Genexpression Protein- und Gentransfer
Genexpression Plastidäre und mitochondriale Genome Mais mtdna Reis mtdna u. ctdna
Organellengenome mtdna ctdna Mensch Hefe 16,5 kb 84 kb 22 trna, 2 rrna 13 Proteine H. Pflanze 120-2000 kb 16 trna 120-180 kb 15-20 Proteine 30 trna, 4 rrna, ca 60 Proteine Pflanzen: Besonderheit Introns (autocatalytic group I intron), T7-Typ DNA Polymerase, RNA Editing, Transsplicing
Plastidentranskription Chloroplasten besitzen zwei verschiedene RNA Polymerasen, Bacteriophagen T3 u. T7 Typ kernkodiert E. coli Typ:,, (plastomkodiert) Gene für regulatorische -Ue. im Kern kodiert z.t. Gene mit mehreren Promotoren Kooperation zwischen Kern- und Plastidengenom
RNA Polymerasen Wiederholung Eukaryotische RNA Polymerase II: Komplex aus zahlreichen Untereinheiten Prokaryotische RNA Polymerase: 4 Hauptuntereinheiten:,,, 1 regulatorische -Untereinheit
Basaler Transkriptionsapparat Wiederholung Allgemeine Transkriptionsfaktoren: TFIID: TATA-binding protein (30 kda,tbp) erkennt TATA Box + ca. 11 TBP-assoziierte Faktoren (TAFs) TFIID ca. 800 kda TFIIDs mit unterschiedlichen TAFs erkennen unterschiedliche Promotoren. TFIIF: RAP74 ATP-abhängige DNA Helicase entwindet DNA RAP38 bindet an RNA Pol II TFIIF- RNA Pol Komplex TFIIH: ATPase, Helicase und Kinase phosphoryliert CTD-Tail (52x[YSPTSPS]) Phosphorylierung des CTD-Tails befreit die RNA Pol II von Transkriptionsfaktoren und die Elongation der RNA startet. Capping enzyme, splicing Faktoren und Komponenten binden an phosphorylierten CTD-Tail (Kopplung Transkription/ Modifizierung)
Nukleäre Genexpression Wiederholung Struktur Promotor und regulatorische Sequenzen Exons Introns Terminator Transkription RNA Polymerasen Allgemeine Transkriptionsfaktoren 5 Cap Splicing Spliceosome Splice-Signale Splicing Reaktion RNA editing Bildung des 3 -Endes
Regulatorische Transkriptionsfaktoren Wiederholung DNA-bindende Transkriptionsfaktoren (meist Aktivatoren) Assoziierte Co-Aktivatoren cis-elemente: 5 von der TATA-Box lokalisierte Nucleotidsequenzen, die als Bindestellen von regulatorischen Transkriptionsfaktoren erkannt werden
Transkriptions-Initiations Komplex Wiederholung trans-acting factor (Protein, z.b. TF) cis-element (DNA-Sequenz) Rep genspezifische Transkriptionsfaktoren Transkription DNA Interaktionen zwischen aktivierenden Transkriptionsregulatoren (Act) und allgemeinen Transkriptionsfaktoren stabilisieren und aktivieren den Transkriptions-Initiationskomplex. Repressoren (Rep) inhibieren bzw. destabilisieren.
Transkriptionsfaktoren (TF) in Eukaryoten TFs/Genom Gene für TFs Organismus Anzahl Gene Total % aller Gene A. thaliana ~26,000 1533 5.9 S. cerevisiae ~6,000 209 3.5 D. melanogaster ~14,000 635 4.5
Modularer Aufbau eines TFs Aufbau TF: DNA-bindende Domäne Aktivierungsdomäne Flexible Verbindung
Yeast-two-hybrid system Protein-Protein-Interaktionen AD-Plasmid BD-Plasmid Klonierung des gene of interest ( GOI ) und einer cdna-bibliothek in AD- und BD-Plasmide AD AD AD BD Expression der Fusions -Proteine in Hefe Gal4 AD BD TATA mrna lacz-gen Analyse der positiven Interaktionen durch Aktivität der Reporter-Gene
Arabidopsis interactome map Wiederholung 8000 proteins examined (30%) 6200 reliable interactions of 2700 proteins. Consortium (2011) Science. 333:601-607
Wiederholung Interaktion von Transportkomponenten Wassertransport Transmembrantransport Vesikeltransport
TF-Klassen in Arabidopsis Genfamilien: Größe prop. zur Anzahl der Mitglieder Domäne: Größe prop. zur Länge der Domäne DNA-Bindungsdomäne: farbig Prot.-Prot.-Interaktionsdo.: schraffiert Domain shuffling Figure 1. Relationships and domain shuffling among the different Arabidopsis transcription factor families. Gene families are represented by circles, whose size is proportional to the number of members in the family. Domains that have been shuffled and that therefore "connect" different groups of transcription factors are indicated with rectangles, whose size is proportional to the length of the domain. DNA binding domains are colored; other domains (usually protein-protein interaction domains) are shown with hatched patterns. Dashed lines indicate that a given domain is a characteristic of the family or subfamily to which it is connected. Gene names are written in italics. Whereas many of the indicated domain-shuffling events are specific to plants, others likely predate the appearance of the three distinct eukaryotic lineages. For an expanded version of this figure and the information that was used to construct it, see supplemental material. Arabidopsis Transcription Factors: Genome-Wide Comparative Analysis Among Eukaryotes Riechmann et al, Science (2000).
