Ringversuche in der Molekularbiologie - Virusgenom-Nachweise zur Virustypisierung Hans-Peter Grunert 1,2,3, Vanessa Lindig 1 und Heinz Zeichhardt 1,3 1 Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, Institut für Virologie, Berlin 2 Institut für Biotechnologische Diagnostik in der GBD, Berlin 3 e.v. Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.v., WHO Collaborating Center for Quality Assurance and Standardization in Laboratory Medicine, Düsseldorf Collaborating Centers of International Consortium for Blood Safety (), New York
EQASs in virus immunology and genome detection Serology and Antigen Detection Virus Genome Detection and Typing HIV-1/2 Measlesvirus HIV-1 (RNA) Adenoviruses HIV-1 p24 Ag Mumpsvirus Hepatitis A Virus Resp. Sync. Virus Hepatitis A virus Resp. Sync. Virus Ag Hepatitis B Virus Hepatitis B virus, Prg. I Influenza A and B Ag + avian H5N1 + new H1N1 Hepatitis C Virus planned: Hepatitis B virus, Prg. II Enterovirus Ag/Typing HCV-genotyping Rubellavirus Hepatitis C virus TBE Virus Parvovirus B19 Measlesvirus Hepatitis D virus Hantavirus Cytomegalovirus Mumpsvirus Hepatitis E virus Denguevirus Epstein-Barr virus Denguevirus Rubellavirus BSE (PrPsc) (2002-2007) Herpes simplex viruses Parvovirus B19 Cytomegalovirus starting in 2010: Varicella zoster virus Influenza A and B + avian H5N1 + new H1N1 Epstein-Barr virus Rabiesvirus Hum. Papillomaviruses Herpes simplex viruses Varicella zoster virus Enteroviruses Enterovirus (WHO/RKI) Since 1988: > 1 073 000 analyzed samples
Ringversuche zur Virustypisierung: molekularbiologisch durch Virusgenom-Nachweis und Sequenzierung serologisch durch Nachweis von Serotyp-spezifischen Antikörpern Grundlage für Verfolgung von Infektionsketten epidemiologische Überwachung Therapie von Virusinfektionen
Ringversuche zur Virustypisierung RVs zum Virusgenom-Nachweis mit Typisierung Influenza A und B Viren (Genom/Antigen) Hepatitis C Virus Genotypisierung Enterovirus-PCR/Anzucht und Typisierung Spezial-RV - RKI-Entero Surveillance Programm zur Differenzierung zwischen - Influenzavirus Typen A und B - saisonalen, neuen (H1N1) und aviären (H5N1) Influenza A-Viren - verschiedenen Subtypen (H X und N X ) von Influenza A-Virus - verschiedenen Genotypen - optional Subtypen - Polioviren und Nicht-Polio-Enterov. - verschiedenen Serotypen RV- Grp. 370 375 374
-Ringversuche zur Virustypisierung von Influenza A und B Viren (Virusnachweis Genom/Antigen) Differenzierung zwischen Influenzavirus Typen A und B saisonalen, neuen (H1N1) u. aviären (H5N1) Influenza A-Viren verschiedenen Subtypen (H X und N X ) von Influenza A-Virus in Kooperation mit Dr. B. Schweiger Robert Koch-Institut Nationales Referenzzentrum für Influenza Insgesamt 22 Ringversuche seit dem Jahr 2000 (2x jährlich im Mrz./Apr. u. Nov./Dez.). Extra-Ringversuch Aug. 2009 während Pandemie mit dem neuen Influenza A(H1N1)-Virus.
