Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

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1 Aus der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung in der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. R. Eckstein Gepaarte Studie zur Validierung des neuen Thrombozytenaggregometers PAP-8 und zur Untersuchung des Einflusses der Einstellung der Thrombozytenkonzentration des plättchenreichen Plasmas auf die Ergebnisse der Thrombozytenaggregationstestung mit PAP-8 und PAP-4 Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Sabine Braun aus Wurzen

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. med. J. Ringwald Koreferent: Prof. Dr. med. R. Eckstein Tag der mündlichen Prüfung:

3 INHALTSVERZEICHNIS 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerungen Summary Objectives Methods Results Conclusions Einleitung Form, Bildung und Funktion der Thrombozyten Pathophysiologie von Thrombozyten Thrombozytopenien Thrombozytopathien Wirkung von Thrombozytenfunktionshemmern Diagnostik der Thrombozytenfunktion Geschichte und Entwicklung der Thrombozytenfunktionstests LTA - Methode nach Born Die Aggregometer PAP-4 und PAP Zielsetzung der Studie Material und Methoden Studiendesign in der Übersicht Detaillierter Ablauf der Studie Auswahl der Spender und Patienten Die Probenentnahme Gewinnung von PRP und PPP Ermittlung und Einstellung der Thrombozytenkonzentration im PRP Messung am PAP Messung am PAP Statistik Ergebnisse... 31

4 5.1 Demographie der Spender und Patienten Medikation der Patienten Blutbild Bestimmung des Normbereichs Validierung des PAP Korrelation zwischen PAP-4 und PAP Korrelation zwischen nicht eingestellter und eingestellter Thrombozytenkonzentration Ergebnisse der Patienten Patienten unter ASS-Medikation Patienten unter Clopidogrel-Medikation Diskussion PAP-4 und PAP-8 im Vergleich Einstellen der Thrombozytenkonzentration Einteilung in Responder und Non-Responder Fehlerquellen Schlussfolgerungen und Ausblick Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang Einverständniserklärung für Kontrollgruppe Fragebogen für Patienten Danksagung... 82

5 1 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Die Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) nach Born gilt als Gold-Standard zur Diagnose von Thrombozytopathien und zur Überwachung von Patienten unter antithrombozytärer Therapie. Der neue Aggregometer PAP-8 besitzt gegenüber dem Vorgänger PAP-4 eine bessere Analysesoftware, vier weitere Messkanäle und benötigt nur noch der Hälfte des Probenvolumens. Primäres Ziel dieser Studie war die Validierung des PAP-8 im Vergleich zum PAP-4. Weiterhin wurde untersucht, ob das Einstellen der Thrombozytenkonzentration die Ergebnisse der LTA beeinflusst. Darüberhinaus wurde beurteilt, wie gut die beiden Aggregometer Non-Responder einer antithrombozytären Therapie mit Acetylsalicylsäure (ASS) und/oder Clopidogrel erfassen. 1.2 Methoden Im ersten Teil der Studie wurden 28 gesunde Blutspender zur Erstellung eines Normbereichs getestet. Die Tests wurden an beiden Geräten sowohl mit eingestelltem als auch mit nicht eingestelltem plättchenreichen Plasma (PRP) vorgenommen. Die Einstellung des PRP (Ziel Thrombozyten/µl) erfolgte mit autologem plättchenarmen Plasma (PPP). Bei allen Messungen wurden die Agonisten Adenosindiphosphat (ADP) [20µmol/l, 10µmol/l], Arachidonsäure (AA) [1,6mmol/l], Kollagen [190µg/ml], Thrombinrezeptoraktivierendes Peptid 6 (TRAP-6) [25µmol/l] verwendet. Die maximale Aggregation [%] wurde zwischen den einzelnen Gruppen verglichen. Im zweiten Teil der Studie wurde das Blut von 35 Patienten unter ASSund/oder Clopidogreltherapie untersucht. Für die Einteilung der Patienten in Responder und Non-Responder wurden neue Cut-off-Werte mithilfe des Median und des 95%- Konfidenzintervalls bestimmt.

6 2 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Beim Vergleich von PAP-4 und PAP-8 stellten wir fest, dass mit eingestelltem PRP eine schwache Korrelation zwischen den beiden Geräten mit ADP II, AA, Kollagen und TRAP-6 vorlag. War das PRP nicht eingestellt konnte lediglich mit AA eine Korrelation der beiden Aggregometer nachgewiesen werden. Auffällig war, dass der PAP-8 bei der Erstellung des Normbereichs, bei allen Messungen eine größere Streuung der Ergebnisse aufwies. Bezüglich des Einflusses der Einstellung der Thrombozytenkonzentration zeigte sich am PAP-4 eine sehr gute und hoch signifikante Korrelation für ADP I, ADP II, TRAP-6 und AA. Am PAP-8 war die Korrelation zwar insgesamt geringer, jedoch wurde ebenfalls eine signifikante bis sehr signifikante Korrelation für alle Agonisten festgestellt. Es wurden von beiden Geräten bei beiden Medikationsgruppen mehr Non-Responder identifiziert, wenn das PRP nicht eingestellt war. Bei den Patienten unter ASS-Therapie erkannte der PAP-8 geringfügig weniger Non- Responder als der PAP-4, wohingegen mehr Non-Responder der Clopidogrel-Therapie vom PAP-8 erkannt wurden. Höher konzentriertes ADP (20µmol/l) scheint sich dabei besser zu eignen, als ADP mit einer Konzentration von 10µmol/l. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Die Korrelation der beiden Aggregometer PAP-4 und PAP-8 muss insgesamt als eher gering betrachtet werden. Das Einstellen der Thrombozytenkonzentration erscheint an beiden Geräten nicht zwingend erforderlich, da die Ergebnisse der maximalen Aggregation entweder kaum Unterschiede aufwiesen, oder signifikant miteinander korrelierten. Lediglich bei Verwendung von Kollagen am PAP-4 ist es nicht unwesentlich, ob die Aggregation mit eingestelltem oder nicht eingestelltem PRP gemessen wird. Der neue PAP-8 bietet zwar einige Vorteile in der Handhabung, jedoch wird auf Grundlage unserer Ergebnisse deutlich, dass er nur nach ausführlicher Validierung und laborspezifischer Referenzbereichsanalyse in den klinischen Betrieb aufgenommen werden darf. Auch hinsichtlich der Detektion von Non-Respondern unterscheiden sich die beiden Geräte. Nur prospektive klinische Studien können jedoch klären, welches der beiden Geräte Non-Responder zuverlässiger erkennen kann.