DNA-Struktur DNA/TF Bindung TFs kontaktieren Doppelhelix und erkennen Sequenzabschnitte ohne Aufschmelzen der Basenpaarung Kontakte über die grosse Furche sind informativer!
DNA/TF Bindung H-Brücken Donor: blau H-Brücken Akzeptor: rot H-Brücke: rote Linie Hydrophobe Protuberanz: gelb Freies H-Atom: weiss Major groove: Erkennungsmuster für alle 4 Kombinationen Minor groove: AT gleicht TA; GC gleicht CG
Bindung eines TF an die major groove der DNA DNA/TF Bindung 10-20 solcher nicht-kovalenten Kontakte tragen zur Bindungsenergie einer DNA/TF Interaktion bei.
Klassen: Einteilung nach DNA-Binde- und Interaktionsdomäne Helix-turn-helix MYB Homeobox Proteine Zink Finger Zinkfinger Steroidrezeptor Basische Helix-loop-helix bhlh Basische Leucine zipper bzip
Identifizierung regulatorischer Sequenzen in einem Promoter Deletionsanalyse : Promoteranalyse Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Deletion von Promoter(teil)sequenzen mit funktionellem Test Beispiel: PR-1 Promoter Arabidopsis INA Induktion spezifische GUS Aktivität ( + -) INA Induktion (2,6-dichloroisonicotinic acid, synthetischer Inducer für SAR) Kontrolle Induktion
Linker Scanning: Promoteranalyse Ziel: Feinanalyse regulatorischer Promoterregionen Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Veränderung kurzer (ca. 10 bp) Sequenzen eines Promoters mit Funktionstest
Transiente Genexpression: Promoteranalyse Ziel: Promoteranalyse Testsysteme: Protoplasten, Particle bombardment Protoplasten: Verdauen der Zellwände (z.b. Blätter) mit Enzymmix (Zellulasen, Pektinasen etc.) Inkubation mit Plasmid-DNA (Effektor, Reporter z.b. Luciferase, GFP, Glucuronidase) PEG-Zugabe Analyse von Reporteraktivität in Abhängigkeit von Effektoren (Proteinen, Signalmolekülen) GFP-Aktivität in Arabidopsis Protoplasten - GFP + GFP Particle bombardment: Beschichtung kleiner Goldkügelchen mit Plasmid-DNA Beschuss (Pressluft) von Gewebe (z.b. Zwiebelepidermis) Analyse von Reporteraktivität Transgene Pflanzen : z.b. mittels Agrobakterien Analyse von Reporteraktivität
Yeast one-hybrid system Promoteranalyse Fusionsprotein Aktivierungsdomäne (AD) cdna Identifizierung von DNA-bindenden Proteinen Bindung des TF-Fusionsprotein an künstlichen Promoter führt zur Aktivierung des Reportergens (HIS3 oder lacz).
Helix-turn-helix TF in Eukaryoten erste identifizierte DNA-Erkennungssequenz 2 -Helices verbunden durch turn (Windung) C-terminale Helix erkennt DNA-Sequenz Erkennungs-Helix (recognition helix; rot) Bindung an major groove Dimere binden DNA Symmetrische Anordnung von Protein und DNA-Erkennungssequenz (Palindrom) Verdopplung der Kontakte vervierfacht die Bindungskonstante
Helix-turn-helix TF in Eukaryoten Myb isoliert aus avian myeloblastosis virus Vorkommen: Insekten, Pilzen, Pflanzen (Arabidopsis >100 Gene) In Pflanzen 3 Klassen: 1, 2 und 3 MYB-Domänen Multifunktionell z.b.: LHY CPC1 AtMYBGL1 AtMYB13 MSA-binding protein Regulation der circadianen Uhr Differenzierung von Epidermiszellen, Wurzelhaaren Trichomentwickung Sprossentwicklung Regulation von Zellcyclus-Regulatoren (cyclin)
Helix-turn-helix-(helix): Homöobox Proteine TF in Eukaryoten 1980 entdeckt, Drosophila Walter Gehring, Biozentrum Basel spezielle helix-turn-helix Proteine konservierte 60 aa Domäne Helix 2 und 3 bilden helix-turn-helix Motif Helix 3 erkennt DNA (major groove) Arm der Helix 1 greift um DNA in minor groove Funktion: Fundamentale Rolle bei der Steuerung der Entwicklung bei Tieren und Pflanzen
Phänotypen bei kn-1 Mutation Homöobox Proteine TF in Eukaryoten KN (knotted) Genfamilie: erstes Homöoboxgen aus Pflanze (Mais kn-1, knotted 1) wichtige Regulatoren der Pflanzenentwicklung Expression in Spross-Apikalmeristem Homöobox
ABA-dependent Activation of Expression of Homeodomain leucine-zipper transcritpion factor AtHB6 water stress control signal 6x Replacement of AtHB6 structural gene by luciferase allows noninvasive imaging of physiologica lly active ABA in Arabidopsis Alex Christmann
Zink Finger TF in Eukaryoten Zink strukturelles Element Cys-Cys-His-His bindet Zink-Atom DNA-Bindung durch 3 Zink-Finger
Zink Finger TF in Eukaryoten SUPERMAN aus Arabidopsis Repressor der Blütenentwicklung Repressordomäne (RD) C-term. wild-type 35S::SUP RD 35S::SUP RD Phenotype of flowers of 35S::SUP RD transgenic plants. A: Wild-type (Col-O) flower, with the normal number of stamen (six) and a central gynoecium, which consisted of two fused carpels. B: Flower from a 35S::SUPDRD transgenic T1 plant with 11 stamens and two incompletely fused carpels. C: Flower from a 35S::SUP RD transgenic T1 plant with seven stamens and three incompletely fused carpels.