von Th. Wolff, RKI 6
Mortality new influenza A(H1N1) worldwide Germany WHO as of 27.11.2009 RKI/AGI as of 23.03.2010 cases: > 622482* 226.018 deaths: > 7826* > 16931 # 250 ratio: approx. 1%* approx. 0.1% * number of cases reported understates the real number of cases # WHO as of 21.03.2010 avian influenza A(H5N1) worldwide WHO as of 12.02.2010 cases: 490 deaths: 290 ratio: approx. 60% http://influenza.rki.de/wochenberichte/2009_2010/2010-05.pdf http://www.who.int/csr/don/2009_11_27a/en/index.html http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2009_12_30/en/index.html
-EQASs: genome and antigen detection of influenza A and B viruses Influenza viruses seasonal influenza A and B viruses avian influenza A(H5N1) viruses new influenza A(H1N1) virus EQAS for genome and antigen detection since February 2000 (22 x) since March 2006 (10 x) since August 2009 (3 x) Number of samples per EQAS 4 5 8
Qualitative PCR and rapid tests for new influenza A(H1N1) - 11/2009 (results of 134 laboratories)
Qualitative PCR and rapid tests for new influenza A(H1N1) - 11/2009 (results of 134 laboratories)
: :
EQAS: genome and antigen detection of avian influenza A(H5N1) virus Correct results Spl. No. 20095 Aug 09 Avian influenza A(H5N1) strain Dilution Infl. A/B (25) 1:80 100% (+) (29/29) Infl. A (10) 92.2% (+) (107/116) Genome detection of Infl. B (20) 98.7% (-) (78/79) Avian Infl. A (H5N1) (12) 85.7% (+) (48/56) New Infl. A (H1N1) (13) 100% (-) (126/126) Infl. A Subtype (11) 100% (+) (16/16) Antigen detection of Infl. A (30) 86.2% (+) (81/94) Infl. B (40) 97.9% (-) (93/95) 20092 Aug 09 20102 Nov 09 A/chicken/ Germany/R3294/ 2007 (H5N1) 1:160 96.6% (+) (28/29) 1:160 96.3% (+) (26/27) 89.7% (+) (104/116) 82.4% (+) (75/91) 100% (-) (79/79) 98.7% (-) (74/75) 78.6% (+) (44/56) 79.6% (+) (39/49) 100% (-) (126/126) 97.9% (-) (92/94) 93.8% (+) (15/16) 75.0% (+) (9/12) 79.8%(+) (75/94) 86.7% (+) (65/75) 97.9% (-) (93/95) 100% (-) (72/72)
EQAS: genome and antigen detection of avian influenza A(H5N1) virus Correct results Spl. No. 20095 Aug 09 Avian influenza A(H5N1) strain Dilution Infl. A/B (25) 1:80 100% (+) (29/29) Infl. A (10) 92.2% (+) (107/116) Genome detection of Infl. B (20) 98.7% (-) (78/79) Avian Infl. A (H5N1) (12) 85.7% (+) (48/56) New Infl. A (H1N1) (13) 100% (-) (126/126) Infl. A Subtype (11) 100% (+) (16/16) Antigen detection of Infl. A (30) 86.2% (+) (81/94) Infl. B (40) 97.9% (-) (93/95) 20092 Aug 09 20102 Nov 09 A/chicken/ Germany/R3294/ 2007 (H5N1) 1:160 96.6% (+) (28/29) 1:160 96.3% (+) (26/27) 89.7% (+) (104/116) 82.4% (+) (75/91) 100% (-) (79/79) 98.7% (-) (74/75) 78.6% (+) (44/56) 79.6% (+) (39/49) 100% (-) (126/126) 97.9% (-) (92/94) 93.8% (+) (15/16) 75.0% (+) (9/12) 79.8%(+) (75/94) 86.7% (+) (65/75) 97.9% (-) (93/95) 100% (-) (72/72)
-Ringversuche zur Genotypisierung von Hepatitis C Viren Zur Selektion eines geeigneten Therapie-Regimes Differenzierung zwischen verschiedenen HCV-Genotypen Zum Therapie-Monitoring quantitative Bestimmung der Hepatitis C-Viruslast in Kooperation mit Prof. Dr. M. Roggendorf und Prof. Dr. S. Ross Universitätsklinikum Essen, Institut für Virologie Nationales Referenzzentrum für Hepatitis C-Viren Insgesamt 5 Ringversuche seit dem Jahr 2006 (1x jährlich im Sep.). Ringversuch Sep. 2010 befindet sich gegenwärtig in der Auswertung.
Geographische Verteilung von HCV-Genotypen 1a/b 2 3a 1a/b 2 3a 6 1a/b 2 3a 4 4 5 Anti-HCV Prävalenz Hoch (> 5.0 %) Mittel (1.1 5.0 %) Niedrig (0.2 1.0 %) Sehr neidrig (< 0.2 %) Unbekannt nach S. Ross, Nat. Reference Center for Hepatitis C, Essen, Germany
Behandlungsalgorithmen zur Ersttherapie einer chronischen Hepatitis C, abhängig vom Genotyp HCV-Genotyp 1-Infektion HCV-Genotyp 2 und 3-Infektion C. Sarrazin et al., Update der S3-Leitlinie Prophylaxe, Diagnostik und Therapie der Hepatitis-C-Virus(HCV)-Infektion, AWMF-Register-Nr.: 021/012, Z Gastroenterol 2010; 48: 289-351.
