Liquid Handling 7 No 025
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- Gerda Beutel
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1 Userguide Liquid Handling 7 No 025 Kalibrierung und Justierung von Dosiergeräten im Labor Kornelia Ewald, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Zusammenfassung Die Kalibrierung von Pipetten und Dispensern bedeutet, dass unter vorgegebenen Umgebungsbedingungen ein aus dem Dosiersystem abgegebenes definiertes Volumen an Wasser ein zu erwartendes Gewicht aufweisen sollte. Genauer definiert bedeutet es die Ermittlung des Zusammenhangs zwischen dem dosierten Volumen und dem Nennvolumen oder gewählten Volumen eines Dosiersystems. Die Kalibrierung erfordert keine Eingriffe, die das Dosiersystem bleibend verändern. Einleitung Die meist verwendete Prüfnorm für Pipetten und Dispenser und deren Kalibrierung ist die Norm DIN EN ISO Diese Norm legt die maximal zulässigen zufälligen und systematischen en für die unterschiedlichen Liquid- Handling-Systeme fest. Die in ihr festgelegten Fehlergrenzen beziehen sich immer auf das Gesamtsystem, bestehend aus dem Dosiergerät und dem Zubehör, wie z. B. der Pipettenspitze. Die Einhaltung der Fehlergrenzen muss durch den Anwender im Rahmen der Prüfmittelüberwachung oder der analytischen Qualitätssicherung mindestens einmal pro Jahr überprüft werden. Es steht dem Anwender somit frei, kürzere Zeitintervalle festzulegen. Für diese Entscheidung spielen die Gebrauchshäufigkeit und die Anzahl der Benutzer des Dosiersystems wie auch die Aggressivität der zu dosierenden Flüssigkeit eine wesentliche Rolle. genannt, ist ein Maß dafür, wie sehr der Mittelwert der Messergebnisse vom Sollwert abweicht. Eine geringe Unrichtigkeit zeigt sich darin, dass das gemessene Volumen nur geringfügig vom Sollvolumen abweicht (Abb. 1). Unpräzise Präzise, aber unrichtig Zufällige und systematische Die zufällige, auch Unpräzision genannt, ist ein Maß für die Streuung der einzelnen Messwerte. Eine geringe Unpräzision liegt vor, wenn zwischen den Wiederholungsmessungen nur eine geringe Abweichung auftritt. Um dies zu erreichen, sind sowohl ein präzises Gerät als auch korrekte Handhabung, Sauberkeit und praktische Erfahrung erforderlich (Abb. 1). Eine Pipette kann auf der einen Seite sehr präzise, auf der anderen Seite aber präzise falsch, also unrichtig messen. Die systematische, auch Unrichtigkeit Präzise und richtig Abb. 1: Einfache Darstellung der zufälligen und systematischen (Unpräzision und Unrichtigkeit); Sollwert 500 µl
2 Liquid Handling 7 No 025 Seite 2 Zufällige und systematische Abbildung 2 zeigt die Messwertverteilung bei Messreihen mit unterschiedlichen zufälligen und systematischen Fehlern. In Abbildung 3 ist die Anzahl der Pipettierungen gegen die Häufigkeit der gemessenen Volumina aufgetragen. Typischerweise ergibt sich eine Gauß sche Verteilungskurve. Je größer der Volumenbereich ist, den die Kurve überspannt, desto unpräziser ist die Messung. Die Genauigkeit eines Dosiersystems kann mittels eines gravimetrischen, photometrischen oder titrimetrischen Prüfverfahrens überprüft werden. besondere bei kleinen Volumina (< 50 µl) den Verdunstungsverlust während des Wägevorgangs so gering wie möglich zu halten, sollte ein dem Volumen entsprechendes Wägegefäß benutzt und eventuell eine Verdunstungsfalle eingesetzt werden (Abb. 4). Zufällige (Unpräzision) Teilungswert Waage Waagentyp bis 0,01 µl 0,001 mg Mikrowaage bis 0,1 µl 0,01 mg Halbmikrowaage bis 1 µl 0,1 mg Analysenwaage überwiegende Fehlerart a und b a b Tab. 1: Richtwerte für die gravimetrische Prüfung von Pipetten