7 3 2 Summary 2.1 Objectives Born s method for testing platelet aggregation is called the Golden standard and is used for diagnosis of platelet (PLT) function defects and for control of platelet inhibiting therapy. The new aggregation device PAP-8 exhibits better software equipment, four additional channels for measurement and uses only half of the sample volume compared to its predecessor PAP-4. The aim of this study was the validation of the successor PAP-8 for platelet aggregation measurement in comparison to PAP-4. Additionally, the influence of the adjustment of the PLT concentration in the PLT rich plasma (PRP) on the results was studied. Furthermore, we compared the assessment of classification in responder and non-responder between the two aggregators during antiplatelet treatment with acetylsalicylic acid (ASA) and/or clopidogrel. 2.2 Methods Twenty eight healthy subjects were included to generate reference ranges. Aggregation testing was accomplished by both aggregation devices using either adjusted or unadjusted PRP. Platelet rich plasma was adjusted to a standardized count of platelets/ µl using autologous platelet poor plasma (PPP). In all test arms the following agonist were used: adenosine diphosphate (ADP) [20µmol/l and 10µmol/l], arachidonic acid (AA) [1,6mmol/l], collagen [190µg/ml] and thrombin receptor-activating peptide 6 (TRAP-6) [25µmol/l]. Maximal aggregation [%] was compared between different groups. The second part of this study included 35 patients receiving daily ASA and/or clopidogrel therapy. To estimate the classification in responder and non-responder, new cut-off values were determined by using median and 95% confidence intervals. 2.3 Results We found a low correlation between PAP-4 and PAP-8 for the used agonists ADP II, AA, collagen and TRAP-6 when platelet count was adjusted. If non-adjusted PRP was used, a correlation was found only for AA. For all agonists, PAP-8 showed a much wider variation of values than PAP-4.There was a very good and highly significant

8 4 correlation between maximal aggregation measured either with adjusted or unadjusted PRP using the PAP-4 and the agonists ADP I, ADP II, TRAP-6 and ASA. For PAP-8 the correlation for all agonists was lower but remained significant. Both aggregation assays identified more non-responder on ASA and /or clopidogrel therapy when platelet count was not adjusted. PAP-8 detected a lower number of non-responder during therapy with ASA but indentified more non-responders during clopidogrel therapy than PAP-4. Higher concentrated ADP (20µmol/l) seems to be more appropriate for monitoring patients undergoing antiplatelet treatment. 2.4 Conclusions Overall, the correlation between PAP-4 and PAP-8 was low. Except for the usage of the agonist collagen on the PAP-4, adjustment of PRP is not necessary for all other agonists on both aggregation devices as the results were similar and correlated well between the two groups. PAP-8 provides indeed several advantages in the performance of LTA, but based on our data the new device should not be used in clinical routine unless a detailed validation has been performed and laboratory-specific reference ranges have been determined. Furthermore, the devices showed differences between the detection of non-responders of patients under platelet inhibition therapy with ASA and/or clopidogrel. However, only clinical prospective studies will be able to clarify which of the two devices might be more reliable in the detection of non-responders.

9 5 3 Einleitung Die Beurteilung der Thrombozyten als eigenständige dritte Komponente des Blutes im Jahre 1865 durch Max Schultze und die 1882 veröffentlichten Beobachtungen von Bizzozero, welcher den Namen Blutplättchen einführte und deren besondere Eigenschaften der Blutkoagulation und Thrombusbildung hervorhob, gelten noch heute als richtungsweisende Entdeckungen der Hämostaseforschung (4; 19). Als kleinste Blutzellen des menschlichen Körpers erfüllen die Thrombozyten jedoch keineswegs eine untergeordnete Rolle, sondern besitzen eine zentrale Bedeutung in der Blutgerinnung. 3.1 Form, Bildung und Funktion der Thrombozyten Thrombozyten sind unregelmäßig geformte, flache Blutzellen mit einem Durchmesser von 1-4 µm und einer Dicke von 0,5-0,75 µm. Morphologisch besteht ein Thrombozyt aus einer Plasmamembran, welche von einer Glykokalix umgeben ist, die Rezeptoren für verschiedene Agonisten und Inhibitoren enthält. Unter dieser Plasmamembran liegt das Hyalomer, eine Zone scheinbar unstrukturierten Protoplasmas mit kontraktilen Filamenten, welche für die Form der Thrombozyten von Bedeutung sind. Die wichtigen Inhaltsstoffe für die Thrombozytenfunktion und Blutgerinnung befinden sich im Inneren des Blutplättchens und sind in Plättchengranula und Lysosomen gespeichert. Thrombozyten besitzen keinen Zellkern und entstehen durch Abschnürung von Zytoplasma der Megakaryozyten im Knochenmark. Von dort gelangen sie in die Blutbahn, wo 70% der Thrombozyten frei zirkulieren. Die restlichen 30% werden in der Milz gespeichert und können bei erhöhtem Verbrauch freigesetzt werden. Beide Depots stehen jedoch im ständigen Austausch miteinander. Die Thrombozyten zirkulieren für 5-11 Tage im Blut und werden danach in der Leber, Lunge oder Milz abgebaut. Ein gesunder Erwachsener hat im Mittel bis Thrombozyten pro µl Blut (62). Die Blutplättchen spielen eine wesentliche Rolle beim körpereigenen Mechanismus der Blutstillung, welcher als Hämostase bezeichnet wird. Dabei unterscheidet man eine primäre Hämostase, welche sich durch einen schnellen Verschluss der Wundränder durch Thrombozyten auszeichnet und eine sekundäre Hämostase, bei der die endgültige

10 6 Abdichtung der Gefäßläsionen erfolgt. Die primäre Hämostase setzt sich wiederum aus der Adhäsion der Thrombozyten, ihrer Aktivierung und Aggregation zusammen. Kommt es aufgrund einer Verletzung zur Freilegung subendothelialer Gefäßstrukturen, so haften die Thrombozyten an den Bindegewebsfasern der Wundränder. Dafür besitzen sie einen spezifischen Rezeptor (GPIb/V/IX-Komplex), welcher eine Bindungsstelle für den von-willebrand-faktor (vwf) aufweist (17). Insbesondere unter hohen Scherkräften bildet dieser Brücken zwischen den freiliegenden Kollagenfasern der verletzten Blutgefäße und den Thrombozyten aus. Der vwf wird von Endothelzellen und von Thrombozyten gespeichert. Somit ist eine schnelle Verfügbarkeit des Faktors gewährleistet. Zusätzlich zur Verbindung des GPIb/V/IX-Komplexes mit dem vwf weisen Thrombozyten noch spezifische Rezeptoren für subendotheliale Matrixproteine wie zum Beispiel Laminin, Fibronektin und Kollagen auf (18). Der wichtigste von diesen Adhäsionsrezeptoren ist der GPIa/IIa-Komplex, über den die Thrombozyten direkt an Kollagen binden können. Durch die Adhäsion an Kollagenfasern werden die Thrombozyten aktiviert und formen sich um. Sie verlieren ihre diskoide Form und bilden stachelartige Fortsätze (Abbildung 3.1). Die für die Umformung verantwortlichen Aktin- und Myosinfilamente werden von Calcium-Ionen angeregt, welche bei der Plättchenaktivierung aus den elektronendichten Granula freigesetzt wurden. Außerdem werden aggregationsfördernde Substanzen wie Adenintriphosphat (ATP), Adenindiphosphat (ADP) und Serotonin aus den Granula abgesondert und führen zur Aktivierung weiterer Blutplättchen in der unmittelbaren Umgebung. Die Vernetzung der Thrombozyten untereinander wird durch den GPIIb/IIIa-Komplex vermittelt, der durch die Plättchenaktivierung ebenfalls stimuliert wird und über Fibrinogenbrücken die Blutplättchen zusammenhält (42). Abbildung 3.1: ruhende Thrombozyten mit diskoider Form (links), aktivierte Thrombozyten mit unregelmäßiger Form und stachelartigen Pseudopodien (rechts) (23).

