Wie ein Krebsmedikament entsteht

Transkript

1 Wie ein Krebsmedikament entsteht 15. Juni 2010 Horst Kessler

2 Krebs (Häufigkeit und Mortalität) I nsti tutf

3 Evolution des Lebens auf der Erde Einzeller Mehrzeller Mensch Milliarden Jahre jetzt Menschen gibt es erst seit ca Jahren. Das entspricht etwa 10 Sekunden, wenn die Entwicklung des Lebens auf einen Tag gerechnet wird. Die Venus von Willendorf, eine der ältesten Skulpturen der Menschheit (ca Jahre alt) entstand weniger als eine Sekunde vor der Gegenwart!

4 Evolution des Lebens auf der Erde Einzeller Mehrzeller Mensch Milliarden Jahre jetzt Höhere Organismen brauchen: Zellsignale Signalweiterleitung Apoptose (gezielter Zelltod) Erkennung und Regulation der Anheftung von Zellen (Nachbarschaft)

5 Krebs gibt es nur bei höheren Organismen! Die Evolution des Lebens begann vor ca. 4 Milliarden Jahren. Erst vor weniger als einer Milliarde Jahren traten erstmals Mehrzeller (höhere Lebewesen) auf. Warum ist das so? Es mussten erst viele neue Entdeckungen gemacht werden: Das Wachstum der Zellen muss durch die Umgebung kontrolliert werden. Zelltod (gezieltes Absterben; Apoptose) Die Zellen müssen miteinander kommunizieren können. Die Zellen müssen gewebespezifisch sein (Reifung)

6 Schrittweise Entwicklung eines bösartigen Tumors 1 2 Zelle mit Neigung zur Vermehrung unkontrolliertes Wachstum (Geschwulst) 3 4 einige Zellen wandern aus, bilden (Metastasen) Krebs durchdringt Gewebebarrieren

7 Apoptose = natürlicher Zelltod Charakteristika von Krebs eigenes Wachstum Wachstum der Apoptose entkommen keine Verhinderung des Wachstum Angiogenese Krebszellen grenzenlose Vermehrung Angiogenese = Bildung neuer Blutgefäße Eindringen in fremdes Gewebe genetische Instabilität

8 Zellwachstum Da sich alle Zellen aus einer einzigen Stammzelle entwickeln, müssen sie reifen und sich durch Differenzierung in die einzelnen Gewebezellen entwickeln Die Teilungsfähigkeit reifer Zellen ist begrenzt (maximal ca. 60 mal teilungsfähig) Nobelpreis Medizin 2009 Unbegrenztes Zellwachstum, wie es im Krebs auftritt, ist eine Entartung. Entartungen können immer auftreten. Beispielsweise gibt es jeden Tag in jeder Körperzelle ca. eine Millionen DNA Strangbrüche Es gibt zum Glück ein Protein (p53), das diese Strangbrüche erkennt und die weitere Vermehrung der Zellen anhält, bis alles repariert ist oder die Zelle in den Tod (Apoptose) schickt.

9 DNA RNA Langzeitspeicher Transkription Vermehrung (Proliferation) etwas Biologie Zellkern Translation Protein Funktion Arbeitspferd Zellmembran im Mensch: 3x10 9 Basen (je 1 cm dann reicht es ein mal um die Erde)

10 vorher Licht Mutation nachher Es gibt jeden Tag in jeder Körperzelle ca. eine Millionen DNA Strangbrüche Also: es muss ständig repariert werden, sonst wären wir alle tot. Zellkern Chromosom Zelle DNA

11 Entstehung von Krebs Schädigung durch Strahlen oder Chemikalien (auch natürliche Stoffe) defekte Reparaturenzyme Erkennung des Defekts durch p53 Mutation keine Erkennung durch defektes p53 Halt der Zellvermehrung oder Apoptose Ungesteuerte Zellvermehrung

12 p53 der Wächter des Genoms defekte Reparaturenzyme Erkennung des Defekts durch p53 Mutation keine Erkennung durch defektes p53 Halt der Zellvermehrung oder Apoptose Ungesteuerte Zellvermehrung

13 p53 der Wächter des Genoms defekte Reparaturenzyme bei Krebs: defektes p53 also keine Kontrolle Mutation keine Erkennung durch defektes p53 Halt der Zellvermehrung oder Apoptose Ungesteuerte Zellvermehrung

14 Probleme in der Krebstherapie Es gibt sehr viele verschiedene Krebsarten (je nach Klassifizierung über 100) Krebszellen durchziehen das natürliche Gewebe Innerhalb eines Krebses gibt es verschiedene Zelltypen (Heterogenität)