Behandlungsalgorithmen zur Ersttherapie einer chronischen Hepatitis C, abhängig vom Genotyp HCV-Genotyp 1-Infektion HCV-Genotyp 2 und 3-Infektion C. Sarrazin et al., Update der S3-Leitlinie Prophylaxe, Diagnostik und Therapie der Hepatitis-C-Virus(HCV)-Infektion, AWMF-Register-Nr.: 021/012, Z Gastroenterol 2010; 48: 289-351.
HCV-Genotypisierung Genotypisierung: -RV Sep. 2009 Proben- Nr. HCV Genotyp (Subtyp) Richtige Ergebnisse Hybridisierung Sequenzierung andere Teste 25016 2 (2c) 96,8% (90/93) 95,7% (22/23) 75,0% (3/4) 25017 1 (1a) 100% (93/93) 91,3% (21/23) 100% (4/4) 25018 1 (1b)* 97,8% (91/93) 95,7% (22/23) 75,0% (3/4) 25019 3 (3a) 97,8% (91/93) 95,7% (22/23) 75,0% (3/4) 25020 1 (1b)* 98,9% (92/93) 100% (23/23) 100% (4/4) * Die Proben 25018 und 25020 sind Plasmen von verschiedenen Patienten, die im selben negativen Plasmapool verdünnt wurden.
Quantitativer Genom-Nachweis von HCV (Subtyp 1b): -Ringversuch Juni 2010 Verdünnung Proben-Nr. Median für alle Methoden [IE/ml] Erfolgsquoten Richtigkeitsinterval +1 log 10 bis -1 log 10 um den Median 1 : 200 362002 9086 100% (98/98) 1 : 600 362004 3065 100% (98/98) 1 : 1800 362001 1181 99,0% (97/98) 1 : 5400 362003 402 93,9% (92/98)
-Ringversuche zur Virustypisierung Spezial-Ringversuch im Rahmen des RKI-Entero-Surveillance-Programms Virusnachweis von Enteroviren (PCR / Anzucht und Typisierung) Polioviren und Nicht-Polio-Enteroviren verschiedenen Serotypen von Enteroviren Insgesamt 3 Ringversuche seit dem Jahr 2006 (1x alle 2 Jahre im Mrz./Apr.). in Kooperation mit Dr. Sabine Diedrich Robert Koch-Institut Nationales und Europäisches WHO/EURO Referenzzentrum für Poliomyelitis und Enteroviren
Poliomyelitis Polio ist immer noch nicht weltweit ausgerottet 1988: 35.251 Fälle 2009: 1.604 Fälle
Spreading of Polio Wild Viruses, 2002-2006 2006 From: A. Windorfer, 2007 Pallansch M et al.: The Eradication of Polio - Progress and Challenges. NEJM 355(24):2508-2511, 2006
Enterovirus - PCR/Anzucht und Typisierung: -RV Mrz./Apr. 2010 Proben- Nr. Enterovirus Serotyp molekularbiologische Typisierung Richtige Ergebnisse immunologische Typisierung 24011 Coxsackievirus B1 100% (8/8) 95,2% (20/21) 24012 Poliovirus 2 (Sabin-Impfvirus) 100% (8/8) 100% (21/21) 24013 Echovirus 30 100% (8/8) 90,5% (19/21) 24014 Echovirus 25 50,0% (4/8) 76,2% (16/21) 24015 Enterovirus negativ 100% (8/8) 100% (20/20) Die Enterovirus-positiven Proben 24011, 24012, 24013 und 24014 sind Stuhlaufschwemmungen, die mit einem Enterovirus "gespikt" wurden. Die negative Probe 24015 ist eine Enterovirus-freie Stuhlaufschwemmung.
