GVO Analyse-Methoden Theorie und Praxis Donau Soja Kongress Berlin, 07.05.15

Genetic ID (Europe) GmbH 2015 GVO Analyse-Methoden Theorie und Praxis Donau Soja Kongress Berlin, 07.05.15

Genetic ID (Europe) GmbH Gegründet im Jahr 2001 Genetic ID NA das erste GVO-Testlabor in den USA ISO 17025 akkreditiert seit 2002 Labore in den USA und Deutschland Global Laboratory Alliance Lizenznehmer auf 4 Kontinenten

Definition GVO GVO: Gentechnisch Veränderter Organismus

Gentechnische Modifikation Bakterium Virus Transgene DNA Pflanze Tier

Gentransfer in eine normale Zelle Normale Zelle Transgen Transgene Zelle GVO (Transgene) Pflanze

Zwei Methoden des Gentransfers Genetic ID (Europe) GmbH 2014

Gentechnische Modifikationen verleihen Pflanzen neuartige Eigenschaften Herbizid-Resistenz (bakterielle Gene, Ackerschmalwand) Insekten-Resistenz (bakterielle Gene, z.b. Bacillus thurngienis) Virus Resistenz (virale Gene) Männliche Unfruchtbarkeit,Wiederherstellung der Fruchtbarkeit Verändertes metabolisches Profil: Fettsäureprofil, Amylopektingehalt (DNA aus Soja, Primel, roter Schimmelpilz, Kartoffel)

Gentechnisch veränderte Pflanzen: Überblick Soja Raps Mais Reis Baumwolle Leinsamen Kartoffel Zuckerrübe Kürbis/Zucchini Papaya Alfalfa/Luzerne Genetic ID (Europe) GmbH 2015

Futtermittel-relevante GVOs Raps Mais Soja

GVO- Nachweis

Zwei Ansätze des GVO-Nachweises Nachweis der eingefügten DNA durch PCR Nachweis der neuen Proteine durch immunologische Methoden Zellkern Gen mrna Protein Transgene Zelle

Proteinnachweis Protein Antikörper -basierte Tests detektieren das rekombinante Protein Strip Tests ELISA Vorteile: Schnelle Methode, um nach GVOs vor Ort zu testen (Feld) Geeignet für einen Initialscreen von Saatgut/Körnern Nachteile: LOD oft zwischen 0.1-1% Nicht verwendbar für prozessierte Produkte (z.b. Sojaschrot) Es können Unterschiede im Gehalt der rekombinanten Proteine zwischen verschiedenen Kultivaren und auch zwischen Geweben auftreten

DNA-Nachweis DNA Polymerase Chain Reaction (PCR)-Test Eine Technik zur billionen-fachen Amplifizierung eines spezifischen DNA- Abschnitts Vorteile: Hohe Sensitivität und Spezifität Möglichkeit zum Nachweis aller GVOs Ermöglicht eine Quantifizierung (für die Einhaltung der EU Verordnung wichtig!) Funktioniert sehr zuverlässig bei einem breiten Spektrum von Lebensund Futtermittelprodukten Wird von fast allen Unternehmen in der EU verlangt Nachteile: Muss in Spezial-Labors durchgeführt werden Genetic ID (Europe) GmbH 2014

Zusammenfassung Strip-Test Schneller Screen vor Ort Anwendbar bei Saatgut/Körnern/Blättern Beispiel: Testen einer LKW-Ladung Sojabohnen vor der Entladung / Schnelltest von Sojapflanzen auf dem Feld PCR-Test Hoch sensitiv und spezifisch Für ein breites Spektrum von Produkten anwendbar Weltweiter Industriestandard zur Verifizierung von Kontrakten und Einhaltung von Kennzeichnungs -Verordnungen Beispiel: Testen einer Schiffsladung Sojaschrot vor dem Export

