Immunglobuline Komponenten des Komplementsystems Proteine der Blutgerinnung und Fibrinolyse Transportproteine Lipoproteine Akute Phase Proteine

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1 35 PROTEINE DES SERUMS DAS BLUTPLASMA BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN Nach der Abtrennung aller korpuskularen Bestandteile (Blutkörperchen und Thrombozyten) des Blutes erhält man das Blutplasma. Dieses weist einen Proteingehalt zwischen 60 und 80 g/l auf, ein Wert, der ein Gemisch aus über 100 Proteinen widerspiegelt (vgl. Tab.1), die überwiegend in der Leber und im Lymphgewebe synthetisiert werden. Nach ihrer Funktion lassen sich diese Proteine in folgende Gruppen einteilen: Immunglobuline Komponenten des Komplementsystems Proteine der Blutgerinnung und Fibrinolyse Transportproteine Lipoproteine Akute Phase Proteine Die Biosynthese und der Abbau der Plasmaproteine werden im Rahmen eines dynamischen Gleichgewichtes reguliert. Störungen dieses Gleichgewichtes können zu einem Absinken des Plasmaproteinspiegels führen, was als Hypoproteinämie bezeichnet wird. Ursächlich kann eine durch Hunger oder Schädigung des Leberparenchyms hervorgerufene Verringerung der Biosynthese sein. Möglich ist aber auch die vermehrte Ausscheidung der Plasmaproteine über den Gastrointestinaltrakt oder die Niere. Erhöht sich hingegen die Konzentration der Plasmaproteine, so bezeichnet man dieses als Hyperproteinämie. Hyperproteinämie liegt z.b. bei der vermehrten Biosynthese der -Globuline vor, die durch maligne klonale Plasmazellen verursacht wird. Das so entstehende Krankheitsbild wird als Plasmocytom bezeichnet. Zur klinischen Diagnostik derartiger Erkrankungen ist allein die Bestimmung der Proteinkonzentration im Plasma nicht ausreichend, da ein ungewöhnlicher Plasmaproteingehalt auch durch eine nicht-pathologische Vermehrung oder Verminderung des Wassergehalts des Bluts verursacht sein kann. Aus diesem Grund wird meist mit elektrophoretischen Verfahren eine Grobauftrennung der Plasmaproteine in Einzelfraktionen durchgeführt.

2 36 Tab.1: Proteine des menschlichen Blutplasmas (Auswahl, entnommen aus Löffler- Petrides, 7. Auflage) Proteine Molekulargewicht (kd) Normalbereich im Serum (g/l) Funktion Albumine Präalbumin 61 0,1-0,4 Thyroxinbindung Albumin Transportfunktion α 1 -Globuline α 1 -Antitrypsin Proteaseinhibitor α 1 -Lipoprotein 200 2,9-7,7 Transport von Lipiden, Hormonen Prothrombin 60 0,05-0,1 Proenzym des Thrombins Transcortin 45 Cortisolbindung Thyroxin-bindendes Globulin 45 Thyroxinbindung α 1 -Antichymotrypsin 68 0,3-0,6 Chymotrypsininhibitor Gc-Globulin 50 0,2-0,55 Vitamin D-Bildung α 2 -Globuline α 2- Antithrombin III 65 0,17-0,3 Thrombininhibitor α 2 Haptoglobin 100 0,8-3,0 Hämoglobinbildung α 2 -Makrogobulin 820 Plasmininhibitor Plasminogen 143 0,06-0,25 Proenzyms des Plasmins β-globuline β-lipoprotein ,5- Transport von Lipiden β- 1 C-Globulin 85 0,8-1,4 Komplementfaktor Hämopexin 80 0,5-1,15 Häminbindung Transferrin Bindung und Transport von Eisen Fibrinogen ,5 Blutgerinnung -Globuline IgG Antikörper IgA 160 0,9-4,5 Antikörper IgM 900 0,6-2,8 Antikörper IgD 170 <0,15 Antikörper IgE 190 <6x10-4 Antikörper Lysozym x10-3 Bakterienauflösung

