Funktionale Charakterisierung des Rca1- Proteins in Drosophila melanogaster

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1 Funktionale Charakterisierung des Rca1- Proteins in Drosophila melanogaster Diplomarbeit im Fachbereich Biologie an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen-Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Norman Zielke aus Bonn Köln, im September 2002

2 Für meinen Opa

3 Danksagung Ich danke Herrn PD. Dr. Frank Sprenger für die Möglichkeit dieses Thema in seinem Labor zu bearbeiten. Ihm möchte ich vor allem für seine Hilfsbereitschaft und seine Anregungen danken. Besonderer Dank gilt Heidi und Axel ohne deren Hilfe diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Bei Ruth möchte ich mich für das überlassene Material und ihre Ratschläge zu Beginn dieser Arbeit bedanken. Chris möchte ich für die Anregungen und Korrekturen beim Schreiben danken. Besonders möchte ich mich bei Ulli bedanken, der bei Computer-Abstürzen und ähnlichen Katastrophen Erste-Hilfe geleistet hat. Außerdem möchte ich mich bei allen Leuten auf der 5. Etage für das angenehme Arbeitsklima bedanken.

4 Inhalt 1 Einleitung Der Zellzyklus im Verlauf der Embryogenese von Drosophila Regulation des Zellzyklus Eintritt in die Mitose Austritt aus der Mitose Regulation des G1-S-Übergangs Die Funktion des Zellzyklus-Regulator Rca Ziele dieser Arbeit Ergebnisse Verwendete Rca1-Konstrukte Herstellung von stabilen UAS-Rca1-Linien Bestimmung der Stabilität der Rca1-Deletionskonstrukte Stabilität von HA-rca1; Stabilität von HA-rca1; Stabilität von HA-rca1; F-Box Stabilität von HA-rca1; Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Rca1-Konstrukte Lokalisierung von HA-rca1; Lokalisierung von HA-rca1; Lokalisierung von HA-rca1; Lokalisierung von HA-rca1; F-Box Überexpression der Rca1-Kostrukte im Drosophila Auge Rettung des rca1-phänotyps Überexpression von HA-rca1; C351S im rca1-mutanten Hintergrund Überexpression von HA-rca1; 203 im rca1-mutanten Hintergrund Diskussion Abbau von Rca Subzelluläre Lokalisierung von Rca Funktionale Charakterisierung der Rca1-Deletionskonstrukte...41

5 4 Zusammenfassung Material und Methoden Material Chemikalien Spezielle Chemikalien und Reaktionssets Puffer; Lösungen; Medien Antikörper Oligonukleotide Plasmide Vektoren Bakterienstämme Fliegenstämme Geräte Molekularbiologische Methoden Herstellung von elektrokompetenten Zellen Transformation durch Elektroporation DNA-Preperation im Mini-Maßstab DNA-Preperation im Midi-Maßstab Quantifizierung von DNA und RNA Restriktionsverdaue Klenow- fill in -Reaktion Dephosphorylierung von Vektorenden Agarosegelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Ligation von DNA-Fragmenten Sequenzierung In vitro Transkription Gezielte Mutagenese Drosophila-Methoden Fliegenhaltung Sammeln von Embryonen Dechorionierung von Drosophila-Embryonen Fixierung von Embryonen Antikörper-Färbungen...56

6 5.3.6 Propidiumiodid-Färbungen RNA-Injektion Hestellung transgener Fliegen Das UAS/Gal4-System Abkürzungen Literatur... 61

7 Einleitung 1 Einleitung Alle lebenden Organismen bestehen aus Zellen, die sich durch Zellwachstum und Zellteilung vermehren. Die Teilung bereits existierender Zellen stellt die einzige Möglichkeit dar, Zellen zu vermehren. Damit ist die Fähigkeit zur Zellteilung eine grundlegende Voraussetzung für den Fortbestand des Lebens. Aus der Zellteilung einzelliger Lebewesen gehen jeweils zwei neue Organismen hervor. Bei Vielzellern sind hingegen viele Zellteilungszyklen notwendig, damit aus einer befruchteten Eizelle ein neues Individuum entstehen kann. Da sich Zellteilung und Differenzierung ausschließen, müssen die Zellteilungen während der Entwicklung eines Organismus im hohem Maße reguliert sein. Zellteilungen beschränken sich bei vielzelligen Organismen jedoch nicht ausschließlich auf die Entwicklung. Im Verlauf des Lebens eines Vielzellers müssen ständig abgestorbene Zellen durch Zellteilungen ersetzt werden. Störungen in der Regulation des Zellzyklus können sowohl im Verlauf der Entwicklung als auch im erwachsenen Organismus zu schwerwiegenden Schäden führen. Die Teilung einer Zelle erfordert zwei grundlegende Prozesse. Zunächst muß eine Verdopplung der Chromosomen erfolgen, die dann im eigentlichen Teilungsvorgang auf die beiden Tochterzellen verteilt werden. Da diese beiden Prozesse in einer geordneten Reihenfolge ablaufen, werden beide Vorgänge als Zellzyklus zusammengefaßt. Der eukaryotische Standard-Zellzyklus wird in vier Phasen unterteilt, die man als M, G1, S und G2 bezeichnet. Den Zeitraum zwischen zwei M-Phasen faßt man als Interphase zusammen. Den ersten Abschnitt der Interphase bezeichnet man als G1-Phase. In dieser Phase nimmt die Zelle aufgrund eines verstärkten Metabolismus erheblich an Masse zu. In der darauffolgenden S-Phase erfolgt die Replikation der DNA, wodurch zwei Schwesterchromatiden gebildet werden. Den Zeitraum zwischen S-Phase und Mitose bezeichnet man als G2-Phase. Auch hier nimmt die Zelle weiter an Masse zu. Die Aufteilung der Schwesterchromatiden auf die beiden Tochterzellen erfolgt in der Mitose. In der darauffolgenden Zytokinese teilt sich dann die Zelle in zwei Hälften. Anhand der DNA-Morphologie wurde die Mitose in fünf Phasen unterteilt. Die erste Phase der Mitose wird als Prophase bezeichnet. In ihr beginnt sich die DNA zu kondensieren. Mit der darauffolgenden Auflösung der Kernmembran wird die Prometaphase eingeleitet. Die Metaphase zeichnet sich dadurch aus, daß die Chromosomen in der Mitte der Zelle in der 4

8 Einleitung sogenannten Metaphaseplatte angeordnet sind. Nach der Aufteilung der Schwesterchromatiden in der Anaphase bildet sich um jeden Chromatidensatz eine neue Kernmembran. Die Ausbildung der neuen Kernmembran markiert den Beginn der Telophase, in der sich die DNA wieder dekondensiert. In der Interphase liegt die DNA in vollständig dekondensierter Form vor. Abb. 1 Schematische Darstellung des eukaryotischen Standard-Zellzyklus (Darnell 1996). Der eukaryotischen Standard-Zellzyklus besteht aus vier Phasen. In der S-Phase wird die DNA durch Replikation verdoppelt, und dann in der M-Phase auf die beiden Tochterzellen verteilt. S- und M- Phase werden durch die beiden Gap-Phasen (G1 und G2) unterbrochen. (gap = engl. Lücke) 1.1 Der Zellzyklus im Verlauf der Embryogenese von Drosophila Zellzyklen bestehen nicht grundsätzlich aus G1, S, G2 und M-Phase, sondern werden an die jeweilige Situation angepaßt. Ein sehr gutes Beispiel für die Variabilität von Zellzyklen ist die Embryonalentwickwicklung von Drosophila. Im Verlauf der Embryogenese von Drosophila verändert sich die Zusammensetzung der Zellzyklen mehrfach, so daß man insgesamt drei verschiedene Typen von Zellzyklen findet. Nach der Befruchtung durchlaufen die Kerne der synzytialen Eizelle eine Folge von zehn synchronen Kernteilungen. Diese Zellzyklen dauern weniger als zehn Minuten und bestehen nur aus M- und S-Phasen. Zu Beginn der Teilungen befinden sich die Kerne im Inneren des Synzytiums. Gegen Ende des siebten Zellzyklus wandern etwa dreiviertel der Kerne zur 5

