Nachweis zirkulierender epithelialer Tumorzellen: Klinische Bedeutung und Zukunftsperspektiven

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1 Nachweis zirkulierender epithelialer Tumorzellen: Klinische Bedeutung und Zukunftsperspektiven K. Pachmann, Transfusionsmedizinisches Zentrum, Bayreuth. Mit der Veränderung der Altersstruktur und der Lebensgewohnheiten in der westlichen Welt nehmen Krebserkrankungen für das Gesundheitssystem stark an Bedeutung zu. Trotz Früherkennungsmaßnahmen, hervorragender Operationsmethoden, neuer Medikamente und ausgefeilter Bestrahlungsmethoden stehen die Behandlungsergebnisse in keinem Verhältnis zu den Aufwendungen. Möglicherweise liegt dies an einem noch unzureichenden Verständnis der Biologie von Krebserkrankungen, denn fast alle Bemühungen zielen auf den Primärtumor ab, während der überwiegende Teil der Patienten an den Tumorabsiedelungen, den Metastasen, verstirbt, die oft erst Jahre nach einer, scheinbar erfolgreichen, Behandlung des Ausgangstumors auftreten. Einigkeit besteht darüber, dass sich Zellen aus soliden Tumoren, meist Karzinomen, loslösen können. Nur so kann erklärt werden, wie die Metastasen an weit entfernten Stellen entstehen können. Deshalb geraten im Blut zirkulierende Tumorzellen zunehmend in den Fokus der Aufmerksamkeit. Wenn gezeigt werden könnte, dass diese Tumorzellen Schritte auf dem Weg zur Metastasenbildung repräsentieren, könnten solche Zellen eine Art Flüssigbiopsie darstellen. Da Blut ein leicht wiederholt zu entnehmendes Material ist, böte dies die Möglichkeit, die Biologie und Genetik von malignen Tumoren im Krankheitsverlauf zu untersuchen. 286 Methoden zum Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen Wann und in welchem Umfang solche Zellen den Primärtumor verlassen und sich an neuen Stellen ansiedeln können, ist Gegenstand der Forschung. Art des untersuchten Materials Knochenmark Obgleich die ersten Berichte über Zellen, die einen Tumor verlassen haben, das Blut betrafen [1], wurde in neuerer Zeit v.a. im Knochenmark nach solchen Zellen gefahndet [2]. Dies lag daran, dass bei vielen Tumoren, insbesondere beim Brustkrebs, sehr häufig Metastasen im Knochen auftreten und man hoffte, hier den frühesten Beginn von Metastasen, Mikrometastasen, zu finden. In der Tat konnten solche Zellen bei Brustkrebspatientinnen im Knochenmark nachgewiesen werden und es scheint sich zu bestätigen, dass Patientinnen, bei denen Tumorzellen im Knochenmark gefunden wurden, häufiger ein Rezidiv erleiden [3]. Knochenmark ist aber ein problematisch zu entnehmendes Material, die hierzu eingesetzte Knochenmarkspunktion ist teilweise sehr schmerzhaft und sie kann nicht beliebig oft wiederholt werden. Darüber hinaus müssten, um unkontaminiertes Knochenmark zu erhalten, das wegen der noch nicht ausgereiften roten Blutkörperchen weiß erscheint, Knochenmarksstanzen untersucht werden [4]. Nur in 1-% der Patienten konnten dort Tumorzellen gefunden werden. Bei der Aspiration dagegen wird ein unterschiedlich hoher Anteil Blut mit aufgezogen. Es handelt sich damit um kein eindeutig charakterisiertes Probengut. Möglicherweise stammt ein Teil der detektierten Zellen in Wirklichkeit aus dem Blut und das kann auch ein Grund dafür sein, dass bei Aspirationen unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden, z.b. wenn an verschiedenen Stellen Knochenmark entnommen wird. Auch zeigte sich, dass Patienten mit Prostatakrebs bei einem positiven Knochenmarksbefund nicht vermehrt Knochenmetastasen erlitten [5]. Blut Blut dagegen ist viel leichter zu entnehmen und besser definiert. Untersuchungen bei Patientinnen, bei denen gleichzeitig Blut und Knochenmark analysiert wurden, konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen den Befunden im Blut und im Knochenmark herstellen [6]. Auch differieren die Zahlen an tumorverdächtigen Zellen, die im Blut mit den verschiedenen Methoden gefunden werden, und die Bedeutung der gefundenen Zellen wird noch unterschiedlich bewertet. Da die roten Blutkörperchen den weit überwiegenden Anteil der Zellen im Blut darstellen und beim Nachweis von Tumorzellen im Blut störend sind, werden diese bei manchen Versuchsansätzen mit Hilfe eines Dichtegradienten durch Überschichten von Ficoll (einer Zuckerlösung) entfernt. Dabei bilden die roten Blutkörperchen Aggregate, die abzentrifugiert werden, gleichzeitig setzen sich auch die polymorphkernigen Granulozyten ab und es verbleiben über dem Ficoll die mononukleären Zellen, die Lymphozyten und die Monozyten. Unter diesen vermutet man die Tumorzellen. Tumorzellen haben aber eine hohe Affinität zu Zuckermolekülen. Wir konnten zeigen, dass die Ficoll-Separation sogar zu einer selektiven Abreicherung der Tumorzellen führen kann [7].