11 7 Die Ausschüttung stimulierender Substanzen aus den Granula verstärkt die weitere Aktivierung von Thrombozyten und führt dadurch zur Blutstillung unter Ausbildung eines hämostatischen Pfropfes. Freigesetztes Serotonin und Thromboxan A 2 bewirken zusätzlich eine Vasokonstriktion der verletzten Gefäße. Infolge der Strukturveränderung der Thrombozyten werden negativ geladene Phospholipide der inneren Schichten der Zellmembran und des Granulomers nach außen gekehrt. Hierdurch werden auch die sekundäre Hämostase und die konsekutive Fibrinbildung initiiert, wodurch der instabile Blutpfropf durch ein Fibrinnetz gefestigt und somit die Blutung dauerhaft zum Stillstand gebracht wird (62). Abbildung 3.2 veranschaulicht den Ablauf der primären Hämostase. unstimulierter Thrombozyt δ Granulum α Granulum Ca ++, ADP, Serotonin stimulierter Thrombozyt Aggregation GPIIb/IIIa Fibrinogen GPIIb/IIIa stimulierter Thrombozyt Adhäsion GPIb/V/IX GPIa/IIa verletzte Endothel zellen vwf subendotheliales Kollagen Abbildung 3.2: Bildung eines Thrombozytenpfropfes an einer verletzten Gefäßwand durch Aktivierung, Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten (Quelle: Eigene Darstellung) GPIa/IIa-Komplex (direkte Haftung an Kollagen) GPIb/V/IX-Komplex (Haftung über den von-willebrand-faktor[vwf]) GPIIb/IIIa-Komplex (Haftung über Fibrinogen)

12 8 Der schnelle Verschluss verletzter Gefäße ist ein lebenswichtiger Mechanismus, um einen größeren Blutverlust zu verhindern. Jedoch können die Thrombozyten auch durch atherosklerotische Veränderungen des Endothels, oder mechanische Hindernisse im Blutstrom, sowie künstliche Herzklappen oder Gefäßersatz aktiviert werden und eine Thrombusbildung provozieren (60). Um diese pathologische Aktivierung der Gerinnung zu verhindern, kann eine gezielte Inhibition mittels sogenannter Thrombozytenfunktionshemmer notwendig sein. 3.2 Pathophysiologie von Thrombozyten Störungen der primären Hämostase können durch Thrombozytopenien oder -pathien hervorgerufen werden. In den folgenden Unterabschnitten werden die wichtigsten dieser Erkrankungen vorgestellt und dabei zusätzlich in angeborene und erworbene Thrombozytendysfunktionen eingeteilt Thrombozytopenien Unter einer Thrombozytopenie versteht man die Verminderung der Thrombozytenzahl auf Werte unter Thrombozyten/µl Blut. Ab weniger als bis Thrombozyten/µl Blut kann es zur hämorrhagischen Diathese kommen und es können spontane Blutungen auftreten, die sich in Petechien, Schleimhautblutungen oder Hämatomen manifestieren (72). Angeborene Thrombozytopenien kommen sehr selten vor. Meist werden sie durch eine Bildungsstörung der Thrombozyten infolge einer Verminderung der Megakaryozyten oder aufgrund der Bildung von fehlerhaften Blutplättchen, die im Körper wieder abgebaut werden, verursacht. Weit häufiger findet sich eine verminderte Thrombozytenkonzentration aufgrund einer erworbenen Störung (72), die meist Folge einer Erkrankung ist oder durch unerwünschte Nebenwirkung von Medikamenten hervorgerufen wird. Ursache für eine Thrombozytopenie kann eine verminderte Thrombozytopoese aufgrund eines Thrombopoetinmangels sein. Des Weiteren kommen Schädigungen des Knochenmarks durch ionisierende Strahlung, Zytostatika sowie durch neoplastische oder chronisch entzündliche Prozesse in Frage. Auch ein gesteigerter Verlust von Thrombozyten infolge einer viralen Infektion, einer Immunreaktion oder auch bei

13 9 ausgedehnten Blutungen muss als Ursache in Betracht gezogen werden (62). Ein weiterer Grund für eine erniedrigte Thrombozytenzahl findet sich in einem gesteigerten Thrombozytenabbau, welcher nicht durch eine gesteigerte Thrombozytopoese kompensiert werden kann. Verantwortlich für diesen erhöhten peripheren Thrombozytenumsatz sind vor allem plättchenspezifische Autoantikörper oder ein größerer, durch Infektionskrankheit induzierter Umsatz der Thrombozyten. Bei der Diagnose von erworbenen Thrombozytopenien ist jedoch sicherzustellen, dass keine Pseudothrombozytopenie vorliegt. Diese beruht auf einem in vitro Phänomen, welches durch die Bildung von Plättchenagglutinaten im antikoagulierten Blut zu Fehlbefunden bei der Analyse mittels automatisierten elektronischen Partikelzählgeräten führt. Auffällig dafür wäre eine verminderte Thrombozytenkonzentration ohne anamnestische oder klinische Anzeichen einer erhöhten Blutungsbereitschaft (60) Thrombozytopathien Thrombozytopathien beschreiben Erkrankungen, die mit einer verminderten Funktion der Blutplättchen einhergehen. Sie lassen sich in Störungen der Adhäsion, Aktivierung, Sekretion und Aggregation der Blutplättchen einteilen. Angeborene Thrombozytopathien sind selten und können unter Umständen als eine erworbene Funktionsstörung der Blutplättchen fehldiagnostiziert werden. Die Diskrepanz zwischen der niedrigen Prävalenz angeborener Thrombozytopathien und dem hohen Anteil von Patienten mit nicht klassifizierten Thrombozytenfunktionsstörungen verdeutlicht die Schwierigkeit zwischen angeborenen und erworbenen Störungen zu differenzieren. Eine genaue Erhebung der Eigenanamnese und der Familienanamnese sind dafür unabdingbar. Angeborene Störungen der Thrombozytenfunktion sind eine Gruppe verschiedenartiger Defekte, welche Symptome von milden Hämatomen bis hin zu schweren mukokutanen Blutungen aufweisen (64). Die Patienten leiden unter einer lebenslangen Blutungsneigung, die jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt sein kann. Nachfolgend werden die wichtigsten hereditären Erkrankungen der Thrombozyten vorgestellt. Das Bernard-Soulier-Syndrom (BSS) ist durch einen qualitativen oder quantitativen Mangel des GPIb/IX/V-Komplexes auf der Thrombozytenmembran gekennzeichnet. Die Adhäsion der Blutplättchen an subendotheliale Bindegewebsfasern über den vwf