9 Einleitung Oberfläche des Eies, während sich die zurückgebliebenen Kerne zu Dotterkernen entwickeln. Diese Dotterkerne stellen im Verlauf des zehnten Zellzyklus ihre Teilungsaktivität ein und durchlaufen eine Reihe von Endozyklen. In diesen Endozyklen kommt es zur Replikation der DNA, jedoch finden keinen Mitosen statt, so daß der DNA-Gehalt der Zellen zunimmt (Edgar und Orr-Weaver 2001). Während des neunten Zyklus erreichen die ersten der wandernden Kerne den posterioren Pol des Eies. Im Verlauf des zehnten Zellzyklus beginnen diese Kerne zu zellularisieren, wodurch sie die Synchronität mit dem Rest der Zellen verlieren. Bei diesen Zellen handelt es sich um die sogenannten Polzellen, aus denen sich später die Geschlechtszellen entwickeln. Der Rest der wandernden Kerne erreicht zu Beginn des zehnten Zellzyklus die Oberfläche. Dort durchlaufen die Kerne vier weitere mitotische Teilungen. Diese Mitosen beginnen in der Nähe der Pole und breiten sich von dort wellenartig aus. Diese Zyklen bestehen ebenfalls nur aus M- und S-Phasen, sind jedoch nicht ganz so schnell wie die ersten zehn. Während des 14. Zellzyklus beginnen die Blastodermzellen zu zellularisieren, wodurch das Zelluläreblastoderm entsteht. Direkt nach der Zellularisierung erfolgt die Gastrulation. Mit Beginn der Gastrulation verlieren die Zyklen ihre Synchronität. Die nächsten drei Zellzyklen (14-16) verlaufen in einem räumlich und zeitlich definierten Muster aus 25 mitotischen Domänen (Foe 1989). Die ersten 13 Zyklen werden ausschließlich von maternalen Komponenten reguliert. Während der Interphase des 14. Zyklus wird die Zellzykluskontrolle jedoch von maternalen Komponenten auf zygotische Komponenten umgestellt. Dies hat zur Folge, daß die Zellen in den Zyklen zusätzlich eine G2-Phase durchlaufen, wodurch die Zellteilungsgeschwindigkeit abnimmt (Edgar et al. 1994). Nach der Mitose des 16. Zellzyklus treten die meisten embryonalen Zellen in eine verlängerte G1-Phase ein (Edgar und O'Farrell 1990). Nur bestimmte Zelltypen, wie die Zellen des sich entwickelnden Nervensystems, teilen sich weiter. Im weiteren Verlauf der Embryogenese durchlaufen die Zellen in verschiedenen Geweben wie dem Darm oder den Speicheldrüsen eine Reihe von Endozyklen. Bis zum Ende der Embryogenese finden keine weiteren Zellteilungen mehr statt. 6

10 Einleitung 1.2 Regulation des Zellzyklus Durch genetische Analysen in den Hefen Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombé wurden eine Reihe von Zellzyklusmutanten identifiziert (Hartwell et al. 1974; Nurse 1975). Diese Arbeiten führten letztendlich zur Identifiktation der cyclin-abhängigen Protein-Kinasen (Cdk). Die regulatorischen Untereinheiten der Cdks die sogenannten Cycline wurden ursprünglich bei biochemischen Untersuchungen an Seeigeleiern entdeckt (Evans et al. 1983). Diese frühen Studien führten zu dem grundlegenden Konzept der Zellzyklus- Regulation. Verschiedene Cdks interagieren in bestimmten Phasen des Zellzyklus mit unterschiedlichen Cyclinen, wodurch eine Reihe von nachgeschalteten Prozessen aktiviert werden (Nurse 2000; Nasmyth 2001). Dieses Konzept ist in allen Eukaryonten verwirklicht. Das Inventar an Cyclinen und Cdks ist unter den Vielzellern hoch konserviert, es unterscheidet sich jedoch stark von dem der Hefen. In Drosophila wurden die mitotischen Cycline A, B und B3, sowie die G1-Cycline D und E identifiziert. Weiterhin wurden in Drosophila Homologe von Cdk1, Cdk2, und Cdk4/6 gefunden (Edgar und Lehner 1996) Eintritt in die Mitose In Drosophila wird der Eintritt in die Mitose von Cdk1 und den drei mitotischen Cyclinen, CyclinA, CyclinB und CyclinB3 reguliert. Die Funktionen der mitotischen Cycline überlappen zum Teil. Einzig CyclinA scheint für den Zellzyklus essentiell zu sein, da nur CyclinA-Mutanten einen letalen Phänotyp haben (Lehner und O'Farrell 1989). Die mitotischen Cycline werden im Verlauf der S- und der G2-Phase synthetisiert und binden an Cdk1. Für den G2-M-Übergang ist die Bindung der Cycline alleine jedoch nicht ausreichend. Die Aktivität des Cdk/Cyclin-Komplexes ist außerdem von dem Phosphorylierungszustand an den beiden Threonin-Resten 14 und 161, sowie dem Tyrosin-Rest 15 abhängig. Die Phosphorylierung von Threonin 161 führt zur Aktivierung des Cdk/Cyclin-Komplexes, während Phosphorylierung an Threonin 14 und Tyrosin 15 eine Inaktivierung zur Folge haben. Der Phosphorylierungszustand an diesen Resten wird durch zwei antagonistische Enzyme reguliert. Die inhibitorische Phosphorylierung wird von den zum Teil redundanten Kinasen Wee und Myt1 katalysiert. Im Gegenzug können die inhibitorischen Phosphorylierungen durch die Phosphatase Cdc25 aufgehoben werden (Morgan 1997). Drosophila besitzt zwei Homologe von Cdc25, nämlich string und twine. String wird 7

11 Einleitung während der Embryogenese ab dem 14. Zellzyklus in einem räumlich und zeitlich definierten Muster exprimiert, wodurch es zur Ausbildung der mitotischen Domänen kommt (Edgar et al. 1994). Die Aktivität von twine ist auf die Meiose begrenzt Austritt aus der Mitose Für den Austritt aus der Mitose werden die mitotischen Cycline durch ubiquitinabhängige Proteolyse abgebaut (Glotzer et al. 1991). Es konnte gezeigt werden, daß die mitotischen Cycline ein Proteinmotiv enthalten, das für den ubiquitinabhängigen Abbau erforderlich ist. Dieses Proteinmotiv wird als destruction box bezeichnet. Die Deletion der destruction box resultiert in einem stabilen Cyclin, was letztendlich zu einem Arrest des Zellzyklus führt. Der Zeitpunkt des Arrest korreliert mit dem Abbau der mitotischen Cycline. Der Abbau von CyclinA erfolgt in der Metaphase, während CyclinB erst beim Übergang in die Anaphase abgebaut wird. Die Überexpression von stabilen CyclinA führt zu einem Metaphase-Arrest. Bei der Überexpression von stabilem CyclinB kommt der Zellzyklus hingegen erst in der frühen Anaphase zum Stillstand. Die Stabilisierung des zuletzt abgebauten CyclinB3 hat einen Arrest während der späten Anaphase zur Folge (Sigrist et al. 1995) Abb. 2 Regulation des anaphase promoting complex (APC). Der Cdk1/Cyclin-Komplex wird durch die Phosphatase Cdc25 aktiviert. Der aktive Cdk1/Cyclin-Komplex phosphoryliert unter anderem den APC. Die phosphorylierte Form des APC wird durch Cdc20 fzy aktiviert, was zum Abbau der mitotischen Cycline und der Inaktivierung von Cdk1 führt. In der späten Mitose und G1 wird die Aktivität des APC durch Cdh1 fzr aufrecht erhalten. 8

