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1 Neue Produkte made by Hämatoonkologie BCR-ABL Multiplex Kit Pharmakogenetik SLCO1B1 Genotypisierungskit VKORC1 Genotypisierungskit Dr. Martin Svoboda

2 Diagnose von CHRONISCHER MYELOIDER LEUKÄMIE (CML): D BCR-ABL Multiplex Kit

3 BioProBCR-ABL Multiplex Kit ausgezeichnet beim NÖ Innovationspreis 2016 Quelle: WKNÖ/Wagner Michael Syrowatka, BioProducts Martin Svoboda, BioProducts Sonja Zwazl, Präsidentin WKNÖ Petra Bohuslav, Wirtschaftslandesrätin NÖ

4 BioProBCR-ABL Multiplex Kit Detektion der vier häufigsten BCR-ABL Varianten in einem Assay

5 Chronische myeloide Leukämie (CML) ~15% aller Leukämien in Erwachsenen Inzidenz: 1-2 Fälle/ Jahres Überlebensrate 80-90% Vor Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs): ~20% Fusion des Abelsonmurineleukemia (ABL) Gens mit Breakpoint cluster region(bcr) Gen

6 Die BCR-ABL Translokation Philadelphia-Chromosom (Ph) Abnormalität ABL (Chromosom 9) fusioniert mit BCR (Chromosom 22) Führt zu Expression des Onkoproteins BCR-ABL BCR-ABL ist eine konstitutiv aktivetyrosinkinase, die Wachstums-und Replikationssignale aussendet

7 Die chromosomale BCR-ABL-Translokation Philadelphia-Chromosom (Ph) Abnormalität Häufigste BCR-ABL Varianten Protein Variant Breakpoint (BCR-Region) 1 p190 Minor (m) Exon 1 (e1a2) 2 p210 Major (M) Exon 13 (b2a2) 3 p210 Major (M) Exon 14 (b3a2) 4 p230 µ Exon 19 (e19a2) Luu MH, Press RD. Expert Rev Mol Diagn Sep;13(7): Alle vier BCR-ABL Varianten werden mit dem BioPro BCR-ABL Multiplex Kit detektiert und identifiziert

8 Akute lymphatische Leukämie (ALL) ~15% aller Leukämien in Erwachsenen Häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter ~20-25% der ALL in Erwachsenen sind Ph + p190/minor ist der häufigste Bruchpunkt (~70%) Ph + wichtiger prognostischer Faktor in der ALL Patienten können mit TKIs behandelt werden

9 BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Überblick Verwendungszweck: Probenmaterial: One-Step RT-PCR Protokoll: Für den qualitativen Nachweis von BCR-ABL Fusionstranskripten RNA isoliert aus Knochenmark oder antikoaguliertem Blut Reverse Transkription und PCR im selben Reaktionsröhrchen Reaktionsvolumen: 25 µl ABL1 wird als internes Kontrollgen verwendet Alle notwendigen Reagenzien für die RT-PCR sind im Kit enthalten

10 BioPro BCR-ABL Multiplex Kit SYBR Green Farbstoff in Kombination mit fluoreszierenden Sonden BCR-ABL Fusionstranskript wird durch spezifische Sonde im VIC/JOE/HEX Kanal detektiert Typ des Fusionstranskriptswird mittels Schmelzkurve im SYBR Green Kanal identifiziert Das ABL1 interne Kontrollgen wird durch eine spezifische Sonde im Cy5 Kanal detektiert bzw. durch Schmelzkurve Assay design ABL1/Extraktionskontrolle (76,9 C) p210/b2a2 (81,2 C) p210/b3a2(82,5 C) p230/e19a2 (87,5 C) p190/e1a2 (85,8 C)

11 BCR-ABL Multiplex Kit Ergebnisse - Schmelzkurven Schmelzkurvenanalyse von Proben positiv für: M/p210 (b2a2) M/p210 (b3a2) m/p190 (e1a2) µ/p230 (e19a2) M/p210/b2a2 m/p190 M/p210/b3a2 µ/p230

12 BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Ergebnisse - Sensitivität 16 pg total RNA von K562 Zelllinie (BCR-ABL M/p210/b3a2 positiv) gemischt mit 40 ng BCR-ABL negativer background RNA (1:2500; <0,3% IS) p210/b3a2 Transkript detektiert in 18/20 Replikaten (90%) Amplifikationsplot BCR-ABL VIC/JOE/HEX Schmelzkurvenanalyse SYBR Cy5 ABL1 Kontrolle