3 37 ELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN Methoden zur Trennung von Proteinen beruhen auf Eigenschaften wie elektrischer Ladung, Größe und Löslichkeit, die je nach Protein variieren. Eine wichtige Methode basiert auf der Eigenschaft geladener Proteine, in einem elektrischen Feld zu wandern, ein Prozess, den man als Elektrophorese bezeichnet. Die erste Elektrophorese wurde in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts von Arne Tiselius entwickelt und 1948 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. In einem mit Puffer gefüllten U-förmigen Rohr, dessen Schenkel mit einer Gleichstromquelle verbunden waren, trennte Tiselius menschliche Seren in die vier Hauptkomponenten Albumin sowie α-, β- und - Globulin auf. Dieses erste Elektrophoreseverfahren basierend auf flüssigen Medien wurde wegen der komplizierten Handhabung und Auswertbarkeit bald zur Zonenelektrophorese weiterentwickelt. Nun dienten feste Medien wie Papier, Agargele und Kieselgele der Probentrennung. Da jedoch diese Trägermaterialien wegen ihrer starken Eigenladung und geringen Retardation sehr diffuse Banden ergeben, wurden neue, inertere Matrices eingeführt: Stärkegele (Smithies, 1955), Celluloseacetatfolien (Kohn, 1957), Polyacrylamidgele (Raymond und Weintraub, 1959) sowie Agarosegele (Hjerten, 1961). Noch heute werden Stärkegele für genetische Untersuchungen verwendet (z.b. Chromosomenanalyse). Agarosegele werden hauptsächlich zur Trennung von kleineren DNA- Fragmenten und für Immunelektrophoresen zur spezifischen und quantitativen Detektion von Proteinen eingesetzt. Polyacrylamidgele besitzen das höchste Auflösungsvermögen sowohl für DNA-Fragmente als auch für Proteine. Die Celluloseacetatfolien finden Verwendung bei klinischen Routineuntersuchungen insbesondere der Analyse von Blutproben. GRUNDLAGEN DER ELEKTROPHORESE Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit und infolge davon räumliche Trennung der Sorten von Teilchen voneinander.

4 38 Werden elektrisch geladene Teilchen einem elektrischen Feld ausgesetzt, so wandern die positiv geladenen Teilchen (Kationen) zum Minus-Pol (Kathode), die negativ geladenen Teilchen (Anionen) zum Plus-Pol (Anode). Der Grund für diese Wanderung ist die auf ein Teilchen mit der Ladung q wirkende Kraft F e : F e = E q mit q=z e F e = am geladenen Teilchen angreifende Kraft [N] E = elektrische Feldstärke [V. m -1 ] = [N. C -1 ] q = Netto-Ladung des Teilchens im Feld z = Zahl der Elementarladungen pro Teilchen e= Elementarladung 1, (35) C Die Kraft F e bewirkt, dass sich die Teilchen im elektrischen Feld bewegen. Ihr entgegengesetzt wirkt die Reibungskraft F fr, die durch das Stoke`sche Gesetz beschrieben wird: F fr =6 π r ŋ v F fr = Reibungskraft [N] r = Partikelradius [m] ŋ = Viskosität des Mediums [Pa. s] = [N. m -2. s] v = Wanderungsgeschwindigkeit [m. s -1 ] CELLULOSEACETATFOLIEN-ELEKTROPHORESE Bei der Celluloseacetatfolien-Elektrophorese werden nicht-denaturierte Proteine getrennt. Die native Konformation der Proteine wird dabei nicht verändert. Aufgrund ihres strukturellen Aufbaus zeigen Celluloseacetatfolien nahezu keine Adsorptionseffekte gegenüber Proteinen und kommen damit dem idealen Trägermaterial recht nahe. Celluloseacetatfolien haben eine schaumartige Struktur und können, obwohl sie kaum hydrophile Eigenschaften aufweisen, bis zu 85% Pufferlösung aufnehmen. Wegen ihrer durchgehend homogenen Struktur gelingt es, mit derartigen Folien elektrophoretische Trennungen bei relativ hohen Spannungen