2 Bedeutung und Zukunftsperspektiven ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN FORTBILDUNG Eine andere Möglichkeit, die roten Blutkörperchen zu entfernen, die sehr schonend für die weißen Blutzellen ist, beruht darauf, dass rote Blutkörperchen kernlose Zellen sind, die in einer niedrig konzentrierten Salzlösung platzen. Die gesamten weißen Blutzellen bleiben übrig und unter ihnen die gesuchten Tumorzellen. Das gängige Verfahren, um anschließend die weißen Blutzellen, insbesondere auch seltene Zellarten zu charakterisieren, ist die Färbung der Zelloberflächenmoleküle mit Antikörpern, die mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind. Dabei werden die Zellen im lebenden, unfixierten Zustand markiert. Dagegen wird in einem der Nachweisverfahren für Tumorzellen (CellSearch TM ) ein Fixativ bereits bei der Blutentnahme zugesetzt, dies kann nachgewiesenermaßen Oberflächenmoleküle zerstören oder unzugänglich machen [8]. Solche Oberflächenmoleküle sind bei Tumorzellen aus Karzinomen z.b. das Adhäsionsmolekül (EpCAM), das für epitheliale Gewebe typisch ist [9]. Dieses Molekül erlaubt es, die Tumorzellen von den mesenchymalen Blutzellen, die kein EpCAM tragen, zu unterscheiden. Antikörper gegen EpCAM werden in einigen Anreicherungsmethoden mit Magnetpartikeln beladen, um dann die magnetbeladenen Zellen, an die sich die Antikörper gebunden haben, in einem starken Magneten von den übrigen Zellen abzutrennen. Allerdings verlieren die Tumorzellen beim Übergang ins Blut zum Teil das EpCAM-Molekül von der Oberfläche oder regulieren die Expression herunter []. Wenn sich auf der Oberfläche der Zellen durch den Fixierungsschritt und durch biologische Modulation nicht mehr genügend EpCAM-Moleküle befinden, um ausreichend magnetbeladene Antikörper zu binden, können diese Zellen nicht mehr im Magneten zurückgehalten werden und gehen für die Analyse verloren. Der Verlust an Tumorzellen im CellSearch TM - Verfahren ist bekannt [11]. Wir haben den Antigen- und Zellverlust während der einzelnen Präparationsschritte untersucht [12] und können damit Hinweise darauf geben, warum die Zahl nachgewiesener Tumorzellen in Cell- Search TM -Verfahren sehr niedrig ist. Infolge der Unwägbarkeiten, die jeder Präparationsschritt mit sich bringt, haben wir uns beim maintrac - Verfahren entschlossen, auch beim Nachweis der Tumorzellen vergleichbar dem Vorgehen bei der Charakterisierung von seltenen weißen Blutzellen vorzugehen, das heißt, im maintrac -Verfahren werden nur die roten Blutzellen lysiert, ein fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen EpCAM zu dem Zellsediment, das alle weißen Blutzellen und die gesuchten epithelialen Tumorzellen enthält, hinzugegeben und ohne weitere Waschschritte werden dann die gesamten Zellen mit Scanningverfahren analysiert. Um sicherzugehen, dass nur vitale Zellen erfasst werden, wird der Probe noch ein roter Fluoreszenzfarbstoff zugegeben, der nur im Zellkern sichtbar wird, wenn die Zellmembran in der Absterbephase der Zellen porös wird. So können tote epitheliale Zellen und Zellen, die sich möglicherweise durch Absterbevorgänge unspezifisch anfärben, ausgeschlossen werden (Abb. 1). Damit konnten alle einer Blutprobe zugesetzten Tumorzelllinienzellen wieder gefunden und weit mehr EpCAM-positive Zellen detektiert werden als in allen Verfahren, bei denen diverse Anreicherungsschritte durchgeführt werden [7]. Diese Zellen können weiterhin auf zusätzliche Eigenschaften (weitere Marker, Genexpression und