13 BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Ergebnisse - Robustheit Linearität des p210 / b3a2 Assays wurde mittels Verdünnungskurve getestet Total RNA von K562 Zelllinie (BCR-ABL + ) Probenmenge: 50 ng 1000 ngtotal RNA Ct ng ng ng ng ng ng C t-wert 22 1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,5 2,7 2,9 3,1 LOG input total RNA [ng] Auch durch RNA Zugabe von 1 µg RNA konnte die RT-PCR Reaktion nicht übersättigt werden

14 BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung

15 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert

16 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert Spezielles Design für Screening-Anwendungen

17 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert Spezielles Design für Screening-Anwendungen Sehr einfache Handhabung: Zwei Reagenzien mischen + RNA

18 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert Spezielles Design für Screening-Anwendungen Sehr einfache Handhabung: Zwei Reagenzien mischen + RNA One-Step RT-PCR Protokoll: Minimierte Handling-Zeit Reduzierte Fehlerwahrscheinlichkeit und Kontaminationsgefahr

19 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert Spezielles Design für Screening-Anwendungen Sehr einfache Handhabung: Zwei Reagenzien mischen + RNA One-Step RT-PCR Protokoll: Minimierte Handling-Zeit Reduzierte Fehlerwahrscheinlichkeit und Kontaminationsgefahr Sensitiver und robuster Test

20 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert Spezielles Design für Screening-Anwendungen Sehr einfache Handhabung: One-Step RT-PCR Protokoll: Sensitiver und robuster Test Zwei Reagenzien mischen + RNA Minimierte Handling-Zeit Reduzierte Fehlerwahrscheinlichkeit und Kontaminationsgefahr Kompatibel mit vielen Real-Time PCR Cyclern (e.g. Roche LC480II, ABI 7500, Qiagen Rotor Gene Q)

21 Vorteile: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit Zusammenfassung Die häufigsten BCR-ABL Fusionstranskripte werden identifiziert Spezielles Design für Screening-Anwendungen Sehr einfache Handhabung: One-Step RT-PCR Protokoll: Sensitiver und robuster Test Zwei Reagenzien mischen + RNA Minimierte Handling-Zeit Reduzierte Fehlerwahrscheinlichkeit und Kontaminationsgefahr Kompatibel mit vielen Real-Time PCR Cyclern (e.g. Roche LC480II, ABI 7500, Qiagen Rotor Gene Q) IVD

22 BioPro BCR-ABL Multiplex Kit by BioProducts In Entwicklung: BioPro BCR-ABL Multiplex Kit für LightCycler 2.0 Glaskapillar-System (20 µl) inklusive dazugehörigem Color-Compensation Kit

23 Pharmakogenetik Wie wirkt sich die genetische Ausstattung eines Menschen auf die Wirksamkeit von Arzneistoffen aus? Zwei neue PCR-Kits 1) BioPro SLCO1B1 Genotypisierungskit (BP201) 2) BioPro VKORC1 Genotypisierungskit (BP202) Beide Produkte in Kollaboration mit Prof. Wilfried Renner (MeduniGraz) entwickelt und sind für Plattencycler und Rotor-Gene geeignet. Nicht für Glaskapillarsysteme (LightCycler 1.x-2.0)!

24 BioPro Genotypisierungskits Überblick Verwendungszweck: Genotypisierung von Punktmutationen mittels Hydrolyse-Sonden ( TaqMan ) Probenmaterial: genomische DNA isoliert aus Blut nach Standardverfahren Reaktionsvolumen: 20 µl Alle notwendigen Reagenzien für die PCR sind im Kit enthalten Positivkontrollen für alle Genotypen (WT, Heterozygot und M) sind im Kit enthalten

25 Genotypisierung von Punktmutationen mit Hydrolyse-Sonden ( TaqMan ) Wildtyp: R gdna Sonde Wildtyp (gelb) A T Q Hydrolyse der Sonde durch Taq- Polymerase R Mutation: R gdna Sonde Mutation (grün) G C Q R

26 Genotypisierung von Punktmutationen mit Hydrolyse-Sonden ( TaqMan ) Wildtyp: R Sonde Mutation (grün) G X T Q SIGNAL Mutation: R Sonde Wildtyp (gelb) A X C Q SIGNAL