12 Einleitung Der Abbau der mitotischen Cycline durch daß 26S-Proteasom erfordert die Ubiquitinilierung der Cycline. Die Ubiquitinilierung von Substraten des 26S-Proteasom wird von einer Kaskade von drei Enzymen vermittelt. Das erste Enzym dieser Kaskade ist das sogenannte E1- oder Ubiquitin aktivierende Enzym. Zur Aktivierung des Ubiquitins bildet das E1-Enzym mit einem Glycin-Rest des Ubiquitins eine energiereiche Thiolbindung. Das aktivierte Ubiquitin wird dann an eines von mehreren E2- oder Ubiquitin konjugierenden Enzymen angehängt. Von dem E2-Enzym wird das Ubiquitin dann durch ein E3-Enzym oder Ubiquitin-Ligase auf einen Lysin-Rest des Substratmoleküls übertragen (Zachariae und Nasmyth 1999). Die Ubiquitin-Ligase die den Abbau der mitotischen Cycline vermittelt, bezeichnet man als anaphase promoting complex (APC). Der APC ist ein hochmolekularer Komplex der mindestens aus elf Untereinheiten besteht. Die Aktivität des APC ist abhängig von den beiden WD40-Proteinen Cdc20 und Cdh1. In Drosophila werden diese Proteine von den Genen fizzy (fzy) und fizzy-related (fzr) kodiert. Der Verlust des fizzy-genes führt zu einem Metaphase-Arrest (Dawson et al. 1995). Es konnte gezeigt werden, daß dieser Arrest darauf zurückzuführen ist, daß die mitotischen Cycline in fizzy-mutanten stabil sind (Sigrist et al. 1995). Mutationen in fizzy-related resultieren in einer zusätzlichen Mitose in den epidermalen Zellen, außerdem kommt es zu einer Inhibition der Endozyklen in den Speicheldrüsen (Sigrist und Lehner 1997) Der APC-Cdc20 fzy -Komplex vermittelt den Abbau der mitotischen Cycline während der Mitose. Die Aktivierung des APC durch Cdc20 fzy ist abhängig von der Phosphorylierung durch den Cyclin/Cdk1-Komplex. Cdc20 fzy kann ausschließlich an den phosphorylierten APC binden, was dazu führt, daß die Aktivität des APC-Cdc20 fzy -Komplex auf die Mitose begrenzt ist (Kramer et al. 2000). Die Aktivität des APC-Cdh1 fzr -Komplex ist hingegegen auf die späte Mitose und die G1-Phase begrenzt. In diesem Fall ist ausschließlich die unphosphorylierte Form von Cdh1 fzr in der Lage den APC zu aktivieren, so daß der APC-Cdh1 fzr -Komplex nur in Phasen mit niedriger Cdk-Aktivität aktiv ist (Kramer et al. 2000). Während die Substrate des APC-Cdc20 fzy -Komplex durch eine destruction box gekennzeichnet sind, findet man in den Substraten des APC-Cdh1 fzr -Komplex häufig eine sogenannte KEN-Box (Glotzer et al. 1991; Pfleger und Kirschner 2000). Eine Funktion der beiden WD40-Proteine könnte in der Substraterkennung und der anschließenden Präsentation der Substrate für das E2-Enzym liegen. 9

13 Einleitung Der APC-Cdc20 fzy -Komplex vermittelt neben dem Abbau der mitotischen Cycline auch die Trennung der Schwesterchromatiden. Nach der Replikation der DNA werden die beiden Schwesterchromatiden durch den Cohesin-Komplex zusammengehalten. Beim Übergang von der Metaphase in die Anaphase muß diese Verbindung zwischen den Schwesterchromatiden getrennt werden. Dieser Vorgang wird durch eine Cystein-Protease vermittelt, die als Separase bezeichnet wird. Um eine vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden zu verhindern, wird die Separase durch den Inhibitor-Securin inaktiviert. Securin, oder pimples in Drosophila, ist ein Substrat des APC-Cdc20 fzy -Komplex, wodurch sichergestellt wird, daß die Separase nur während des Metaphase-Anaphase-Übergangs aktiv ist (Zachariae und Nasmyth 1999; Cohen-Fix 2001). Der APC-Cdc20 fzy -Komplex ist außerdem am sogenannten spindle checkpoint beteiligt. Durch diesen Kontrollpunkt wird sichergestellt, daß alle Chromosomen am Ende der Metaphase ordnungsgemäß mit dem Spindelapparat verbunden sind. Der Übergang von der Metaphase in die Anaphase erfolgt nur dann, wenn alle Kinetochoren mit dem Spindelapparat assoziiert sind. Ist dies nicht der Fall, wird der APC-Cdc20 fzy -Inhibitor Mad2 durch die freien Kinetochoren aktiviert. Dies führt dazu, daß die Substrate des APC-Cdc20 fzy -Komplex nicht abgebaut werden, was letztendlich in einem Metaphase-Arrest resultiert (Shah und Cleveland 2000) Regulation des G1-S-Übergangs In Säugetieren wird der Übergang von der G1-Phase in die S-Phase durch zwei Typen von Cdk s vermittelt. Cdk4 und Cdk6 interagieren mit CyclinD, während Cdk2 durch CyclinE aktiviert wird. Das wichtigste Substrat des Cdk/CyclinD-Komplex ist das Retinoblastoma- Protein (prb). In seiner hypophosphorylierten Form agiert prb als ein Inhibitor des Transkriktionfaktors E2F. Die Phosphorylierung von prb durch den Cdk/CyclinD-Komplex führt zur Freilassung von E2F, wodurch verschiedene für die DNA-Replikation notwendige Gene, wie zum Beispiel CyclinE, aktiviert werden. In Drosophila ist der G1-S-Übergang hauptsächlich von CyclinE abhängig, daß unter der Kontrolle des Entwicklungsprogramm steht. Nach dem G1-S Übergang kommt es zur Autophosphorylierung von CyclinE, wodurch dieses für den ubquitinabhängigen Abbau markiert wird. Der Abbau von CyclinE führt dazu, daß die Aktivität von Cdk2 abnimmt und daß Cdk2 bis zur nächsten G1-Phase inaktiv bleibt. In 10

14 Einleitung diesem Fall wird der Cyclin-Abbau jedoch nicht durch den APC vermittelt, sondern durch ein weiteres E3-Enzym das man als SCF-Komplex bezeichnet. Der SCF-Komplex besteht aus drei Kern-Untereinheiten Skp1, einem Cullin und einem F- Box-Protein. Neben diesen drei Komponenten, von denen sich der Name ableitet, enthält der SCF-Komplex noch das Ringfingerprotein Rbx1/Roc1 und ein E2-Enzym (Zachariae und Nasmyth 1999; Jackson et al. 2000). Das F-Box-Protein fungiert als Substraterkennungs- Untereinheit. In vielen Fällen, jedoch nicht immer, ist die Bindung des F-Box-Proteins an das Substrat phosphorylierungs-abhängig. Alle Mitglieder der F-Box-Familie enthalten ein konserviertes Proteinmotiv, das zuerst in CyclinF gefunden wurde und daher als F-Box bezeichnet wird (Bai et al. 1996). Neben der F-Box findet man in F-Box-Proteinen häufig WD40-repeats, zinc finger und andere an Protein-Protein-Interaktionen beteiligte Proteinmotive (Das et al. 2002). Das F-Box-Motiv wird spezifisch von Skp1 gebunden (Schulman et al. 2000; Zheng et al. 2002). Die Funktion von Skp1 liegt wahrscheinlich darin, das an die F-Box gebundende Substratmolekül mit dem Kernkomplex aus Cullin, Rbx1/Roc1 und dem E2-Enzym zu verbinden. Die Struktur dieses Kernkomplexes wird durch das Gerüst-(scaffold)-Protein Cullin stabilisiert. Die Aktivität des SCF-Komplex ist nicht auf den Zellzyklus beschränkt. Durch den SCF-Komplex werden unter anderem die ubiquitinabhängige Proteolyse von armadillo und cactus, den Drophila-Homologen von ß-Catenin und Iκß vermittelt (Jiang und Struhl 1998; Spencer et al. 1999) Die Aktivität des Cdk2/CyclinE-Komplex ist in Drosophila und in Säugetieren für den G1-S Übergang essentiell. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß der Cdk2/CyclinA-Komplex ebenfalls dazu in der Lage ist, die S-Phase einzuleiten (Sprenger, et al. 1997). Normalerweise wird die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex jedoch durch drei verschiedene Mechanismen unterdrückt. Erstens wird Cyclin A während der G1-Phase durch den APC-Cdh1 fzr -Komplex abgebaut. Zweitens wird die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex durch inhibitorische Phosphorylierung an Threonin 14 und Tyrosin 15 verringert. Drittens wird der Cdk1/CyclinA- Komplex durch den cyclin-dependent kinase inhbitor (CKI) roughex (rux) gebremst (Sprenger et al. 1997; Foley et al. 1999). 11

