Untersuchungen zur direkten und indirekten Genotoxizität von Natriumselenit und Selenomethionin

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1 Untersuchungen zur direkten und indirekten Genotoxizität von Natriumselenit und Selenomethionin vorgelegt von CAROLINE HALL Staatlich geprüfte Diplom-Lebensmittelchemikerin aus Bad Hönningen von der Fakultät III Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin (TU) zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat.- genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rotard Berichter: Prof. Dr. A. Hartwig Berichter: Prof. Dr. L. W. Kroh Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 03. November 2008 Berlin 2008 D83

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3 Inhaltverzeichnis I INHALTSVERZEICHNIS 1 ZUSAMMENFASSUNG EINLEITUNG Selen Vorkommen und Exposition Resorption und Metabolismus Selenoproteine Toxikologie Untersuchte Selenverbindungen DNA-Schäden und ihre Reparatur Oxidative DNA-Schäden und die Basenexzisionsreparatur Helixverzerrende DNA-Schäden und die Nukleotidexzisionsreparatur BPDE-induzierte DNA-Schäden UV-induzierte DNA-Schäden Nukleotidexzisionsreparatur Das Xeroderma Pigmentosum Protein A Glutathion FRAGESTELLUNG MATERIAL UND METHODEN Zellkultur und Behandlung der Zellen Zelllinien Zellkultur Inkubationslösungen Bestimmung der Aktivität der Glutathion-Peroxidase Versuchsdurchführung Proteinbestimmung nach Bradford Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit Nachweis oxidativer DNA-Schäden Versuchsansatz Alkalische Entwindung Chromatographie und fluorimetrische Quantifizierung Quantifizierung von Gesamtglutathion und Glutathiondisulfid... 31

4 INHALTSVERZEICHNIS II Versuchsansatz Probenaufarbeitung Durchführung des Recycling-Assays Bestimmung des Proteingehaltes nach der BCA-Methode Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden Versuchsansatz Versuchsdurchführung Bestimmung der Glutathion-S-transferase-Aktivität Versuchsdurchführung Nachweis BPDE-induzierter DNA-Addukte Versuchsansatz DNA-Isolierung und -Quantifizierung DNA-Hydrolyse HPLC-Analyse Immunologischer Nachweis des XPA-Proteins Zelllyse Elektrophorese und Westernblot Chemilumineszenz-Detektion Freisetzung von Zink aus XPAzf Versuchsdurchführung ERGEBNISSE UND DISKUSSION Bioverfügbarkeit der Selenverbindungen Zytotoxizität der Selenverbindungen Untersuchungen zur prooxidativen Wirkung der Selenverbindungen Induktion von oxidativen DNA-Schäden Untersuchung des Glutathionhaushaltes Induktion und Reparatur von UVC-induzierten DNA-Schäden Induktion von UVC-induzierten DNA-Schäden Reparatur der Photoläsionen Beeinflussung der Reparatur UVC-induzierter DNA-Schäden durch Selenverbindungen Modulierung der Toxizität von BPDE durch die Selenverbindungen Untersuchungen zur Detoxifizierung von Benzo[α]pyrendiolepoxid Beeinflussung des Glutathionhaushaltes... 62

5 INHALTSVERZEICHNIS III Untersuchung der Aktivität der Glutathion-S-transferase Einfluss auf die Bildung und Reparatur BPDE-induzierter DNA-Addukte Beeinflussung der BPDE-induzierten Zytotoxizität Untersuchungen in XPA knock-in und XPA-defizienten Zellen Charakterisierung der Zellen Reparatur von BPDE-induzierten DNA-Addukten Beeinflussung der Induktion von BPDE-induzierten DNA-Addukten durch Selenverbindungen Zinkfreisetzung aus XPAzf ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Abkürzungsverzeichnis Geräte Verbrauchsmaterialien Zelllinien Chemikalien Lösungen und Puffer HPLC-Analyse Recycling Assay PUBLIKATIONSLISTE DANKSAGUNG

6 ZUSAMMENFASSUNG 1 1 ZUSAMMENFASSUNG Das für den Menschen essentielle Spurenelement Selen ist Bestandteil von Selenoproteinen, von denen insbesondere die Glutathion-Peroxidasen und die Thioredoxin-Reduktasen am Abbau von Peroxiden in der Zelle beteiligt sind. Neben den unumstrittenen antioxidativen Eigenschaften der Selenoproteine werden eine Stimulierung von DNA-Reparaturprozessen und eine Induktion von Phase II- Enzymen des Fremdstoffmetabolismus als weitere chemopräventive Wirkmechanismen von Selen diskutiert. Epidemiologische Studien und Untersuchungen zur Krebshäufigkeit in Korrelation zur Selenaufnahme sind jedoch uneinheitlich und deuten auf komplexe biologische Wirkmechanismen der Selenverbindungen hin, darunter auch prooxidative Eigenschaften. Das Ziel dieser Arbeit war es, Natriumselenit und Selenomethionin hinsichtlich ihrer direkten und indirekten genotoxischen Effekte zu vergleichen. Beide Selenverbindungen sind für die Selenversorgung des Menschen als Bestandteil von Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln von Bedeutung. Während es sich bei Selenomethionin um eine organische, vollständig reduzierte Verbindung handelt, gehört Natriumselenit zu den anorganischen, reduzierbaren Selenverbindungen. Infolge dessen unterliegen sie einem unterschiedlichen zellulären Metabolismus. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand der Enzymaktivität der Selen-abhängigen Glutathion-Peroxidase die Aufnahme und Metabolisierung beider Verbindungen in A549 Zellen nachgewiesen werden. In anschließenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Natriumselenit bereits ab einer Konzentration von 4 µm zytotoxische Effekte hervorrief und somit ca. 100fach stärker zytotoxisch war als Selenomethionin. Die Untersuchung der direkten Genotoxizität der Selenverbindungen erfolgte anhand der Induktion oxidativer DNA-Schäden und des Einflusses auf den Glutathionhaushalt. Selenomethionin führte weder zu einer Induktion oxidativer DNA-Schäden, noch zu einer Verschiebung des Redoxhaushaltes. Hingegen führte Natriumselenit in zytotoxischen Konzentrationen sowohl zu einer konzentrationsabhängigen und signifikanten Induktion oxidativer DNA-Basenmodifikationen als auch zu einer signifikanten Bildung von oxidiertem Glutathiondisulfid. Die Untersuchungen zur indirekten Genotoxizität der Selenverbindungen erfolgte anhand der Modulierung der Genotoxizität von UVC-Strahlung und

