Immunologische Methoden in der Medizin In vitro - Nachweis einer Immunitäreaktion Humorale Immunität: Analyse des Antiserums = serologische Tests: Nachweis von Antikörper, deren Charakterisierung und Menge (Titer) im flüssigen Überstand geronnenen Blutes eines durch Impfung immunisierten Individuums Grundlage der Nachweissysteme: Ag-Ak-Reaktion Zellvermittelte Immunität: Analyse der T-Zellspezifität, Menge und Funktion: Kirsten Gehlhar Im Blut oder lymphatischen Organen im Tierexperiment oder humanen in vitro Zellkulturen Eigenschaften einer Antikörperantwort Hämagglutination I Spezifität: Fähigkeit, das Immunogen von körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu unterscheiden Affinität: Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigen in bezug auf eine Bindungsstelle (hoch = wenig Antikörper für Antigenbeseitigung nötig) Avididtät: Gesamte Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigenmolekül Prinzip: Bildung von unlöslichen Antigen-Antikörper- Komplexen Menge: Isotyp: Maß für die Zahl reagierender B-Zellen, der AK-Synthesegeschwindigkeit und Lebensdauer bestimmt die Ak-Lebensdauer, deren biologische Funktionen und Reaktions-Ort
Immunpräzipitation Medizinische Bedeutung: Ag:Ak-Komplexe = Immunkomplexe (IK) Lösliche IK können sich an der Basalmembran von kleinen Blutgefäßen oder an Nierenpodozyten unterhalb der Membran anlagern und dort zu Schädigungen der Glomeruli (z.b. bei Lupus erythematodes) oder Entzündung kleiner Gefäße führen. Niere: Ausschnitt aus einem Glomerulus mit normaler (blauer Pfeil) und stark verdickter Basalmembran (roter Pfeil). Dunkle Komplexe werden von der Blutseite her (rechts) abgelagert. Heidelberger`sche Präzipitationsreaktion Prinzip: Verschiedene Mengen an Antigen werden mit konstanten Ak-Mengen inkubiert. Die Menge der präzipitierten Ag-Ak- Komplexe wird über Trübung (Turbidimeter), oder nach Abzentrifugieren ihr Gewicht oder der Proteingehalt bestimmt Hämagglutination I Hämagglutination II Prinzip: Bildung von unlöslichen Antigen-Antikörper- Komplexen Anwendung: AB0-Blutgruppenbestimmung und geeignete Spender-Empfänger Zuordnung bei Bluttransfusionen (Kreuzprobe) Agglutinationsreaktion durch Quervernetzung mit Antikörpern gegen Blutgruppenantigene auf der Oberfläche von roten Blutkörperchen
AB0-Schnelltest (Bedside-Test) Blutgruppenbestimmung direkt vor Transfusionen In den beiden Vertiefungen ist Antikörper vorgelegt In jede Vertiefung wird 1 Tropfen Blut (direkt aus der Kanüle oder der Pipette) zugetropft. Der Test kann nach 10s abgelesen werden ELISA: Prinzip und Durchführung I ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay ELISA: Prinzip und Durchführung II Immunoassay Sonderformen RIA: Radioimmunassay (radioaktive Markierung der Nachweissysteme). Sehr sensitiv, z.b. zur Bestimmung von Hormonspiegeln in Blut und Gewebsflüssigkeiten 1) Beschichtung mit Protein Substrat 2) Zugabe des Erstantikörpers (Serum) Farbiges Endprodukt 3) Zugabe des Enzymmarkierten Zweitantikörpers Sandwich-ELISA: abgewandelter ELISA zur Bestimmung von sezernierten Produkten (z.b. Zytokinen) Beschichtung: Ak-Ag-Ak 4) Enzymreaktion 5) Absorptionsmessung
