Die Sauerstoff-abhängige Regulation der Erythropoiese. Christof Dame
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- Wolfgang Becker
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1 Die Sauerstoff-abhängige Regulation der Erythropoiese Christof Dame Klinik für Neonatologie Charité - Universitätsmedizin Berlin christof.dame@charite.de
2 Erythropoietin (Epo) und sein Rezeptor (EpoR) in der Hämatopoiese Wildtyp EpoR -/- Epo e11.5 Wu H. et al., Cell 1995 Hämatopoiese
3 Erythropoietin (Epo) und sein Rezeptor (EpoR) in der Hämatopoiese Wildtyp Epo e11.5 Wu H. et al., Cell 1995 Hämatopoiese Niere O 2 Transportkapazität EpoR -/- Knochenmark Anämie Hypoxie po 2 Epo-Synthese Epo im Plasma Erythropoiese
4 Auswirkung der Epo -/- Ablation auf die Blutbildung Wildtyp Epo -/- e13 Wu H. et al., Cell 1995, 83:59-67
5 Frühe Phasen der Erythropoietin-Synthese Dottersack e10 Leber hepo overexpressing mouse C D Yasuda Y et al., Anatom Sci Internat; 2002; 77:58-63 Koury ST et al., Blood 1991; 77:
6 Erythropoietin-Synthese in der Niere hepo SV40T Mutante, unter Anämie SV40T A B SV 40T PECAM/CD31 C D F: Interstitial fibroblast-like cell R: Monocyte-like cell P: Proximal tubules Ca: Capillaries 5 µm 0.5 µm Maxwell PH et al., Kidney International 1993; 44:
7 Charakterisierung der Renal Epo Producing Cells Mausmutante mit Expression von green fluorescent protein (GFP) unter Kontrolle des murinen Wildtyp Epo Gens A B C D E F Obara N. et al., Blood 2008; 111:
8 Charakterisierung der Renal Epo Producing Cells Mausmutante mit Expression von green fluorescent protein (GFP) unter Kontrolle des murinen Wildtyp Epo Gens Obara N. et al., Blood 2008; 111:
9 Charakterisierung der Renal Epo Producing Cells Mausmutante mit Expression von green fluorescent protein (GFP) unter Kontrolle des murinen Wildtyp Epo Gens Obara N. et al., Blood 2008; 111:
10 Charakterisierung der Renal Epo Producing Cells Mausmutante mit Expression von green fluorescent protein (GFP) unter Kontrolle des murinen Wildtyp Epo Gens A B C D E F REPC exprimieren Neuronen-spezifische Markerproteine, u.a. microtubule-associated protein 2 und neurofilament light polypeptide Obara N. et al., Blood 2008; 111:
11 Wechsel der primären Epo-Synthesestätte während der Entwicklung Contribution [%] Yolk Sac AGM Liver Spleen Kidneys weeks embryonic fetal period months Completed Weeks of Human Gestation neonatal period Dame C.. In Dame, Fliedner, Sola-Visner, Yoder: Atlas of the Cellular and Molecular Development of Human Hematopoiesis, 2013
12 Der humane Epo Genlocus Kidney inducible element Generally active elements Liver inducible element Adult liver negative elements /\/ \/\ /\/ \/\/\/ \/\/\/ \/\ 5 3 I II III IV V 5 3 min P E Dame C.. In Dame, Fliedner, Sola-Visner, Yoder: Atlas of the Cellular and Molecular Development of Human Hematopoiesis, 2013
13 Das Hypoxia Response Element (HRE) im Epo 3 Enhancer -0,4kb I II III IV V +2.2kb UTR UTR 5 3 CTACGTGCTG..TCACAC...CTGACCTCTCGACCTA HIF-α HIF-β HNF-4 HNF-4 CBP/p300 po 2
14 Der Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF- 2α) bindet am Epo 3 Enhancer der REPC Paliege A et al., Kidney International 2010; 77:
15 Aktivierung der Epo-Synthese in REPC unter Hypoxie Normoxie Hypoxie Wenger RH, Hoogewijs D. Am J Physiol Renal Physiol 2010;298:F1287-F1296
16 Regulierung der Stabilität von HIF po 2 hoch po 2 niedrig aktiv HIF-Hydroxylasen inaktiv Proteasomale Degradierung HIF inaktiv HIF aktiv
17 Prolyl-Hydroxylierung von HIF Bunn H F Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3:a011619