15 Einleitung 1.3 Die Funktion des Zellzyklus-Regulator Rca1 Das rca1-gen (regulator of cyclin A 1) wurde in einem Screen für dominante Suppressoren des roughex-augenphänotyps identifiziert (Dong et al. 1997). Roughex ist ein CKI der spezifisch die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex inhibiert. Roughex-Mutanten besitzen einen rauhen Augenphänotyp, der durch einen Defekt während der Augenentwicklung hervorgerufen wird. Während der Musterbildung in der Augenimaginalscheibe werden die Zellen innerhalb der morphogenetischen Furche in der G1-Phase synchronisiert. Ein Teil dieser Zellen differenziert sich zu Neuronen, während die restlichen eine weitere Zellteilung durchlaufen. In roughex-mutanten kann der Cdk1/CyclinA-Komplex nicht mehr inhibiert werden, was zu ektopischen S-Phasen und letztendlich zu dem rauhen Augenphänotyp führt. Der rauhe Augenphänotyp kann durch eine Reduktion der Rca1 oder CyclinA Menge aufgehoben werden. Hingegen führt die Überexpression von Rca1 oder CyclinA in Augenimaginalscheiben, wie der Verlust von roughex, zu einem rauhen Augenphänotyp (Dong et al. 1997). Diese Beobachtungen deuten daraufhin, daß Rca1 einen Einfluß auf die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex hat. Homozygote rca1-mutanten arretieren in der G2-Phase von Zellzyklus 16, mit einem ähnlichen Phänotyp wie CyclinA Mutanten (Lehner und O'Farrell 1989; Dong et al. 1997). Der Verlust des rca1-gens wirkt sich in einer Reduktion der Anzahl epidermaler Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen aus. Die DNA in diesen Zellen ist dekondensiert, wodurch deutlich wird, daß es sich nicht um ein Arrest in der Mitose handelt (Dong et al. 1997). Der Arrest in der G2-Phase von Zellzyklus 16 ist darauf zurückzuführen, daß in rca1-mutanten sowohl Cyclin A als auch Cyclin B vorzeitig abgebaut wird (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Der Abbau der mitotischen Cycline wird durch den APC in Verbindung mit den beiden Aktivatorproteinen Cdc20 fzy und Cdh1 fzr vermittelt. Durch genetische Analysen konnte gezeigt werden, daß rca1 und fizzy-related miteinander interagieren. In fizzy-related- Mutanten kommen die epidermalen Zellen nicht in der G1 Phase von Zellzyklus 17 zur Ruhe, sondern durchlaufen eine weitere Zellteilung (Sigrist und Lehner 1997). Dieser Phänotyp ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, daß der CyclinA-Abbau während der G1-Phase nicht aufrechterhalten werden kann (Sprenger et al. 1997). Im Gegensatz dazu führt die Überexpression von fizzy-related zum vorzeitigen Abbau der mitotischen Cycline, was sich in 12

16 Einleitung einem G2-Arrest in Zellzyklus 16 auswirkt (Sigrist und Lehner 1997). Rca1/fizzy-related- Doppelmutanten besitzen eine ähnliche Zahl von Epidermiszellen wie vergleichbare Wildtyp- Embryonen, was bedeutet, daß fizzy-related epistatisch über rca1 ist. Die Überexpression von Rca1 kann den Effekt der Überexpression von Fizzy-Related aufheben, wodurch bewiesen wurde, daß Rca1 einen negativen Effekt auf Fizzy-Related ausübt. Außerdem konnte gezeigt werden, daß Rca1 und Fizzy-Related nicht nur genetisch sondern auch biochemisch miteinander interagieren (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Diese Daten belegen, daß die Aktivität des APC-Cdh1 fzr -Komplex in der G2-Phase von Zellzyklus 16 durch Rca1 inhibiert wird. Abb. 3 Schematische Darstellung der Rca1-Funktion. Die Aktivität des APC-Cdh1 fzr -Komplex ist auf Phasen mit niedriger Cdk-Aktivität begrenzt. Rca1 inhibiert den APC-Cdh1 fzr -Komplex in der G2-Phase und verhindert so den vorzeitigen Abbau der mitotischen Cycline. Auf welche Weise Rca1 in der späten Mitose inaktiviert wird, ist noch unklar. Da Cdh1 fzr für die Etablierung der G1-Phase von Zellzyklus 17 benötigt wird, ist es erforderlich daß Rca1 zu diesem Zeitpunkt inaktiviert wird. Es konnte gezeigt werden, daß Rca1 in der G1-Phase von Zellzyklus 17 abgebaut wird. Rca1 ist jedoch noch in einigen Zellen vorhanden die bereits in der G1-Phase von Zellyklus 17 sind. Da auch in diesen Zellen CyclinA abgebaut wird und nicht wie in fzr-mutanten reakkumuliert, muß die inhibitorische Wirkung von Rca1 auf eine andere Weise inaktiviert werden. Durch welchen Mechanismus dies geschieht ist jedoch bisher unklar. 13

17 Einleitung Rca1 besitzt Homologe in der Maus, dem Krallenfrosch (Xenopus laevis) und dem Menschen (Reimann et al. 2001a). Die Vertebraten Homologe von Rca1 werden Emi1 (early mitotic inhibitor 1) genannt. Rca1 und das Xenopus-Emi1 sind zu 18 Prozent identisch und besitzen eine Ähnlichkeit von 27 Prozent (Abb. 4). Beide Proteine sind jedoch sehr ähnlich in ihrer Größe und in der Anordnung ihrer funktionalen Domänen. Das Rca1-Protein besitzt 411 Aminosäuren, während Emi1 nur aus 393 Aminosäuren besteht. Beide Proteine enthalten in ihrem N-terminalen Teil eine potentielle F-Box. F-Box-Proteine fungieren als Substraterkennungs-Untereinheiten des SCF-Komplexes (Zachariae und Nasmyth 1999; Jackson et al. 2000). Der N-Terminus von Rca1 enthält außerdem eine zweigeteilte Kernlokalisierungssequenz. Im C-Terminalen Abschnitt beider Proteine befindet sich eine sogenannte zinc binding region (ZBR). Dieses Proteinmotiv ist häufig an Protein-Protein Interaktionen beteiligt und zeichnet sich durch eine charakteristische Abfolge von Cystein- Resten aus. Zwischen der F-Box und der ZBR befinden sich noch zwei weitere konservierte Strukturelemente. Einerseits eine Folge von drei Aminosäuren die man als KEN-Box bezeichnet und in Substraten des APC-Cdh1 Fzr -Komplex findet (Pfleger und Kirschner 2000). Andererseits die Erkennungssequenz für die Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) (persönliche Mitteilung Peter Jakson), welche eine wichtige Rolle beim Abbau von Iκß der inhibitorischen Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκß spielt (Hattori et al. 1999; Spencer et al. 1999). Rca1 enthält insgesamt zehn potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen, während in Emi1 nur fünf gefunden wurden. Im Gegensatz zu Rca1 interagiert Emi1 sowohl mit Cdh1 fzy als auch mit Cdc20 fzr (Reimann et al. 2001a; Reimann et al. 2001b). Es konnte gezeigt werden, daß Emi1 zu verschieden Zeiten unterschiedliche Funktionen hat. Eine Funktion von Xenopus-Emi1 besteht darin den APC-Cdc20 fzy -Komplex in der frühen Mitose zu inhibieren (Reimann et al. 2001a). Weiterhin scheint Emi1 eine wichtige Komponente des Cytostatic Factor (CSF) zu sein, der gewährleistet das die Eizelle so lange in der Meiose2 gehalten wird bis eine Befruchtung erfolgt. Dieser Arrest beruht ebenfalls auf einer Inhibition des APC-Cdc20 fzy -Komplex durch Emi1 (Reimann und Jakson 2002). Während des G1-S-Übergangs in humanen Zellen agiert Emi1 außerdem als Inhibitor des APC-Cdh1 fzr -Komplex (Hsu et al. 2002). Emi1 blockiert die Substratbindungsstelle von Cdc20 und inhibiert so die Aktivität des APC- Cdc20 fzy -Komplex. Prinzipiell wäre ein ähnlicher biochemischer Mechanismus auch für den 14