14 10 ist somit speziell bei hohen Scherkräften unzureichend. Dieser Adhäsionsdefekt wird oft durch Makrothrombozyten sowie Thrombozytopenie begleitet (35). Störungen der Thrombozytenaktivierung werden vorwiegend durch Defekte der ADP- Rezeptoren P2Y12, P2Y1 und P2X hervorgerufen. Bis heute sind nur sehr wenige Fälle dieser Dysfunktion diagnostiziert und das genaue Zusammenspiel der Rezeptoren noch nicht hinreichend geklärt. Jedoch ist bekannt, dass die Wirkung von ADP auf den P2Y1-Rezeptor eine Mobilisierung von zytoplasmatischen Calciums, gefolgt von einer vorübergehenden und reversiblen Thrombozytenaggregation, hervorruft. Der P2Y12- Rezeptor bewirkt dann eine nachhaltige Aggregation durch progressive Verstärkung dieses Effekts (18). Die Umformung der Blutplättchen, sowie die Aktivierung durch Kollagen unter hohen Scherkräften, wird durch den P2X-Rezeptor beeinflusst (39). Die Storage Pool Disease (SPD) zeichnet sich entweder durch ein Defizit an Granula oder deren Inhaltsstoffe aus. Infolge dessen kommt es zu einer Sekretionsstörung von ADP aus den aktivierten Plättchen und somit zu einer anormalen Thrombozytenaggregation. Die α-granula enthalten Proteine für die Adhäsion (vwf, Fibronektin), für die Zell-Zell-Wechselwirkung (P-Selektin) und Gerinnungsfaktoren (Faktor V), wohingegen die δ-granula, aufgrund ihres hohen Calciumgehaltes auch dense bodies genannt, hauptsächlich ATP, ADP und Serotonin speichern und somit für die Aggregation der Thrombozyten verantwortlich sind. Die SPD wird nach betroffenen Granula in α-, δ- oder αδ-spd eingeteilt. Bei einem Defizit der α-granula treten primär Adhäsionsstörungen auf. Im Gegensatz dazu kommt es bei einem Mangel oder Fehlen der δ-granula zu einer Aggregationsstörung. Sind, wie bei einer kombinierten SPD, keine oder defizitäre Granula beider Gruppen vorhanden, werden auch beide Prozesse beeinträchtigt (64). Die Glanzmann-Thrombasthenie (GT) ist eine sehr seltene, angeborene Thrombozytopathie. Sie beruht auf einer quantitativen oder qualitativen Funktionsstörung des GPIIb/IIIa-Komplexes, welcher für die Aggregation der Blutplättchen untereinander verantwortlich ist (35). Die Vernetzung der Blutplättchen über Fibrinogenbrücken ist in unterschiedlich schwerer Ausprägung eingeschränkt, infolge dessen es zu relativ schweren hämorrhagischen Diathesen kommen kann. Da es sich um einen Aggregationsdefekt handelt, der in der Phase der Thrombusfestigung auftritt, ist die Adhäsion sowie die Formänderung der Blutplättchen nicht beeinträchtigt (57).

15 11 Im Gegensatz zu den seltenen angeborenen Thrombozytendysfunktionen treten die erworbenen Funktionsstörungen der Blutplättchen weit häufiger auf. Verschiedene Erkrankungen, aber auch zahlreiche Arzneimittel, greifen in die Reifung und den Umsatz der Thrombozyten ein und führen oft zu unerwünschten Blutungen. Plättchenfunktionsstörungen, welche durch eine Grunderkrankung wie chronische Niereninsuffizienz, Leberzirrhose, antithrombozytäre Antikörper, hämatologische Erkrankungen oder Infektionen hervorgerufen werden, bezeichnet man als krankheitsbedingte oder -assoziierte Thrombozytopathien. Auch Aggregationsdefekte, die durch extrakorporale Zirkulationsverfahren (Dialyse) induziert werden, ordnet man dieser Gruppe zu. Auf der anderen Seite benennt man die zahlreichen durch Arzneimittel hervorgerufenen Thrombozytendysfunktionen als medikamenteninduzierte Thrombozytopathien (59). Der Pathomechanismus der Thrombozytenfunktionsstörung bei chronischer Niereninsuffizienz ist noch nicht vollständig geklärt. Man geht aber davon aus, dass die chronische Urämie und die Ansammlung von weiteren toxischen Substanzen im Blut zu einer erhöhten Blutungsneigung führen (63). Schwere hämorrhagische Komplikationen können auftreten, wenn zu dieser Grunderkrankung noch medikamenteninduzierte Plättchenfunktionsstörungen oder Thrombozytopenien hinzukommen. Eine Besserung des Hämostasedefekts wird oft durch Dialysetherapie beobachtet, wobei jedoch zu beachten ist, dass eben dieses extrakorporale Zirkulationsverfahren auch zu vorübergehenden Störungen der Blutstillung führen kann. Dies erklärt sich in vorübergehenden qualitativen Störungen der Plättchenfunktion durch den Kontakt der Thrombozyten im strömenden Blut mit künstlichen Oberflächen. Dabei korreliert der Schweregrad des Defekts mit der Dauer dieses Verfahrens und hat ebenfalls eine herabgesetzte Aggregationsantwort zur Folge (59). Bei einer chronischen Leberzirrhose treten ebenfalls komplexe Hämostasedefekte auf. Die Kombination von Gerinnungsstörung durch verminderte hepatische Produktion von Gerinnungsfaktoren, Störungen der Fibrinolyse und milder bis mittelschwerer Thrombozytopenie, bedingt durch eine erhöhte Sequestration der Thrombozyten in der Milz, verursachen die Blutungsneigung dieser Patienten. Des Weiteren können alkoholtoxische Effekte bei chronischem Alkoholabusus zur Thrombozytopathie beitragen (61).

16 12 Sekundäre Thrombozytopenien und -pathien können außerdem durch antithrombozytäre Antikörper hervorgerufen werden. Dabei handelt es sich um Autoimmunkrankheiten, bei denen sich diese Antikörper gegen spezifische Rezeptoren der Plättchenoberfläche richten. Bei der idiopathischen thrombozytopenischen Purpura wird, je nachdem welcher Rezeptorenkomplex blockiert wurde, von einer erworbenen GT (GPIIb/IIIa- Komplex) oder von einem erworbenen BSS (GPIb/IX/V-Komplex) gesprochen (61). Als häufigste Ursache erworbener Thrombozytopathien gilt die Einnahme von Medikamenten, welche direkt oder in Kombination mit anderen Substanzen, eine Störung der Thrombozytenfunktion hervorrufen. Dabei kann die antithrombotische Wirkung durch sogenannter Thrombozytenaggregationshemmer erwünscht sein, oder als unerwünschte Nebenwirkung in Erscheinung treten, wie sie beispielsweise bei nichtsteroidalen Entzündungshemmern und β-laktam-antibiotika vorkommt (61). Seit vielen Jahren nimmt die antithrombotische Therapie als Primär- oder Sekundärprävention von kardiovaskulären Erkrankungen einen besonderen Stellenwert ein. Einem Großteil dieser Erkrankungen liegen atherosklerotische Prozesse zugrunde, infolge dessen es durch Läsionen des Endothels oder Ruptur von abgelagerten Plaques zur lokalen Plättchenaktivierung kommt. Die antithrombotische Therapie verhindert die Bildung eines intravasalen Thrombus mit konsekutivem Gefäßverschluss und Ischämie des jeweiligen Versorgungsgebietes und beugt somit einem erneuten Herzinfarkt, Schlaganfall oder dem Fortschreiten einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit vor (26). 3.3 Wirkung von Thrombozytenfunktionshemmern Die Medikamente der antithrombotischen Therapie erzielen ihre Hemmwirkung auf die Thrombozytenaktivierung und deren nachfolgende Aggregation über unterschiedliche intrazelluläre Blockaden. Im folgenden Kapitel werden die drei wichtigsten antithrombozytären Substanzgruppen vorgestellt und das Problem der Aspirin- oder Clopidgrelresistenz erörtert. Die antithrombotische Wirkung der Acetylsalicylsäure (ASS) beruht auf der irreversiblen Hemmung der Cyclooxygenase 1 (COX-1) der Thrombozyten. Durch deren Inhibition wird die Synthese von Thromboxan A 2 (TXA 2 ) unterdrückt, wodurch vasokonstriktorisches und aggregationsförderndes Potential gehemmt wird. Da die