7 ZUSAMMENFASSUNG 2 (+)-anti-benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE), dem ultimalen genotoxischen Metabolit von Benzo[α]pyren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Natriumselenit als auch Selenomethionin in hohen Konzentrationen die Reparatur UVC-induzierter Photoläsionen hemmen können. Die Untersuchungen zur Beeinflussung der Genotoxizität von BPDE ergaben keine Anzeichen einer verminderten Detoxifizierung von BPDE. Der Hauptweg der enzymatischen Detoxifizierung von BPDE, die Glutathion-S-transferase katalysierte Konjugation an Glutathion, war von den Selenverbindungen unbeeinflusst. Beide Selenverbindungen führten bereits im nicht-zytotoxischen Konzentrationsbereich zu einer erhöhten Anzahl BPDEinduzierter DNA-Addukte und zu einer Hemmung der Nukleotidexzisionsreparatur. Während die durch Selenomethionin hervorgerufene Reparaturhemmung nach 24- stündiger Reparaturzeit aufgehoben war, war sie nach Inkubation mit Natriumselenit sowohl nach acht als auch nach 24 Stunden Reparatur nachweisbar. Zudem konnte gezeigt werden, dass sich die Reparaturhemmung durch Natriumselenit in einer Verstärkung der BPDE-induzierten Zytotoxizität auswirkt. Abschließend wurde mit Hilfe eines subzellulären Testsystems gezeigt, dass Natriumselenit Zink aus der Zinkfingerdomäne des Xeroderma Pigmentosum Protein A (XPA) herauslösen kann, während Selenomethionin dazu nicht in der Lage war. Da das XPA-Protein für die Nukleotidexzisionsreparatur von essentieller Bedeutung ist, kann dies der Grund für die Reparaturhemmung durch Natriumselenit sein. Demgegenüber sind weitere Versuche zur Aufklärung der Reparaturhemmung durch Selenomethionin nötig. Somit konnten im Verlauf dieser Arbeit direkte genotoxische Effekte von Natriumselenit gezeigt werden, die die genomische Stabilität beeinträchtigen können. Außerdem wurden erstmals indirekte genotoxische Effekte von Selenverbindungen nachgewiesen. Die Hemmung der DNA-Reparatur resultierte im Fall von Natriumselenit wahrscheinlich aus einer Interaktion mit dem DNA-Reparaturprotein XPA. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Relevanz der Ergebnisse für den intakten Organismus abzuklären.

8 EINLEITUNG 3 2 EINLEITUNG 2.1 Selen Das Spurenelement Selen wurde 1817 von dem schwedischen Chemiker Jöns Jacob Berzelius entdeckt und nach der griechischen Mondgöttin Selene benannt. Selen mit der Ordnungszahl 34 ist ein Halbmetall und gehört in die VI. Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente. Somit hat es ähnliche chemische Eigenschaften wie Schwefel und Tellur und wird zu den Chalkogenen gezählt. Dennoch unterscheiden sich seine biochemischen Eigenschaften von denen des Schwefels. Unter physiologischen Bedingungen ist der Säurecharakter von Selenolen (-SeH) deutlich stärker ausgebildet als der von Thiolen (-SH), so dass Selenole in biologischen Systemen fast vollständig dissoziiert vorliegen (Barceloux, 1999). Nachdem lange Zeit von einer toxischen Wirkung von Selen ausgegangen wurde, konnten Schwarz und Foltz (1957) die Essentialität für Säugetiere nachweisen folgte die Entdeckung von Selen als Komponente der Glutathion-Peroxidase (Flohé et al., 1973; Rotruck et al., 1973). Als Bestandteil von Glutathion-Peroxidasen ist Selen für den Abbau von Peroxiden von zentraler Bedeutung und seine antioxidative Wirkung anerkannt. Als weitere chemopräventive Wirkung werden die Induktion von Phase II-Enzymen des Fremdstoffmetabolismus und eine Steigerung von DNA- Reparaturmechanismen diskutiert (Seo et al., 2002; Fischer et al., 2007; Brigelius- Flohé, 2008). Aufgrund dieser Eigenschaften wurden Selen-Präparate als Nahrungsergänzungsmittel in den vergangenen Jahren verstärkt angeboten. Demgegenüber besitzen einige Selenverbindungen ebenso prooxidative Eigenschaften und die Fähigkeit, mit Thiolgruppen von Proteinen und Peptiden zu reagieren. Epidemiologischen Studien und Daten zur Krebsinzidenz in Korrelation der Selenaufnahme sind uneinheitlich, deuteten aber zunächst darauf hin, dass ein niedriger Selenspiegel im Serum bzw. eine geringe tägliche Aufnahme mit einem erhöhten Risiko an Leber-, Lungen-, Prostata- und Dickdarmkrebs verbunden ist (Clark et al., 1996; Yu et al., 1997). In der bislang umfassendsten placebokontrollierten Interventionsstudie, der Nutritional Prevention of Cancer Studie (NPC), wurde der Effekt einer täglichen Gabe von 200 µg Selenomethionin in Form von angereicherter Bäckerhefe auf das Auftreten von Hautkrebsrezidiven in einem Hautkrebsrisikokollektiv untersucht. Obwohl sich keine Effekte auf das primäre

9 EINLEITUNG 4 Studienziel ergaben, waren die Prostata-, Lungen- und Dickdarmkrebsraten ebenso reduziert, wie die krebsbedingte Mortalität. Allerdings zeigten sich in der gleichen Studie auch gesteigerte Krebshäufigkeiten, von z.b. Brust- und Blasenkrebs. Des Weiteren wurde die präventive Wirkung nur bei Patienten mit niedrigem initialen Selenspiegel deutlich (Clark et al., 1996; Duffield-Lillico et al., 2002; Duffield-Lillico et al., 2003). Dahingegen konnten im finnischen Interventionsprogramm, in welchem die Selenversorgung der Bevölkerung durch Anreicherung der landwirtschaftlichen Düngemittel mit Selenat erhöht wurde, keine signifikante Veränderung der Krebsinzidenz festgestellt werden (Vinceti et al., 2000) Vorkommen und Exposition Aufgrund seines Durchschnittsgehaltes in der Erdkruste von 90 µg/kg gehört Selen zu den seltenen Elementen. Es ist ubiquitär verbreitet. Durch die Verwitterung sulfidischer Eisenerze wird es in anorganischer Form als Selenit oder Selenat freigesetzt und von Pflanzen aufgenommen. Nach der Reduktion zu Hydrogenselenid kann dieses methyliert, zur Biosynthese von Selenoproteinen genutzt oder zu verschiedenen niedermolekularen Selenverbindungen metabolisiert werden. Durch Methylierung ist es einigen Pflanzenarten möglich, auf selenreichen Böden zu wachsen. Diese so genannten Akkumulatorpflanzen speichern Selen überwiegend in Form methylierter Metabolite wie Methylselenocystein oder y-glutamyl-se-methylselenocystein. Zu ihnen zählen vorwiegend Astralagus- (Tragant), Brassic-a (Kohl) und Allium- (Zwiebel) Spezies. Demgegenüber speichern Hefen Selen fast ausschließlich als Selenomethionin (zusammengefasst in Barceloux, 1999; Birringer et al., 2002; Rayman, 2008). Mit Ausnahme der beruflich bedingten Exposition, wie z. B. in der Halbleiter- oder Kupferherstellung und der Keramikindustrie, nimmt der Mensch Selen fast ausschließlich mit der Nahrung auf. Der Selengehalt in Lebensmitteln ist von der Selenaufnahme der Pflanzen und Tiere abhängig und kann deshalb je nach Bodenbeschaffenheit stark variieren. In Lebensmitteln treten überwiegend Selenomethionin und Selenocystein auf, deren Bioverfügbarkeit aus pflanzlichen Lebensmitteln besser ist als aus tierischen Lebensmitteln (Navarro-Alarcon und Lopez-Martinez, 2000). In Deutschland wird die tägliche Selenaufnahme überwiegend in Form der eiweißreichen Lebensmittel Fleisch, Wurst, Fisch und Eier gedeckt. Backwaren tragen zu ca. 10 % zur täglichen Selenaufnahme bei (Anke,