a) zufällige Fehler b) systematische Fehler zufällige systematische schlecht schlecht sehr gut schlecht gut schlecht gut gut Abb. 2: Zufällige und systematische einer Pipette am Beispiel eines Koordinatenkreuzes Istwert Anzahl der Messungen Sollwert Gravimetrisches Prüfverfahren d geringe zufällige hohe zufällige systematische Volumen Abb. 3: Sollwert: Eingestelltes Volumen der Pipette (hier: 100 µl) Istwert: Am häufigsten gemessenes Volumen aller Pipettierungen d: Systematische, Abweichung des Ist- vom Sollwert Voraussetzung für das gravimetrische Prüfverfahren ist eine analytische Waage oder gleichwertige Wägeeinrichtung. Der Skalenteilungswert muss dem gewählten Volumen des zu prüfenden Dosiersystems entsprechen (Tab. 1). Um ins- d Abb. 4: Pipettenkalibration an der Analysenwaage mit Feuchtigkeitsfalle Weiterhin müssen während der gravimetrischen Kalibrierung folgende Punkte berücksichtigt werden: Die Prüfungen müssen in einem zugfreien Raum stattfinden. Im Prüfraum muss eine relative Luftfeuchte über 50 % und eine konstante Temperatur (± 0,5 C) zwischen 15 und 30 C herrschen. Vor der Prüfung müssen das zu prüfende Dosiersystem und die Prüfflüssigkeit eine ausreichende Zeit im Prüfraum gestanden haben (mindestens zwei Stunden), um Gleichgewicht mit den Raumbedingungen zu erreichen. Die Prüfzyklen müssen so gleichmäßig wie möglich ablaufen. Es ist wichtig, dass die Messdauer sowohl innerhalb jedes Zyklus als auch möglichst von Zyklus zu Zyklus gleich bleibt, um Verdunstungseffekte während einer Messreihe rechnerisch zuverlässig kompensieren zu können. Als Prüfflüssigkeit muss entgastes destilliertes oder ionenfreies Wasser eingesetzt werden.
3 Liquid Handling 7 No 025 Seite 3 Gravimetrisches Prüfverfahren Bei variablen Pipetten werden drei verschiedene Volumina geprüft: Das Nennvolumen (größtes vom Anwender einstellbares und vom Hersteller festgelegtes Volumen) 50 % des Nennvolumens Die untere Grenze des Nutzvolumens oder 10 % des Nennvolumens. In der Regel werden zehn Messungen je Prüfvolumen durchgeführt. Der Anwender kann jedoch die Anzahl der Prüfvolumina, die Anzahl der Messungen je Prüfvolumen und bei Mehrkanalpipetten die Anzahl der geprüften Kanäle in geeigneter Weise ändern, sodass die Überprüfung seinen Genauigkeitsanforderungen entspricht. Entsprechend der Erstjustierung durch den Hersteller müssen Pipetten und Dispenser auf die Abgabe von Prüfflüssigkeit in ein Wägegefäß überprüft werden. Der Prüfvorgang läuft folgendermaßen ab: Das Wägegefäß ist bis zu einer Höhe von mindestens 3 mm mit Prüfflüssigkeit zu befüllen. Die Temperatur der Flüssigkeit, die Raumtemperatur und der Luftdruck (Tab. 2) sind zu messen. (Die Temperaturen und der Luftdruck werden für die Wahl des Korrekturfaktors Z benötigt: siehe Statistische Auswertung der Messergebnisse.). Die Pipette wird mit der entsprechenden Pipettenspitze bestückt und die Pipettenspitze fünfmal mit Prüfflüssigkeit vorbenetzt, um ein Feuchtigkeitsgleichgewicht im»toten«luftvolumen herzustellen. Danach ist die Spitze zu wechseln und einmal vorzubenetzen. Die Waage ist zu tarieren. Bei senkrecht gehaltener Pipette wird die Pipettenspitze wenige Millimeter in die Prüfflüssigkeit eingetaucht. Das zu prüfende Volumen soll langsam und gleichmäßig aufgenommen werden. Dabei ist eine Wartezeit von 1 bis 3 s zu berücksichtigen. Danach wird die Pipettenspitze langsam, an der Gefäßwand abstreifend, aus der Flüssigkeit gezogen. Die gefüllte Spitze ist schräg an die Wand des Wägegefäßes anzulegen und die Prüfflüssigkeit langsam bis zum ersten Hub (Messhub) abzugeben. Durch Drücken des