17 13 Thrombozyten kernlos und demzufolge nicht in der Lage sind, Enzyme zu synthetisieren, können sie die inaktivierte COX-1 nicht ersetzen. Dieser Zustand hält über die gesamte Lebensdauer der betroffenen Thrombozyten an (26). Die ADP- Rezeptor-Antagonisten Ticlopidin und Clopidogrel gehören zur Stoffgruppe der Thienopyridine, welche die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung inhibieren, indem sie selektiv und irreversibel den P2Y12-Rezeptor hemmen. Beide Medikamente bezeichnet man auch als prodrugs, da sie erst nach Metabolisierung in der Leber ihre antithrombozytäre Wirkung entfalten, die für etwa 7-10 Tage anhält (48; 58). Eine Blockade des GPIIb/IIIa-Rezeptors bewirkt ebenfalls die Inhibition der Thrombozytenaggregation, indem die Fibrinogen-Thrombozyten-Vernetzung unterbunden wird. Die sogenannten GPIIb/IIIA-Antagonisten (Abciximab, Tirofiban, Eptifibatid) beruhen alle auf dem gleichen Wirkprinzip, jedoch unterscheiden sie sich in ihren strukturellen und pharmakologischen Eigenschaften (58). In Abbildung 3.3 werden die drei Substanzgruppen und ihre Hemmwirkung anschaulich dargestellt. Abbildung 3.3: Übersicht der Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation (58). ASS verhindert die Bildung von Thromboxan A 2 durch Hemmung der Cyclooxengenase (COX-1). Clopidogrel hemmt die Bindung von ADP an den P2Y12- Rezeptor. GPIIb/IIIa- Antagonisten verhindern die Vernetzung von Fibrinogen mit dem GPIIb/IIIa-Rezeptor.

18 14 Ein großes Problem bei der Verabreichung von aggregationshemmenden Medikamenten stellt die hohe Variabilität des patientenspezifischen Ansprechens auf die Substanzen dar. Hierfür wurden die Begriffe Aspirinresistenz und Clopidogrelresistenz geprägt, mit denen sich viele Studien auseinandergesetzt haben. Dabei spricht man von einer Clopidogrelresistenz, wenn die Thrombozyten trotz Einnahme dieses Medikaments auf ADP weiterhin eine fast unveränderte Aggregationsfähigkeit zeigen. Hingegen spricht man von einer Aspirinresistenz, wenn trotz Einnahme von ASS die Thrombozytenaggregation auf Arachidonsäure (AA) nahezu unverändert erfolgt (26). Wong et al. (70) unterscheidet dabei - klinische Aspirinresistenz (atherothrombotische Ereignisse trotz Behandlung), - biochemische Aspirinresistenz (normale Laborbefunde trotz Behandlung), - pharmakologische Aspirinresistenz (persistierende Produktion von Thromboxan A 2 und/ oder Metaboliten) und - funktionelle Aspirinresistenz (persistierende Aggregation trotz Behandlung). Das Phänomen der Aspirinresistenz unterliegt verschiedenen klinischen, zellulären und genetischen Faktoren, von denen einige modifizierbar sind und andere nicht (3). Zum Beispiel können als mögliche Ursachen für ein Behandlungsversagen von ASS eine inadäquate Dosierung, Resorptionsstörungen, Interferenzen mit anderen Pharmaka, beschleunigter Thrombozytenumsatz, alternative Wege der Thromboxansynthese, erhöhte Plättchensensitivität auf Aspirin bei Langzeittherapie, genetische Polymorphismen, Diabetes mellitus, Tabakkonsum, Hypercholesterinämie sowie Stress in Frage kommen. Aber auch die fehlende Einnahme der Medikamente durch den Patienten, welche als Pseudoresistenz bezeichnet wird, ist nicht zu unterschätzen (26). Nach einer Studie von Cotter et al. (16) stellte sich heraus, dass mehr als die Hälfte der Patienten, denen zunächst eine Aspirinresistenz zugewiesen worden war, nach eingehender Befragung zugaben, dass sie ihre Medikamente nicht oder nur unregelmäßig eingenommen hatten. Somit könnten zumindest einige der Patienten durch ein verändertes Verhalten oder eine Steigerung der täglichen Dosierung von der ASS-Wirkung profitieren (48), wohingegen die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien oder die Verschreibung zusätzlicher Medikamente eine Bereicherung für die Patienten sein könnte, deren Resistenz einem unveränderbaren Mechanismus zugrunde liegt (3).

19 15 Aufgrund des Wissens über die variable Empfindlichkeit der Patienten gegenüber den thrombozytenfunktionshemmenden Medikamenten ist eine genaue und individuelle Einstellung erforderlich, um auf der einen Seite die optimale Wirkung des Medikamentes oder deren Kombination für den Patienten zu gewährleisten und auf der anderen Seite, die dadurch erhöhte Blutungsgefahr so gering wie möglich zu halten. Die Herausforderung besteht in der Entwicklung antithrombozytärer Strategien, welche thrombotische Effekte blockieren, ohne die physiologische Funktion der Plättchen zu beeinträchtigen (61). Im klinischen Alltag könnten Thrombozytenfunktionstests die Überwachung der antithrombotischen Therapie von Patienten gewährleisten. Bis heute mangelt es jedoch an einem konformen Leitfaden zur standardisierten, labordiagnostischen Bestimmung einer Aspirin- oder Clopidogrelresistenz (50). 3.4 Diagnostik der Thrombozytenfunktion Geschichte und Entwicklung der Thrombozytenfunktionstests Das erste Verfahren zur Überprüfung der Thrombozytenfunktion wurde 1910 von William Duke entwickelt. Es handelte sich um die Bestimmung der Blutungszeit dem ersten in vivo Test zur Überprüfung der Plättchenfunktion. Die Blutungszeit ist die Zeit, nach der eine Blutung aus einer möglichst standardisiert gesetzten Wunde (meist an der Unterseite des Unterarmes) zum Stillstand kommt (31; 53). Im Laufe der Zeit wurde die in vivo Methode noch verfeinert, jedoch birgt dieser Test erhebliche Fehlerquellen in sich, weswegen er derzeit nicht zur Routinediagnostik der Thrombozytenfunktion empfohlen wird (53). Erst neue technische Entwicklungen und die Entdeckung der Sensibilität von Thrombozyten gegenüber Calcium und ADP bewirkten im Jahre 1962 die Erfindung der Licht-Transmissions-Aggregometrie (LTA) mit plättchenreichem Plasma durch Born und O Brien (45). Diese Erfindung revolutionierte die Diagnostik von primären hämostatischen Defekten und gilt auch heute noch als Goldstandard der in vitro Thrombozytenfunktionstests, da man umfangreiche Informationen über die Funktion der Blutplättchen erhält (32). In Kapitel wird detailliert auf die LTA nach Born eingegangen.