15 Probleme in der Krebstherapie Es gibt sehr viele verschiedene Krebsarten (je nach Klassifizierung über 100) Krebszellen durchziehen das natürliche Gewebe Innerhalb eines Krebses gibt es verschiedene Zelltypen (Heterogenität) Krebszellen mutieren sehr schnell und entkommen I nsti tutf damit meist der Chemotherapie Wegen der hohen Mutationsraten können sich Transportsysteme entwickeln, die die toxischen Krebsmedikamente aus dem Krebs herausschleusen (Resistenz)

16 Probleme in der Krebstherapie Es gibt sehr viele verschiedene Krebsarten (je nach Klassifizierung über 100) Krebszellen durchziehen das natürliche Gewebe Innerhalb eines Krebses gibt es verschiedene Zelltypen (Heterogenität) Krebszellen mutieren sehr schnell und entkommen damit meist der Chemotherapie (p53 ist kaputt!) Wegen der hohen Mutationsraten können sich Transportsysteme entwickeln, die die toxischen Krebsmedikamente aus dem Krebs herausschleusen (Resistenz) (vergleichbar der Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika)

17 Apoptose = natürlicher Zelltod Charakteristika von Krebs eigenes Wachstum klassische Chemotharapie: alle wachsenden Zellen werden getötet der Apoptose entkommen keine Verhinderung des Wachstum Angiogenese grenzenlose Vermehrung Angiogenese = Bildung neuer Blutgefäße Eindringen in fremdes Gewebe genetische Instabilität Haarausfall Darmprobleme Geschlechtszellen

18 Wie tötet man Krebszellen ohne gesunde Zellen zu treffen? 1. Selektive Toxizität Arzneimittel, die auf Tumorzellen einen stärker wachstumshemmenden Einfluss haben als auf normale Zellen Imatinib (Gleevec ) 2. Gezielter Transport zur Krebszelle Stoffe, die spezifisch mit Molekülen reagieren, die beim Krebs verstärkt vorhanden sind Antikörper, peptidische Hormone Integrin-Liganden 3. Angiogenese (Bildung neuer Blutgefäße) Nutzt die abnormale Gefäßstruktur der Tumoren Bevacizumab (Avastin ), RGD Peptide In Liposomen verkapselte Arzneimittel

19 Eine Naturstoff ist noch lange kein Arzneimittel Natur Multidimensionale Optimierung Mehrere (verschiedene) Rezeptoren Medizinischer Chemiker I nsti tutf Optimierung für ein ausgesuchtes Zielmolekül Spezifität Stabilität Lokale und zeitliche Verteilung Super-Aktivität

20 Präklinik Der lange Weg zum Arzneimittel Zulassung Klinik

21 Der Weg von der Theorie zum Arzneimittel Molekül Zelle Tier Mensch Präklinische Phase ca Jahre Klinische Phase ca Jahre I II III 1. Ziel definieren, Test entwickeln 2. Hit auffinden, Leitstruktur entwickeln 3. Tierversuche (Wirkung im Tier aufzeigen; Toxizität, Dosisabschätzung) I. Verträglichkeit, Dosis II. Wirksamkeit am Mensch III. Breiter Einsatz am Patienten

22 Im Durchschnitt arbeiten Forscher Jahre an der Entwicklung eines neuen Wirkstoffes, der einmal ein Arzneimittel werden könnte aber noch nicht ist Die Forschungs- und Entwicklungskosten betragen derzeit etwa 1 Milliarde pro Medikament Nur zwei von 10 vermarkteten Arzneimitteln bringen die Kosten wieder ein, bzw. bringen mehr Verdienst als Forschungs- und Entwicklungskosten. Die Pharmazeutische Industrie hat zunehmende Herausforderungen bei der Entwicklung eines neuen Medikamentes zu bewältigen. Die Zahl neuer Medikamente pro Jahr ist dramatisch gesunken (derzeit unter 18/Jahr).