10 EINLEITUNG ). In Nahrungsergänzungsmitteln werden Selenhefen, welche überwiegend Selenomethionin enthalten, oder anorganisches Natriumselenit oder -selenat eingesetzt (Rayman et al., 2008). Der tägliche Bedarf an Selen ist derzeit nicht ausreichend geklärt, da die zugrunde liegenden Kriterien der Beurteilung unklar sind. Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung empfiehlt eine tägliche Zufuhr von 30 bis 70 µg (DGE/ÖGE/SGE/SVE, 2000) für Erwachsene Resorption und Metabolismus Mit Ausnahme der inhalativen Aufnahme nach Exposition am Arbeitsplatz erfolgt die Resorption von Selenverbindungen nach oraler Aufnahme im Duodenum des Gastrointestinaltraktes ohne homöostatische Kontrolle (zusammengefasst in Barceloux, 1999). Selenomethionin wird über den gleichen Na + Ionen-abhänhigen Aminosäurecarrier wie Methionin absorbiert. Selenocystein wird wie Cystein über den Carrier für basische Aminosäuren transportiert (Wolffram et al., 1989). Während Selenat mittels eines aktiven Natrium-Cotransportes transportiert wird, konnten für die Absorption von Selenit keine aktiven Transportmechanismen identifiziert werden. Daher wird im Fall von Selenit von eine passiven Diffusion ausgegangen. Dies wird als Grund dafür angesehen, dass Selenit langsamer absorbiert wird als Selenat (Wolffram et al., 1986; Mykkanen und Wasserman, 1989). Nach der Resorption können organische sowie anorganische Selenverbindungen zu Hydrogenselenid (H 2 Se) umgesetzt werden, welches nach ATP-abhängiger Phosphorylierung dem Aufbau von Selenoproteinen dienen kann. Selenit unterliegt dem reduktiven Metabolismus und wird zunächst durch Glutathion reduziert. Das dabei entstehende gemischte Disulfid wird nachfolgend durch die Glutathion-Reduktase oder Thioredoxin-Reduktase unter NADPH-Verbrauch zu Hydrogenselenid, dem zentralen Metabolit, reduziert. Im Gegensatz dazu kann Selenomethionin entweder ohne vorherige Metabolisierung unspezifisch anstelle von Methionin in Proteine eingebaut werden oder durch enzymatische Reaktion dem zellulären Selenpool zugeführt werden. Nach der Transselenierung von Selenomethionin katalysiert die ß-Lyase die Freisetzung von Hydrogenselenid aus Selenocystein. Dieses kann in Folgereaktionen entweder zur Biosynthese von Selenoproteinen eingesetzt werden oder in Form methylierter Produkte oder als Selenozucker ausgeschieden werden. Des Weiteren wird eine Oxidation von Hydrogenselenid mit gleichzeitiger Bildung von

11 EINLEITUNG 6 Superoxidradikalen diskutiert (Whanger, 2004; Rayman et al., 2008; Brigelius-Flohé, 2008). Abbildung 1 zeigt den Metabolismus von Selenomethionin und Selenit. Unspezifischer Einbau in Proteine Körperproteine 4 GSH GSSG Selenit Selenomethionin 2 Selenocystein 3 1 GS-Se-SG (CH 3 ) 3 Se + (CH 3 ) 2 SeH CH 3 SeH H 2 Se 2 O OH - Urin partielle Abatmung Selenozucker ATP ADP+P i 2 H 2 O Se O - 2 Ausscheidung Urin H 3 SePO 3 Toxizität Selenoproteinbiosynthese Selenoproteine Abbildung 1: Metabolismus von Selenomethionin und Selenit. 1: Glutathion-Reduktase und Thioredoxin-Reduktase, 2: γ-lyase, 3: ß-Lyase; GSH: Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid (zusammengefasst aus Yan und Spallholz, 1993; Rayman et al., 2008; Brigelius-Flohé, 2008) Selenoproteine Im Gegensatz zu anderen essentiellen Metallionen, die als Cofaktoren mit Proteinen in Wechselwirkung treten, wird Selen in Form der 21sten genetisch codierten Aminosäure Selenocystein cotranslational in so genannte Selenoproteine eingebaut. Bekannt sind außerdem Selen-bindende Proteine, deren Funktion weitgehend ungeklärt ist, und selenomethioninhaltige Proteine, die keine besondere biologische Bedeutung ausüben (Behne und Kyriakopoulos, 2001). Proteomanalysen ergaben eine Anzahl von 25 humanen Selenoproteinen, die mindestens ein Selenocystein im aktiven Zentrum enthalten, welches für die Enzymaktivität von essentieller Bedeutung ist (Kryukov et al., 2003). Die Synthese von Selenoproteinen bedarf zum einen spezieller Enzyme zur Ausbildung der Selenocysteinyl-tRNA, dem Grundbaustein für Selenoproteine. Des Weiteren wird eine von der gewöhnlichen Transkription abweichende Proteinsynthesemaschinerie benötigt, die das UGA-

12 EINLEITUNG 7 Codon nicht wie üblich als Stoppcodon, sondern als Selenocystein-Insertionssignal decodiert. Zentrales Element für die korrekte Decodierung ist die Selenocystein- Insertions-Sequenz (SECIS), eine Haarnadelstruktur im 3 -untranslatierten Bereich der mrna. Dieses Strukturelement wird durch SECIS-bindende Proteine erkannt, die infolgedessen spezifische Elongationsfaktoren rekrutieren. Als weiteres an der Synthese einiger Selenoproteinen beteiligtes Element wurde das selenocystein redefinition element entdeckt, welches sich in 5 -Richtung in unmittelbarer Nähe des UGA-Codons befindet. Dessen Funktion bedarf jedoch noch der Aufklärung (Behne und Kyriakopoulos, 2001; Schomburg et al., 2004; Papp et al., 2007). Die Biosynthese der Selenoproteine und die Selenversorgung der Organe unterliegen einer Hierarchie mit bislang teilweise unklaren molekularbiologischen Grundlagen. Dies bedeutet, dass einzelne Gewebe bevorzugt versorgt werden und Selenoproteine mit besonderer Bedeutung für den Organismus auch unter Mangelzuständen präferentiell synthetisiert werden (Allan et al., 1999). Zu den Selenoproteinen mit bekannter biologischer Funktion gehören die Enzymfamilien der Glutathion-Peroxidasen (GPx), Thioredoxin-Reduktasen und Thyroxin-Deiodinasen sowie das Selenoprotein P. Es sind vier Enzyme aus der Familie der Glutathion-Peroxidasen bekannt. Diese sind die zytosolische (GPx-1), die gastrointestinale (GPx-2) Glutathion-Peroxidase, die Plasma-GPx (GPx-3, pgpx) und die Phospholipidhydroperoxid-GPx (GPx-4, PHGPx). Sie katalysieren die Reduktion von Wasserstoffperoxid und organischen Hydroperoxiden, einschließlich Lipidhydroperoxiden, zu den entsprechenden Alkoholen (Abbildung 2). Auf diese Weise schützen sie die Zelle vor oxidativen Schäden durch reaktive Sauerstoffverbindungen. Sie weisen ein breites Substratspektrum bezüglich der Peroxide auf. Alle GPx haben Selenocystein in ihrem aktiven Zentrum, welches aus einer katalytischen Triade aus Selenocystein, Glutamin und Tryptophan besteht (Arthur, 2000; Brigelius-Flohé et al., 2002).