20 16 Vormals wurden die Thrombozytenaggregationstests hauptsächlich zur Diagnose von Blutungskrankheiten verwendet. Heutzutage hat sich das Aufgabenspektrum dieser Untersuchung jedoch deutlich vergrößert. Nach wie vor dienen sie zum Erkennen von Erkrankungen mit erhöhter Blutungsneigung, aber auch zur Identifikation von Patienten mit einem erhöhten Risiko für arterielle Krankheiten oder zur Überwachung bei Atherothrombosetherapie mit Thrombozytenaggregationshemmern. Dabei steht die optimale Dosierung für jeden einzelnen Patienten im Vordergrund, da bei der antithrombotischen Therapie erhebliche individuelle Unterschiede bezüglich der Sensibilität des Patienten auf das verabreichte Medikament nachgewiesen werden konnten (siehe Kapitel 3.3). Durch das erhöhte Blutungsrisiko der Patienten, welche mit antithrombozytären Medikamenten behandelt werden, benutzt man die Thrombozytenaggregationstests auch für die prä- und perichirurgische Einstellung der Blutgerinnung und Überwachung bei geplanten Operationen oder Traumata. Aufgrund des großen Aufgabenbereiches wurden sogenannte Point-of-Care-Tests (POCT) entwickelt, die patientennah, außerhalb von Speziallaboratorien eine schnellere und einfachere Überprüfung der Thrombozytenfunktion sicherstellen (53). Mit diesen Tests versucht man das Probenvolumen zu senken, eine Untersuchung von Vollblutproben zu ermöglichen und dadurch besser standardisierte Methoden zu gewährleisten. Darüber hinaus soll die Handhabung vereinfacht, sowie der Zeitaufwand verringert werden. Nachfolgend werden die wichtigsten POC-Tests vorgestellt. Der VerifyNow (Accumetrics, San Diego, USA) beruht wie die LTA auf einem turbidimetrischen optischen Verfahren. Mit diesem Test wird die Aggregation der Blutplättchen untereinander über den GPIIb/IIIa-Rezeptor gemessen. Dabei wird die Agglutination von stimulierten Plättchen an fibrinogenbeschichteten Partikeln im mit Citrat antikoaguliertem Vollblut gemessen. Die verwendeten Kartuschen enthalten je nach Indikation verschiedene Agonisten wie AA, ADP oder ein Thrombinrezeptoraktivierendes Peptid 6 (TRAP-6) zur Messung von Effekten durch ASS, ADP- Inhibitoren und GPIIb/IIIa-Inhibitoren. Vorteile des VerifyNow - Systems sind das kleine Probenvolumen, die Messung in Vollblut und die Schnelligkeit des Tests durch die entfallende Vorbereitung der Blutprobe. Als nachteilig erweist sich die Einschränkung der Testmöglichkeiten in Abhängigkeit der jeweils verwendeten Kartusche und der recht hohe Preis (53; 32).

21 17 Der PFA-100, sogenannter Platelet Function Analyzer (Dade Behring, Newark, USA), berücksichtigt bei der Vollblutmessung zusätzlich die physiologisch auftretenden hohen Scherkräfte. Die Blutprobe wird durch eine 150 µm kleine Öffnung in einer mit Kollagen beschichteten Membran unter Anwesenheit von Epinephrin oder ADP gesaugt. Die Zeit, die der Thrombozytenpfropf braucht, um die mikroskopische Öffnung zu verschließen, wird als Verschlusszeit dokumentiert (53; 31). Daraus können nun Rückschlüsse auf die Wirksamkeit der antithrombotischen Therapie gezogen werden. Eine einfache Handhabung, Schnelligkeit und ein kleines Probenvolumen gelten als Vorteile dieses POC-Tests. Jedoch ist zu beachten, dass der PFA-100 nicht auf alle Thrombozytenfunktionsstörungen sensitiv reagiert und trotz seines weit verbreiteten und lang erprobten Einsatzes im klinischen Alltag weniger geeignet zum Nachweis einer Aspirin- oder Clopidogrelresistenz ist (47). Ein Test auf dem Prinzip der Vollblutimpedanzaggregometrie ist der Multiplate (Dynabyte Medical, München, Deutschland), welcher die Impedanz zwischen zwei Elektroden misst, die in citratantikoaguliertes Vollblut eingebracht werden. Die Elektroden bestehen aus leitfähigem silberummanteltem Kupfer und weisen einen Durchmesser von 0,3 mm und eine Länge von 3 mm auf. Verschiedene Agonisten lösen die Aggregation aus, welche über einen Zeitraum von sechs Minuten aufgezeichnet wird und eine Aggregationskurve ergibt. Die wesentlichen Vorteile gegenüber der optischen Licht-Transmissions-Aggregometrie (nach Born) sind das Entfallen der benötigten Zentrifugation zur Herstellung von plättchenreichen Plasma (PRP) und plättchenarmen Plasma (PPP), die mögliche Einschätzung der Plättchenaggregation in etwa zehn Minuten und das unveränderte zelluläre Millieu (50). Die Messung mit dem halbautomatischen Impact-R, sogenannten Cone and platelet analyzer (Diamed, Cressier, Schweiz), erfolgt ebenfalls in Vollblut unter Berücksichtigung der relevanten Scherkräfte. Das Gerät enthält eine speziell beschichtete Platte, die mit Kollagen oder extrazellulärer Matrix versehen ist, an denen die aktivierten Blutplättchen haften und dann nach automatischer Färbung durch eine optische Einrichtung aufgenommen werden. Auf diesem Wege versucht der Impact-R die Thrombozytenadhäsion im Falle einer Gefäßverletzung naturgetreu zu simulieren, jedoch hat sich der Test bisher nicht zur Diagnose von Thrombozytenfunktionsdefekten und zur Überwachung von Aspirin- und Thienopyridintherapie bewährt (53; 30).