Genveränderungen) untersucht werden. Abb. 1: Drei vitale EpCAM-positive tumorverdächtige Zellen mit typischer grün fluoreszierender kappenförmiger Anfärbung zwischen nicht angefärbten vitalen Blutzellen und rotgefärbten Kernen toter Blutzellen. Welche Bedeutung haben die gefundenen zirkulierenden epithelialen Tumorzellen (CETCs)? In der metastasierten Situation Für Patienten mit metastasierten Tumoren konnten mit dem CellSearch TM - Verfahren bei 30-40% der Patienten Tumorzellen im Blut gefunden werden und es scheint, dass das Vorhandensein von solchen Zellen mit einer schlechteren Prognose korreliert [13]. Bei primärem Tumor Bei Tumorpatienten ohne Metastasen wird mit diesem Verfahren bereits 1 gefundene Tumorzelle als signifikant angesehen. Dies ist bei ca. 20% der Patienten der Fall, von denen aber nur ein Teil ein Rezidiv erleidet. Dennoch treten Metastasen bei mehr als 30% der Patientinnen mit Brustkrebs im Laufe von 5 Jahren nach der Operation auf und weitere Patientinnen metastasieren noch bis zu 20 Jahre nach Diagnose des Ersttumors. Das bedeutet, dass auch bei Patientinnen, bei denen mit dem CellSearch TM -Verfahren keine Tumorzellen nachgewiesen werden können, solche Zellen im Körper vorhanden sein müssen [14]. Auch bei gesunden Probanden findet sich bei ca. 5,5% 1 Zelle. In der neoadjuvanten Situation Mit der maintrac -Methode werden andererseits bei nahezu allen Tumorpatienten im Blut zirkulierende epitheliale Zellen gefunden. Stammen diese CETCs aus dem Tumor? Dann sollten sie auf eine Therapie in der gleichen Weise ansprechen, wie die Zellen im Tumor selbst. Ein neuerer Ansatz, die Empfindlichkeit der Zellen im Tumor zu testen, ist die neoadjuvante Chemotherapie. Diese Therapie wird eingesetzt mit dem Ziel, den Tumor zu verkleinern und gleichzeitig, um zu sehen, auf welche Medikamente die Tumorzellen ansprechen. Bei Brustkrebspatientinnen sprachen die mit der maintrac -Methode gefundenen tumorverdächtigen Zellen in identischer Weise auf die ersten Zyklen der Therapie an, wie der Tumor selbst (Abb. 2) [15]

3 288 Bei Hormonrezeptor-positiven Tumoren ist die neoadjuvante Chemotherapie zur Tumorverkleinerung viel weniger wirksam, als bei den geringer differenzierten Mammakarzinomen. Dies spiegelte sich auch bei den CETCs wider, die bei Östrogenrezeptor-positiven Tumoren weniger effektiv reduziert wurden als bei den Östrogenrezeptor-negativen Tumoren [15]. Mit der neoadjuvanten Therapie war auch die Erwartung verbunden, dass Mikrometastasen, die noch nicht nachweisbar sind, gleichzeitig mit dem Primärtumor eliminiert werden. Deshalb war es unerwartet, dass die Hormonrezeptor-negativen Mammakarzinome, v.a. die triple-negativen Tumore, trotz des guten Ansprechens auf die neoadjuvante Therapie, eine schlechtere Prognose haben solange sie keine komplette pathologische Remission (pcr, keine nachweisbaren Tumorreste im Tumorbett und den Lymphknoten) erreichen und es häufig innerhalb von wenigen Jahren zur Entwicklung von Metastasen kommt [16]. Bisher gibt es noch keine Vorhersagemöglichkeit, ob eine solche pcr erreicht wird, und selbst unter den Patientinnen mit pcr gibt es noch Rezidive. Unsere Analysen im Rahmen der neoadjuvanten Chemotherapie haben gezeigt, dass es nach der initialen Reduktion der CETCs im Zuge der weiteren Tumorverkleinerung, regelmäßig einen erneuten Anstieg der vitalen zirkulierenden epithelialen Tumorzellen gibt (Abb. 3) [15]. Dies beruht möglicherweise darauf, dass der Druck innerhalb des Tumors kleiner