18 Einleitung Effekt von Rca1 auf Fizzy-Related denkbar. Auf zellulärer Ebene ist jedoch zu beobachten, daß Rca1 im Kern lokalisiert ist, während Fizzy-Related hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert ist. Da die Cycline in der Interphase 16 in ebenfalls im Zytoplasma zu finden sind, stellt sich die Frage wie Rca1 trotz der räumlichen Trennung den Abbau Cycline durch Fizzy- Related verhindern kann. Abb. 4 Vergleich der Primärstruktur von Rca1 und Emi1 (Grosskortenhaus 2001). 18 Prozent der Aminosäuren von Rca1 und Emi1 sind identisch (schwarze Kästen); bzw. zu 27 Prozent ähnlich (graue und schwarze Kästen). Im N-terminalen Bereich von Rca1 befinden sich eine zweiteilige Kernlokalisierungssequenz (blauer Kasten) und eine potentielle F-Box (gelber Kasten). In der Mitte befinden sich eine KEN-Box (grüner Kasten) sowie eine GSK3-Phosphorylierungsstelle (rosa Kasten). Im C-terminalen Abschnitt befindet sich die sogenannte zinc binding region (ZBR) mit der Konsensussequenz C(4X)C(14-30X)C(1-4X)C(1-4X) C(4X)C(2X)C(4X)H(4X)C. Die konservierten Cystein-Reste sind durch die roten Kästen markiert. Die blauen Punkte kennzeichnen potentielle Cdk- Phosphorylierungsstellen. 15

19 Einleitung 1.4 Ziele dieser Arbeit Rca1 enthält mehrere konservierte Strukturelemente. Ziel dieser Arbeit ist herauszufinden welche Strukturelemente für die Funktion von Rca1 von Bedeutung sind. Es konnte gezeigt werden, daß Rca1 im Zellkern lokalisiert ist (Grosskortenhaus 2001). Es ist jedoch unklar ob die Kernlokalisierungssequenz oder eines der anderen Strukturelemente von Rca1 für die nukleare Lokalisierung verantwortlich sind. Weiterhin sollen durch diese Arbeit Hinweise zur die Funktion der Kernlokalisierung gesammelt werden. Außerdem soll untersucht werden nach welchem Mechanismus Rca1 abgebaut wird und welche Proteinmotive dafür erforderlich sind. Ein weiterer Punkt der im Rahmen dieser Arbeit geklärt werden soll ist, ob die potentiellen CDK-Phosphorylierungsstellen bei der Inaktivierung von Rca1 eine Rolle spielen. 16

20 Ergebnisse 2 Ergebnisse Die Datenbankanalyse der Primärstruktur von Rca1 (Abb. 4) hat gezeigt, daß Rca1 mehrere konservierte Strukturelemente enthält (Grosskortenhaus 2001). Um die Funktion dieser Proteinmotive in vivo zu studieren, wurden zunächst mehrere Deletionskonstrukte von Rca1 hergestellt (Abb. 6), die dann in der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) exprimiert wurden. 2.1 Verwendete Rca1-Konstrukte Für Emi1, dem Vertebraten Homolog von Rca1, konnte in vitro gezeigt werden, daß der Austausch eines der konservierten Cysteine der ZBR gegen Serin zu einem nicht funktionalen Protein führt (Reimann et al. 2001a). Um die Bedeutung der ZBR in vivo zu untersuchen, wurde ein Rca1-Konstrukt (HA-rca1; C351S) hergestellt, bei dem ebenfalls der zweite Cystein-Rest der ZBR mutiert wurde (Abb. 5). Abb. 5 Ausschnitt aus der zinc binding region (ZBR) von Rca1 und Emi1. Der Austausch von Cystein 346 gegen Serin führt zur Inaktivierung von Emi1 (Reimann et al. 2001a). Für die in vivo Analyse der ZBR-Funktion, wurde der homologe Cystein-Rest in Rca1 ebenfalls durch Serin ersetzt. Zur Bestimmung der Funktion der weiteren Strukturelemente, wurden zunächst drei verkürzte Rca1-Konstrukte hergestellt. HA-rca1; 133 fehlen die ersten 133 Aminiosäuren. In diesem Bereich befindet sich die Kernlokalisierungssequenz und sechs mögliche CDK- Phosphorylierungsstellen. Bei HA-rca1; 203 wurden die N-terminalen Reste bis zu Position 203 entfernt. Diesem Konstrukt fehlen dadurch die Kernlokalisierungssequenz und die F-Box, sowie sieben potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen. Die KEN-Box und die GSK3- Phosphorylierungsstelle sind jedoch noch vorhanden. In HA-rca1; 255 wurden diese beiden Strukturelemente auch noch deletiert. Außerdem wurde zur detaillierteren Untersuchung der Funktion der F-Box das Konstrukt HA-rca1; F-Box hergestellt, das in diesem Bereich eine interne Deletion besitzt. 17

21 Ergebnisse Abb. 6 Schematische Darstellung der verwendeten Deletionskonstrukte. Die Numerierung der Reste bezieht sich auf das offene Leseraster von rca1. Abkürzungen: HA = Hämagglutinin-Epitop; NLS = zweigeteilte Kernlokalisierungssequenz; KEN = KEN-Box; DSGXXS = GSK3- Phosphorylierungsstelle; ZBR = zinc binding region; * = potentielle Cdk- Phosphorylierungsstelle Um die exprimierten Proteine in vivo mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen nachzuweisen, wurden alle Konstrukte am N-Terminus mit dem Hämagglutinin-(HA)-Epitop des Influenza-Virus versehen (Wilson et al. 1984). Außerdem wurde in den 5 nichttranslatierten Bereich dieser Konstrukte die 5 ß-globin-leader Sequenz aus dem Krallenfrosch (Xenopus laevis) kloniert. Diese Sequenz dient dazu die Effizienz der Translation zu erhöhen. 2.2 Herstellung von stabilen UAS-Rca1-Linien Für die Herstellung der transgenen Fliegenlinien wurde die P-Element-Insertions-Methode nach Rubin und Spradling verwendet (Rubin und Spradling 1982). Bei der Transformation der Rca1-Konstrukte wurde der an das UAS/Gal4-System angepaßte puasp-vektor verwendet (Brand und Perrimon 1993; Rorth 1998). Dieser Vektor enthält den minimal Promotor des Transposase-Genes, hinter den die hergestellten Rca1-Deletionskonstrukte kloniert wurden. Stromaufwärts vom Promotor befinden sich 14 Gal4-Bindungsstellen (Gal4-UAS) und die GAGA-Sequenz aus dem EP-Vektor. Stromabwärts befindet sich die 3 nicht-translatierte 18