PCR: Grundlagen Grundlagen der PCR GVOs enthalten charakteristische, DNA Sequenzen Primer (synthetische, kurze DNA Moleküle) werden zur Suche von GVO-Sequenzen benutzt Exponentielle Amplifizierung der GVO-Sequenz

PCR: Grundlagen Das Enzym Taq Polymerase katalysiert eine Reaktion, die Kopien der erkannten Sequenz produziert. Dies wird durch die Erkennung der angelagerten Primer ermöglicht, die als Schablonen für den neuen DNA-Strang dienen. Transgene Taq Polymerase Synthesie einer DNA-kopie

PCR: Grundlagen Primer sind kurze synthetische DNA-Moleküle, die komplementär zur Ziel-Sequenz sind. Beispiel 1: Keine Primerbindung Beispiel 2: Primerbindung

PCR Amplifizierung Taq Taq Amplifizierung (meistens 45 Zyklen) Taq Taq Kettenreaktion, Kopien der Kopien werden synthetisiert

PCR Amplifizierung Anzahl der PCR Zyklen 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40 Anzahl der DNA Moleküle 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 1 000 000 1 000 000 000 1 000 000 000 000

Real Time PCR Basiert auf dem Nachweis und Quantifizierung einer fluoreszierenden Reporter Probe (ein zusätzlicher, mit einem fluoreszierenden Farbstoff markierter Primer) Signal nimmt direkt proportional mit der Menge des PCR- Produkts zu Durch den Einsatz der Probe wird die Sensitivität und Spezifität erhöht

Quantitative Real Time PCR [Kopienzahl GVO-DNA (z.b. RUR)] [Kopienzahl Spezies-DNA (z.b. Soja)] x 100% = % GVO Relative Quantifizierung

GVO-Test Optionen Screening Test Konstrukt-spezifischer Test Event-spezifischer Test

Screening Test Breitband Screen, um allg. zu bestimmen, ob irgendein GVO in der Probe vorhanden sein könnte. Nachweis von typischen GVO-Elementen (Marker). Beispiel: CaMV 35S Promotor und NOS Terminator RUR Soja 35S EPSPS NOS Soja Genom Promotor Charakterist. Gen Terminator Soja Genom Transgene DNA

Konstrukt-spezifische Tests Weist das merkmalsgebende Gen nach (z.b. Herbizidresistenz) Beispiel: EPSPS RUR Soja 35S EPSPS NOS Soja Genom Promotor Charakterist. Gen Terminator Soja Genom Transgene DNA

Event-spezifischer Test Ermöglicht den 100% Nachweis eines GVO Varietäten-spezifisch Beispiel: Übergang zwischen Pflanzengenom und Transgen RUR Soja 35S EPSPS NOS Soja Genom Promotor Charakterist. Gen Terminator Soja Genom Transgene DNA

PCR Test-Optionen Qualitatives Screening - An-oder Abwesenheit von GVOs - Nachweisgrenze (LOD)= 0.01% - Geeignet wenn eine Ja/Nein Antwort ausreicht - Oft als Vorabscreen - kostengünstig

PCR Test-Optionen Quantitative Tests - Bestimmung des GVO-Gehalts (möglich bei ausreichender Menge an Zielspezies-DNA) - Erforderlich für: - Einhaltung der EU Verordnungen 1829/2003 und 1830/2003 - Verifizierung der Konformität mit Zertifizierungsprogrammen (z.b. NON-GMO Standard) - Verifizierung von Positivauslobungen (z.b. Ohne Gentechnik in D, gentechnikfrei erzeugt in A, Donau Soja )

GVO Teststrategien Um den geeignetsten PCR-Test auszuwählen müssen einige Faktoren erwogen werden, wie: Ist ein qualitativer Test ausreichend? Ist eine Quantifizierung notwendig? Ist es wichtig alle kommerzialisierten GVOs zu detektieren? Ist der Nachweis eines bestimmten GVOs notwendig/ausreichend?