13 EINLEITUNG 8 ROOH ROH E-Se - E-SeOH GSSG + H + GSH GSH E-Se-SG H 2 O Abbildung 2: Allgemeiner Reaktionsmechanismus von Glutathion-Peroxiden. GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathion (modifiziert nach Birringer et al., 2002) Thioredoxin-Reduktasen katalysieren die NADPH-abhängige Reduktion von Thioredoxin, welches an zahlreichen Redoxreaktionen der Zelle beteiligt ist. Thioredoxine enthalten in ihrem aktiven Zentrum zwei Cystein-Gruppen, die in der Disulfid- oder Thiolform vorliegen können. Außerdem können sie weitere Stoffe, wie z.b. Wasserstoffperoxid, Selenit und Hydroperoxide reduzieren. Durch ihre reduzierenden Eigenschaften haben sie Auswirkungen auf die Faltung von Proteinen, die Redoxregulation von Transkriptionsfaktoren und die Steuerung der Proliferation (Behne und Kyriakopoulos, 2001). Die Familie der Thyroxin- Deiodinasen enthält drei verschiedene Deiodinasen (Typ 1-3) und ist für die Aktivierung und den Abbau von Schilddrüsenhormonen von zentraler Bedeutung. Sie katalysieren die Deiodierung von Thyroxin und Iodothyroninen, wobei der molekulare Mechanismus nicht vollständig aufgeklärt ist (Köhrle, 2000). Das menschliche Selenoprotein P enthält 10 Selenocysteine und es wird geschätzt, dass es ca. 50 % des im Plasma enthaltenen Selens enthält. Es wird vermutet, dass Selenoprotein P für die Verteilung von Selen aus der Leber in Zielorgane und als extrazelluläres Antioxidans von Bedeutung ist. Des Weiteren wird seine Beteiligung an der Komplexierung von Schwermetallionen diskutiert (Burk et al., 2003; Papp et al., 2007).

14 EINLEITUNG Toxikologie Die Toxizität von Selen hängt von der entsprechenden Selenverbindung ab und ist im Allgemeinen eher gering. Anorganische Selenverbindungen gelten als toxischer als organische Verbindungen (Barceloux, 1999). Die auftretenden toxischen Effekte werden auf die Reaktivität des Selens gegenüber SH-Gruppen und die Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zurückgeführt (Yan und Spallholz, 1993; Stewart et al., 1999; Vinceti et al., 2001). Obwohl die molekularen Mechanismen der Selentoxizität noch unklar sind, scheint die Reaktion einiger Selenverbindungen mit Glutathion, die zur Bildung von Selenotrisulfiden führt, eine wesentliche Rolle zu spielen. Dies kann eine Depletion von Glutathion und somit eine Störung des Redoxhaushaltes zur Folge haben (Vernie et al., 1979; Caffrey und Frenkel, 1991; Yan und Spallholz, 1993; Shen et al., 2000). Des Weiteren wird die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und damit verbunden oxidativer Stress als Ursache für die durch Selen hervorgerufene Apoptose diskutiert (Kim et al., 2004; Drake, 2006). In-vitro Untersuchungen zeigten eine Bildung von Superoxidradikal-Anionen durch Selenverbindungen, die reduktiv unter Beteiligung von Glutathion zu Hydrogenselenid umgesetzt werden (Spallholz et al., 2004). Durch die Reaktivität anorganischer Selenverbindungen gegenüber Thiolen, wie z. B. Glutathion, werden die Selenverbindungen in Hydrogenselenid überführt, welches mit Sauerstoff reagieren und zur ROS-Produktion beitragen kann (Abbildung 3) (Seko et al., 1989; Spallholz, 1997). Während die Reduktion von Selenit zu Selenodiglutathion ohne enzymatische Katalyse stattfindet, werden die weiteren Reaktionen zur Bildung von Selenid durch Glutathion-Reduktasen oder Thioredoxin-Reduktasen katalysiert (Birringer et al., 2002). 4 GSH GSSG GSH GSSG GSH GSSG 2 O OH - 2 O H 2 O SeO 2-3 GSSeSG GSSeH H 2 Se Se 0 Abbildung 3: Mögliche Bildung von Superoxidradikal-Anionen aus Selenit. (modifiziert nach Seko et al., 1989; Spallholz, 1997). SeO 2-3 : Selenit, GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathiondisulfid, H 2 Se: Hydrogenselenid, O - 2 : Superoxidradikal-Anion, Se 0 : elementares Selen.

15 EINLEITUNG 10 Außerdem können einige Selenverbindungen Thiole in Proteinen oxidieren und auf diese Weise zu einer Inaktivierung von Enzymen führen (Kim et al., 2003). Neben den beschriebenen Mechanismen werden zusätzlich toxische Wirkungen beispielsweise auf das Immun- und Nervensystem, das endokrine System, die Haut und die Leber beschrieben (zusammengefasst in Vinceti et al., 2001) Untersuchte Selenverbindungen Mit dem Ziel der Untersuchung direkter und indirekter genotoxischer Effekte wurden in dieser Arbeit reduzierbares, anorganisches Natriumselenit und vollständig reduziertes, organisches Selenomethionin eingesetzt (Abbildung 4). Wie in Kapitel beschrieben, sind beide Selenverbindungen als Bestandteil von Lebensmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln für die Ernährung des Menschen von Bedeutung. Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften wird Natriumselenit unter Beteiligung von Glutathion zu Hydrogenselenid reduziert, während Selenomethionin enzymatisch, ohne Beteiligung von Redoxreaktionen in den Zentralmetabolit überführt wird. Die unterschiedlichen Redoxeigenschaften von Selenverbindungen spiegeln sich ebenso in ihrer Interaktion mit Thiolen wider. Reduzierbare Selenverbindungen können Zink aus Zinkfingerstrukturen freisetzen, während vollständig reduzierte Selenverbindungen dazu nicht in der Lage sind (Blessing et al., 2004). Sowohl eine Interaktion mit Zinkfingerstrukturen, eine Störung des vorwiegend durch Glutathion bedingten Redoxstatus als auch eine verstärkte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies können wesentliche zelluläre Mechanismen beeinflussen. Dazu zählen die genomische Stabilität, die Zellzykluskontrolle, die Genexpression und die Apoptose. Na + Na O O +IV Se O COO - + -II H 3 N Se Natriumselenit Selenomethionin Abbildung 4: Strukturformeln von Natriumselenit und Selenomethionin.