22 Ergebnisse Region des K10-Gens. Durch diese Sequenz wird die Stabilität der transkribierten mrna erhöht (Rorth 1998). Abb. 7 Schematische Darstellung der Promotorregion des puasp-vektor (Rorth 1998). Der puap-vektor enthält den Tronsposase-Minimal-Promotor. Hinter diesen Promotor wurden die Rca1-Deletionskonstrukte, inklusive 5 ß-globin-leader Sequenz und HA-Epitop, kloniert. Unterhalb des Rca1-Deletionskonstrukts befindet sich die 3 nicht-translatierte Region des K10-Gens. Oberhalb des Promotors befinden sich 14 Gal4- Bindungsstellen (Gal4-UAS) und die GAGA-Sequenz aus dem EP-Vektor. Für jedes Konstrukt wurden etwa 800 Embryonen injiziert. Im Durchschnitt erwiesen sich 20% der überlebenden Fliegen als positive Transformanten. Mit diesen Fliegen wurden dann durch Kreuzung gegen einen Balancerstamm stabile Linien etabliert (Tab. 1). Konstrukt 1.Chromosom 2.Chromosom 3.Chromosom Durchschnittliche Expression UAS-HA-rca1; C351S schlecht UAS-HA-rca1; 133 / 3 10 sehr gut UAS-HA-rca1; 203 / 11 5 sehr gut UAS-HA-rca1; sehr gut UAS-HA-rca1; F-Box mittelmäßig Tab. 1 Übersicht über die erhaltenen UAS-Rca1-Linien. Die Tabelle zeigt die Verteilung der P-Element- Insertionen auf die ersten drei Chromosomen. Die Kartierung der Insertionen erfolgte anhand der Verteilung der Marker. Es wurden nur Insertionsereignisse berücksichtigt die zu stabilen Linien geführt haben. Für den Test der Expression wurden von jeder Linie jeweils 5 Männchen gesammelt und zusammengeführt. Dieser Pool wurde dann gegen den prd-gal4-stammes gekreuzt. Von dieser Kreuzung wurden dann Übernacht- Ablagen gesammelt und mit dem HA-Antikörper gefärbt. 2.3 Bestimmung der Stabilität der Rca1-Deletionskonstrukte Der Abbau von Rca1 beginnt in der G1-Phase von Zellzyklus 17. Zu diesem Zeitpunkt befindet sich der Embryo im 11. Stadium der Embryonalentwicklung (Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997)). Im Verlauf des 11. Stadiums beginnt auch der Abbau von CyclinA. CyclinA ist jedoch in der G1-Phase von Zellzyklus 17, wenn der Rca1-Abbau beginnt, bereits abgebaut. Daher kann man anhand von CyclinA eine Aussage darüber machen, ob sich eine Zelle noch im 16. Zellzyklus befindet oder ob sie schon in der Interphase 17 ist (Abb. 8; G-F). Im 13. Stadium der Embryonalentwicklung befinden sich alle Zellen der Epidermis in der G1-Phase von Zellzyklus 17. Zu diesem 19

23 Ergebnisse Zeitpunkt sind beide Proteine nur noch in den Zellen des sich entwickelnden Nervensystems detektierbar (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Die Überexpression von HA-rca1 hat weder einen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA noch auf den Zellzyklus-Verlauf, was bedeutet, daß das zusätzliche Rca1 auf irgendeine Weise inaktiviert wird. Abb. 8 Überexpression von HA-rca1in Wildtyp-Embryonen (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Für die Expression wurde die ubiquitär aktive armadillo-gal4-linie verwendet. HA-rca1wurde durch einen Rca1-Antikörper (linke Spalte) nachgewiesen. Außerdem wurde gegen CyclinA (rechte Spalte) gefärbt. (A-B) Stadium 10 (C-D) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von HA-rca1 und CyclinA. (E-F) Spätes Stadium 11; Die Zellen, in denen CyclinA noch sichtbar ist, befinden sich noch in der Mitose von Zellzyklus 16, whärend die Zellen in denen CyclinA bereits abgebaut ist, schon in der Interphase von Zellzyklus 17 sind (G-H) Stadium 13; Zu diesem Zeitpunkt befinden sich alle Zellen der Epidermis in der G1-Phase von Zelzyklus 17. In den epidermalen Zellen sind sowohl Rca1 als auch CyclinA vollständig abgebaut. Beide Proteine sind nur noch in den Zellen des sich entwickelnden Nervensystems nachweisbar. Die Überexpression von HA-rca1 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997). 20

24 Ergebnisse Zur Identifizierung der für den Rca1-Abbau notwendigen Strukturelemente, wurde die Stabilität der Rca1-Deletionskonstrukte in 6-10 Stunden alten Embryonen analysiert. Dazu wurden die UAS-Konstrukte mit Hilfe der paired-gal4-linie in jedem zweitem Segment exprimiert. Die Aktivität der paired-gal4-linie beginnt im Stadium 10, wenn sich die meisten Zellen im 15. Zellzyklus befinden. Zu Beginn ist paired-gal4 im ganzen Segment aktiv, während die Aktivität in der späteren Stadien auf den posterioren Teil der Segmente beggrenzt ist. Der Nachweis der modifizierten Rca1-Proteine erfolgte durch Immunfluoreszenzfärbungen mit einem HA-Antikörper. Das Alter der Embryonen wurde anhand der Morphologie der Embryonen und von CyclinA-Färbungen bestimmt. Gleichzeitig hätten Unregelmäßigkeiten im Abbaumuster von CyclinA auf einen dominanten Effekt des exprimierten Deletionskonstrukts hingedeutet. Außerdem wurden DNA-Färbungen durchgeführt Stabilität von HA-rca1; 133 Bei HA-rca1; 133 wurde der N-Terminus um 133 Aminosäuren verkürzt. Neben der Kernlokalisierungssequenz fehlen diesem Konstrukt sechs potentielle CDK- Phosphorylierungsstellen, die eine wichtige Rolle bei der Proteolyse von Rca1 spielen könnten. Verglichen mit dem vollständigen Protein wird HA-rca1; 133 im Verlauf des 17. Zellzyklus weniger stark abgebaut (Abb. 9; D-I). HA-rca1; 133 ist, im Gegensatz zum vollständigen Rca1, auch noch in der Epidermis von Embryonen detektierbar die bereits sich im Stadium 13 befinden. Das Fluoreszenzsignal ist jedoch auf den posterioren Teil der Segmente beschränkt (Abb. 9; J-L). Aus diesen Beobachtungen kann man schließen, daß die in HA-rca1; 133 deletierte Proteinmotive die Stabilität von Rca1 beeinflussen. Die Expression von HA-rca1; 133 hat keinen Effekt auf den Abbau von CyclinA (Abb. 9; mittlere Spalte). 21

25 Ergebnisse Abb. 9 Überexpression von HA-rca1; 133 in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem zweiten Segment aktive paired-gal4-linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; 133 wurde ein Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt. (A-C) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von CyclinA. (D-F) Spätes Stadium 11; HA-rca1; 133 wird verglichen mit dem vollständigen Rca1-Protein weniger stark abgebaut (G-I) Stadium 12 (J-L) Stadium 13; HA-rca1; 133 ist noch nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits abgebaut ist. Das HA-Signal ist ausschließlich auf den posterioren Teil der Segmente begrenzt. Die Überexpression von HA-rca1; 133 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997) Stabilität von HA-rca1; 203 C-terminal von der Kernlokalisierungssequenz befinden sich die F-Box und eine weitere mögliche CDK-Phosphorylierungsstelle. Da beide Proteinmotive in den Abbau von Rca1 involviert sein könnten, wurde das Konstrukt HA-rca1; 203 hergestellt. Bei diesem Konstrukt wurde der N-Terminus bis zu Position 203 verkürzt, so daß die Kernlokalisierungssequenz und die F-Box, sowie sieben CDK-Phosphorylierungsstellen deletiert wurden. HA-rca1; 203 verhält sich ähnlich wie HA-rca1; 133. (Abb. 10; D-I). Es wird wie HArca1; 133 im Vergleich zum vollständigen Rca1 weniger stark abgebaut. HA-rca1; 203 ist 22

