Susanne Schnittger. Molekulargenetik bei der CML

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1 Susanne Schnittger Molekulargenetik bei der CML

2 Übersicht Molekulargenetik Methodik - PCR - quantitative PCR Ergebnisse Interpretation Resistenzentwicklung

3 Chronische myeloische Leukämie (CML) Fusionsprotein q34 q11 BCR BCR-ABL ABL ABL-BCR q+ 22q- (Ph) BCR mrna Fusionstranskript ABL ABL Ib Ia a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 XI m-bcr M-BCR bcr BCR e1 e2 e3 e4 e5 e6 e7 e12 e13 e15 e16 e17e18 e19 e20 e23 b1 b2 b3 b4 b5 c1 c2 c3 c4

4 Sensitivität der Molekulargenetik Standard PCR: 1:100-1:1000 Quantitative PCR: 1: :

5 Number of leukemic cells Minimale Resterkrankung (MRD) Time from therapy start Relapse CR MRD Cure

6 Therapien bei CML

7 Imatinibwirkung

8 Molekulargenetik in der Diagnostik der CML

9 BCR-ABL-Verläufe Müller et al., Leukemia 2003

10 Chronische myeloische Leukämie (CML) Fusionsprotein q34 q11 BCR BCR-ABL ABL ABL-BCR q+ 22q- (Ph) BCR mrna Fusionstranskript ABL ABL Ib Ia a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 XI m-bcr M-BCR bcr BCR e1 e2 e3 e4 e5 e6 e7 e12 e13 e15 e16 e17e18 e19 e20 e23 b1 b2 b3 b4 b5 c1 c2 c3 c4

11 KM + PBS Aufschichten auf Ficoll

12 Probe auf Ficoll Nach Zentrifugation

13 Zellen messen Portionieren

14 cdna Synthese DNA Exons 1% Intons 99 % Nukleotide: ACGT PCR RNA Nukleotide: ACGU PCR Reverse Transkription RT-PCR Nukleotide: ACGT

15 Nachweis von Fusionsgenen 5 F-Primer 3 5 R-Primer 3 Fusionsgene A/B Rearrangement 5 3 PCR-Product Fusionsgene B/A

16 Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Template 1. Denaturation 2. Annealing Nach 20 Zyklen: > 1 Millionen Moleküle 3. Elongation Nach 35 Zyklen: > 30 Milliarden Moleküle Agarosegel

17 Gele beladen

18

19 BCR-ABL-Fusionstranskripte 1% 31% 65% <1% <1% 1% BCR e1a2 b3a2 b2a2 -C +C +C P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 MW H 2 O p210 p190

20 Auswertung von PCR-Reaktionen N log-phase analysis end-point analysis a) Gelanalyse (nested PCR) (Endpunktanalyse) n b) Real time Analyse (im logarithmischen Bereich)

21 Real time quantitative PCR

22

23 Unter Therapie: Quantitative Real Time PCR Standardkurve mit Plasmiden, die das Fusionstranskript enthalten Fusionsgen Kontrollgen (ABL1) 1-1/10-1/100-1/1000-1/ / Ratio: 100 x Fusionsgen / ABL1

24 a) b) 1:10.000

25 Nested PCR (1:100:000) 1. Primäre PCR 5 F-Primer Template 3 35 Zyklen R-Primer PCR-Produkt Agarosegel 2. Nested PCR N - F-Primer Template 35 Zyklen N-R-Primer Nested PCR-Produkt Agarosegel

26 Befundinterpretation Quantitative Real time PCR: Datum LabNr. Mat. Zielgen Ratio (*) ABL-Kopien (+) log PB BCR-ABL_P210 53, PB BCR-ABL_P210 2, , KM BCR-ABL_P210 0, , PB BCR-ABL_P210 0, , PB BCR-ABL_P210 0, , PB BCR-ABL_P210 0, ,7

27 Imatinibtherapie: Response Kriterien Baccarani et al. for ELN, Blood 2006

28 Qualitätskontrolle Hughes et al., Blood 2006

29 Qualitätskontrolle ELN - Ringversuche wurden aus Mannheim koordiniert (Prof. A. Hochhaus; Dr. M. Müller) - Standards (Plasmidverdünnungen) verteilt - Proben in München und Mannheim gemessen - 12 interschiedliche Proben jeweils 3 x - CF (conversion factor: )

30 Resistenzbildung

31 Mutationen in der Kinase Domäne P-Loop Phosphatbindung Direkter Kontakt mit Imatinib Katalytische Domäne A-Loop Aktivierte Konformation