16 EINLEITUNG DNA-Schäden und ihre Reparatur Nach Schätzungen finden pro Tag in einer menschlichen Zelle ca DNA- Schadensereignisse statt. Ihre Ursachen können endogenen Ursprungs, wie z.b. Replikationsfehler oder reaktive Sauerstoffspezies, sein. Oder sie können exogen durch DNA-schädigende Agenzien aus der Umwelt verursacht werden. Das Netzwerk der zellulären Antwort besteht im Wesentlichen aus der Schadenstoleranz, dem Einleiten von Zellzyklusarresten und Apoptose sowie in Abhängigkeit des Schadenstyps der Aktivierung verschiedener DNA-Reparaturwege. Somit stellen DNA-Reparaturprozesse einen wichtigen Mechanismus der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität dar und wirken der Entstehung von Mutationen entgegen. Die Mechanismen der Doppelstrangbruchreparatur, das nichthomologe End-Joining und die homologe Rekombination beseitigen DNA-Doppelstrangbrüche, die unter anderem durch ionisierende Strahlung entstehen. Die Basenexzisionsreparatur (BER) dient der Reparatur von Schäden an DNA-Basen als Folge von Alkylierung, Desaminierung oder Oxidation. Durch Umweltmutagene, wie z.b. Benzo[α]pyren, verursachte großräumige DNA-Addukte und UV-induzierte Photoläsionen werden über den Weg der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) beseitigt. Zur Reparatur von Basenfehlpaarungen sowie von Polymerasen eingefügte Nukleotid-Insertionen und -Deletionen, wie sie bei der Replikation entstehen können, dient die Fehlpaarungsoder Mismatchreparatur (zusammengefasst in Friedberg, 2001, 2003). Dem Fokus dieser Arbeit entsprechend werden im Folgenden einzelne Aspekte der DNA- Schadensinduktion und der DNA-Reparatur eingehender erläutert Oxidative DNA-Schäden und die Basenexzisionsreparatur Oxidative Schäden an zellulären Makromolekülen, wie Lipiden, Proteinen und der DNA, werden in der Zelle durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verursacht. Sie können durch entzündliche Prozesse in der Zelle, ionisierende Strahlung, langwelliges UV-Licht oder kontinuierlich als Nebenprodukte der aeroben Zellatmung entstehen und werden über ein fein reguliertes Abwehrsystem abgebaut. Enzymatische Abwehrmechanismen, wie Superoxiddismutasen, Peroxidasen und Reduktasen sowie nicht-enzymatische Antioxidantien, wie Glutathion, Ascorbinsäure und Carotinoide stellen die wesentlichen Bestandteile der zellulären Abwehr gegen ROS dar, welche jedoch unvollständig ist. Durch das Gleichgewicht zwischen der

17 EINLEITUNG 12 chronischen ROS-vermittelten Induktion und Reparatur oxidativer DNA-Schäden existiert in Zellen ein Grundschaden der zellulären DNA (Epe, 2002). Die Exposition gegenüber exogenen Noxen, wie UVA-Strahlung oder redoxaktiven Chemikalien, kann zu einer erhöhten Bildung von ROS oder zu einer Deaktivierung zellulärer Detoxifizierungsmechanismen führen und in Folge dessen oxidativen Stress und vermehrt auftretende oxidative Schäden von Makromolekülen hervorrufen. Durch Interaktion von reaktiven Sauerstoffspezies mit der DNA entsteht ein vielfältiges Spektrum an DNA-Schäden. Dabei stellt das prämutagene 8-Oxoguanin einen der schwerwiegendsten oxidativen DNA-Basenschäden dar, da es sich bei der Replikation mit Adenin paaren und somit Mutationen hervorrufen kann (zusammengefasst in Friedberg, 2006). Die Basenexzisionsreparatur dient der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität und repariert oxidative DNA-Schäden, alkylierte DNA-Basen, Uracil und abasische Stellen. Die BER besteht im Wesentlichen aus drei Schritten und wird durch Enzyme der Familie der DNA-Glykosylasen eingeleitet. Substratspezifische Glykosylasen erkennen die geschädigte Base und entfernen diese durch Hydrolyse der N-glycosidischen Bindung zwischen Base und Zucker-Posphat-Rückgrat. Anschließend hydrolysiert eine AP-Endonuklease die Phosphodiesterbrücke an der 5 -Position zur abasischen Stelle und das Desoxyribosephosphat wird an der 3 - Position zur AP-Stelle durch eine Desoxyribosephosphatdiesterase abgespalten. Dadurch entsteht eine Lücke von einem Nukleotid in 5 -Position zur abasischen Stelle. Alternativ existieren Glykosylasen, welche die Glykosylaseaktivität mit einer Endonuklease- oder 3 -Lyase-Aktivität vereinen. In der short-patch BER wird ein Nukleotid durch die Polymerase ß eingefügt und ein Enzymkomplex aus DNA-Ligase III, Pol ß und XRCC1 katalysiert die Ligation. Bei der long-patch BER werden durch die Polymerase δ und ε bis zu 10 Nukleotide synthetisiert. Nachfolgend werden die überschüssigen Desoxyriboseeinheiten durch das Zusammenspiel der Flap- Endonuklease-1 und PCNA entfernt und die Reparatur durch die Ligase I vollendet (zusammengefasst in Friedberg, 2006; Wilson und Bohr, 2007).

18 EINLEITUNG Helixverzerrende DNA-Schäden und die Nukleotidexzisionsreparatur Durch Umweltmutagene oder deren Metabolite verursachte großräumige bzw. helixverzerrende DNA-Schäden werden durch die Nukleotidexzisionsreparatur aus der DNA entfernt. In dieser Arbeit wurden zur Schädigung der DNA (+)-anti-benzo[α]pyrendiolepoxid, der reaktive Metabolit von Benzo[a]pyren, und UVC-Strahlung eingesetzt. Aus diesem Grund werden im Folgenden zunächst Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE)- und UVC-induzierte DNA-Schäden beschrieben, um anschließend auf den Mechanismus der Nukleotidexzisionsreparatur einzugehen BPDE-induzierte DNA-Schäden Wegen ihrer Persistenz, Toxizität und ihrer ubiquitären Verbreitung zählen Polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) zu den bedeutendsten Umweltschadstoffen. Sie entstehen durch unvollständige Verbrennungsprozesse organischer Materialien und umfassen Verbindungen mit maximal sechs kondensierten, meist aromatischen Ringen. Im Körper werden sie zu aromatischen Elektrophilen metabolisiert, welche mit Purinbasen der DNA stabile Addukte bilden können. Die Kanzerogenität vieler PAK ist bekannt, wobei Benzo[α]pyren (B[α]P) zu den stärksten Kanzerogenen aus dieser Gruppe gehört und von der International Agency for Research on Cancer als krebserregend für den Menschen eingestuft wurde (IARC, 2008). Mit Ausnahme der beruflichen Expositionen stellen Tabakrauch und Lebensmittel die Hauptexpositionsquellen für den Menschen dar. Dabei stammen ca. 70 % der täglichen B[α]P-Aufnahme aus Lebensmitteln, wie Gemüse, Fisch und Fleisch (Phillips, 1999). Die berufliche Exposition ist insbesondere bei Schornsteinfegern und Arbeitern in Kokereien und Gasfabriken, bei der Aluminiumherstellung, der Eisen- und Stahlerzeugung und in Gießereien besonders hoch (Praml und Nowak, 1998). B[α]P ist gut über den Magen-Darmtrakt, die Haut und die Lunge resorbierbar und wird im Verlauf des menschlichen Fremdstoffmetabolismus zu einer Vielzahl Metabolite umgesetzt (Abbildung 5). Der wahrscheinlich relevanteste Reaktionsweg für die kanzerogene Wirkung von B[α]P ist die Bildung des ultimalen Kanzerogens (+)-anti-bpde ((+)-r-7,t-8-dihydroxy-t-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren) und dessen Interaktion mit der DNA. BPDE bildet vor allem stabile DNA-Addukte an