23 Charakteristika von Krebs Apoptose = natürlicher Zelltod eigenes Wachstum der Apoptose entkommen keine Verhinderung des Wachstum Angiogenese grenzenlose Vermehrung Angiogenese = Bildung neuer Blutgefäße Eindringen in fremdes Gewebe genetische Instabilität

24 Tumor-assoziierte Angiogenese I nsti tutf

25 Krebs 1. Wachstumsfaktoren 2. Integrine werden gebildet 3. Blutgefäße wachsen

26 Zelladhäsion: Keine Adhäsion Apoptose

27 Die Zellen hängen an fokalen Adhäsionspunkten wie das Münchner Olympiazelt In den fokalen Adhäsionspunken sind Integrine zu finden Actin Vinculin

28 Integrine sind bidirektionale Adhäsionsrezeptoren Extrazelluläre Matrix Zelladhäsion Signal α-untereinheit β-untereinheit von außen außen innen Zellgerüst von innen

29 Das RGD-Motiv als Erkennungssequenz I nsti tutf

30 Integrin Untertypen 18 α-untertypen und 8 β-untertypen bilden 24 Dimere β2 αl αd αm αx αe β7 α4 Laminin receptors α6 α3 α7 β1 β4 α8 β8 αv α5 β6 β5 β3 Zelladhäsion, Angiogenese Krebs Blutplättchen- Aggregation Thrombose αiib Leukocyte receptors α9 α1 α2 α11 α10 RGD receptors Collagen receptors

31 Beweglichkeit von Zellen auf RGD beschichteten Oberflächen Das αvβ3 Integrin ist verantwortlich für Beweglichkeit normale OV-MZ-6 Zelllinien Zellen mit dreifach höherer αvβ3-dichte U. Reuning, Frauenklinik, Klinikum rechts der Isar, München

32 Selektivität von Integrin Subtypen, die alle die RGD Sequenz erkennen Integrin natürliche Proteine außerhalb der Zellen (ECM) αvβ3 Vn Ln Fn vwf αvβ5 Vn Fn Opn Fb α5β1 Fn αiibβ3 Vitronectin Fibrinogen Fibronectin Osteoepondin von Willebrandt Faktor Fb Fn Vn steigende Bindungsstärke Wo kommt der Unterschied her? Räumliche Anordnung? vwf

33 Suche nach Passform von RGD I nsti tutf

34 Ein lineares flexibles Molekül kann sehr verschiedene Raumstrukturen annehmen, die sich sehr schnell umwandeln R R G D D G R D G R G D R G D

35 Flexible Moleküle in Lösung flexible molecule in solution Rezeptor receptor less active nicht aktiv more active aktiv Festhalten constrained der Form molecules durch Ringbildung solution Komplex complex inaktiv inactive mismatched case kein Treffer super-aktiv active matched case Treffer!!!

36 Die Herausforderung Ist es möglich, die Raumstruktur zu ändern, ohne neue Bindungen zu knüpfen? cyclische Peptide räumliches Screening

37 Wahl der Sequenz Pentapeptide Hexapeptide VRGDFX In der Gendatenbank von ECM Proteinen zeigt sich, dass RGD oft von A und F flankiert ist

38 Bevorzugte Anordnung eines zyklischen Pentapeptides mit einer D-Aminosäure unabhängig von der Natur von R r O R D-Aminosäure N L H N H βιι,, O O H N R L N H γ O C L R L N O H R

39 D-Aminosäure Scan von cyclo(vrgdf) lineare Referenz GRGDSPK: 1.2 µmol super-active selective IC 50 (αiibβ3) against fibrinogen >10µmol µmol > 10 µmol IC 50 (αvβ3) against vitronectin µmol 0.15 µmol > 10 µmol M. Aumailley, M. Gurrath, G. Müller, J. Calvete, R. Timpl, H. Kessler; FEBS Lett. 1991, 291,

40 Selektivität von Integrin Antagonisten linear: flexibel = nicht selektiv Thrombose Krebs gestreckt αiibβ3-selektiv geknickt: αvβ3-selektiv zyklisch: starr = selektiv M. Gurrath, G. Müller, H. Kessler, M. Aumailley, R. Timpl, Eur. J. Biochem. 1992, 210,

41 Verhinderung der Angiogenese menschlicher Tumore auf Hühner-Embryonen Brooks et al. Cell 79, (1994)

42 The Drug Cilengitide

43 Effekt einer N-Methylierung der Peptidbindungen in cyclo(rgdfv) nanomol = 10-9 mol = 1 Würfelzucker auf 1000 Tonnen IC 50 [nm] (αvβ3) cyclo(-[nme]r-gdfv) 5.5 cyclo(r-[nme]g-dfv) 45 cyclo(rgdfv) cyclo(rg-[nme]d-fv) 560 cyclo(rgd-[nme]f-v) 1400 cyclo(rgdf-[nme]v-) 0.58 ( Cilengitide, EMD ) 1995 von Michael Dechantsreiter in München hergestellt Klinische Phase III zur Behandlung von Hirntumoren (Merck) M. A. Dechantsreiter E. Planker, B. Mathä, E. Lohof, G. Hölzemann, A. Jonczyk, S. L. Goodman, H. Kessler, J. Med. Chem. 1999, 42,