32 Imatinibresistenz

33 Mutationen in der Kinase Domäne P-Loop Imatinibkontakt Katalytische Domäne A-Loop Hughes et al., Blood 2006

34 Mutationen Verteilung der Mutationen im MLL Mutation Anzahl Mutation Anzahl Mutation Anzahl Mutation Anzahl T315I 53 E255K + T315I 2 E355G 1 G254G 1 F317L 23 E292A 2 E459K 1 I242L 1 E255K 15 E355Q 2 F311I 1 I293V + H396R 1 M351T 11 F359C 2 F311L 1 K245E + L284S 1 Y253H 10 H396R 2 F317L + M351T 1 L298V 1 V299L 9 L248V 2 F359I 1 M244V + T315I 1 G250E 8 Q252H 2 G250E + F317L 1 Q252H + E255K 1 M244V 8 Y253H + T315I 2 G250E + F359V 1 T315I + E355Q 1 F359V 5 A269A 1 G250E + Q252H 1 T315I + F359C 1 E255V 3 A397P 1 G250E + T315I 1 T315I + F359V 1 E279K 3 D276G 1 G250E + T315I 1 V299L + F359V 1 G250E + H396R 3 E255K + M351T 1 G250E + Y253F 1 Y253H + E279K 1 L387M 3 E255V + T315I 1 G250E+ M388L 1 Y253H + F311I 1 n= 201

35 Biochemische und zelluläre Eigenschaften Starke Resistenz (Medikament wechseln?) Komplette Resistenz Moderate Resistenz (Dosis?)

36 Resistenz bei Dasatinib Soverini et al, Haematologica, 2007

37 Resistenzen gegen Kinaseinhibitoren O Hare et al. Blood 2007

38 Methode zur BCR-ABL-Sequenzbestimmung first step (PCR): B2B (BCR exon 13) plus A7- (ABL exon 7) B2B BCR ABL AN4+ second step (Seq.): AN4+ (ABL exon 4) plus A7- A7- A7-

39 Methode Sequenzierung O

40 Sequenzanalyse 896g>a ggg>gag G250E/Gly250Glu

41 Sequenzanalyse 1223t>a ttc>atc F359I / Phe359Iso

42 Befundung der Mutation Aminosäureaustausch M244V, Y253F, Y253H (AAB60394) Basenaustausch A58758G, T58795C, A58796T (U ) Menge mutierter/unmutierten BCR-ABL Transkripte Hughes et al., Blood, 2006

43 Methoden zur Detektion von BCR-ABL-Mutationen Methode Sensitivität Anwendung Sequenzierung 10% Primäre Analyse DHPLC 1% Primäre Analyse Verlaufsbeobachtung ASO-PCR 0,1% Verlaufsbeobachtung

44 Methoden zur Detektion von BCR-ABL-Mutationen Methode Sensitivität Anwendung Sequenzierung 10-20% Primäre Analyse DHPLC 1% Primäre Analyse Verlaufsbeobachtung ASO-PCR 0,1% Verlaufsbeobachtung Vorsicht vor zu Sensitiven Methoden!!!

45 Methoden zur Detektion von BCR-ABL-Mutationen Methode Sensitivität Anwendung Sequenzierung 10-20% Primäre Analyse DHPLC 1% Primäre Analyse Verlaufsbeobachtung ASO-PCR 0,1% Verlaufsbeobachtung

46 Empfehlungen für molekulares Monitoring 1. Komplette molekulare Remission alle 3 Monate 2. Kontinuierliche Abnahme der Transkripte alle 3 Monate 3. Stabiles Niveau der BCR-ABL Transkripte alle 3 Monate 4. Ansteigen* der BCR-ABL Expression < 3 Monate (*Wiederholte Verdopplung oder Verfünffachung der Transkripte) Martinelli et al., Hematological Oncology, 2006

47 Indikation für Mutationsanalyse Schlechtes initiales Ansprechen (primäre Resistenz) - kein hämatolisches Ansprechen nach 3 Monaten - kein minor zytogenetisches Ansprechen nach 6 Monaten - kein major zytogenetische Ansprechen nach 12 Monaten Verlust der Ansprechens (sekundäre Resistenz) - > 1 log, 2-fach, 5-fach Anstieg der BCR-ABL-Expression

48 Resistenzmechanismen 1. BCR-ABL abhängige Resistenzen - Mutationen in der Tyrosinkinasedomäne - BCR-ABL Überexpression - BCR-ABL Amplifikation 2. BCR-ABL unabhängige Resistenzen - klonale zytogenetische Evolution - P-Glycoprotein (Pgp) Hochregulation (MDR1-Resistenz) - BRCP/ABCG2 (breast cancer resistence protein) - hoct1 (human organic cation transporter) - AGP (a1-acid glycoprotein) Bindung - Überexpression von Src-Kinasen (Lyn) - Aktivierung des mtor Pathways

49 Schlussfolgerung Genetik bietet sehr spezifische und sehr sensitive Methoden, die ein optimales Monitoring unter modernen Targeted Therapien ermöglicht.