19 EINLEITUNG 14 der N 2 -Position von Guanin. Infolge der damit verbundenen Helixverzerrung der DNA werden die Replikation und Transkription inhibiert und Mutationen hervorgerufen (Conney et al., 1994; Melendez-Colon et al., 1999). Als weitere Ursache für die zytotoxische und potentiell mutagene Wirkung des B[α]P gilt weiterhin die Induktion reaktiver Sauerstoffspezies über die Bildung von Chinonen. Aus B[α]P gebildete Dihydrodiole werden durch eine Dehydrogenase in Katechole umgewandelt, die zu Semichinonradikalen und o-chinon autoxidieren und dabei ROS freisetzen. o-chinone können instabile DNA-Addukte bilden oder werden durch nichtenzymatische Reduktion in Katechole überführt, welche durch Oxidation erneut zur Produktion von ROS beitragen können (zusammengefasst in Bolton et al., 2000). Des Weiteren wird angenommen, dass an der C6-Position des B[α]P Radikal- Kationen gebildet werden, die instabile DNA-Addukte und infolgedessen potentiell mutagene AP-Stellen hervorrufen (zusammengefasst in Cavalieri und Rogan, 1995). Über die Bildung von Semichinonen können diese Radikal-Kationen außerdem zur ROS-Produktion beitragen (Joseph und Jaiswal, 1994) Cytochrom P Epoxidhydrolasen Benzo[a]pyren Cytochrom P450 (Ein-Elektronen-Oxidation) + Hydrolyse Autoxidation instabile DNA-Addukte ROS HO HO HO OH Katechol O - 2 Cytochrom P450 HO O HO O N NH N DNA N NH HO HO HO (+)-anti-bpde GST GSH OH GS HO OH Dihydrodiol- Dehydrogenase GSH- Konjugat H 2 O 2 erweiterte Chinone Reduktion - O O Semichinonradikalanion N 2 -Guaninaddukt NADP + Semichinone O 2 Autoxidation ROS O - 2 NADPH ROS instabile DNA- Addukte O O o-chinon Abbildung 5: Metabolismus von Benzo[α]pyren (modifiziert nach Conney et al., 1994; Joseph und Jaiswal, 1994; Cavalieri und Rogan, 1995; Bolton et al., 2000).

20 EINLEITUNG 15 An der Detoxifizierung von (+)-anti-bpde und seinen Metaboliten sind vor allem Glutathion-S-transferasen (GST), UDP-Glucuronosyltransferasen und Sulfotransferasen beteiligt. Die GST-katalysierte Konjugation an Glutathion als Hauptweg der metabolischen Inaktivierung von (+)-anti-bpde wird in Kapitel 2.3 beschrieben UV-induzierte DNA-Schäden UV-Strahlung, deren Hauptquelle für die menschliche Exposition die Sonne ist, wird in die drei Wellenlängenbereiche UVA (315 bis 400 nm), UVB (280 bis 315 nm) und UVC (100 bis 280 nm) unterteilt. Für die Exposition des Menschen sind ausschließlich UVA- und UVB-Strahlung relevant, die mit einem Anteil von 95 bzw. 5 % die Erde erreichen. UVC-Strahlung wird dagegen von der Ozonschicht vollständig resorbiert. Das verursachte Schadensspektrum variiert mit der Wellenlänge. UVA-Strahlung führt hauptsächlich zu oxidativen Basenschäden, während UVB überwiegend und UVC-Strahlung fast ausschließlich DNA- Photoprodukte induziert. UVC-Strahlung führt hauptsächlich durch [2+2]-Zykloaddition zur Bildung von DNA-helixverzerrenden Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD) und 6-4-Photoprodukten (6-4-PP). Dabei werden durchschnittlich dreimal mehr CPD als 6-4-PP induziert (Ravanat et al., 2001). Beide Verbindungen sind zytotoxisch und können zu Mutationen führen. Obwohl 6-4-PP in geringerem Maße auftreten, sind sie aufgrund ihres höheren mutagenen Potentials von großer biologischer Bedeutung. Die eingesetzte Wellenlänge von 254 nm stimmt nahezu mit dem Absorptionsmaximum der DNA überein, wird nur ineffizient von Proteinen absorbiert und führt infolgedessen zu einer relativ spezifischen Photoreaktion mit der DNA (IARC, 1992; Brendler-Schwaab et al., 2004; Friedberg, 2006). O O O O O O HN N DNA NH N O DNA UVC O HN N DNA NH N O DNA UVC HN O N DNA OH H N N O DNA CPD 6-4-PP Abbildung 6: Bildung von Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD) und 6-4-Photoprodukten (6-4-PP) am Beispiel zweier benachbarter Thyminbasen (Ravanat et al., 2001).

21 EINLEITUNG Nukleotidexzisionsreparatur Die Nukleotidexzisionsreparatur ist ein komplexer Reparaturmechanismus mit einer breiten Substratspezifität, die sowohl UV-induzierte DNA-Läsionen als auch durch andere Umweltmutagene induzierte Schäden einschließt. Die biologische Bedeutung der NER wird anhand der autosomal rezessiven Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und der Trichothiodystrophie deutlich. Die NER wird in zwei Reparaturpfade unterteilt, die sich vor allem in der Schadenserkennung unterscheiden. Die globale genomische Reparatur (GGR) bezieht sich auf die Reparatur von nichttranskribierter DNA und umfasst somit den Großteil der genomischen DNA. Bei aktiv transkribierten Genen werden Schäden durch die transkriptionsgekoppelte Reparatur (TCR) aus der DNA entfernt. Im Ablauf der NER folgen auf die Schadenserkennung die Schritte der DNA-Entwindung, der Inzision und Schadensentfernung sowie der Reparatursynthese. Vollendet wird die Reparatur durch die Ligation. Der in die GGR und TCR unterteilte Ablauf der Nukleotidexzisionsreparatur ist in Abbildung 7 dargestellt.

22 EINLEITUNG 17 Globale genomische Reparatur Transkriptionsgekoppelte Reparatur RNA-Polyerase II DDB1 Schadenserkennung DDB2 (XPE) XPC-hHR23B XPG CSB CSA, DDB1 DNA-Entwindung TFIIH (XPB, XPD) Schadensentfernung ERCC1-XPF XPA XPG RPA PCNA, RFC DNA-Polymerase ε/δ Reparatursynthese DNA-Ligase I Abbildung 7: Mechanismus der humanen Nukleotidexzisionsreparatur (modifiziert nach Volker et al., 2001; Sugasawa, 2008). Dargestellt sind die Proteine mit bekannter Funktion für die NER. In-vitro Versuche zeigten eine Beteiligung von mindestens 30 Proteinen, wobei der Mechanismus der NER in Säugerzellen weitere Faktoren benötigt und noch nicht vollständig aufgeklärt ist (Friedberg, 2006; Thoms et al., 2007). Zur Schadenserkennung während der GGR bildet XPC einen heterotrimeren Komplex mit dem humanen Homolog von RAD23B (hhr23b) und Centrin 2. Dies stabilisiert die Bindung an partiell verzerrte, teilweise einzelsträngige DNA. Es wird angenommen, dass aufgrund der schwächeren Helixverzerrung durch CPD diese weniger gut von XPC erkannt werden und ihre Reparatur langsamer ist, als die von