5 39 durchzuführen, wodurch der Zeitaufwand der Elektrophorese wesentlich verkürzt wird. Da Protein-Anfärbereagenzien ebenso wie Proteine kaum adsorbiert werden, können sie in wenigen Minuten ausgewaschen werden. Durch geeignete Maßnahmen lassen sich die Folien vollständig transparent machen und ermöglichen dadurch eine quantitative photometrische (densitometrische), automatisierbare Auswertung. Diese Art der Elektrophorese gehört in der klinischen Chemie und Biochemie zu den häufig durchgeführten Analysemethoden. Als Probe für diese Art der Elektrophorese dient in der Regel das Blutserum, nicht aber das Plasma (Blutserum inklusive Fibrinogen), da durch das darin enthaltene Fibrinogen das Elektrophoresemuster häufig undeutlich wird. Nach dem Auftragen der Proben auf die Acetatfolie wird an diese in einer feuchten Kammer eine konstante elektrische Gleichspannung für die Trennzeit angelegt, in der die Proteine von der Auftragsstelle aus entsprechend ihrer Ladung und damit ihrer elektrischen Beweglichkeit entlang einer Trennstrecke von der Kathode (-) zur Anode (+) wandern (Abb.1). Auftrags-Position für die Probe Abb.1. Schematische Darstellung der Apparatur zur Serumelektrophorese Aufgrund des Verhaltens bei der elektrophoretischen Trennung von Serumproteinen lassen sich folgende Fraktionen einteilen: Albumin α 1 -Globuline α 2 -Globuline β-globuline -Globuline Albumin läuft im elektrischen Feld am schnellsten, gefolgt von den α 1, α 2 und β-globulinen; - Globuline wandern besonders langsam (Abb.2).

6 40 PROTEINBESTIMMUNG Werden mehrere Seren parallel analysiert, ist es empfehlenswert, parallel zur Elektrophorese eine Bestimmung des Gesamtproteingehaltes durchzuführen. Dies ermöglicht eine bessere Einschätzung der relativen Abundanzen einzelner Proteinfraktionen, da die Summe der abgebildeten Proteine immer bei 100% liegt. Die Proteinbestimmung ist eine der am häufigsten durchgeführten Methoden in der biochemischen Forschung. Es existieren eine Reihe verschiedener Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Diese unterscheiden sich hinsichtlich Sensitivität und Störanfälligkeit. Man unterscheidet grundsätzlich die Absorptionsspektroskopie, bei der die Absorption der Proteinlösung direkt gemessen wird, von kolorimetrischen Methoden, bei denen die Verfärbung der Proteinlösung nach Zugabe bestimmter Farbstoffe gemessen wird. Zu den gängigsten kolorimetrischen Methoden gehören die Biuret-Methode, die Bradford-Methode und die BCA-Methode. Letztere Methode zeichnet sich durch eine einfache Durchführung, hohe Sensitivität und geringe Störanfälligkeit aus, weshalb sie für die Proteinbestimmung von komplexen Mischungen (wie z.b. Serum) gut geeignet ist. Das Prinzip des hier verwendeten BCA-Assays beruht auf der Bildung von Cu 2+- Proteinkomplexen unter basischen Bedingungen. Im Anschluss erfolgt die Reduktion des Cu 2+ zu Cu 1+, dessen Konzentration direkt proportional zur Proteinkonzentration ist. BCA (Bicinchoninic acid) bildet mit Cu 1+ einen violett-blauen Komplex, der spektrometrisch bei 562 nm detektiert werden kann. Das Prinzip des BCA-Assays soll im Rahmen dieses Praktikums durch die Messung zweier Standard-Proteinlösungen demonstriert werden. Diese Standardproteine werden anschließend zusammen mit den Seren elektrophoretisch aufgetrennt. DENSITOMETRIE Nachdem die Serumproteine elektrophoretisch aufgetrennt wurden, ist zur Krankheitsdiagnose fast immer eine quantitative Auswertung der gefärbten Proteine notwendig. Hierzu werden Densitometer eingesetzt, deren Funktionsweise mit der des Photometers vergleichbar ist. Computerunterstützt wird mit einem Scanner eine bewegliche Lichtquelle über die Acetatfolie geführt und die Absorption an jeder Stelle der Acetatfolie gemessen. Resultierend hieraus erhält man eine Kurve der Extinktion lg(i 0 /I) über die Folienlänge, wobei I 0 die eingestrahlte Intensität und I die am Detektor gemessene Intensität darstellt (Abb.2).