wird, der Tumor wird weicher, die Blutgefäße innerhalb des Tumors weiten sich und mit den absterbenden Zellen werden auch vitale Tumorzellen ausgeschwemmt. Nach dem operativen Eingriff Die ausgeschwemmten Zellen verbleiben auch nach der Operation im Körper und bilden die residuale Tumorlast. Da mit dem maintrac - Verfahren ausreichend Zellen detektiert werden, können von % Zellen % Zellen d. vortherapeutischen Werts Abb. 2: a) Unterschiedlich ausgeprägte Reduktion der im Blut zirkulierenden tumorverdächtigen Zellen durch die ersten 4 Zyklen neoadjuvanter Therapie (vortherapeutischer Wert %) und b) Vergleich der Reduktion der Tumorgröße mit der Reduktion der im Blut zirkulierenden Zellen in 2 Therapiegruppen. manchen Patienten bis zu Zellen einzeln isoliert werden. An diesen Zellen konnten wir zeigen, wie heterogen die Expressionsprofile sind, und dass die Operation in allen 20 untersuchten Fällen von Brustkrebs mit einer Aktivierung von Adhäsionsgenen und dem Stammzellgen NANOG in einem Teil der im Blut vorhandenen Tumorzellen verbunden ist (Cancer Res 2012, 72 (24 Suppl.): 432-3s, Manuskript in Vorbereitung). Auch Mutationsanalysen können jetzt an einzeln isolierten Zellen durchgeführt werden. Für den weiteren Krankheitsverlauf ist offenbar das Verhalten dieser verbliebenen Zellen, ihre Fähigkeit zur Anheftung in fremden Organen und ihre Wachstumspotenz für die Bildung von Metastasen ausschlaggebend. Dies gilt besonders für triple-negative Mammakarzinome, bei denen die Rezidive a) b) 1 0, Behandlungstage pat 1 pat 2 pat 3 pat 4 pat 5 pat 6 pat 7 pat 8 pat 9 pat pat 11 pat 12 pat 13 pat 14 Abb. 3: Nach der initialen Reduktion der Zahl zirkulierender Tumorzellen bei Brustkrebspatientinnen unter neoadjuvanter Gabe von Epirubicin/Cyclophosphamid Wiederanstieg im weiteren Verlauf der neoadjuvanten Therapie mit Paclitaxel bei allen untersuchten Patientinnen. Gutes Ansprechen auf Anthrazyklin 0, Tage vor Operation Reduktion d. Tumorvolumens mm 3 pat 1 pat 2 pat 6 pat 9 pat 5 pat 12 pat 15 pat 16 pat 17 pat 20 pat 23 pat ,8391 y = 1991,1 x R 2 = 0,786 3,8 0,9358 y = 1322,7 x R 2 = 0, Reduktion der CETCs bereits innerhalb von 1-3 Jahren auftreten, wenn nach der Operation keine Therapie folgt [16]. In der adjuvanten Situation Beim Mammakarzinom ist die adjuvante Chemotherapie ein seit langem etabliertes Vorgehen, um nach der Operation möglicherweise verbliebene Tumorzellnester zu eliminieren. Derzeit wird sie bei den meisten Patientinnen durchgeführt. Hier besteht der größte Bedarf, die Effektivität der Therapie zu überprüfen. Bisher war der Therapieerfolg der unterschiedlichen Therapieschemata nur statistisch erfassbar und für die einzelne Patientin nicht voraussagbar. In einer Studie mit 91 Patientinnen konnten wir zeigen, dass das Verhalten der CETCs unter der adjuvanten Chemotherapie engmaschig überwacht werden kann [17] und mit dem weiteren Krankheitsverlauf korreliert. Eine Reduktion der Zahl der CETCs am Ende der Chemotherapie ist mit einem langen rezidivfreien Überleben verbunden ebenso wie eine während der gesamten Therapie wenig variierende Zellzahl. Ein Anstieg der Zahl der CETCs dagegen, noch unter der Chemotherapie, ist mit einer erhöhten Gefahr eines Rezidivs verbunden (Abb. 4). Das heißt, in diesen Fällen sprechen die Zellen zwar initial auf die Chemotherapie an, anschließend kommt es