23 EINLEITUNG PP. Zur Erkennung von CPD dient zusätzlich das UV-damaged DNA-binding protein (UV-DDB) mit seinen Untereinheiten DDB1 und DDB2. Dabei ersetzt UV-DDB nicht die Schadenserkennung durch XPC, sondern begünstigt diese (zusammengefasst in Sugasawa, 2008). UV-DDB ist nicht nur an der Erkennung von CPD, sondern auch 6-4-PP, AP-Stellen und fehlgepaarter DNA beteiligt (Moser et al., 2005; Wittschieben et al., 2005). Die Schadenserkennung während der TCR verläuft unabhängig von XPC und UV-DDB. Stattdessen erfolgt die Erkennung des Schadens durch eine Transkriptionshemmung der RNA-Polymerase II aufgrund der Verzerrung der DNA-Helix. Infolge dessen kommt es zur Assoziation weiterer Reparaturproteine, wie CSA, CSB und DDB1. Nach der Schadenserkennung erfolgt um den Schaden eine initiale, lokale Entwindung der DNA durch den basalen Transkriptionsfaktors IIH (TFIIH), der aus zehn Untereinheiten, darunter die Helikasen XPB und XPD, besteht. An der Rekrutierung des TFIIH sind einerseits XPC und andererseits die RNA-Polymerase II, CSA und CSB beteiligt. Zur Bildung des Präinzisionskomplexes, der partiell entwundene DNA enthält, lagern sich weitere Proteine an. Darunter befinden sich die 3 -Endonuklease XPG, der XPA-RPA Proteinkomplex und die 5 -Endonuklease XPF- ERCC1. Das Zinkfingerprotein XPA bindet an DNA, ist an der Protein-Protein- Interaktion zu TFIIH und RPA beteiligt und ist für die Endonukleaseaktivität von ERCC1 unerlässlich. Anschließend erfolgt die Exzision eines Oligonukleotids mit der Länge von 24 bis 32 Nukleotiden durch XPG und XPF-ERCC1. Die DNA- Neusynthese in der entstandenen Lücke wird durch die Polymerasen δ und ε in Gegenwart von PCNA und RPA katalysiert, bevor die DNA-Ligase I den Reparaturprozess beendet (zusammengefasst in Sugasawa, 2008). Obwohl Details des molekularen Mechanismus der TCR noch unklar sind, gilt die TCR als der schnellere und effizientere Reparaturpfad der NER, welcher zu einer schnellen Wiedererlangung der transkriptionellen Aktivität führt (zusammengefasst in Mellon, 2005) Das Xeroderma Pigmentosum Protein A Xeroderma Pigmentosum-Patienten zeigen eine gesteigerte Sensitivität gegenüber UV-Licht sowie eine um mehr als 1000fach gesteigerte Prädisposition gegenüber Hautkrebs. Ursache dafür ist ein Defekt in einem Gen der XP-Komplementationsgruppen A bis G oder V (Thoms et al., 2007). Bei dem 273 Aminosäuren langen

24 EINLEITUNG 19 XPA-Protein handelt es sich um ein Zinkfingerprotein, in dessen Zinkfingerdomäne Zink durch vier Cysteine (Cys105, Cys108, Cys126 und Cys129) komplexiert wird (Buchko et al., 1998). Die Substitution eines der vier an der Zinkbindung beteiligten Cysteine führt zu einem Funktionsverlust von XPA und einem fast vollständigem Erliegen der NER (Miyamoto et al., 1992). Abbildung 8: Minimale Bindungsdomäne (98-210) und Zinkfingerdomäne (XPAzf, AS ) von XPA (Ikegami et al., 1998; Bal et al., 2003). XPA-defiziente Zellen zeigen im Gegensatz zu XPA-profizienten Zellen keine NER Kapazität und infolge dessen eine hohe Sensitivität gegenüber UV-induzierten DNA- Schäden (siehe Abbildung 9) (Tanaka et al., 1990; Satokata et al., 1993). In der Vergangenheit wurden XPA-defizienten Zelllinien aus verschiedenen Spendern isoliert, von denen vor allem die drei Zelllinien XP12RO, XP2OS und XP12BE in Studien eingesetzt werden. XPA -/- Mausmodelle bestätigen die hohe Sensitivität gegenüber UV-Strahlung und chemischen Mutagenen (de Vries et al., 1997a; de Vries et al., 1997b; Bol et al., 1998; Ide et al., 2000; Tanaka et al., 2001). Dies verdeutlicht die für die Nukleotidexzisionsreparatur essentielle Bedeutung des XPA- Proteins. Wie bereits beschrieben ist XPA im Verlauf der NER an der Bildung des Präinzisionskomplexes beteiligt (Volker et al., 2001; Sugasawa, 2008).

25 EINLEITUNG 20 XPA-defiziente Zellen (XPA-): G-zu-C-Transversion im XPA-Gen führt zum vorzeitigen Transkriptionsstopp NER-defizient: keine Reparatur UVinduzierter DNA-Schäden hohe Sensitivität gegenüber UV- Strahlung SV40- Transformation Knock-in von XPAC XPA knock-in Zellen (XPA+): Überexpression von XPA NER profizient: Reparatur UVinduzierter DNA-Schäden normale Sensitivität gegenüber UV- Strahlung Abbildung 9: Ursprung und Eigenschaften XPA-defizienter und XPA knock-in Zellen (modifiziert nach Tanaka et al., 1990; Satokata et al., 1993; Camenisch et al., 2006). XPAC: Xeroderma pigmentosum complementation group A correcting gene. 2.3 Glutathion Glutathion (GSH) ist ein in allen Organismen ubiquitär vorkommendes Tripeptid, γ-l-glutamyl-l-cysteinyl-l-glycin, welches an einer Vielzahl zellulärer Funktionen beteiligt ist (Abbildung 10). Die Synthese erfolgt intrazellulär aus den entsprechenden Aminosäuren in zwei aufeinander folgenden ATP-abhängigen Reaktionen. Zunächst erfolgt die Peptidbindung zwischen Glutamat und Cystein, welche durch die γ-glutamylcystein-synthetase katalysiert wird. Anschließend katalysiert die Glutathionsynthetase die Kondensation der Carboxylgruppe des Cysteins mit der Aminogruppe des Glycins. Die erste Reaktion stellt den limitierenden Syntheseschritt dar, der durch GSH rückkoppelnd gehemmt und durch die Verfügbarkeit der Aminosäuren limitiert wird (zusammengefasst in Sies, 1999; Lu, 2000).

26 EINLEITUNG 21 H O O O SH H N N NH 2 H O γ-glu Cys Gly O OH H O O HO NH 2 O O N H N H O S S O H N H N O O OH NH 2 O OH Glutathion Glutathiondisulfid Abbildung 10: Struktur von Glutathion und Glutathiondisulfid. γ-glu: Glutaminsäure; Cyc: Cystein, Gly: Glycin. Das niedermolekulare Tripeptid ist das vorherrschende zelluläre Thiol und kommt in millimolaren Konzentrationen vor. Gemeinsam mit dem oxidierten Glutathiondisulfid (GSSG), welches durch Oxidation und Ausbildung einer Disulfidbrückenbindung gebildet wird, stellt es das wichtigste Redox-Puffersystem der Zelle dar. Die intrazelluläre Konzentration an oxidiertem Glutathiondisulfid beträgt in der Regel maximal 1 % des reduzierten Glutathions (Meister und Anderson, 1983; Deneke und Fanburg, 1989). Glutathion ist an der Metabolisierung von Fremdstoffen beteiligt und beeinflusst den Redoxstatus der Zelle. Somit beeinflusst es weitere wichtige Prozesse, wie die Signaltransduktion, die Genexpression, die Zellproliferation und die Apoptose (zusammengefasst in Sies, 1999). Im Folgenden wird die Bedeutung von Glutathion im Fremdstoffmetabolismus und als Elektronendonator bei der enzymatischen Reduktion von Peroxiden näher beschrieben (Abbildung 11). Glutathion ist für den Abbau von reaktiven Sauerstoffspezies endogenen oder exogenen Ursprungs von großer Bedeutung. Es fungiert als Elektronendonator bei der enzymatischen Reduktion von Peroxiden, welche durch die Glutathion- Peroxidase (GPx) katalysiert wird. Dabei kommt es als Folge der Oxidation von GSH zur Bildung von GSSG. Unter physiologischen Bedingungen ist das Verhältnis von GSH zu GSSG fein reguliert. Glutathiondisulfid wird in einer durch Glutathionreduktasen katalysierten Reaktion unter Verbrauch von NADPH zu reduziertem Glutathion regeneriert. Die Aufrechterhaltung eines optimalen Verhältnisses von GSH zu GSSG ist für die Zelle von essentieller Bedeutung, da eine Verschiebung des Gleichgewichtes zu Gunsten von GSSG die Gefahr der oxidativen Schädigung von Proteinen, Lipiden und der DNA erhöht (Townsend et al., 2003).