Bedienknopfes bis zum zweiten Anschlag (Überhub) wird die Restflüssigkeit abgegeben. Bei gedrückt gehaltenem Bedienknopf wird die Spitze an der Gefäßwand hochgezogen. Danach wird der Wägewert, also die Masse der pipettierten Flüssigkeit, ermittelt. von Umzurechnen in bar Pascal (Pa) 10 5 bar Hektopascal (hpa) 10 3 bar Kilopascal (kpa) 10 2 millibar (mbar) Pascal (Pa) 10 2 millibar (mbar) Hektopascal (hpa) 1 millibar (mbar) Kilopascal (kpa) 0,1 Tab. 2: Umrechnung verschiedener Druckeinheiten Zu multiplizieren mit Statistische Auswertung der Messergebnisse Im diesem Kapitel werden die wichtigsten statistischen Größen zur Kontrolle einer Volumenmessung vorgestellt und anhand eines einfach nachzuvollziehenden Beispiels berechnet. Es soll bestimmt werden, wie genau eine Pipette mit einem Nennvolumen von 1000 µl Sollwert (V 0 ) dosiert. Dazu wird destilliertes Wasser (20 C) fünfmal aufgenommen und die entsprechenden Wassermengen auf einer Analysenwaage ausgewogen. Die fünf Wägungen ergeben: m 1 = 0,998 g m 2 = 0,999 g m 3 = 0,995 g m 4 = 0,996 g m 5 = 0,975 g Um die zugehörigen Volumina x i zu ermitteln, muss man die Dichte des Wassers berücksichtigen. Aus Tabellenwerken lässt sich entnehmen, dass 1000 µl destilliertes Wasser bei 20 C genau 0,9983 g wiegen. Damit erhält man als Volumen-Istwerte: m i (xi ) = µl 0,9983 g x 1 = 1000 µl x 2 = 1001 µl x 3 = 997 µl x 4 = 998 µl x 5 = 977 µl Zur Vereinfachung können die Wägewerte auch mit den in der DIN EN ISO 8655 festgelegten Korrekturfaktoren Z für destilliertes Wasser in die zugehörigen Volumen-Istwerte umgerechnet werden: x i = m i Z Alle Messungen einer Messreihe sind wie beschrieben durchzuführen.
4 Liquid Handling 77 No 025 Seite 44 Die fünfte Wägung weicht augenscheinlich stark von den anderen vier ab. Sie ist offensichtlich fehlerhaft. Eine mögliche Ursache ist, dass der Tropfen an der Pipettenspitze nicht abgestreift wurde. Derart leicht erkennbare Fehler heißen grobe Fehler. Dieses Ergebnis kann bei der weiteren statistischen Auswertung weggelassen werden. Da auch die verbleibenden vier Ergebnisse unterschiedlich sind, muss der»wahre Wert«irgendwo dazwischen liegen. Eine Annäherung an den wahren Wert erhält man aus dem arithmetischen Mittelwert χ -. Er errechnet sich aus der Summe ( ) der verwendbaren Ergebnisse x i, dividiert durch die Anzahl n der Ergebnisse: n x i i = 1 χ - = n x 1 + x 2 + x 3 + x 4 χ - = 4 Neben der Unrichtigkeit ist eine zweite Größe zur Beschreibung von Messergebnissen nötig. Dies wird deutlich, wenn sich aus den Wägeergebnissen z. B. folgende Volumenwerte ergeben hätten: x 1 = 1011 µl x 2 = 1010 µl x 3 = 986 µl x 4 = 989 µl Auch mit diesen Werten ergäbe die Berechnung des arithmetischen Mittelwerts χ - = 999 µl. Aber die Einzelergebnisse weichen wesentlich stärker voneinander ab: Zwischen dem größten und kleinsten Wert liegen 25 µl. Im vorigen Beispiel betrug die Differenz nur 4 µl. Wie weit die einzelnen Ergebnisse um den arithmetischen Mittelwert streuen, wird durch die Standardabweichung s angegeben. n (x i - χ - ) 2 i = 1 s = ± n µl µl µl µl χ - = 4 χ - = 999 µl Um beurteilen zu können, ob die Messgenauigkeit eines Dosiergeräts innerhalb der vorgegebenen Fehlergrenzen liegt, muss die systematische und zufällige ermittelt werden. Berechnung der systematischen Die systematische oder Unrichtigkeit d ist definiert als die prozentuale Abweichung des Mittelwerts χ - vom Sollwert V 0, bezogen auf den Sollwert. χ - V 0 d =. 100 % V 0 Im obigen Beispiel beträgt sie: 999 µl 1000 µl d =. 100 % 1000 µl d = -0,1% Für die erste Messreihe ergibt dies: ( ) 2 + ( ) 2 + ( ) 2 + ( ) 2 s = ± µl s = ± µl 3 s = ± 1,83 µl Im Fall der zweiten Messreihe ergäbe sich bei analoger Rechnung: s = ± 13,34 µl Berechnung der zufälligen Die zufällige (Unpräzision), auch als Variationskoeffizient VK bezeichnet, ist als das Verhältnis der Standardabweichung s zum arithmetischen Mittelwert χ - definiert, ausgedrückt als Prozentwert: s VK = ±. 100 % χ - Für die erste Messreihe ergibt sich: 1,83 µl VK = ±. 100 % 999 µl VK = ± 0,183 % Die zweite Messreihe liefert hingegen: VK = ± 1,34 %