18 Normoxie Hypoxie Interaktion mit Strukturstabilisierenden Proteinen Interaktion mit Aktivitätsregulierenden Proteinen Wenger RH, Hoogewijs D. Am J Physiol Renal Physiol 2010;298:F1287-F1296
19 Funktion der PHD und FIH regulierenden Proteine Interactor Target Putative function Protein stability Siah1a/2 Siah1 FKBP38 TriC Scaffolding proteins Others makap12 ING4 OS-9 MAGE-9/11 Morg1 Importin-α5 CRM1 Mint3/ABPA3 VHL Cdr2 IOP1 PHD1/3 FIH PHD2 PHD3 PHD2/3 PHD2 PHD2/3 PHD2 PHD3 PHD1 PHD2 FIH FIH PHD1 PHD2 PHD degradation FIH degradation PHD degradation Chaperonin Molecular scaffold HIF-α inhibition Molecular scaffold PHD inhibition Molecular scaffold Nuclear import Nucelar export FIH inhibition HIF-α inhibition HIF-α inhibition Induction of HIF-1α mrna
20 Humane PHD2 Mutationen (GoF) Lee FS, Percy MJ, Ann Rev Pathol Mech Dis 2011; 6:165-92
21 Humane HIF-2α Mutationen (GoF) Lee FS, Percy MJ, Ann Rev Pathol Mech Dis 2011; 6:165-92
22 Humane VHL Mutationen (LoF) Lee FS, Percy MJ, Ann Rev Pathol Mech Dis 2011; 6:165-92
23 Epo in Relation zum verfügbaren O 2 Die besondere Situation beim Frühgeborenen 100 Gestationsalter (Wochen) 100 Erythropoietin mu/ml adult verfügbarer O 2 ml / dl Blut 1 Dallman PR, J Pediatr 1984; 105:756-7
24 Gewebespezifische Regulation der Epo mrna Expression Wechsel der Epo-Synthese von der Leber zur Niere [%] Anteil an der gesamten Epo mrna Expression Leber Nieren Milz bis Gestationsalter [Wochen] Dame C. et al., Blood 1998
25 Gewebespezifische Regulation der Epo mrna Expression Wechsel der Epo-Synthese von der Leber zur Niere Organspezifische Antwort unter fortgesetzer Hypoxie Anteil an der gesamten Epo mrna Expression [%] Leber Nieren Milz bis Epo mrna (x-facher Anstieg der basalen Expression) Niere ZNS Gestationsalter [Wochen] Zeit [h] Dame C. et al., Blood 1998 Chikuma M. et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 2000
26 Transkriptionelle Regulation am 5 Epo Promotor -0,4kb I II III IV V +2.2kb UTR UTR CCCCCACCCCCACCCGCG..CG..CACATG.. GATA..CG.CG HAF Sp1 GCC Gupta M. et al., Blood. 2000; 96:491-7; Sanchez-Elsner T. et al., J Mol Biol. 2004; 336:9-24
27 Transkriptionelle Regulation am 5 Epo Promotor -0,4kb I II III IV V +2.2kb UTR UTR CCCCCACCCCCACCCGCG..CG..CACATG.. GATA..CG.CG HAF E-Box GATA Sp1 GCC Gupta M. et al., Blood. 2000; 96:491-7; Sanchez-Elsner T. et al., J Mol Biol. 2004; 336:9-24
28 GATA4 induziert die Epo mrna Expression in Hepatozyten (Hep3B Zellen) A. M Control RNAi/GATA-4 a WCE B. GATA-4 Controls RNAi/ GATA-4 a kda Epo 45 kda kda GAPDH 20.1kDa Dame et al., J Biol Chem, 2004; 279:
29 Transkriptionelle Regulation am 5 Epo Promotor -0,4kb I II III IV V +2.2kb UTR UTR CCCCCACCCCCACCCGCG..CG GATA..CG.CG HAF GATA-4 Sp1 GCC Gupta M. et al., Blood. 2000; 96:491-7; Sanchez-Elsner T. et al., J Mol Biol. 2004; 336:9-24; Dame C. et al., J Biol Chem. 2004; 279:
30 Transkriptionelle Regulation am 5 Epo Promotor -0,4kb I II III IV V +2.2kb UTR UTR CCCCCACCCCCACCCGCG..CG GATA..CG.CG HAF GATA-4 Sp1 GCC CFU-E per fetal liver cells Wt1-/- Wt1-/+ Wt1+/+ Gupta M. et al., Blood. 2000; 96:491-7; Sanchez-Elsner T. et al., J Mol Biol. 2004; 336:9-24; Alberta JA. et al., Blood. 2003; 101: Dame C. et al., J Biol Chem. 2004; 279:
31 Transkriptionelle Regulation am 5 Epo Promotor -0,4kb I II III IV V +2.2kb UTR UTR CCCCCACCCCCACCCGCG..CG GATA..CG.CG HAF GATA-4 Sp1 GCC CCCCGG..GGCCCCC..CCCCTG..CCCCTC potential Wt1 binding sites CCCCCACCCCCACCCGC CFU-E per fetal liver cells Wt1-/- Wt1-/+ Wt1+/+ Gupta M. et al., Blood. 2000; 96:491-7; Sanchez-Elsner T. et al., J Mol Biol. 2004; 336:9-24; Alberta JA. et al., Blood. 2003; 101: Dame C. et al., J Biol Chem. 2004; 279:
32 Aktivierung des Epo Promotors und Induktion der Epo Expression durch Wt1 A. Normalized luziferase activity p117 + pcb6 + p117 + Wt1(-KTS) p117 + Wt1(+KTS) mut p117 + pcb6 + mut p117 + Wt1(-KTS) mut p117 + Wt1(+KTS) 0 7,5 15,0 22,5 30,0 Dame C, et al. Blood, 2006, 107:
33 Aktivierung des Epo Promotors und Induktion der Epo Expression durch Wt1 A. Normalized luziferase activity B. 600 bp 400 bp M p117 + pcb6 + p117 + Wt1(-KTS) p117 + Wt1(+KTS) mut p117 + pcb6 + mut p117 + Wt1(-KTS) mut p117 + Wt1(+KTS) 0 7,5 15,0 22,5 30,0 H 2 O pcb6 + Wt1(-KTS) Wt1(+KTS) H 2 O pcb6 + Wt1(-KTS) Wt1(+KTS) H 2 O pcb6 + Wt1(-KTS) Wt1(+KTS) Epo β-actin Wt1 Dame C, et al. Blood, 2006, 107:
34 Aktivierung des Epo Promotors und Induktion der Epo Expression durch Wt1 A. Normalized luziferase activity B. 600 bp 400 bp M p117 + pcb6 + p117 + Wt1(-KTS) p117 + Wt1(+KTS) mut p117 + pcb6 + mut p117 + Wt1(-KTS) mut p117 + Wt1(+KTS) 0 7,5 15,0 22,5 30,0 H 2 O pcb6 + Wt1(-KTS) Wt1(+KTS) H 2 O pcb6 + Wt1(-KTS) Wt1(+KTS) H 2 O pcb6 + Wt1(-KTS) Wt1(+KTS) C. Wt1 Epo Western Blot pcb6 + Wt1(-KTS) Epo β-actin Wt1 α-tubulin Dame C, et al. Blood, 2006, 107:
35 In vivo Relevanz von Wt1 für doe Epo mrna Expression in der fetalen Leber A. Wt1 Epo Wt1 + Epo Wt1 + Epo 50µm 50µm 50µm 20µm Wt1 H&E DAPI DAPI+ WT1 + Epo Epo 50µm 50µm 50µm 20µm Dame C, et al. Blood, 2006, 107:
![mrna expression [%]](/docs-images/75/71536656/images/36-6.jpg "125 100 75 50 25 0 *")
36 In vivo Relevanz von Wt1 für doe Epo mrna Expression in der fetalen Leber A. Wt1 Epo Wt1 + Epo Wt1 + Epo 50µm 50µm 50µm 20µm Wt1 H&E DAPI DAPI+ WT1 + Epo Epo 50µm 50µm 50µm 20µm B. C. H 2 O Wt1 +/+ Wt1 -/- M H 2 O Wt1 +/+ Wt1 -/- Gapdh Epo mrna expression [%] * Epo Albumin Afp Dame C, et al. Blood, 2006, 107:
37 Normoxie Molekulare Mechanismen der Epo Regulation WT1 Pol II Co-Fp300 GATA4 Fog2 5 E 3 ATG Promoter Enhancer RARβ RXR Dame C.. In Dame, Fliedner, Sola-Visner, Yoder: Atlas of the Cellular and Molecular Development of Human Hematopoiesis, 2013
38 Normoxie Molekulare Mechanismen der Epo Regulation WT1 Pol II Co-Fp300 GATA4 Fog2 5 E 3 ATG Promoter Enhancer RARβ RXR Hypoxie 3 Smad3 RARβ RXR CBP/p300 Enhancer HIF-2α HIF-β Co-Fp300 5 HAF WT1 Sp1 Pol. II E Promoter GATA4 Fog2 ATG Dame C.. In Dame, Fliedner, Sola-Visner, Yoder: Atlas of the Cellular and Molecular Development of Human Hematopoiesis, 2013
39 Reaktivierung der hepatischen Epo Expression mittels EgIN sirna (murine PHDs) Verteilung LNP Leber Nieren Querbes W et al. Blood 2012;120:
40 Reaktivierung der hepatischen Epo Expression mittels EgIN sirna (murine PHDs) Verteilung LNP Leber Epo Expression Nieren Leber Nieren Querbes W et al. Blood 2012;120:
41 Reaktivierung der hepatischen Epo Expression mittels EgIN sirna (murine PHDs) Day 0 Day 12 Sham PBS Luc EglN1 EglN1+2 EglN1+2+3 Retic (%) Querbes W et al. Blood 2012;120:
42 Wirkung der HIF-Aktivierung auf den Eisen-Metabolismus DCYTB: Duodenal cytochrome b DMT1: Divalent metal transporter 1 FPN: Ferroportin TF: Transferrin GDF15: Growth Differentiation Factor 15 Haase VH. Blood Reviews 2013; 27:41-53
43 and it s more than HIF and Epo Hattangadi SM et al. Blood 2011;118:
44 Danke! Karin Kirschner, Holger Scholz Johannes-Müller-Institut für Physiologie Charité, Berlin Joachim Fandrey Institut für Physiologie, Universität Duisburg-Essen Jörg Bungert Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Gainesville, FL, USA Hans-Ulrich Bucher, Jean-Claude Fauchère Klinik für Neonatologie Universitätsspital Zürich Deutsche Forschungsgemeinschaft American Heart Association RoFAR Fritz-Thyssen-Stiftung Wilhelm-Sander-Stiftung Sonnenfeld-Stiftung Berliner Krebsgesellschaft
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