copies PCR-ELISA real-time PCR Sequenzverifizierung des

21 DNA-Sequenz des Hauptallergens Cor a aus Haselnuss rcor a 10401: 483 bp 160 AA (ohne Met) berechneter pi 6,1 berechn MW 17,45 kda (Lüttkopf et al, 2002) Intron: Codon 62 5' ag:gt-ag:gc 3'' (Hoffmann-Sommergruber et al, 1997) (Lüttkopf et al, Mol Immunol 2002)

22 Prinzip eines PCR-ELISA A) Binding of Product B) Denaturing biotinylated PCR products Streptavidin DNA single strand bound to solid phase ELISA-well ELISA-well C) Hybridization D) Color reaction Sequence specific probe Enzymeantibodyconjugate substrate ELISA-well ELISA-well

23 Haselnuss: Vergleich von PCR-ELISA mit Protein Sandwich ELISA Accuracy Samples Detected total PCR-ELISA Protein-ELISA Mg/kg protein DNA/protein >1000 7/ / /8 + <10 (n=8) 7/6 + 0 positive negative Samples with/without Hazelnut Positiv: 27 Lebensmittel mit > 4 mg/kg Haselnuss Negativ: 14 Lebensmittel ohne Haselnuss Holzhauser et al J Agric Food Chem 2002, 50:

24 Erdnuss: Vergleich von Real-Time PCR mit Sandwich- ELISA Stephan and Vieths, J Agric Food Chem 2004, 52:

25 Schlussfolgerung Sicherer Allergennachweis im Spurenbereich ist möglich Sowohl Protein- als auch DNA-basierte Methoden einsetzbar Dringende Notwendigkeit für Standardisierung und Entwicklung allergener Referenzmaterialien Regelung für allergene Kontaminationen notwendig

26 Versteckte Allergene in Lebensmitteln Lebensmittelallergie und versteckte Allergene Analytik Modelluntersuchungen und Untersuchungen in Lebensmittelbetrieben Schlussfolgerung und Ausblick

27 Erfassung und Management von unbeabsichtigten Einträgen von allergenen Lebensmitteln am Beispiel Feiner Backwaren Forschungskreis der Ernährungsindustrie AiF-FV 14362N

28 Modelluntersuchungen im Technikum Industrielle Ausstattung im Kleinmaßstab verfügbar Überprüfung des Haselnusseintrags durch verschiedene Gerätschaften Untersuchung verschiedener Reinigungsverfahren Separate Untersuchungen für gemahlene und stückige Haselnüsse Produkt mit 10 % Haselnuss gefolgt von Produkt ohne Haselnuss

29 Reinigungsprozeduren 1 Mechanisches Auskratzen als übliche industrielle Prozedur 2 Auskratzen plus Heißwasserreinigung 3 Auskratzen plus Heißwasserreinigung plus Spülen 4 3 mit zusätzlicher Verwendung von Detergens 5 Worst case Keine Reinigung Insgesamt >1500 Proben genommen und mittels Haselnuss-spezifischem ELISA analysiert

30 Zusammenfassung (gemahlene Haselnuss) Untersuchtes Gerät Kneter Schnitt- und Formmaschinen Stahlbandofen Reinigungsprotokoll Ohne Reinigung Auskratzen Auskratzen plus Heißwasser Auskratzen plus Heißwasser plus Detergenz Auskratzen Auskratzen plus Heißwasser Auskratzen Auskratzen plus Heißwasser Haselnussprotein im Folgeprodukt (mg/kg) < 1-2 < < 1-3 < Nachweisgrenze < Nachweisgrenze

31 Reduziert Erhitzung die Detektion von Haselnuss? baking test 10% HN dough mg/kg hazelnut protein before baking after baking 10% hn-dough

32 Schlussfolgerungen Allergeneintrag durch Kreuzkontakt stellt ein Risiko für allergische Verbraucher dar Die übliche industrielle Reinigungspraxis ist nicht effizient genug um empfindliche Allergiker zu schützen Einfaches Auskratzen kombiniert mit Heißwasserreinigung genügt um Kontaminationen in den Bereich von 1mg/kg Haselnussprotein zu reduzieren Stückige Haselnussanteile können mit den angewandten Methoden nicht erfasst werden Keine Kontamination durch Staub detektierbar Sehr gute Übereinstimmung zwischen Technikum und Betrieb

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