27 EINLEITUNG 22 Fremdstoffmetabolismus: Abbau von Peroxiden: Xenobiotika (X) ROOH 2 GSH NADP + GSH GST GPx GR GSSG NADPH/H + GSH-X-Konjugat H 2 O + ROH Abbildung 11: Rolle von Glutathion im Fremdstoffmetabolismus und als Antioxidans (Sies, 1999). GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid, GST: Glutathion-S-transferase, GPx: Glutathion-Peroxidase, GR: Glutathionreduktase, NADPH/H + : Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat (reduzierte Form); NADP + : Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (oxidierte Form). Im Zuge der Metabolisierung von Fremdstoffen erfolgt unter anderem in der Phase II Reaktion eine Konjugation von unpolaren und elektrophilen Xenobiotika an Glutathion. Diese Reaktion wird durch Enzyme der Glutathion-S-Transferase (GST) Familie katalysiert und entspricht in der überwiegenden Anzahl der Fälle einer Detoxifizierung der Fremdstoffe. Für die Inaktivierung von (+)-anti-benzo[α]pyrendiolepoxid gilt die GST-katalysierte Konjugation an reduziertes Glutathion als wichtigster enzymatischer Mechanismus. Sie wirkt der toxischen Wirkung von BPDE entgegen (Abbildung 12) (Robertson et al., 1986; Hu et al., 1996).

28 EINLEITUNG 23 (+)-anti-bpde O weitere Reaktionswege N O N DNA HO OH GSH, GST N DNA N HO NH GS OH HO HO OH BPDE-DNA-Addukt OH BPDE-GSH-Konjugat Bildung eines N 2 -Guanin-Adduktes Konjugation an Glutathion Abbildung 12: (+)-anti-benzo[α]pyrendiolepoxid - Bildung von BPDE-DNA-Addukten und enzymatische Detoxifizierung. GSH: reduziertes Glutathion, GST: Glutathion-S-transferase. Glutathion-S-transferasen katalysieren die Konjugation von reduziertem Glutathion an eine Vielzahl von Elektrophilen endogenen oder exogenen Ursprungs. Die Familie der GST wird in sieben Klassen unterteilt, von denen in Säugerzellen die Alpha (GSTA), Mu (GSTM) und Pi (GSTP) Klassen am häufigsten exprimiert werden (Sheehan et al., 2001). Die humanen Isoenzyme GSTM-1, GSTP1 und GSTA1 besitzen die höchste katalytische Aktivität zur Konjugation von (+)-anti-bpde (Sundberg et al., 2002). Ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die basale und induzierbare Genexpression der Glutathion-S-transferasen ist Nrf2 (nuclear factor E2-related factor) (Hayes et al., 2000; Ramos-Gomez et al., 2001). Nrf2 wird von keap1 (kelch-like ECH-associated protein 1) im Cytosol verankert und translokalisiert nach Einwirkung elektrophiler oder oxidativer Stimuli in den Kern. Dort bindet Nrf2 an antioxidativ-responsive Elemente (ARE), welche sich in der regulatorischen Region der Zielgene befinden. Daneben wurden weitere Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, wie z.b. C/EBPß, NF-κB und AP-1, identifiziert. Deren Funktionen sowie die transkriptionelle Regulation der einzelnen Klassen der Glutathion-S-transferasen sind noch nicht vollständig aufgeklärt (zusammengefasst in Coles und Ketterer, 1990; Hayes et al., 2005; Pool-Zobel et al., 2005).

29 FRAGESTELLUNG 24 3 FRAGESTELLUNG Selen ist für den Menschen ein essentielles Spurenelement, welches mit der Nahrung und in Form von Nahrungsergänzungsmitteln aufgenommen wird. Aufgrund der antioxidativen Eigenschaften der Selenoproteine, insbesondere der Glutathion- Peroxidasen und der Thioredoxin-Reduktasen, wird Selen eine antikanzerogene Wirkung zugesprochen (Whanger, 2004; Letavayova et al., 2006). Außerdem wurde als Mechanismus der Steigerung der genomischen Stabilität eine Stimulation von DNA-Reparaturprozessen postuliert (Seo et al., 2002; Fischer et al., 2007). Epidemiologische Studien zur Auswirkung einer erhöhten Selenversorgung auf die Tumorinzidenz zeigen bisweilen ein uneinheitliches Bild. Insbesondere die umfangreichste Nutritional Prevention of Cancer Studie zeigte sowohl inverse als auch direkte Korrelationen einiger Tumorarten (Clark et al., 1996; Duffield-Lillico et al., 2002). Neben den antioxidativen Eigenschaften sind prooxidative Effekte einiger Selenverbindungen bekannt. Diese scheinen von der chemischen Struktur und dem daraus resultierenden zellulären Metabolismus der Verbindungen abhängig zu sein. Anhand von reduzierbarem Natriumselenit und vollständig reduziertem Selenomethionin, die einem unterschiedlichen zellulären Metabolismus unterliegen, soll zum einen deren direkte Genotoxizität anhand der Induktion oxidativer DNA- Schäden und der Beeinflussung des Redoxhaushaltes in A549 Zellen untersucht werden. Außerdem sollen die indirekten genotoxischen Wirkungen der beiden Selenverbindungen anhand der Interaktion mit Umweltmutagenen in intakten Zellen aufgeklärt werden. Dabei soll einerseits die Reparatur UVC-induzierter DNA- Photoläsionen untersucht werden. Andererseits steht die Induktion und Reparatur von (+)anti-benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE), dem ultimalen Kanzerogen von Benzo[α]pyren, sowie die Beeinflussung der Detoxifizierung von BPDE im Vordergrund. Als mögliche Ursache der indirekten Genotoxizität soll die Interaktion von Natriumselenit und Selenomethionin mit der Zinkfingerdomäne des DNA- Reparaturproteins Xeroderma Pigmentosum Proteins A (XPA) untersucht werden. Die Ausbildung des Zinkfingers und demzufolge die Aktivität des XPA- Proteins ist für die Nukleotidexzisionsreparatur von essentieller Bedeutung. Sowohl die Zinkfreisetzung als auch die Verminderung der DNA-Bindungsfähigkeit von XPA wird durch die Redoxeigenschaften einiger Selenverbindungen hervorgerufen (Blessing et al., 2004).