27 Genotypisierung von Punktmutationen mit Hydrolyse-Sonden ( TaqMan ) Mögliche Ergebnisse Wildtyp Heterozygot Mutation Fluoreszenz z Fluoreszenz z Fluoreszenz z Zyklus Sonde Wildtyp Sonde Mutation Zyklus Zyklus

28 BioPro SLCO1B1 Genotypisierungskit SLCO1B1 ist ein Aufnahmetransporter in Hepatozyten (Leber) Zuständig für die Statinaufnahme aus dem Blut in die Leber Statine sind sehr häufig verschriebene Arzneimittel zur Lipidsenkung Austausch der Aminosäure Valin an Position 174 durch Alanin im SLCO1B1 Protein (OATP1B1) führt zur kompletten Hemmung der Transportfunktion Nebenwirkungen bei Statinüberdosierung: Myopathien, im schlimmsten Fall Rhabdomyolyse, die über Nierenversagen tödlich enden kann

29 BioPro SLCO1B1 Genotypisierungskit SLCO1B1 Genotyp Pos. 174 Häufigkeit Bedeutung VV 70% Kein Hinweis auf reduzierte Transportfunktion. VA 28% Erniedrigte SLCO1B1 Transportfunktion. Etwa 4-fach erhöhtes Risiko für Myopathien unter Statin-Therapie. Stark erniedrigte SLCO1B1 Transportfunktion. Etwa 16- AA 2% fach erhöhtes Risiko für Myopathien unter Statin- Therapie. Die American Society forclinical PharmacologyandTherapeuticsempfiehlt den Einsatz der SLCO1B1 Genotypisierung im Rahmen der Routine-Versorgung. Wilke et al. The clinical pharmacogenomics implementation consortium: CPIC guideline for SLCO1B1 and simvastatin-induced myopathy. Clin Pharmacol Ther Jul;92(1):112-7.

30 BioPro SLCO1B1 Genotypisierungskit Ergebnisse No. Color Name Genotype Cycling A.Green Cycling A.Yellow Amplifikationsplot Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction 25 SLCO1B1 W Wild Type No Reaction Reaction 26 SLCO1B1 W+M Heterozygous Reaction Reaction Mutant None 27 SLCO1B1 M Mutant Reaction No Reaction 28 H2O No Reaction No Reaction Streudiagramm Heterozygous Wild Type

31 BioPro VKORC1 Genotypisierungskit VKORC1 = Vitamin K-Epoxid-Reduktase Wichtige Rolle im Vitamin-K Stoffwechsel, Angriffspunkt für Cumarine Cumarine sind Gerinnungshemmer, hemmen in der Leber die Vitamin-K abhängige Bildung von Blutgerinnungsfaktoren Eine Mutation an Position mit einen Austausch von G>A hat einen Einfluss auf die Effektivität der Hemmung von VKORC1 durch Cumarin Genotypen Häufigkeit Cumarin Dosierung VKORC GG 38% Höhere Dosierung VKORC GA 43% Normal VKORC AA 19% Niedrigere Dosierung

32 BioPro VKORC1 Genotypisierungskit Ergebnisse N o. Col or Amplifikationsplot Name Genotyp e Cycling A.Green Wild Type No Reaction Reaction Cycling A.Yellow Mutant Reaction No Reaction Heterozygous Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction Mutant Reaction No Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Wild Type No Reaction Reaction Heterozygous Reaction Reaction 852 Heterozygous Reaction Reaction 853 Wild Type No Reaction Reaction Mutant None 855 Mutant Reaction No Reaction 856 Wild Type No Reaction Reaction 857 Wild Type No Reaction Reaction 858 Heterozygous Reaction Reaction 859 Wild Type No Reaction Reaction 860 Wild Type No Reaction Reaction 861a Wild Type No Reaction Reaction 861b Wild Type No Reaction Reaction 862 Wild Type No Reaction Reaction 863 Wild Type No Reaction Reaction Streudiagramm Heterozygous Wild Type

33 Pharmakogenetik Zusammenfassung BioPro SLCO1B1 Genotypisierungskit (BP201) BioPro VKORC1 Genotypisierungskit (BP202) Vorteile: Sehr einfache Handhabung: Zwei Reagenzien mischen + gdna Automatisierte Auswertung durch die Cycler-Software möglich Manuelle Auswertung ist zusätzlich möglich Kompatibel mit vielen Real-Time PCR Cyclern (e.g. Roche LC480, ABI 7500, Qiagen Rotor Gene Q) CE-IVD

34 Neue Produkte made by Kooperationen für neue Projekte auf Real-Time PCR Basis Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!