44 D G R Henry Matisse

45 Henry Matisse The Drug

46 Anwendungen des Integrin Liganden Cilengitide extrazelluläre Matrix Beschichtung von Implantaten Markierung mit Radioisotopen Biomaterial RGD Peptid Integrin RGD Peptid multimere RGD Peptide

47 Das Ziel: Molekulare Bildgebung Selektive Radiomarkierung von Tumormetastasen

48 Anwendung der αv selektiven Inhibitoren Verbindungen der ersten Generation Schilddrüse Nachteile: die Verbindungen bleiben nicht stabil im Krebs sondern werden sehr rasch wieder ausgewaschen Darm neben dem Tumor sieht man auch den Darm und die Schilddrüse Tumor 0% 100% R. Haubner et al. J. Nucl. Med. 1999, 40, and 2001, 42,

49 Verbesserungen waren nötig: glycosylierte RGD-Peptide HO AcHN O OH I 125 D-Tyr CONH HN O O HN HO Asp O NH NH O Gly NH O Arg die zweite Generation O OH H N OH Zucker- Aminosäuren NH NH 2 D-Phe O HO Asp HN O CONH O NH O Gly HO HO O HN NH NH O Arg O OH H N H N NH O (Fprop)SAA 18 F NH 2 Cancer Res. 2001, 61, 1781 J. Nucl. Med. 2001, 42, 326

50 [ 18 F]Galacto-RGD: Metastase (Melanom) im Lymphknoten der Achsel CT PET Galacto-RGD 220 MBq; 2h p.i. PET/CT-Fusion Galacto-RGD R. Haubner.. H. Kessler et al. PLOS Medicine 2005, 2,

51 Patient mit einem Melanom im Lymphknoten der Achsel (50-75 min p.i., acquisition time 25 min; 5.8 mci [ 18 F]Galacto-RGD) Immunhistologie mit αvβ3- Antikörper nach der OP FDG-PET 02/03 Galacto-RGD-PET 09/03 lymph node vasculature

52 Molekulare Bildgebung mit Galacto-RGD (optimaler Kontrast, hohe Spezifität) Erkennung von Krebsmetastasen in mehreren hundert Patienten in München und weltweit in vivo Quantifizierung der Integrinexpression Molekulare Bildgebung von Glioblastomen Beobachtung der Heilung von Herzinfarkten

53 Das nächste Ziel Verbesserung von Implantaten

54 Beschichtung der Oberflächen von Biomaterialien Implantat Integrin K f D R G K f D R G Osteoblasten K f D R G Gewebe Knochen Oberflächenschicht

55 Design von Beschichtungsmolekülen spezifischer Ligand Abstandhalter Anker Acrylsäure PMMA Peptide Aminohexansäure (Ahx) Phosphonat Ti/TiO 2 Thiole Zyklopeptide PEG / HEGAS Isothiocyanate -NH 2 (BSA) Peptidomimetika Polyprolin Thiole Au Lipidreste Zellmembranen

56 Anwendung von αv selektiven Molkülen Biomaterialien Verankerung auf Oberfläche (bioverträglich) nicht beschichtet RGD beschichtet M. Kantlehner, D. Finsinger, J. Meyer, P. Schaffner, A. Jonczyk, B. Diefenbach, B. Nies, H. Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38,

57 Kaninchenmodell: Plexiglas-Kügelchen Beschichtung mit Acrylamid-Platzhalter-Lysin-Peptideptide PMMA- Knorpelmasse Kügelchen neuer embryonaler Knochen neuer Knochen unbeschichtet RGD beschichtet M. Kantlehner et al., ChemBioChem. 2000, 1,

58 Oberflächenverankerung von Integrin-Ligandens Verbesserung des Implantats durch Beschichtung (Stimulierung der Osteoblasten-Adhäsion) Verankerung auf verschiedenen Materialien Wird in Kürze durch Biomaterials Germany angewendet (erstmalige Anwendung von RGD- Beschichtungen) Beschichtung von Stents beschleunigt Anheftung von Endothelzellen unter Bildung einer glatten Oberfläche (verhindert Restenose)

59 Interdisziplinarität auf dem RGD-Gebiet Finn Industrie Biochemie Timpl Engel Geiger Polymer Physik Nyken Spatz, Uni Heidelberg Sackmann Joner Deutsches Herzzentrum München Medizin Reuning Schmidt Gynocological Hospital Nuklear Medizin Schwaiger Wester Orthopädie Gradinger Bausch Tanaka

60 Danke I nsti tutf