Genomorganisation von Poliovirus Eignung sequenzierter Genombereiche zur Typbestimmung
Enterovirus - PCR/Anzucht und Typisierung: -RV Mrz./Apr. 2010 Proben- Nr. Enterovirus Serotyp molekularbiologische Typisierung Richtige Ergebnisse immunologische Typisierung 24011 Coxsackievirus B1 100% (8/8) 95,2% (20/21) 24012 Poliovirus 2 (Sabin-Impfvirus) 100% (8/8) 100% (21/21) 24013 Echovirus 30 100% (8/8) 90,5% (19/21) 24014 Echovirus 25 50,0% (4/8) 76,2% (16/21) 24015 Enterovirus negativ 100% (8/8) 100% (20/20) Die Enterovirus-positiven Proben 24011, 24012, 24013 und 24014 sind Stuhlaufschwemmungen, die mit einem Enterovirus "gespikt" wurden. Die negative Probe 24015 ist eine Enterovirus-freie Stuhlaufschwemmung.
Enterovirus - PCR/Anzucht und Typisierung: -RV Mrz./Apr. 2010
EQAS Referenzlaboratorien A. Baillot Niedersächsisches Landesgesundheitsamt, Hannover S. Becker / M. Eickmann Philipps Universität Marburg, Konsiliarlab. Filoviren S. Diedrich Robert Koch-Institut, Berlin; NRZ Poliomyelitis und Enteroviren Regionales Referenzlabor der WHO/EURO für Poliomyelitis H.W. Doerr / H. Rabenau / A. Berger / R. Allwinn Universitätsklinikum Frankfurt Ch. Drosten / A.-M. Eis-Hübinger / B. Matz Universität Bonn G. Enders / M. Enders Labor Enders, Stuttgart B. Fleckenstein / K. Korn Universitätsklinikum Erlangen; NRZ Retroviren W. Gerlich / W.R. Willems Universität Gießen; Konsiliarlab. HBV und HDV E. Grünelt / M. Loehr / A. Vornwald DRK-Blutspendedienst Ost, Cottbus S. Günther / J. Schmidt-Chanasit Bernhard-Nocht-Institut, Hamburg G. Harms-Zwingenberger / R. Ignatius Institut für Tropenmedizin, Berlin W. Jilg Universität Regensburg; Konsiliarlab. HAV und HEV A. Karl / K. Gubbe DRK-Blutspendedienst Ost, Plauen D. Krüger / J. Hofmann Charité Universitätsmedizin Berlin, CCM; Konsiliarlab.Hantaviren C. Kücherer Robert Koch-Institut, Berlin; Konsiliarlab. FSME U.G. Liebert Universität Leipzig A. Mankertz Robert Koch-Institut, Berlin; NRZ Masern, Mumps und Röteln T. Mertens / D. Michel Universitätsklinikum Ulm; Konsiliarlab.CMV S. Modrow Universität Regensburg; Konsiliarlab. Parvoviren D. Neumann-Haefelin / D. Huzly / M. Panning Universitätsklinikum Freiburg S. Nick / H. Scheiblauer Paul-Ehrlich-Institut, Langen; Prüflabor für IVD M. Niedrig Robert Koch-Institut, Berlin; M. Nübling / M. Chudy Paul-Ehrlich-Institut, Langen H. Pfister / U. Wieland / R. Kaiser Uniklinik Köln; Konsiliarlab. Polyomaviren T. Rogge Vivantesklinikum, Berlin-Neukölln M. Roggendorf / S. Ross Universitätsklinikum Essen; NRZ HCV T. Schulz / A. Heim Medizinische Hochschule Hannover; Konsiliarlab. Adenoviren B. Schweiger Robert Koch-Institut, Berlin; NRZ Influenza S. Smola, N. Müller-Lantzsch / B. Gärtner Universitätsklinikum des Saarlandes; Konsiliarlab.EBV, HHV 6, 7, 8 P. Wutzler / A. Sauerbrei Universitätsklinikum Jena; Konsiliarlab. HSV und VZV
Vielen Dank für f r Ihre Aufmerksamkeit! Dr. Hans-Peter Grunert Prof. Dr. Heinz Zeichhardt Charité Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin Institut für Virologie Hindenburgdamm 27 12203 Berlin Tel.: +49-30-8445 3624 or 3625 Fax: +49-30-8445 3626 Email: Hans-Peter.Grunert@charite.de Heinz.Zeichhardt@charite.de Web: www.instandev.de