7 41 Auftrags-Position für die Probe Abb.2: Angefärbte Celluloseacetatfolie nach erfolgter Elektrophorese (unten) und die densitometrische Auswertung (oben). (Modifiziert nach Schmidt und Thews, 27. Auflage) Nach dem Lambert Beerschen Gesetz nimmt die Extinktion einer verdünnten Lösung linear zur Konzentration zu. Bei der Densitometrie von elektrophoretisch getrennten Proteinbanden stimmt dieser Zusammenhang aber nicht mehr, da dort die Proteinkonzentration sehr hoch ist und die Färbung in eine Sättigung übergeht, so dass über bestimmten Absorptionswerten hyperbolische oder sigmoidale Abhängigkeiten beobachtet werden. Dazu trägt bei, dass während der Färbung starken Banden in der Folienumgebung relativ weniger Farbstoff zur Verfügung steht als schwachen Banden, die eine für sie maximale Menge an Farbstoff binden können. Daher werden schwache Banden in ihrer Menge oft überschätzt und große Proteinmengen unterschätzt. Die Auswertung der gescannten Proteinbanden erfolgt nach Kalibrieren der Geräte mittels photographischer Graukeile über die Proportionalität der Proteinkonzentration und der Bandenintensität. Derartige Auswertungen erfolgen heute praktisch ausschließlich computerunterstützt, wobei spezialisierte Softwarepakete die Subtraktion der Hintergrundfärbung, die Bandenerkennung, Quantifizierung und die Dokumentation übernehmen. Auch für den Vergleich von Mehrfachbestimmungen ein und derselben Probe auf unterschiedlichen Folien, zwischen denen immer kleine Unterschiede und Verzerrungen existieren, kann diese Software genutzt werden. Die Qualität der Resultate hängt aber weitgehend von der Qualität der Folien ab und manuelle Nachbearbeitungen vor allem bei der Bandenerkennung sind heute noch unerlässlich.

8 42 PATHOBIOCHEMIE Eine Abweichung des Profils der einzelnen Plasmaproteinfraktionen von der Norm ist ein diagnostisches Merkmal unterschiedlicher Erkrankungen, die unter dem Begriff der Pathoproteinämien zusammengefasst werden (vgl. Abb.3). Diese Bezeichnung umfasst im einzelnen Dys-, Defekt- und Paraproteinämien. Abb.3. Densitogramme von Blutseren unterschiedlicher Pathoproteinämien Bei Dysproteinämien ist die Menge einzelner Plasmaproteinfraktionen erhöht oder erniedrigt. In Abhängigkeit von der betroffenen Fraktion unterscheidet man den α-, α 2 -β, β- sowie den - Typ. Der α-typ ist meist durch akute Entzündungen verursacht und weist sich durch eine Verminderung der Albumine einhergehend mit einer Erhöhung der α 1 - und β 2 -Globuline aus. Die -Fraktion ist häufig erhöht, kann aber auch Normalwerte aufweisen. Wie beim α-typ liegt auch beim α 2 -β-typ wie z.b. beim nephrotischen Syndrom - eine Verminderung der Albumine vor. Sehr stark erhöht sind die α 2 -Globuline, die β-globuline sind ebenfalls deutlich vermehrt. Die -Globuline sind meist vermindert, können aber auch normal oder erhöht vorliegen. Der β-typ - die Vermehrung der β-fraktion - kommt sehr selten vor.