26 Ergebnisse ebenfalls noch in Embryonen nachweisbar, die bereits im Stadium 13 sind (Abb. 10; J-L). Verglichen mit HA-rca1; 133 sind jedoch weniger Zellen angefärbt. Der Abbau von CyclinA wird durch die Überexpression wiederum nicht beeinflußt (Abb. 10; mittlere Spalte). Abb. 10 Überexpression von HA-rca1; 203 in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem zweiten Segment aktive paired-gal4-linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; 203 wurde ein Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt. (A-C) Stadium 10 (D-F) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von CyclinA (G-I) Stadium 12; HA-rca1; 203 wird verglichen mit dem vollständigen Rca1-Protein weniger stark abgebaut (J-L) Stadium 13; HA-rca1; 203 ist noch nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits abgebaut ist. Das HA-Signal ist ausschließlich auf den posterioren Teil der Segmente begrenzt. Die Überexpression von HA-rca1; 203 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997) Stabilität von HA-rca1; F-Box Bei HA-rca1; F-Box wurde nur der Abschnitt deletiert in dem sich die F-Box befindet. Wie die bei den vorangegangenen Deletionskonstrukten, ist HA-rca1; F-Box auch noch in der Epidermis von Embryonen im Stadium 13 detektierbar. Bei HA-rca1; F-Box ist das Fluoreszenzsignal ebenfalls auf die posterioren Bereiche der Embryonen beschränkt (Abb. 11; 23

27 Ergebnisse G-I). Das Abbaumuster von CyclinA scheint durch die Überexpression von HA HA-rca1; F- Box nicht beeinflußt zu werden (Abb. 11; D-F). Abb. 11 Überexpression von HA-rca1; F-Box in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem zweiten Segment aktive paired-gal4-linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; F-Box wurde ein Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt. (A-C) Stadium 10 (D-F) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von CyclinA (G-I) Stadium 13; HA-rca1; F-Box ist noch nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits abgebaut ist. Das HA-Signal ist ausschließlich auf den posterioren Teil der Segmente begrenzt. Die Überexpression von HA-rca1; F-Box hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997) Stabilität von HA-rca1; 255 C-terminal von der F-Box befinden sich eine KEN-Box und eine GSK3- Phosphorylierungsstelle. Von beiden Proteinmotiven ist bekannt, daß sie einen Einfluß auf die Stabilität von Proteinen haben können (siehe 1.2.2). Um zu Untersuchen ob diese Motive auch für den proteolytischen Abbau von Rca1 von Bedeutung sind, wurde das Konstrukt HArca1; 255 verwendet, bei dem die Reste fehlen. 24

28 Ergebnisse Abb. 12 Überexpression von HA-rca1; 255 in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem zweiten Segment aktive paired-gal4-linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; 255 wurde ein Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt. (A-C) Stadium 10. (D-F) Stadium 11; Beginn der Proteolyse von CyclinA.. Der Abbau von HA-rca1; 255 bleibt jedoch aus (G-I) Stadium 12; Ein Großteil des CyclinA ist abgebaut; während die Menge an HA-rca1; 255 wenig verändert erscheint (J-L) Stadium 13; HA-rca1; 255 ist noch in großen Mengen nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits abgebaut ist. Die Überexpression von HArca1; 255 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997). HA-rca1; 255 scheint im Verlauf des 17. Zellzyklus nahezu stabil zu sein (Abb. 12; D-I). Im Gegensatz zu den anderen Deletionskonstrukten ist HA-rca1; 255 im Stadium 13 noch in nahezu allen Zellen der Epidermis detektierbar (Abb. 12; I-J). Die im Vergleich zu den anderen rca1-deletionskonstrukten erhöhte Stabilität deutet daraufhin, daß entweder die KEN-Box oder die GSK3-Phosphorylierungsstelle entscheidenden Einfluß auf die Stabilität von Rca1 haben. Die Überexpression dieses Konstrukts hat ebenfalls keinen Effekt auf das Abbaumuster von CyclinA (Abb. 12; mittlere Spalte). 25

29 Ergebnisse 2.4 Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Rca1- Konstrukte Die Injektion von HA-rca1-mRNA hat gezeigt, daß das vollständige Rca1 im Zellzyklus 14 im Nukleus lokalisiert ist (Grosskortenhaus 2001). Diese Beobachtung bestätigte sich bei der Untersuchung von älteren Embryonen, bei denen HA-rca1 mit armadillo-gal4 oder paired- Gal4 überexprimiert wurde (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Die subzelluläre Lokalisierung eines Proteins wird durch verschiedene Sequenzmotive bestimmt. Um herauszufinden welche Proteinmotive die Lokalisierung von Rca1 beeinflussen, wurden die Rca1-Deletionskonstrukte wiederum mit Hilfe der paired-gal4- Linie exprimiert. Zur Bestimmung der Lokalisierung der Konstrukte wurden 6-10 Stunden alte Embryonen verwendet. Um die Lokalisierung der Rca1-Deletionskonstrukte auch in früheren Stadien zu untersuchen, wurden außerdem mrna-injektionen durchgeführt. Für die Herstellung der mrna s wurden die Rca1-Deletionskonstrukte zunächst in den psp64- Vektor kloniert. Dieser Vektor enthält den für die in vitro Transkription notwendigen SP6- Promotor. Um eine effektive Translation im Embryo zu gewährleisten wurden die mrna s mit einer 7-Methylguanosin-Kappe versehen. Der Nachweis der Konstrukte erfolgte wiederum durch einen gegen das HA-Epitop gerichteten Antikörper. Zur besseren Orientierung wurden die Embryonen außerdem gegen CyclinA und DNA gefärbt. Die CyclinA-Färbung dient im diesem Fall als Marker für das Zytoplasma, während die DNA-Färbung den Zellkern sichtbar macht. Zusätzlich wurden WGA- und Phosphotyrosin-Färbungen durchgeführt. Bei wheat germ agglutinin (WGA) handelt es sich um ein Protein das an O-glykolysierte Proteine in der Kernmembran bindet. Diese Eigenschaft wird ausgenutzt, um die Kernmembran mit Hilfe von fluoreszenzmarkiertem WGA anzufärben. Der Phosphotyrosin-Antikörper erkennt tight junctions in der Zellmembran, so daß diese angefärbt wird. 26

30 Ergebnisse Abb. 13 Lokalisierung von HA-rca1 in Wildtyp Embryonen. Während des 16. Zellzyklus ist HA-rca1 innerhalb des Nukleus lokalisiert. Obere Reihe (A D) Ausschnitt aus einem Embryo gefärbt gegen HA, CyclinA (Zytoplasma) und DNA. Untere Reihe (E-H) Ausschnitt aus einen Embryo gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). Für die Überexpression von HA-rca1 wurde in beiden Fällen die paired-gal4-linie verwendet Lokalisierung von HA-rca1; 133 Mit diesem Konstrukt sollte getestet werden, ob die Kernlokalisierungssequenz oder die sechs deletierten Phosphorylierungsstellen für die nukleare Lokalisierung von Rca1 verantwortlich sind. Obwohl bei HA-rca1; 133 die Kernlokalisierungssequenz deletiert wurde, ist HA-rca1; 133 während des Zellyklus 14 weiterhin im Nukleus lokalisiert (Abb. 14; A). Ein anderes Bild zeigt sich jedoch bei der Überexpression mit der paired-gal4-linie. Im Verlauf von Zellzyklus 16, findet man HA-rca1; 133 auch im Zytoplasma (Abb. 14; B-I). Die zytoplasmatische Lokalisierung zeigt eine starke Variabilität. In einigen Fällen ist HA-rca1; 133 über die ganzen Zelle verteilt, (Abb. 14; B) während es in anderen rein zytoplasmatisch lokalisiert ist (Abb. 14; F). Diese Beobachtung deutet daraufhin, daß die deletierten Proteinmotive während des 16. Zellzyklus für eine effektive Kernlokalisierung benötigt werden. 27