Western Blot (Immunblot) Zweck: Auftrennung von Proteinen z.b. aus einem Zelllysat, Untersuchung von Bindungsmustern Prinzip am Beispiel: Nachweis von Ak gegen verschiedene Bestandteile von HIV im humanen Serum Immunfluoreszenz I Prinzip: Direkte Darstellung von Antigenen in Zellen und Geweben mittels spezifischer Antikörper, an die Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) gekoppelt sind. Medizinische Bedeutung: Nachweis verschiedener Zelltypen in Suspension (Differentialblutbild) und Gewebeschnitten Langerhans sche Inseln im Pankreas) α Zellen (orange = Glutamin-Decarboxylase) ß Zellen (grün = Glucagon) Nachweis von: Immunfluoreszenz II Aktivierungs-assoziierten Ag (HLA-DR) Differenzierungs-assoziierten Ag (CD45RA, CD45RO) Funktions-assoziierte Ag (CD4/CD8 Verhältnis bei HIV- Diagnostik) Intrazelluläre Parasiten, Viren und Bakterien λ=488 nm Laser (Anregung) Fluorochrom λ=530 nm Antikörper Photodetektor + angeschlossenes Emission Analysesystem (PC) Häufig verwendete Fluorochrome Was ist Fluoreszenz? Anregung (nm) Abstrahlung (nm) Nierenzellkultur infiziert mit Tollwutviren Intrazellulärer Nachweis von Zytokinen, Enzymen Krankheits-assoziierten Antigenen (GAD bei Diabetes, Tumormarker)
Detektion und Analyse der Fluoreszenz I Fluoreszenzmikroskopische Analyse Detektion und Analyse der Fluoreszenz II Fluoreszenzmikroskopische Analyse Lichtquelle: Laser, Quecksilberdampflampe Borrelia sp. Analyse der Fluoreszenz und Morphologie (teilweise) möglich! EBV-Infektion I EBV-Infektion: Diagnostik Beispiel: EBV-Infektion (Epstein-Barr-Virus) Antikörper Primärinfekt Abgelaufene Infektion Reaktivierung Anti-EBV IgM Positiv Negativ Positiv/negativ Anti-EBV IgG Hoch Niedrig Hoch Anti-EA (early antigen) Positiv Negativ Positiv Umhülltes dsdna-virus. Anti-EBNA (EBV-specifc nuclear antigen) Negativ Positiv Positiv durch Speichel übertragen Durchseuchung: 90-95% (älter als 25a) VCA = Virus Capsid Antigen Klinik: Akut: Infektiöse Mononukleose Immunsuppression, Lymphom (B-Zell-Tumor) Antikörper-Verläufe während einer Reaktivierung
EBV-Infektion: Diagnostik im Blot EBV-Infektion: Diagnostik: ELISA / IFT EBV-ELISA EBV- Immunfluoreszenz In beiden Systemen kann die Affinität der Antikörper bestimmt werden Lateral Flow Tests Aufbau eines FACS-Gerätes Troponin T: Bestandteil des Herzmuskels, kann nach Herzinfarkt (abgestorbenes Herzmuskel-Gewebe) im Blut nachgewiesen werden. Zellen werden vorher mit Fluoreszenz- Farbstoffen markiert 1) Probe wird mit Überdruck in die Messküvette eingeführt 2) Beim Eintreten in die Messkammer werden die Zellen stark beschleunigt Aggregate lösen sich auf Perlenkette durch hydrodynamische Fokussierung 3) Am Analysepunkt findet Anregung mit Laserstrahl statt Messung von Streulicht und Fluoreszenz