9 43 Chronische Entzündungen, Hepatitis oder auch Leberzirrhose sind durch eine - Dysproteinämie gekennzeichnet. Hierbei sind die Albumine vermindert, die -Globuline hingegen vermehrt. Durch die Vermehrung der IgG-, aber auch der IgA- und IgM-Globuline, erscheint die gesamte -Bande verstärkt. Defektproteinämien sind durch den genetischen Mangel einzelner Proteine gekennzeichnet. Resultierend aus diesem Defekt kommt es zum Fehlen einzelner Fraktionen des Blutserums. Ein Vertreter dieser sehr seltenen Erkrankungen ist die Agammaglobulinämie, die auch als Antikörpermangelsyndrom bezeichnet wird. Dieser X-chromosomal gekoppelten Erkrankung liegen einzelne Mutationen zugrunde, die eine Reifung von B-Zellen zu Antikörperproduzierenden Zellen verhindern. Dies hat das Fehlen von Immunglobulinen zur Folge. Im Gegensatz zur den beschriebenen Defektproteinämienen kommt es bei den Paraproteinämienen zu einer drastischen Vermehrung einheitlicher Immunglobuline. Im Falle des multiplen Myeloms (Plasmocytom) führen maligne Plasmazellen zu einer Überproduktion monoklonaler Immunglobuline. In der Serumelekrophorese äußert sich diese Erkrankung in Form einer schmalbasigen, hochaufstrebenden Bande (Peak). ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE Zahlreiche Erkrankungen sind anhand quantitativ unterschiedlicher Zusammensetzungen der Serumproteine mittels der Serumelektrophorese zu diagnostizieren. Eine derartige Diagnose soll im Rahmen der Versuche anhand von Normal- und pathologischen Seren mit der Celluloseacetat-Folien-Elektrophorese und anschließender densitographischer Auswertung und Vergleich der Proteinbanden mit zwei Standard-Serumproteinen erfolgen. Die Densitogramme der unterschiedlichen Seren sollen in der Gruppe verglichen und mögliche Ursachen für deren Abweichungen von der Norm diskutiert werden.

10 44 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL Um einen Vergleich der relativen Abundanzen relevanter Serumproteine zu ermöglichen, sollen zwei Standards pro Bankreihe (ein Standard pro Gruppe) aufgetrennt werden. Dabei handelt es sich um Albumin und -Globuline. Die Konzentration von Albumin im Serum von gesunden Menschen liegt bei etwa g/l, während die Konzentration der -Globuline mit etwa 8-18 g/l deutlich niedriger ist. Da die Konzentration der hier verwendeten Standardlösungen nicht bekannt ist, soll zunächst eine Proteinbestimmung erfolgen. Für die Proteinbestimmung werden Reagenz A und Reagenz B gemischt (Farbreagenz). Der Standard mit unbekannter Proteinkonzentration wird 1:100 in PBS-Puffer 1 verdünnt. 50 µl der verdünnten Standard-Lösung werden mit 1 ml des Farbreagenz vermischt und für 15 Minuten bei 60 C inkubiert. Als Leerwert für die photometrische Messung werden 50 µl PBS- Puffer mit 1 ml des Farbreagenz vermischt und ebenfalls für 15 Minuten bei 60 C inkubiert. Anschließend werden die Proben in Küvetten überführt. Das Photometer wird mit dem Leerwert auf null geeicht. Anschließend werden die beiden Standardproben bei 562 nm gemessen. Die Proteinkonzentration wird durch das Lambert-Beer-Gesetz ermittelt: A = ε Percent c d A = Absorption ε Percent = Prozentualer Extinktionskoeffizient [100 ml. g -1. cm -1 ], hier 19 (100 ml. g -1. cm -1 ) d = Schichtdicke der Küvette [cm], hier 1 cm c = Konzentration (g/100 ml) Achtung!!! Verdünnung der Proteinlösung nicht vergessen! Nachdem die Konzentration der Standard-Lösung ermittelt wurde, erfolgt die Einstellung der Konzentrationen durch Verdünnung mit PBS 1 (40 g/l für HSA und -Globuline). Anschließend wird der Standard in das Well rechts neben die Serumproben gefüllt (20 µl). 1 PBS: Phosphate-buffered saline