31 Ergebnisse Abb. 14 Lokalisierung von HA-rca1; 133 in Wildtyp Embryonen. (A) Ausschnitt aus einem Wildtyp Embryo in den HA-rca1; 133-mRNA injiziert wurde. Während des 14. Zellzyklus zeigt HA-rca1; 133 eine eindeutige Kernlokalisierung. Der Nachweis von HA-rca1 erfolgte mit einem HA-Antikörper. Obere Reihe (B E) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma) und DNA. HA-rca1; 133 ist in der ganzen Zelle verteilt. Untere Reihe (F-I) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HA-rca1; 133 ist hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Für die Überexpression von HA-rca1; 133 wurde in beiden Fällen die paired-gal4-linie verwendet Lokalisierung von HA-rca1; 203 Bei HA-rca1; 203 fehlen die N-terminalen Aminosäuren bis zu Position 203. In diesem Abschnitt befindet sich die Kernlokalisierungssequenz und die F-Box, sowie sieben potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen. In Embryonen in denen HA-rca1; 203 mit Hilfe der paired-gal4-linie exprimiert wurde zeigt sich ein ähnliches Bild wie bei HA-rca1; 133 (Abb. 15). Die Lokalisierung variiert wiederum von einer Verteilung in der ganzen Zelle (Abb. 15; H) bis zu einer rein zytoplasmatischen Lokalisierung (Abb. 15; E). 28

32 Ergebnisse Abb. 15 Lokalisierung von HA-rca1; 203 in Wildtyp Embryonen Obere Reihe (A D) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma) und DNA. HA-rca1; 203 ist größtenteils zytoplasmatisch lokalisiert.untere Reihe (E-H) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HArca1; 203 ist in der ganzen Zelle nachweisbar. Für die Überexpression von HA-rca1; 203 wurde in beiden Fällen die paired-gal4-linie verwendet Lokalisierung von HA-rca1; 255 Bei HA-rca1; 255 wurde das Rca1-Protein bis auf ein C-terminales Fragment verkürzt das nur noch die ZBR und drei potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen enthält. Die Injektion der entsprechenden mrna zeigt, daß HA-rca1; 255 während des 14. Zellzyklus vorwiegend zytoplasmatisch lokalisiert ist (Abb. 16; A). Im Zellzyklus 16 ist HArca1; 255 ebenfalls hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 16; B-E). Allerdings findet man, wie bei den anderen N-terminal verkürzten Rca1-Konstrukten, auch hier Bereiche in denen HA-rca1; 255 in der ganzen Zelle verteilt ist (Abb. 16; F-I). 29

33 Ergebnisse Abb. 16 Lokalisierung von HA-rca1; 255 in Wildtyp Embryonen (A) Ausschnitt aus einem Wildtyp Embryo in den HA-rca1; 255-mRNA injiziert wurde. Im Zellzyklus 14 ist HA-rca1; 255 nahezu vollständig im Zytoplasma lokalisiert. Obere Reihe (B E) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma) und DNA. HA-rca1; 255 ist in der ganzen Zelle verteilt. Untere Reihe (F-I) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HA-rca1; 255 ist entweder in der ganzen Zelle verteilt oder hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Für die Überexpression von HA-rca1; 255 wurde in beiden Fällen die paired-gal4-linie verwendet Lokalisierung von HA-rca1; F-Box Um die Bedeutung der F-Box für die Kernlokalisierung alleine zu untersuchen, wurde das Konstrukt HA-rca1; F-Box hergestellt. Dieses Konstrukt enthält eine interne Deletion im Bereich der F-Box, während alle anderen Proteinmotive intakt sind. HA-rca1; F-Box ist in Zellzyklus 14 weiterhin im Kern lokalisiert (Abb. 17; A). In älteren Embryonen in denen HA-rca1; F-Box in jedem zweiten Segment exprimiert wurde, ist es jedoch eindeutig zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 17; B-I). Aus diesem Resultat kann man entnehmen, daß für die Kernlokalisierung im Zellzyklus 16 sowohl die Kernlokalisierungssequenz als auch die F-Box erforderlich sind. Im Vergleich zu den N-terminal verkürzten 30

34 Ergebnisse Konstrukten, findet man hier eine erheblich geringere Anzahl von Zellen bei denen HA-rca1; F-Box in der gesamten Zelle verteilt ist (Abb. 17; B & F). Abb. 17 Lokalisierung von HA-rca1; F-Box in Wildtyp Embryonen (A) Ausschnitt aus einem Wildtyp Embryo im 14. Zellzyklus in den HA-rca1; F-Box-mRNA injiziert wurde. HA-rca1; F-Box ist eindeutig Kern lokalisiert. Obere Reihe (B E) Ausschnitt aus einen Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma) und DNA. HA-rca1; F-Box ist fast ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert. Untere Reihe (F-I) Ausschnitt aus einen Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HA-rca1; F-Box ist hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert. Nur vereinzelt findet man eine Gleichverteilung in der Zelle. Für die Überexpression von HA-rca1; F-Box wurde in beiden Fällen die paired- Gal4-Linie verwendet. 2.5 Überexpression der Rca1-Kostrukte im Drosophila Auge Die Überexpression des vollständigen Rca1-Proteins, unter der Kontrolle des glass responsive element-(gmr)-promotors führt zu einem rauhen Augenphänotyp (Dong et al. 1997). Im Verlauf der Musterbildung in der Augenimaginalscheibe werden die Zellen, die sich in morphogentischen Furche befinden, in der G1-Phase synchronisiert. Ein Teil dieser Zellen differenziert sich zu Neuronen, während die restlichen eine weitere Zellteilung durchlaufen. Die Überexpression von Rca1 führt, ähnlich wie die Überexpression von CyclinA oder der 31

35 Ergebnisse Verlust von roughex, dazu, daß diese G1-Phase nicht etabliert wird, was sich letztendlich in dem rauhen Augenphänotyp auswirkt. Um zu Untersuchen welche Proteinmotive für die Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps erforderlich sind, wurden die Rca1- Deletionskonstrukte im Auge überexprimiert. Für die Überexpression der Rca1-Konstrukte wurden zwei verschiedene augenspezifische Gal4-Linien verwendet. Zum einem wurde ähnlich wie bei Dong et al die gmr-gal4-linie verwendet. Die Überexpression von HA-rca1 mit gmr-gal4 führt wie beim unmarkierten Rca1 zu einem rauhen Augenphänotyp, woraus man schließen kann, daß die Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps durch das HA- Epitop nicht beeinflußt wird (Abb. 18; D & E). Um zu Testen ob die Menge des überexprimierten Proteins die Stärke des Augenphänotyps beeinflußt, wurden zwei unterschiedlich starke gmr-gal4-linien verwendet. Jedoch ist in keinem der Fälle ein Unterschied zwischen beiden Allelen sichtbar. Benutzt man für die Überexpression von HA- Rca1 die sevenless-gal4-linie, erhält man ebenfalls rauhe Augen (Abb. 18; F). Die Überexpression von HA-rca1; C351S resultiert weder mit gmr-gal4 noch mit sevenless- Gal4 in einem rauhen Augenphänotyp (Abb. 18; G-I). Daraus kann man schließen, daß die zinc binding region (ZBR) für die Induktion des rauhen Augenphänotyps notwendig ist. Außerdem wird deutlich, daß der Austausch eines der konservierten Cystein-Reste ausreicht um die ZBR auch in vivo zu inaktivieren. Wie das vollständige Rca1-Protein ist auch HA-rca1; 133 in der Lage den rauhen Augenphänotyp zu induzieren, was bedeutet, daß die ersten 133 Aminosäuren für diesen Prozeß nicht erforderlich sind (Abb. 18; J-L). Die Überexpression von HA-rca1; 203 und HA-rca1; F-Box hat keinen Einfluß auf die Gestalt des Auges (Abb. 18; M-O & S-U), woraus man entnehmen kann, daß die F-Box eine wichtige Funktion bei der Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps hat. Wie nach den vorangegangenen Experimenten zu erwarten war, hat die Überexpression von HA-rca1; 255 ebenfalls keinen Effekt (Abb. 18; P-R). 32

36 Ergebnisse Abb. 18 Überexpression der Rca1-Deletionskonstukte im Drosophila Auge. Für die Überexpression wurden zwei unterschiedlich starke gmr- Gal4-Linien, sowie die sevenless-gal4-linie verwendet. Die Überexpression von HArca1 (D-F) und HA-rca1; 133 (J-K) resultiert in einem rauhen Augenphänotyp. Die Überexpression der anderen Konstrukte hat keinen Einfluß auf die Morphologie des Auges. Als Kontrolle dienten heterozygote Fliegen von den jeweiligen Gal4-Linien (A-C). 33