Zink Finger-targeted nuclease Schematic of the target reporter and zinc finger recognition sequences. a Target reporter construct with tandem, overlapping, partial gfp gene fragments, a 30 pat selectable marker gene fragment, left and right homologous sequences and zinc finger binding sites. b Recognition sequences for ZFN-1 and ZFN-2 Cai et al. (2009) Plant Mol Biol 69:699 709
Strategies for ZFN-driven targeted integration of a 30 pat gene fragment into a chromosomal reporter locus and molecular analysis of targeted reporter events. a Targeted cleavage at two ZFN-2 binding sites. b Targeted cleavage at a single ZFN-1 binding site. c PCR analysis of genomic DNA isolated from Bialaphosresistant (=herbicide resisitant) isolates showing the 2.3 kb recombinant amplification product. d Southern blot analysis showing targeted (2.1 kb) and nontargeted (3.0 kb) reporter loci
TAL-Effektor Nuklease (TALEN) TAL (transcription activator like) effectors from plant pathogenic Xanthomonas are important virulence factors thatact as transcriptional activators in the plant cell nucleus, where they directly bind to DNA via acentral domain of tandem repeats. Boch et al, Science 321, 1509 (2009)
Boch et al, Science 321, 1509 (2009)
Nga-Sze Mak et al, Science 335, 706 (2012)
TALEN (gerichtete Deletion, homologe Rekombination) Miller et al, Nature Biotech 29, 143 (2011)
Leucine Zipper TF in Eukaryoten Dimerisierungsdomäne, z.b. Mit basischer DNA-Erkennungsdomäne (bzip) Säuger Jun + Fos = AP1 oder mit Homöodomäne (Pflanzen HD-ZIP) 2 -Helices bilden coiled-coil hydrophobe Wechselwirkungen (Leucin) zwischen Helices bindet major groove Form einer Wäscheklammer auf der Leine Jun (blau), Fos (rot) L-Leu
bzip cis-regulatorischer Sequenzen in Pflanzenpromoteren: Spezifität durch flankierende Sequenzen und assoziierte Elemente G-Box: bzip
Kombinatorische Kontrolle TF in Eukaryoten Homo-, Heterodimere 3 TFs: 6 DNA-Sequenzen 4 TFs: 10 DNA-Sequenzen 5 TFs: 15 DNA-Sequenzen etc. plus Kombinationen mit Inhibitor-Bindung bzw. Repressoren
Kombinatorische Kontrolle TF in Eukaryoten Einsetzen von einer begrenzten Anzahl TFs in unterschiedlichen Kombinationen, um ein breites Spektrum von Expressionsmustern zu erzeugen z.b. Heterodimerisierung von Leucine zipper Proteinen verändert die Spezifität der DNA-Bindung. Eukaryotische Genregulatoren bilden häufig Komplexe auf der DNA 5 Regulator- Proteine Gen an Gen aus
Regulation der Transkriptionsfaktoren Beispiel de novo Biosynthese ABA-abhängige Bildung von MYB22 Phosphorylierung phospho-tf aktiv: z.b. bzip ABI5 phospho-tf inaktiv: z.b. HDZIP AtHB6 Abbau des Auxin-induzierte Proteolyse reprimierenden TF-Bind-Partners von IAA/AUX Ligandenbindung Freisetzung vom Ankerprotein Steroidrezeptoren (Säuger) (nukleäre K.) Cytosolische nukleäre K. NF- B / I- B (Säuger), bzip17