11 45 ELEKTROPHORESE Die Elektrodenräume des Elektrophorese Gefäßes werden mit je etwa 400 ml ATX-Puffer 2 bis zur Markierung gefüllt. Die restlichen 100 ml werden in eine Plastikschale gefüllt, wo sie zum Befeuchten der Folien dienen. Die Folien, von denen jede zum Auftragen von 3 Proben geeignet ist, können im trockenen Zustand mit Kugelschreiber beschriftet werden. Die Streifen werden flach auf die Oberfläche des restlichen Puffers in die Glasschale fallen gelassen und erst bei vollständiger Benetzung vorsichtig untergetaucht. Nach etwa 5 min werden die Membranen wieder aus der Lösung genommen und zwischen zwei Filterpapierstreifen von überschüssiger Flüssigkeit befreit. Die Folien dürfen dabei weder gepresst werden noch austrocknen. Mit der Pinzette (!) werden sie anschließend so in die Streifenträger eingesetzt, dass die Stifte der Folienhalterung in die Perforationslöcher der Folie greifen und die Streifenenden in die Pufferlösungen eintauchen. Diese zuletzt genannten Handgriffe vom Ablöschen der Folien an müssen rasch durchgeführt werden, damit die Streifen nicht wieder trocknen, was durch das Auftreten weißer Flecken angezeigt wird. Die aufzutrennenden Proteingemische liegen in einer Füllkammer mit verschiedenen Wells vor. Durch Eintauchen des Mikroauftragestempels in die gefüllten Wells wird eine geringe, je nach Stempelgröße definierte Menge der Lösung aufgenommen und kurz auf die Folie durch fallen lassen überstempelt. Zwischen den einzelnen Auftragungen ist der Stempel mit Aqua dest. (Spritzflasche) zu reinigen und durch Auftupfen auf Filterpapier abzutrocknen. Zur Verminderung der Diffusion sollen die Proben in rascher Folge aufgetragen werden. Nach dem Entfernen der Auftragsbrücke und dem Aufsetzen des Deckels wird an das Gerät für 20 Minuten eine Spannung von 220 Volt gelegt. Nach Beendigung der Elektrophorese werden die Folien sofort für 5 Minuten in die Färbelösung gelegt. Ein Übereinanderliegen der Folien sollte durch die Wahl einer entsprechend großen Schale vermieden werden. Nach der Färbung erfolgt unter leichtem Schütteln die Inkubation in Entfärbelösung (2 Minuten). Zum völligen Entfärben der Folien wird ein zweites anschließendes Entfärbebad genutzt. Nachdem der Folienhintergrund völlig weiß ist, werden die Folien ½ -1 Minute in Klärlösung getaucht. Danach werden diese luftblasenfrei auf einen Objektträger aufgezogen. Überstehende Folienenden werden abgeschnitten und der Objektträger auf einer Heizplatte (Stufe 6) so lange inkubiert, bis der Folienhintergrund durchsichtig ist. 2 Handelsname der Firma Biotec Fischer; ATX steht für atoxisch.

12 46 AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION Das Bandenmuster auf den Folien wird mittels eines Durchlichtscanners in digitale s/w Bilder umgewandelt. Diese Dateien werden im Folgenden softwaregestützt densitometrisch ausgewertet. Es erfolgt die Messung der Proben über die gesamte Laufstrecke. Das Programm misst die Graufärbung der einzelnen Banden und stellt sie in einem Graphen dar. Hohe Signale entsprechen dabei einer starken niedrige Signale einer schwachen Färbung bzw. Proteinkonzentration. Diesen Signalen sollen die entsprechenden Serumfraktionen zugeordnet werden. Die Daten der einzelnen Gruppen sollen verglichen und Veränderungen in der Zusammensetzung der Seren und deren mögliche Ursachen diskutiert werden. SCHLUSSFOLGERUNGEN