4 a) OP 1. Z. 2. Z. 3. Z. 4. Z. 5. Z. 6. Z. b) 1. Z. 2. Z. 3. Z. 4. Z. 5. Z. 6. Z. 7. Z. c) OP 1. Z. 2. Z. 3. Z. 4. Z. 5. Z FEC CR EC Pac Rez FEC CR Her2/c-erbB2: 3+ ER (immunhistochem.): 80% pos. PR (immunhistochem.): 70% pos. Her2/c-erbB2: 3+ ER (immunhistochem.): neg. PR (immunhistochem.): neg. Her2/c-erbB2: negativ ER (immunhistochem.): 30% pos. PR (immunhistochem.): 60% pos. Abb. 4a-c: Typisch Verläufe der Zellzahlen der tumorverdächtigen Zellen bei 3 verschiedenen Patientinnen mit Brustkrebs unter adjuvanter Chemotherapie mit a) abnehmender Zahl, b) abnehmender und wieder ansteigender Zahl und c) nur geringen Änderungen der Zellzahl. FEC=5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamid, EC=Epirubicin/Cyclophosphamid, Pac=Paclitaxel, Rez=Rezidiv, CR=Komplettes Ansprechen. 290 aber wieder zu einem Zellzahlanstieg, ob auf Grund einer sich ausbildenden Resistenz oder durch Ausschwemmung aus okkulten Residuen, ist ungeklärt. Chemosensitivität Dass eine in vitro Sensitivitätstestung an den CETCs vor Gabe der jeweiligen Therapeutika möglich ist, haben wir gezeigt [18], und dies könnte mehr Sicherheit schaffen, insbesondere bei triple-negativen Tumoren, bei denen die Chemotherapie derzeit die einzige Option ist. Überwachung dieser Erhaltungstherapie mit der maintrac -Analyse [19] deutet ein Anstieg der Zellzahl auf wiederaufflammende Tumoraktivität und ein mögliches drohendes Rezidiv hin. Ein Therapiewechsel kann dann rechtzeitig in Erwägung gezogen werden. Wenn die Zahl gleich bleibt, ist dies ein Hinweis darauf, dass die Zellen aktuell nicht aktiv sind (Schläferzellen Dormancy). Bei Ansprechen findet sich meist eine langsame, kontinuierliche Reduktion der Zellzahl über die Jahre der Anti-Hormontherapie (Abb. 5a). Diese Ergebnisse stimmen sehr gut überein mit den klinischen Erfahrungen bei der neoadjuvanten endokrinen Therapie [20]. Die langsame Reduktion beruht möglicherweise eher auf Seneszenz der Zellen als auf Induktion von Apoptose. Auch wenn die CETCs nicht endgültig eliminiert werden, verhindert offenbar die Hormonblockade das Wachstum (Abb. 5b). Eine positive Rückkopplung für die Patienten kann helfen, die oft unangenehmen Nebenwirkungen dieser Therapie zu ertragen und sie trotzdem weiterzuführen. Eine Sensitivitätstestung wäre auch hilfreich bei Hormonrezeptor-positiven Tumoren, bei denen, wie bereits aus der neoadjuvanten Therapie bekannt, die Zellen häufig nur wenig durch die Chemotherapie reduziert werden. So könnte man den Patientinnen nutzlose Therapien ersparen. Während der Erhaltungstherapie Bei den Hormonrezeptor-positiven Tumoren wie auch den Her2/neupositiven Tumoren schließt sich an die Chemotherapie eine Erhaltungstherapie an, beispielsweise eine Anti-Hormontherapie oder die Behandlung mit dem Anti-Her2/neu-Antikörper Trastuzumab (Herceptin ). Von der endokrinen Therapie nimmt man an, dass ihr die entscheidende Wirkung bei Hormonrezeptorpositiven Tumoren zukommt. Bei der a) OP c) OP Rezidiv.000 E P Gos.000 Gos.000 Tam.000 Tam b) OP.000 EC D Ca R Abb. 5: Langzeitverläufe zweier Patientinnen mit Brustkrebs a) mit Reduktion der Zahl zirkulierender Zellen und b) mit konstanter Zellzahl unter Hormonblockertherapie; c) und d) nach Abschluss der endokrinen Therapie mit rasch ansteigenden Zellzahlen vor Diagnose des Rezidivs. E=EC=Epirubicin/Cyclophosphamid, Tam=Tamoxifen, P=Paclitaxel, D=Docetaxel, Ca=Capecitabin, Gos=Goserelin, R=Radiatio. d) OP Tam.000 E D Ca.000 R Rezidiv Tam