22 18 Das Grundproblem all dieser Testverfahren ist jedoch, dass kein einzelner Test die Komplexität der Biologie und Funktion von Thrombozyten komplett erfasst und zum Teil eine nur geringe Korrelation der Tests untereinander besteht. Die LTA gilt auch heute noch als Standardmethode unter den Thrombozytenfunktionstests, wobei jedoch die POC-Tests, insbesondere die Multiplate -Methode, in den letzten Jahren in der klinischen Praxis im europäischen Raum an Bedeutung gewonnen haben (38) LTA - Methode nach Born Die Bestimmung der Thrombozytenaggregation durch das turbidimetrische Verfahren nach Born gilt bis heute als der Goldstandard in der Thrombozytenfunktionsdiagnostik, wird aber vornehmlich in Speziallaboratorien durchgeführt. Bei diesem Verfahren ist eine Vorbereitung des Probenmaterials erforderlich, was einen erheblichen Aufwand an Zeit und Technik erfordert. Zuerst wird aus dem antikoagulierten Vollblut durch Zentrifugation PRP gewonnen. Es enthält bis auf die Thrombozyten praktisch keine anderen Blutzellen mehr und erscheint beim Betrachten trübe. Das PRP wird dann mit einer Pipette abgehoben. Um PPP des gleichen Patienten zu erhalten, welches im Gegensatz zum thrombozytenreichen Plasma klar aussieht, wird eine zweite Vollblutprobe mit einer höheren Umdrehungszahl zentrifugiert. Nach Überführung des plättchenreichen Plasmas in eine Küvette erfolgt die Messung der Thrombozytenaggregation bei 37 C durch ein Analysegerät. Dieses ermittelt photometrisch mithilfe von Lichttransmission die Trübung des Plasmas bei einer definierten Wellenlänge (PAP-4 : 697 nm; PAP-8 : 430 nm) und zeichnet die Aggregation der Thrombozyten als Abnahme der Trübung über die Zeit in einem Kurvenverlauf auf (Abbildung 3.4). Zuvor ist jedoch eine Eichung des Aggregometers erforderlich. Dabei wird das klare PPP des Patienten als Referenzpunkt für 100% Transmission betrachtet. Durch das Einsetzen des trüben PRP wird die Lichttransmission maximal absorbiert und somit als 0% Transmission angesehen (6; 54). Nach Zugabe von verschiedenen stimulierenden Plättchenagonisten wie AA, ADP, Kollagen, Epinephrin, Ristocetin oder TRAP-6 zum PRP tritt zunächst eine Formänderung bzw. Aktivierung der Blutplättchen ein, die sich initial in einer Zunahme der Trübung bzw. Abnahme der Lichttransmission äußert. Die dann einsetzende Aggregation der Thrombozyten in der Probe bedingt eine Abnahme der Trübung und Zunahme der Lichttransmission (primäre, noch reversible Aggregation). Danach ist

23 19 diese im weiteren Verlauf entweder wieder rückläufig (Deaggregation) oder geht nach vorübergehendem Erreichen eines Plateaus (biphasische Aggregation) in die zweite Phase der Aggregation über (sekundäre irreversible Aggregation). Beurteilt werden zumeist das Ausmaß der maximalen Aggregation, die Aggregation nach fünf Minuten und die maximale Steigung der Kurve als Ausmaß für die Geschwindigkeit der Aggregationsreaktion. Je nachdem welcher Agonist verwendet wurde, kann man über die ausgelösten spezifischen Reaktionen eine Reihe von Thrombozytenfunktionsstörungen unterscheiden (6; 7). [Transmission] in % Formänderung primäre Aggregation sekundäre Aggregation [t] in min Abbildung 3.4: Aggregationskurve des PAP-4 der Agonisten ADP I (20µmol/l), ADP II (10µmol/l), AA, Kollagen. Typisches Bild der Formänderung, primärer Aggregation und sekundärer Aggregation (Quelle: Eigene Darstellung). Als Nachteil der Methode nach Born lassen sich der technikintensive Ablauf, das große Probenvolumen und dessen Vorbereitung, die daraus resultierende lange Testzeit und der Bedarf gut geschulten Personals zur Durchführung des Tests anführen (53). Des Weiteren ist die LTA ein relativ unphysiologisches Messverfahren, da die Blutplättchen getrennt von anderen Blutbestandteilen unter geringem Scherstress in der Küvette gerührt werden und nur durch Zugabe einzelner Agonisten aggregieren. Dies spiegelt nicht den korrekten physiologischen Ablauf einer Thrombozytenaggregation wider (32). Um zuverlässige und plausible Werte zu erhalten, sind auch in der Präanalytik einige Dinge streng zu beachten. Bei der Probenentnahme soll ein hoher Scherstress unbedingt vermieden werden, da es hierdurch zur Voraktivierung der Thrombozyten und somit zur Verfälschung der Testergebnisse kommen kann. Außerdem müssen die Blutproben bei Raumtemperatur gelagert werden, da Kälte ebenso die Blutplättchen aktiviert. Die

24 20 Wartezeit bis zum Beginn des Tests sollte mindestens 30 Minuten betragen, drei Stunden jedoch nicht überschreiten, da die Ergebnisse sonst ebenfalls beeinträchtigt werden. Die Einstellung der Thrombozytenzahl im PRP auf bis Thrombozyten/µl galt als standardisierte Norm, um relevante Vergleichswerte für die in vitro Aggregationsstudien aufzustellen. Jedoch haben neueste Studien belegt, dass eine Einstellung der Thrombozytenzahl nicht notwendig, ja sogar hinderlich sein kann, da es bei der Einstellung der erwünschten Thrombozytenkonzentration durch das Vermischen mit autologen plättchenenarmen Plasma zu einer Beeinflussung der Plättchen und somit schlechteren Aggregationsergebnissen kommen kann. Bei Unterschreitung der Thrombozytenzahl unter Thrombozyten/µl ist aber die Aussagekraft des Tests fragwürdig (45; 49) Die Aggregometer PAP-4 und PAP-8 Die Firma Mölab ist vor allem im Bereich der Thrombozytenfunktionsdiagnostik und der therapeutischen Medikamentenüberwachung tätig. Seit 1982 ist sie mit dem Aggregometer PAP-4 in der Gerinnungsdiagnostik vertreten. Im Laufe der letzten Jahre hat sich allerdings das Spektrum der Thrombozytenaggregometrie kontinuierlich von der Diagnose von Thrombozytenfunktionsdefekten hin zur Überwachung der antithrombotischen Therapie vergrößert. Dabei spielt im klinischen Alltag die Datensicherung und vor allem die Dokumentation und Rückverfolgung der Daten von den Patienten unter Therapie mit Thrombozytenaggregationsinhibitoren eine große Rolle. Aus diesem Grund entwickelte die Firma Mölab im Jahre 2005 ein moderneres Nachfolgegerät (PAP-8 ), welches durch die verbesserte Datenüberwachung und - sicherung, umfangreichere Analysesoftware und Zubehör sowie durch doppelte Anzahl von Messkanälen schnellere und umfassendere Analysen der Thrombozytenaggregation ermöglicht. Nachfolgend sind in Tabelle 3.1 die wichtigsten Unterschiede der beiden Aggregometer dargestellt.