13 47 KURZANLEITUNG Gruppennummer beachten! 1. Reagenz A und Reagenz B mischen (Farbreagenz) 2. 5µl der Proteinstandardlösung in einem Eppi 1:100 mit PBS verdünnen µl der verdünnten Proteinstandardlösung mit 1 ml des in Schritt 1 angesetzten Farbreagenzes mischen µl PBS-Puffer in einem Eppi mit 1 ml Farbreagenz versetzen (Leerwert) 5. Die zwei Proben für 15 min bei 60 C im Heizblock inkubieren 6. Proben kurz abkühlen lassen 7. Proben in Küvetten überführen 8. Photometer mit Leerwertprobe (PBS + Reagenz) auf null eichen (562 nm) 9. Probe messen 10. Konzentration berechnen 1. Schritt (wie im Skript angegeben) Weitere Rechenschritte: 2. Schritt: C (gewollt) * V (gewollt) = C (gemessen) * V (benötigt) 3.Schritt: V (benötigt) + y µl PBS = 20 µl 11. Proteinstandard (unverdünnt) mit PBS verdünnen (Zielkonzentration ist 40 mg/ml) µl dieses Proteinstandards in das Well rechts neben den vorgelegten Serumproben pipettieren (Gruppennummer beachten) 13. ATX Puffer in die dazugehörige Plastikschalen füllen 14. Die Folie mit Kugelschreiber oberhalb der Perforation mit Gruppenkürzel beschriften 15. Folie in die Schale mit ATX-Puffer geben und vorsichtig mit der Pinzette untertauchen, bis die Folie vollständig durchnäßt ist. 5min stehen lassen 16. Folie zwischen zwei Filterstreifen legen und von der überschüssigen Flüssigkeit befreien. Achtung, die Folie darf dabei nicht austrocknen (dies erkennt man daran, dass eine weiße Oberfläche entsteht). Ansonsten Schritt 15 wiederholen 17. Folie mit der Pinzette in der Halterung des Streifenträgers befestigen und in die Elektrophoresekammer einsetzen. Wichtig: die Enden der Folie müssen in den Puffer eingetaucht sein 18. Der Mikroauftragestempel, auch Auftragebrücke genannt, wird nun in die Füllkammer aufgesetzt und wieder herausgezogen, dabei bleibt circa 1µl der Probe am Kamm hängen 19. Nun wird der Kamm auf die in der Elektrophoresekammer befindliche Folie fallengelassen (mittleres Einschubraster)

14 Elektrophoresekammer mit dem Deckel verschließen (Pole beachten!!) Anmerkung: Serum ist negativ geladen und fließt zur Anode (+-Pol) 21. Über einen Zeitraum von 20 min wird eine Spannung von 220 V, ca. 6 ma angelegt und die Serumbestandteile können sich im elektrischen Feld auftrennen 22. Färben der Folie: Folie für 5 min in die Färbelösung legen 23. Entfärben der Folie: Folie für 2 min ins Entfärbebad legen, bis der Folienhintergrund wieder weiß ist. Falls nötig den Vorgang wiederholen 24. Klärlösung: Folie 1 min in die Klärlösung tauchen 25. Folie luftblasenfrei mit dem Folienroller auf den Objektträger ziehen 26. Überstehende Enden abschneiden 27. Objektträger solange auf die Heizplatte (Stufe 6) legen, bis der Hintergrund der Membran wieder durchsichtig ist (Schutzbrille tragen, dauert ca. 3 min) 28. Objektträger abkühlen lassen 29. Gruppennummer unten auf den Objektträger links mit Edding schreiben 30. Zum Scanner gehen und dem Assistenten geben 31. Scanergebnisse werden im Seminar besprochen Anmerkung: Lösungen in den Färbeschalen bitte nicht wegschütten, Entsorgung übernimmt der Assistent