5 Bedeutung und Zukunftsperspektiven ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN FORTBILDUNG Nach Ende der Erhaltungstherapie Die bisherigen Leitlinien empfehlen eine 5-jährige endokrine Therapie und die Patienten sind häufig erleichtert, die Therapie beenden zu können. Jedoch zeigt sich, dass es noch weit über 5 Jahre hinaus zu Rezidiven kommt. Deswegen ist auch eine bis zu Jahre dauernde Hormontherapie angedacht, ohne dass klar ist, wer von dieser verlängerten Therapie profitieren wird. Ein typisches Beispiel, wie sich die CETCs nach Ende der Hormontherapie entwickeln können ist in Abbildung 5c und d gezeigt. Bereits kurz nach Ende der Hormontherapie kam es bei diesen Patientinnen zu einem massiven Wiederanstieg der Zellzahl. In der zeitnahen Nachkontrolle waren beide Patientinnen noch rezidivfrei, dann aber wurde kurz darauf ein Rezidiv festgestellt, an dem die eine Patientin bereits verstorben ist. Die Zeit nach Ende der endokrinen Therapie scheint eine besonders sensible Phase zu sein, in der es, anders als bisher gehandhabt, besonders wichtig ist, die CETCs der Patienten engmaschig zu überwachen. Hier ist ein Einsatzgebiet, das von den Patienten dringend gewünscht wird. Bei einem Anstieg der Zellzahl kann mit Therapieoptionen reagiert werden, die auch von den Patienten meist akzeptiert werden und deren Wirksamkeit wiederum überwacht werden kann. Wenn sich nämlich erst einmal Metastasen etabliert haben, sprechen endokrin vorbehandelte Patienten auf eine erneute endokrine Therapie nur noch schlecht an, wie statistische Erhebungen erwiesen haben. Offenbar ermöglicht z.b. die Aufhebung der Hormonblockade manchmal ein erneutes rasches Wachstum vorher blockierter wachstumsfähiger Zellen. Abb. 6: Typisches EpCAM-positives Tumorsphäroid (TSFU) in der kombinierten Darstellung im Durchlicht und der grünen Fluoreszenz. In der Tat wachsen unter geeigneten Bedingungen im Kontext der anderen Blutzellen klonale Epithelantigen-positive Tumorsphäroide (Abb. 6), die wir Tumor Spheroid Forming Units (TSFU) nennen. Damit können wir erstmals direkt zeigen, dass sich unter den im Blut zirkulierenden Zellen aus dem Tumor eine Subpopulation von Tumorinitiierenden Zellen mit Stammzelleigenschaften finden kann, denen man die Fähigkeit zur Metastasenbildung zuspricht. Meist stellen diese Zellen eine kleine Fraktion der mit der maintrac - Methode nachweisbaren Zellen dar. Solche Zellen scheinen bei manchen Tumorpatienten auch nach all den verschiedenen Therapien noch vorhanden zu sein. Diese offenbar für die Metastasenbildung wichtigsten Zellen können nun auf ihre Expression von Stammzelleigenschaften, Rezeptormolekülen und relevante Mutationen untersucht werden. Möglicherweise können sie in Zukunft auch zur gezielten Suche nach Genveränderungen dienen, die im weiteren Krankheitsverlauf von Bedeutung sind. Fazit Beim Nachweis zirkulierender Tumorzellen im Blut spielen die verschiedenen Anreicherungsschritte eine große Rolle. Die meisten Anreicherungsmethoden führen zu einem Zellverlust. Die Entscheidung, die Präparationsschritte auf ein Minimum zu reduzieren, hat bei der maintrac -Methode zu einer hohen Wiederfindungsrate geführt, und dazu, dass höhere Zahlen an CETCs gefunden werden, als mit anderen Vorgehensweisen. Die mit der maintrac -Methode im Blut detektierten tumorverdächtigen Zellen weisen alle Eigenschaften auf, wie sie auch von den Zellen in den zugehörigen Tumoren bekannt sind. Das betrifft das Ansprechen auf die unterschiedlichen Therapien ebenso wie Dormancy, Wachstumsaktivität und den Nachweis von epithelialen Zellen mit klonaler Wachstumspotenz. Das Verhalten dieser Zellen stimmt gut mit einer Reihe empirischer