Tumorzell-Diagnostik aus dem Blut. Prof. Dr. Rainer Schobert (Universität Bayreuth) und Dr. Stefan Schuster (SIMFO GmbH)
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- Friedrich Zimmermann
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1 Tumorzell-Diagnostik aus dem Blut Prof. Dr. Rainer Schobert (Universität Bayreuth) und Dr. Stefan Schuster (SIMFO GmbH)
2 Problem in der Onkologie: Heterogenität der Erkrankung
3 Grundlagen der Tumorzell Diagnostik
4 Metastasenbildung durch zirkulierende Tumorzellen!! Karzinome sind epithelialen Ursprungs!! Karzinome setzen epitheliale Zellen frei! CETCs (circulating epithelial tumor cells)
5 Maintrac!!! Mikroskopbasierte, semiautomatische Detektion!! Bei jedem soliden Tumor Nicht bei Leukämien oder Lymphomen Bis Beginn 2016 über Tests in Bayreuth 650 Patienten in klinischen Studien
6 Maintrac Fluorochrommarkierte Antikörper (FITC) Keine Fixierung Keine Isolierung Keine Extraktion Die Flüssigbiopsie erlaubt eine quantitative Detektion lebender zirkulierender epithelialer Tumorzellen Oberflächenantigen HEA Zirkulierende epitheliale Tumorzelle
7 Blutprobe Färbung mit fluoreszierendem Antikörper Maintrac Mikroskopie!Keine Selektion!Keine Extraktion Quantitative Bestimmung lebender Zellen Verlauf der Zellzahl EpCAM Antikörper Mikroskopische Identifikation lebender Zellen
8 Zellgalerie eines Patienten
9 Anwendung im Patienten
10
11 Beispiel: Brustkrebspatientin
12 Charakterisierung EpCAM positive Zellen mit einem mehrfach vorhandenen (amplifizierten) Signal des Her2/neu Gens (FISH-Technik)!! Estrogenrezeptor!! Androgenrezeptor!! Progesteronrezeptor!! PSA/PSMA!! Ki67!! FISH EGFR!!!
13 Ovarialkarzinom Patientin
14 CETC als Erfolgsparameter, prognostischer und prädiktiver Marker für personalisierte Therapieentscheidungen!! Echtzeitkontrolle der Tumoraktivität durch eine Blutprobe von 15 ml!! Quantitative Erfassung der CETC!! Nicht-invasives Verfahren!! Höchste Sensitivität auch bei Patienten mit Primärtumor!! Verlaufs- und Erfolgskontrolle während der Tumortherapie!! Charakterisierung therapierelevanter Tumoreigenschaften!! Langzeitüberwachung auch 10 Jahre nach einer Krebsdiagnose
15 Welche Zellen können sich nun vermehren?
16 Kultivierung zirkulierender Tumorzellen Tumorsphäroide (Tumorstammzellen)
17 Sphäroid Wachstum CETC 7 Tage 14 Tage 21 Tage Der Test gibt Hinweise auf das Vorhandensein von vermehrungsfähigen Stammzellen im Blut Pizon et al Oncotarget 2016
18 Tumorsphäroide exprimieren typische Stammzellmarker FITC-EpCAM PE-CD 44 merge! Nur eine kleine Gruppe von CETC kann Tumorsphäroide bilden FITC-EpCAM PE-CD 24 merge! CD44 + /CD24 -/low / EpCAM + - typisch für Brustkrebsstammzellen ALDH1 Control ALDH Test Pizon et al Oncotarget 2016
19 Zahl der Sphäroide korreliert signifikant mit der Aggressivität Pizon et al Oncotarget 2016
20 Was suchten wir:!! Ein System das schnell Aussagen über das Wachstum zulässt (u.a. Invasivität)!! Ein System das die Testung von Substanzen zulässt (auch nicht direkt toxische Substanzen)!! Ein System das keinen Tierversuch darstellt
21 Arbeitsgemeinschaft Transfusionsmedizinisches Zentrum Bayreuth TZB SIMFO Spezielle Immunologie Forschung + Entwicklung GmbH & Labor Dr. Pachmann Dr. rer. nat. Stefan Schuster sschuster@simfo.de Kurpromenade Bayreuth Germany
22 PROF DR RAINER SCHOBERT LEHRSTUHL FÜR ORGANISCHE CHEMIE Naturstoffsynthese! und! Wirkstoffentwicklung!
23 Antibiotika!!!! Antitumorale!!!! Antimykotika! Penicillenol C 1! Pestalotioprolid A! Illudin M! Schisantherin A! Aurantosid G!
24 Wirkstoff-Optimierung! Naturstoff!!!! Synthetisches Derivat! Combretastatin A-4!!!!! Patent EP B1! "! vaskulär-disruptiv und cytotoxisch! "! tumorspezifisch! "! stabil, wasserlöslich! "! gut verträglich! "! oral verfügbar Combretum caffrum
25 Biologische / Präklinische Tests! "! Aktivitätstests an Bakterien und Krebszellen!!!!!!! "! Biochemische Assays (Targetfindung, Wirkmechanismen)! "! in vivo Maustests (extern)
26 CAM-Test!
27 Die Chorioallantois-Membran!
28 Test vaskulär-disruptiver Substanzen! (CAM-Test 1.0)!
29 Test vaskulär-disruptiver Substanzen! (CAM-Test 1.0)!
30 Gemeinschaftsprojekt! CAM Assay Innovatives Kit zur Kultivierung menschlicher Tumorzellen aus dem Blut für prognostische Zwecke und Medikamentenscreenings! (Fördervolumen ca 500 keuro)
31 CAM-Test 2.0! CETC Sphäroide Implantation "Zukünftige Metastase"! Test auf! "! Invasivität! "! Metastasierungsneigung! "! Ansprechen auf " Chemotherapeutika! Anwachsen Vaskularisierung
32 Etablierung der Methode! Optimierung folgender Parameter: "! Eiqualität "! Implantationsmethode und -zeitpunkt "! Alter, Größe und Zellzahl der Sphäroide "! Zusätze für verschiedene Tumorentitäten "! Wirkstoffapplikation (topisch, i.v.)
33 Einstufungskriterien!! Makroskopisch: o! Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur des Tumorpellets o! Sternförmige Vaskularisierung o! Veränderung der Farbe des Tumorpellets! Histopathologisch: o! Einwachsen der Tumorzellen in die CAM o! Vitalität der Zellen o! Ausbildung tumorspezifischer Strukturen
34 Getestete Entitäten!
35 Vaskularisierung der Mikrotumoren! Kolon! 600 Sphären, 25 d alt,! implantiert am Tag 8 pf
36 Positive Beispiele! Prostata! 6 d nach Implantation (600 Sphären)! implantiert Tag 8pf histologischer Schnitt! HE Färbung
37 anderes Prostatakarzinom! 6 Tage nach Implantation (1800 Sphären, 20 Tage alt)! implantiert am Tag 8 pf histologischer Schnitt! HE Färbung Pfeile: vitales Adenokarzinoms
38 Pfeile: Formationen eines! papillären Mammakarzinoms Mamma-Karzinom! 6 d nach Implantation (225 Sphären)! implantiert am Tag 8 pf
39 Vorteile! Evaluation von Invasivität und Metastasierungspotential!!! Verfolgung der Streuung von Tumorzellen in Blut und Embryo!! Wirkstoffindung für zukünftigen Rückfall / Metastasen!!! Schneller als Maustests; rechtlich kein Tierversuch!!!
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