5 Liquid Handling 7 No 025 Seite 5 Pipettenkalibrations-Software Laboratorien in der Diagnostik und Forschung stellen höchste Ansprüche an die Richtigkeit und Präzision der Dosiergeräte. Die Richtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) verlangen eine regelmäßige Kontrolle der festgelegten Fehlergrenzen. Pipetten können grundsätzlich über einen langen Zeitraum wartungsfrei genutzt werden. Im Einzelfall kann es jedoch zu Undichtigkeiten kommen, z. B. durch Anlösen des Kolbenfetts bei häufiger Pipettierung aggressiver Flüssigkeiten. Dies gilt es rechtzeitig zu erkennen. Führende Hersteller von Pipetten und Dosiersystemen bieten daher eine Kalibrationssoftware an, mit der sich die systematischen und zufälligen en einer Pipette über die gesamte Lebensdauer kontrollieren und dokumentieren lassen. Eine Pipettenkalibrations-Software ist ein umfassendes Programm zur automatischen Aufnahme und Bearbeitung von Messdaten aus der gravimetrischen und photometrischen Pipettenprüfung. Damit können alle Pipettentypen unterschiedlicher Hersteller und auch andere Dosiersysteme, wie z. B. Flaschendispenser, überprüft werden. Mögliche Fehlerquellen beim Pipettieren mit Luftpolsterpipetten Selbst routinierten Anwendern können im Laufe der Zeit Fehlmessungen unterlaufen, auf deren Lokalisierung und Beseitigung in Tabelle 3 hingewiesen wird. Justieren von Luftpolsterpipetten Kolbenhubpipetten sind bei ihrer Herstellung unter den genannten Messbedingungen auf destilliertes Wasser kalibriert worden. Die Luftpolsterpipetten Eppendorf Reference und Research tragen zur Kennzeichnung der Kalibration ein so genanntes Kalibrationssiegel. Kommen Zweifel an der Richtigkeit des Pipettiervolumens auf, sollte an ein Nachjustieren der Pipette wirklich zuletzt gedacht werden. Ein zu geringes Volumen ist oft ein untrügliches Anzeichen für Undichtigkeit. Ist bei einer vollkommen dichten Pipette dennoch eine positive oder negative Abweichung feststellbar, sollten noch einmal alle Messbedingungen geprüft und gegebenenfalls rechnerisch berücksichtigt werden: Passende Pipettenspitzen (System) Temperatur der Probe Temperatur der Pipette Temperatur der Luft Umrechnung von mg in µl. Erst wenn diese Überprüfung keinen Zweifel mehr offen lässt, kann man davon ausgehen, dass sich die Justierung der Pipette durch bestimmte Einflüsse (z. B. durch den Austausch mehrerer wesentlicher Bauteile) verändert hat. Einflussgröße Auswirkung* Beeinflussbar durch Feststellbar durch Abweichung der Dichte der zu pipettierenden Flüssigkeit von der Dichte des bei der Justierung verwendeten Wassers bis 1,0 % Umjustieren der Pipette (siehe Benutzerinformation). Dichte der zu pipettierenden Flüssigkeit mit der Dichte von Wasser vergleichen Abweichung des Dampfdrucks der zu pipettierenden Flüssigkeit zum Dampfdruck von Wasser bei der Justierung bis 2,0 % Pipettenspitze ausreichend vorbefeuchten, EN ISO beachten Spitze tropft Ungleichmäßiger Hubkraftverlauf bis 0,5 % Gleichmäßiger Hubkraftverlauf, Kolben reinigen und fetten Ungleichmäßiger Rhythmus und Zeitabstand Eintauchen der Pipettenspitze und Haltewinkel