Aktuell in Brasilien zugelassene GVO-Soja Varietäten Handelsname Event-Name Gen Eigenschaft Hersteller Roundup Ready GTS 40-3-2 CP4 epsps Glyphosat-R. Monsanto Mon 89788 x CP4 epsps, Intacta RR2 Pro Mon87701 cryiac Glyphosat-/Insektenresistenz Monsanto Liberty Link A2704-12 pat Glufosinat-R. Bayer CropScience BPS-CV127 Cultivance Csr1-2 Imidazolinon-R. BASF Anmerkung: In Brasilien ist zur Zeit nur Roundup Ready und Intacta kommerzialisiert, der Anbau der EUzugelassenen Varietät Liberty Link und Cultivance erfolgt voraussichtlich 2015 oder später.

Beispiel 1: Soja/Soja-haltige Mischfuttermittel Handelsname Eventname Trait Zusätzliche genetische Elemente 35SP NOST FMV Roundup Ready GTS 40-3-2 cp4 epsps Mon 89788 x cp4 epsps Intacta RR2 Pro Mon 87701 cryiac Teststrategie (Mon40-3-2 und Mon89788) ist ausreichend, um alle kommerzialisierten Varietäten abzudecken. Die Menge Intacta wird in den kommenden Jahren zunehmen Anmerkung: Mon 87701 wird nicht als einzelnes Event vertrieben, sondern nur als Hybrid mit Mon89788

Beispiel 2: Allgemeines Screening Test 35S Promoter NOS Terminator FMV Promoter Qualitative PCR Analyse Beispielhaftes Testergebnis Nicht nachgewiesen Nicht nachgewiesen Nicht nachgewiesen Nachgewiesene GVO Events Fast alle kommerzialisierte und EU nicht-zugelassene GVOs, z.b. GVO Reis, GVO-Leinsamen z.b. Soja Mon89788, Zuckerrübe H7-1, Raps GT73 Geeignet für Lebensmittelprodukte, Getreide, Saaten, Einzelfuttermittel (z.b. Mais, Raps), Futtermittel ohne Soja (Kreuzkontamination)

GVO-Testpaket Design Zusammenfassung Das angemessene GVO-Testpaket sollte sich nach verschiedenen Faktoren richten: EU und/oder nationale Verordnungen Komerzielle Anforderungen Kundenanforderungen Sollte alle relevanten GVOs abdecken Möglichst kosteneffizientes Design

Weitere Faktoren Beprobung

Überlegungen zur Beprobung Probe sollte repräsentativ sein (Beprobung nach internationalen Richtlinien, wie z.b. GAFTA, EU VO 152/2009, EU Empfehlung 2004/787) Das analytische Ergebnis bezieht sich auf die Probe, nicht auf das Los Hauptursache für Schwankungen von Laborergebnissen

Beprobungsstrategien: Schüttgüter vs. 2.1 2004_787_EG

Probenahmeintervall VLOG Standard 13.02

Leitfaden Futtermittelkontrolle (Deutschland) Genetic ID (Europe) GmbH 2014

Leitfaden Futtermittelkontrolle Grundsatz: Keine gv-kennzeichnungspflicht im Mischfuttermittel, wenn keine der Einzelfuttermittel kennzeichnungspflichtig ist! D.h. bei Positivbefund (>0,9% GVO) eines soja-haltigen Misch- Futtermittels ist eine Nachbeprobung der Einzelfuttermittel ratsam, da evtl. doch nicht gekennzeichnet werden muss.

Leitfaden Futtermittelkontrolle Bis zu 5% botanisches Fremdmaterial im Einzelfutter- Mittel laut Futtermittelverordnung erlaubt. Bei botanischen Verunreinigungen mit GVO-haltigem Material wird laut Leitfaden GVO-Wert in Bezug auf das Gesamtfuttermittel berechnet.

Leitfaden Futtermittelkontrolle Genetic ID (Europe) GmbH 2014

Leitfaden Futtermittelkontrolle...und das Berechnungsbeispiel

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