Was ist Streulicht? Detektion des Streulichtes Oberhalb 0.3µm nimmt das Streulicht proportional zum Querschnitt der Partikel zu 2 Typen von Streulicht im FACS: 1) Vorwärts Streulicht (FCS) Gibt Auskunft über Größe 2) Seitwärts Streulicht (SSC) Gibt Auskunft über Körnung Auswertung des Streulichtes Vorwärts- und Seitwärtstreulicht werden für jede Zelle gegeneinander aufgetragen (Dot-Plot) 1) Granulozyten 2) Monozyten 3) Lymphozyten 2-Parameter-Darstellung ( Dot Plot) Je nach Gerät können neben FSC und SSC noch 6 Fluoreszenz- Parameter bestimmt werden. Erkenntnisse über: 1) Größe (kleine Zellen erzeugen ein kleines Vorwärtsstreulicht-Signal (FSC) 2) Granularität (intrazelluläre Bestandteile), Zellen ohne Granula erzeugen ein kleines Seitwärtsstreulicht-Signal (SSC) Beispiel: Analyse von Lymphozyten- Populationen Problem: Im Streulicht unterscheiden sich B-Zellen und T-Zellen nicht Detektion der Fluoreszenz Lösung: Ausnutzung der Fluoreszenz-Detektion. T-Zellen werden mit einem grün-fluoreszierenden Antikörper markiert (z.b. FITC anti-cd3; assoziiert mit TCR). B-Zellen werden mit einem rot-fluoreszierenden Antikörper markiert (z.b. PE-anti-CD19, Corezeptor, spezifisch für B-Zellen)
Auswertung der Fluoreszenz Beispiel 1: Leukämie Für jede einzelne Zelle wird jeder Parameter FSC SSC 1. Fluoreszenz (grün = T-Zellen) 2. Fluoreszenz (rot = B-Zellen)... gemessen und gespeichert B-Lymphozyten T-Lymphozyten Fluoreszenz-Parameter CD19 = spezifisch für B-Lymphozyten CD3 = spezifisch für T-Zellen Auswahl bestimmter FSC und SSC Werte Selektion von Lymphozyten = gaten Beispiel 2: HIV-Infektion Erhöhte Anzahl an B-Lymphozyten, nur sehr wenige T-Lymphozyten Wahrscheinlich eine Form der Leukämie Präparative Anwendung FACS wird nicht nur für diagnostische Zwecke genutzt, sondern auch zum Sortieren von Zellen Zellsortierung (FACS = Fluorescece Assisted Cell Sorting) Die Zellen werden unterschiedlich ionisiert und durch die Ablenkung zwischen 2 Kondensatorplatten sortiert CD4 = Co-Rezeptor für MHC II, auf T-Helfer-Zellen, Monozyten und Makrophagen CD8 = Co-Rezeptor für MHC I, spezifisch für zytotoxische T-Zellen Patient hat im Vergleich zur Kontrolle zu wenig CD4+ Th-Zellen Ablenkplatten Sortierte Zellen Bis zu 10.000 Zellen/s können isoliert/sortiert werden
Magnetische Zellsortierung (MACS) Nachweis der zellulären Immunität Zweck: Prinzip: Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus einem Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse Anlegen eines Magnetfeldes Entfernen des Magneten verdünntes Blut Ficoll (Dichte = 1,078) Isolierung von mononukleären Zellen (Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation) Zentrifugation Thrombozyten Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) Erythrozyten Granulozyten Zellgemisch mit Ak, an die paramagnetische Partikel gekoppelt sind Magnetisch markierte Zellen werden zurückgehalten gebundene Zellen werden freigesetzt Zellkultur in vitro Zweck: ELISPOT I Nachweis der Anzahl antigenspezifischer T-Zellen oder AK-produzierenden B-Zellen (Maß für die Effektivität, mit der ein Individuum auf ein bestimmtes Antigen reagiert ELISPOT II
Prinzip: Nachweis der Immunität in vivo I (Tuberkulintests) Nachweis der zellvermittelten Immunität auf Tuberkuloseerreger durch Injektion eines Extrakts aus Mycobacterium tuberculosis Tine-Test (Mendel-) Mantoux-Test Prinzip: Nachweis der Immunität in vivo II (Tests allergischer Reaktionen) Nachweis allergischer Reaktionen durch lokale Intrakutaninjektionen mit kleinsten Dosen von Allergenen Überempfindlichkeitsreaktionen vermittelt durch: Spezifische IgE-Antikörper Allergenspezifische T-Zellen