beim Pipettieren Unterlassen des Vorbefeuchtens der Pipettenspitze Nichtabstreifen der Pipettenspitze an der Gefäßwand Beachten der eigenen Pipettiertechnik bis 1,5 % Gleichmäßig pipettieren Fehlergrenzen werden nicht eingehalten bis 1,0 % Pipette senkrecht halten, Benutzerinformation oder EN ISO beachten Optische Kontrolle der Eintauchtiefe und des Haltewinkels bis 2 % Pipettenspitze vorbefeuchten Fehlergrenzen werden nicht eingehalten bis 3,0 % Abstreifen der Pipettenspitze an der Gefäßwand, EN ISO beachten Undichte Pipettenspitzen 0,5 % bis 50 % Originale oder empfohlene Pipettenspitzen verwenden *: Die möglichen en sind Richtwerte und in Prozent vom Nennvolumen angegeben. Tab. 3: Mögliche Fehlerquellen beim Pipettieren mit Luftpolsterpipetten Fehlergrenzen werden nicht eingehalten Spitze tropft oder Fehlergrenzen werden nicht eingehalten
6 Liquid Handling 7 No 025 Seite 6 Nachjustieren im Fehlerfall Für die Nachjustierung müssen die Pipette, die passende Pipettenspitze und das Wasser dieselbe Temperatur haben (15 C bis 30 C, auf ± 0,5 C konstant). Die Anzeige der Pipette wird auf das gewünschte Sollvolumen eingestellt, das Volumen zehnmal pipettiert und gewogen. Der Mittelwert dieser Wägungen, korrigiert um die Dichte des Wassers bei der gegebenen Temperatur, ergibt das Istvolumen der Pipette. Die Justierung erfolgt nach Herstellerangaben (siehe Bedienungsanleitung der jeweiligen Pipette) mittels des beigefügten Spezialschlüssels. Nach der Justierung wird die Anzeige der Pipette in gewohnter Weise auf das Sollvolumen eingestellt. Falls das Sollvolumen noch immer nicht mit dem Ergebnis der Messungen übereinstimmt, werden die oben genannten Arbeitsschritte wiederholt. Da sich die Justierung auf den gesamten Messbereich auswirkt, müssen bei Pipetten mit variablem Volumen unbedingt sämtliche in den technischen Daten der Pipette angegebenen Volumina ebenfalls überprüft werden (in der Regel sind dies 10 %, 50 % und 100 % vom Nennvolumen). Pipetten, deren Werkseinstellungen durch eine Nachjustierung verändert wurden, müssen laut DIN EN ISO 8655 eine eindeutige sichtbare Kennzeichnung haben. Umjustieren bei Flüssigkeiten mit anderer Dichte als Wasser Es ist möglich, die Kolbenhubpipetten mit Luftposter für ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit mit einer anderen Dichte als Wasser so umzujustieren, dass das angezeigte Volumen dem pipettierten Volumen entspricht. Im Fall von Pipetten mit variablem Volumen sind dann alle anderen Werte dejustiert, d.h., aus einer variablen Pipette wird eine Fixvolumenpipette. Die so eingestellte Pipette liefert nur für die verwendete Flüssigkeit und für das geprüfte Volumen einen mit der Anzeige übereinstimmenden Pipettierwert! Daher muss die umjustierte Pipette unbedingt als»fixvolumenpipette für die Lösung X«gekennzeichnet werden. Der Fehler bei Flüssigkeiten mit erhöhtem Dampfdruck (z. B. organische Lösungsmittel) kann durch Umjustieren nicht ausgeglichen werden. Für Anwendungen mit derartigen Flüssigkeiten wird der Einsatz einer Direktverdrängerpipette empfohlen [1]. Literatur [1] Eppendorf Userguide No. 019: Liquid Handling 1 Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH Deutschland Tel: Fax vertrieb@eppendorf.de Eppendorf Austria Österreich Tel: Fax: office@eppendorf.at Vaudaux-Eppendorf AG Schweiz Tel: Fax: vaudaux@vaudaux.ch Application Support Tel.: support@eppendorf.com eppendorf ist eine eingetragene Marke. Alle Rechte vorbehalten, einschließlich der Graphiken und Abbildungen. Order No. AU025 WW 010/DE1/WEB/0308/NEUH
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