25 21 Eigenschaften PAP-4 PAP-8 Messkanäle 4 8 Wellenlänge 697 nm 430 nm Lichtdetektoren Silizium Fotodioden Silizium Fotodioden Probenvolumen 450 µl 225 µl Reagenzvolumen 50 µl 25 µl Drucker Digitalthermodrucker Tintenstrahl Farbdrucker Inkubationszeit 5 min 2-5 min Rührgeschwindigkeit 1000 U/min 1200 U/min Tabelle 3.1: Vergleich der unterschiedlichen technischen Daten von PAP-4 und PAP-8. Die Bedienung des PAP-8 wird durch den Touchscreen, die automatische Pipette und den angeschlossenen Scanner zur Patientenidentifizierung erheblich erleichtert. Im Gegensatz zum PAP-4 ist eine Messung mit acht Kanälen möglich. Eine wichtige Veränderung liegt in der Wellenlänge der eingesetzten Leuchtdiode als Lichtquelle; diese beträgt im PAP nm (rotes Licht), im PAP-8 jedoch 430 nm (blaues Licht). Dadurch soll eine präzisere Erfassung der Trübung einer Suspension erreichbar sein. Abbildung 3.5 zeigt die beiden Aggregometer der Firma Mölab. Abbildung 3.5: Aggregometer PAP-4 (links) der Firma Mölab und Nachfolgermodell PAP-8 (rechts) mit Scanner und Automatikpipette.

26 Zielsetzung der Studie Die Testung der Thrombozytenaggregation ist eine Standardmethode, welche aus dem Klinikalltag nicht mehr wegzudenken ist. Die Suche nach einem schnelleren und unkomplizierteren Ablauf dieses Verfahrens mit präziseren Ergebnissen ist jedoch erstrebenswert. Aus diesem Grund versuchte die Firma Mölab mit ihrem neuen Gerät PAP-8 die Qualität und die Handhabung gegenüber seinem Vorgänger PAP-4 weiter zu verbessern. Dies wird sowohl durch einen geringeren Bedarf an Probenmaterial als auch durch eine deutlich bessere Ausstattung der Analysesoftware ermöglicht. In der Literatur wird derzeit diskutiert, ob die Notwendigkeit besteht, die Thrombozytenkonzentration des für die Aggregation verwendeten PRPs auf einen bestimmten Bereich von ca Thrombozyten/µl einzustellen. Dieser Aspekt wurde ebenfalls in dieser Studie untersucht. Zusammengefasst waren die Ziele der vorliegenden Arbeit daher: 1. Validierung des Thrombozytenaggregometers PAP-8 im Vergleich zum Vorläufer PAP-4 2. Untersuchung des Einflusses der Einstellung der Thrombozytenkonzentration des PRPs auf die Ergebnisse der Thrombozytenaggregationstestung mit PAP-4 und PAP-8 3. Vergleich von PAP-4 und PAP-8 hinsichtlich der Erkennung von Non- Respondern unter antithrombozytärer Therapie mit ASS und/oder Clopidogrel.

27 23 4 Material und Methoden 4.1 Studiendesign in der Übersicht Die Studie wurde in zwei Phasen durchgeführt. Der erste Teil der Studie diente zur Normbereichserstellung. Hierzu wurde von gesunden und freiwilligen Blutspendern Blut entnommen und parallel an beiden Aggregometern mit den gleichen Agonisten untersucht. Die Tests wurden zudem mit zwei verschiedenen PRP-Ansätzen durchgeführt. Einmal wurde die Thrombozytenkonzentration auf einen Bereich von bis Thrombozyten/µl eingestellt, das andere Mal wurde das PRP so verwendet, wie es nach der ersten Zentrifugation (siehe Kapitel 4.2.3) zur Verfügung stand. Der Cut-off als Referenz für den Normbereich wurde mit dem Median und seinem 95%- Konfidenzintervall (95%-CI) bestimmt. Außerdem wurden die Ergebnisse zwischen den beiden Aggregometern bei gleichen PRP-Ansätzen, sowie zwischen den verschiedenen PRP-Ansätzen unter Verwendung des gleichen Aggregometers für den jeweiligen Agonisten verglichen. Im zweiten Teil der Studie wurde das Blut von Patienten untersucht, die unter Therapie mit Thrombozytenfunktionshemmern (ASS oder/und Clopidogrel) standen. Hier wurden nur die jeweiligen, für das Medikament spezifischen Tests, an beiden Aggregometern mit beiden PRP-Ansätzen durchgeführt. Die Daten wurden hinsichtlich der verwendeten Aggregometer und Ansätze auf das Vorliegen von Respondern und Non-Respondern analysiert. Zusätzlich wurde bei den Aspirin-Patienten auf die Medikamentendosis und bei den Clopidogrel-Patienten auf die verwendete ADP- Konzentration bei der Thrombozytenaggregation geachtet. Neben den Untersuchungen an PAP-4 und PAP-8 wurden sowohl bei den gesunden Spendern, als auch bei den Patienten ein kleines zelluläres Blutbild am ADVIA 120 (Fa. Siemens, Eschborn, Deutschland) und ein Gerinnungsprofil am STA-R Evolution (Fa. Diagnostica Stago, Asnières, Frankreich) bestimmt. Das Gerinnungsprofil beinhaltet einen Quicktest, aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aptt), Faktor VIII-Aktivität, vwf-antigen, Ristocetin-Cofaktoren-Aktivität und Fibrinogenkonzentration nach Clauss. Alle Untersuchungen erfolgten in den Laboratorien der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen.

28 Detaillierter Ablauf der Studie Auswahl der Spender und Patienten In der ersten Phase, der Normbereichserstellung, wurden 28 gesunde und freiwillige Blutspender untersucht. Dabei durften diese Probanden keine regelmäßigen Thrombozytenspender sein oder in den letzten zehn Tagen Medikamente eingenommen haben, welche die Thrombozytenfunktion beeinträchtigen. Da zur Thrombozytenaggregationstestung mit PAP-4 und PAP-8 das PRP sowohl mit einer eingestellten Zielkonzentration von ca Thrombozyten/µl (Ansatz 1) als auch ohne eingestellte Zielkonzentration (Ansatz 2) verwendet werden sollte, wurden nur Spender für die Studie ausgewählt, die eine Thrombozytenkonzentration von mindestens Thrombozyten/μl aufwiesen. Die durch die Analyse der Blutproben ermittelten Werte dienten als Normwerte zur Validierung des PAP-8. Die Blutentnahme der Kontrollgruppe erfolgte im Blutspendezentrum der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung der Universitätsklinik Erlangen. Für die zweite Phase wurde das Blut von 35 Patienten entnommen, welche seit mindestens fünf Tagen unter einer Therapie mit ASS oder Clopidogrel standen. Die Patienten wurden in der Neurologischen Klinik sowie der Medizinischen Klinik 2 der Universitätsklinik Erlangen akquiriert. Um die Daten miteinander vergleichen zu können, wurden auch in dieser Gruppe nur Teilnehmer ausgewählt, welche eine Thrombozytenkonzentration von mindestens Thrombozyten/μl aufwiesen. Die Dosis der verordneten thrombozytenfunktionsbeeinträchtigenden Medikamente und der Begleitmedikation wurde erfasst. Alle Teilnehmer wurden schriftlich und mündlich über die Studie aufgeklärt und die Einwilligung schriftlich bestätigt (siehe Anhang) Die Probenentnahme Nach Einwilligung der Spender wurde für die venöse Blutentnahme eine geeignete Punktionsstelle im Bereich der Ellenbeuge ausgesucht und eine Staubinde etwa eine Handbreit oberhalb dieser Stelle angelegt. Der Staudruck lag zwischen mmhg, die Stauzeit betrug maximal eine Minute. Während der Probenentnahme mussten die