klinischer Erfahrungen überein. Es spiegelt unseres Erachtens verlässlich die Eigenschaften der im Körper verbliebenen Tumorlast zu verschiedenen Zeitpunkten einer Tumorerkrankung wider und ist damit für die Überwachung von Tumorpatienten im Krankheitsverlauf geeignet. In Zukunft können an diesen Zellen Expressionsprofile und Mutationen analysiert werden, die für den weiteren Krankheitsverlauf von ausschlaggebender Bedeutung sind. AUTOR Dr. med. Katharina Pachmann Transfusionsmedizinisches Zentrum Bayreuth Kurpromenade Bayreuth Tel: 0921/ kpachmann@laborpachmann.de 291

6 Literatur Ashworth TR. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Aust Med J 1869; 14: Jauch KW, Heiss MM, Gruetzner U, et al. Prognostic significance of bone marrow micrometastases in patients with gastric cancer. J Clin Oncol. 1996;14: Molloy TJ, Bosma AJ, Baumbusch LO, et al. The prognostic significance of tumour cell detection in the peripheral blood versus the bone marrow in 733 earlystage breast cancer patients. Breast Cancer Res 2011;13:R Ridell B, Landys K. Incidence and histopathology of metastases of mammary carcinoma in biopsies from the posterior iliac crest. Cancer 1979;44: Thalgott M, Rack B, Maurer T, et al. Detection of circulating tumor cells in different stages of prostate cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 2013; [Epub ahead of print] PMID: Wiedswang G, Borgen E, Schirmer C, et al. Comparison of the clinical significance of occult tumor cells in blood and bone marrow in breast cancer. 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Pachmann, Transfusionsmedizinisches Zentrum, Bayreuth Having observed, that all enrichment methods for circulating tumor cells suffer from loss of relevant cells we have developed a nondissipative approach, the maintrac approach, for enumeration of cells shed from solid tumors into blood. With this approach we had in the past shown that in breast cancer the cells in blood respond identically to the first cycles of neoadjuvant chemotherapy as the cells in the tumor. However, subsequently, numbers reincrease most probably due to cells flushed from the shrinking tumor into the blood. This may contribute to explain the paradox that tumors with a good response to neoadjuvant chemotherapy like hormone-receptor negative tumors still have a poor prognosis if no pathological complete response is achieved. The frequency of detected cells allows to individually isolate multiple cells from individual patients for expression profiling and mutation analysis and to demonstrate the heterogeneity of the cells activated after surgery. The most commonly used therapy after surgery, the adjuvant chemotherapy, has the highest need for therapy monitoring since there are no means available to control whether the therapy actually works and this we have shown to be possible with our approach as well as to test these cells in vitro for their sensitivity to the respective drugs. Monitoring is also possible during the subsequent maintenance therapy and after the end of maintenance therapy which may be important for some patients in which remnant tumor cells seem to be reactivated. Most recently, we have been successful in growing clonal tumorspheres from the peripherally circulating tumor cells and these possibly most important cells for metastasis formation can now be further analyzed for expression profiles and relevant mutations. Keywords: circulating tumor cells, methodological pitfalls, clinical significance